（分析化学专业论文）g四联体hemin过氧化物模拟酶的结构及应用研究.pdf

中图分类号： u d c ： 学校代码： 1 0 0 5 5 密级：公开 高蕊犬淫 硕士学位论文 l8 39 9 60 g 四联体h e m i n 过氧化物模拟酶的结构及应用研究 s t u d i e so nt h es t r u c t u r ea n da p p l i c a t i o n so f g - q u a d r u p l e x - h e m i nd n a z y m e s 答辩委员会主席评阅人 南开大学研究生院 二。一。年五月 南开大学学位论文使用授权书l i l i i i 。l l i 1 1 1 1 3 l 7 l l 1 7 l 1 1 7 l l 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和中国学 术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文数据库， 通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 f i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字：墓蓟蕴 2 0 1 0年6月2日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目g 四联体- h e m i n 过氧化物模拟酶的结构及应用研究 姓名蔡莉莉l 学号i2 1 2 0 0 7 0 5 1 2l 答辩日期2 0 1 0 年5 月2 8 日 论文类别博士口学历硕士硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院睬惭化学院专业1分析化学 联系电话 1 3 6 1 2 0 1 7 5 4 2 je m a i l l i l i c a i 2 0 4 6 1 2 6 c o m 通信地址( 邮编) ：南开大学西区公寓5 - 4 - 3 01 备注：l 是否批准为非公开论文l否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 i 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：墓越蕴 2 0 1 0年6 月2日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非丛开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级口限制( 2 年)口秘密( 1 0 年)口机密( 2 0 年) 保密期限 2 0 年月日至2 0年月日 审批表编号批准日期 2 0 年月日 限制2 年( 最长2 年，可少于2 年) 秘密l o 年( 最长5 年，可少于5 年) 机密2 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) 摘要 摘要 g - 四联体是d n a 的二级结构，由富含鸟嘌呤( g ) 序列的d n a 通过h o o g s t e e n 氢键连接而成。g 四联体可以与氯化血红素( h e m i n ) 结合，形成具有过氧化氢 酶活性的d n a 模拟酶。这种模拟酶可以催化h 2 0 2 与a b t s ( 2 ，2 l 氨基一二( 3 一乙 基一苯并噻唑啉6 磺酸) ) 的反应，生成的产物具有特征的绿色并在护4 2 2 n m 处 有特征吸收。本论文利用此种模拟酶的反应并结合荧光探针的方法探讨了具有 催化活性的g 四联体构型；设计开发了新的检狈j j a g + ，h 9 2 + 的方法，此方法也可用； 于其他金属离子的检测。 c a t g 4 ( 5 一t g g g t a g g g c g g g t t g g g a a a ) 为含有连续四个g 序列的核苷 酸链，在离子的作用下可以折叠成g 四联体。结合其紫外吸收，利用荧光熔点 法和圆二色光谱法( c d ) ，以及荧光值的比较，我们考察了在三种不同离子条件 下( 1 0 0 m mk c i 1 0 0 m mn a c l 1 6 m mk c l + 0 8 m mm g c l 2 ) ，具有催化能力的 c a t g 4 的g 四联体构型。发现c a t g 4 在1 0 0 m mk c l 和1 6 m mk c l + 0 8 m mm g c l 2 这两种离子条件下，折叠成分子内平行结构的g 四联体，且有很强的催化作用；i 在1 0 0 m m n a c l 的条件下，折叠成分子内反平行的结构，表现出很弱的催化作用。 在c a t g 4 的基础上，我们设计了检测a g + 和h 9 2 + 的方法。据报道，a 矿和胞 嘧啶( c ) 可以结合形成c a r c 的金属碱基配对，使错配的c c 碱基更稳定， 而h 9 2 + 和胸腺嘧啶( t ) 可以形成t - h 9 2 + t 的金属碱基配对，使错配的t - t 碱基 更稳定。利用此原理我们设计了两条核苷酸链，一条为c a t g 4 的加长型，含有 连续的g 序列可以形g 一四联体，另一条链与其部分互补。在没有a 矿或h 9 2 + 存 在时，两条链互补，破坏g 四联体的形成；在a g + 或h 9 2 + 存在的条件下，c - a 矿c 或t _ h 9 2 + - t 金属碱基配对，有助于g 四联体的形成，形成的g 四联体和h e m i n 结合使整体具有催化能力。由于a 矿也可以和半胱氨酸上的巯基结合，因此，该 方法还可用来定量检测半胱氨酸。 关键词：g 四联体g 四联体h e m i n 配合物氯化血红素a g + 检测 a b s t r a c t a b s t r a c t g q u a d r u p l e xs t r u c t u r ei s t h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fd n a o l i g o n u c l e o t i d e s e q u e n c e st h a tc o n t a i ng u a n i n e - r i c hs t r e t c h e sc a r lf o l di n t og - q u a d r u p l e xs 订u c t u r eb y h o o g s t e e nb o n d i th a sb e e nr e p o r t e dt h a tt h ec o m p l e x e sf o r m e db yh e m i n a n ds o m e g q u a d r u p l e x e sc a nb ed e v e l o p e da san e wc l a s so fd n a z y m ew i t hp e r o x i d a s e a c t i v i t y ，w h i c hi sa b l et o je f f e c t i v e l yc a t a l y z et h eh 2 0 2 - m e d i a t e do x i d a t i o no fa b t s i nt h ep r e s e n c eo fh e m i h , p r o d u c i n gt h ef r e e r a d i c a lc a t i o na b t s 一，w h i c hh a sa m a x i m a la b s o r p t i o na t4 2 2n m c o r r e s p o n d i n g l y , t h er e a c t i o nm i x t u r ep r o d u c e sa c h a r a c t e r i s t i cg r e e nc o l o r t h u s ，t h ec h a n g ei nt h ea b s o r p t i o ns i g n a la t4 2 2n m c a l lb e e m p l o y e dt om o n i t o rt h ef o r m a t i o no ft h eg q u a d r u p l e xs t r u c t u r e o rd e t e c t i o no f m e t a li o n s h e r e i n ，t h eg 。q u a d r u p l e x s t r u c t u r eo fc a t 0 4 ( 5 - t g g g t a g g g c g g g t t g o g a a a ) ，a21 n u c l e o t i d ed n ao l i g o m e rw h i c hw a sp r e v i o u s l yr e p o r t e d t ob i n d h e m i na n dt h er e s u l t i n gc o m p l e xe x h i b i t i n ge n h a n c e dp e r o x i d a s ea c t i v i t y ，w a s c h a r a c t e r i z e db yf l u o r e s c e n c ea n dc i r c u l a rd i c h r o i s mm e a s u r e m e n t si n t h et h r e e d i f f e r e n ti o n i cc o n d i t i o n sf 10 0 m mk c l 10 0m m n a c l 1 6 m mk c l + 0 8 m mm g c l 2 t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h ec a t a l y t i c a l l ya c t i v ef o r mo fc a t g 4m a yb eau n i m o l e c u l a r p a r a l l e lq u a d r u p l e xr a t h e rt h a na u n i m o l e c u l a rc h a i r t y p ea n t i p a r a l l e lq u a d r u p l e xo ra m u l t i s t r a n d e dp a r a l l e lq u a d r u p l e x i na d d i t i o n ，t h ef l u o r e s c e n c ea n a l y s i so fl a b e l e d o l i g o n u c l e o t i d e sm a yb ed e v e l o p e da sas u p p l e m e n t a r yt o o l f o rt h es t u d yo fd n a c o n f o r m a t i o n s b e s i d e s ，as i m p l ec o l o r i m e t r i ca n dh o m o g e n o u ss e n s o rd e s i g ns t r a t e g yb a s e do n g q u a d r u p l e x h e m i nd n a z y m e si sd e v e l o p e dt o d e t e c tm e t a li o ni nt h i sa r t i c l e i n t h i sm e t h o d ，t w ou n l a b e l l e do l i g o n u c l e o t i d e sw i t hd i f f e r e n tl e n g t ha r eu s e d i nt h e a b s e n c eo fa 毫，t h et w oo l i g o n u c l e o t i d e sh y b r i d i z et o e a c ho t h e rt of o r ma n i n t e r m o l e c u l a rd u p l e x t h ea d d i t i o no fa g + c a nd i s r u p tt h ei n t e r m o l e c u l a rd u p l e xa n d p r o m o t e ap a r to fs e q u e n c eo ft h el o n g e ro l i g o n u c l e o t i d e t of o l di n t oa l l i n t r a m o l e c u l a rd u p l e x i nw h i c hc cm i s m a t c h e sa r es t a b i l i z e db yc - a 旷一cb a s e i i a b s t r a c t p a i r s a sar e s u l t , t h eg - r i c hs e q u e n c eo ft h es a m eo l i g o n u c l e o t i d ec a r lf o l di n t oa g q u a d r u p l e x ，w h i c h i sa b l et ob i n dh e m _ i nt of o r ma c a t a l y t i c a l l y a c t i v e g - q u a d r u p l e x - h e m i nd n a z y m e t h i sc a l lb er e f l e c t e db ya l la b s o r b a n c ei n c r e a s e w h e nm o n i t o r e di nt h eh 2 0 2 a b t s ( 2 ，2 一a z i n o b i s ( 3 - e t h y l b e n z o t h i o z o l i n e ) 一6 s u l f o n i c a c i d ) r e a c t i o ns y s t e mb yu s i n g u v - v i s a b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y a s a s u l f u r - c o n t a i n i n ga m i n oa c i d ，c y sc a l lb eu s e da sas t r o n gb i n d e ro fa g + t h e r e f o r e ， t h e a g 十d e t e c t i o nm e t h o dm a yb ef u r t h e re x p l o r e da sac y sd e t e c t i o nm e t h o d s i m i l a r ，t - r i c hs e g m e n tf o l d si n t oa l li n t r a m o l e c u l a rd u p l e xi nw h i c ht - t m i s m a t c h e sa r es t a b i l i z e db yt - h 9 2 + - tb a s ep a i r t h i s i u l t i - o n p r o c e s s 知l o w st h e d e t e c t i o no fa q u e o u sh g z 十a tc o n c e n t r a t i o n sa sl o wa s5 0n mu s i n gas i m p l e c o l o r i m e t r i ct e c h n i q u e k e yw o r d s ：g q u a d r u p l e xg q u a d r u p l e x - h e m i nc o m p l e xh e m i na 。矿d e t e c t i o n i i i 目录 目录 第一章绪论1 第一节g 四联体简介。1 1 1 1g 四联体的形成和特点1 1 1 2g 四联体结构的多样性2 1 1 3 研究g 四联体结构的方法5 第二节g 四联体h e m i n 生物模拟酶简介8 1 2 1g 四联体与h e m i n 的作用方式8 1 2 2 不同构型的g 四联体结合h e m i n 后对催化效果的影响9 1 2 3g 四联体- h e m i n 生物模拟酶的应用1 0 第三节生物分子检测a 矿、h 9 2 十的几种方法简介1 5 1 3 1 蛋白检测h + 16 1 3 2 寡核苷酸检测h g + 、a f 17 1 3 3d n a 酶检测h g h 、a g + 1 7 1 3 4 抗体检测h + 19 第二章具有过氧化氢酶活性的g 四联体构型特征2 0 第一节实验部分2 0 2 1 1 仪器与试剂2 0 2 1 2 过氧化氢酶活性的检测一2 1 2 1 3 紫外吸收光谱一2 1 2 1 4 荧光检测一2 2 2 1 5 热熔度检测2 2 2 1 6 匾二色光谱( c d ) 2 2 第二节结果与讨论2 2 2 2 1d n a h e m i n 配合物的过氧化氢酶活性研究。2 2 2 2 2 紫外吸收光谱2 4 2 2 3 荧光分析2 5 2 2 4 圆二色光谱分析( c d ) 3 2 2 2 5 结论o 3 3 第三章g 一四联体h e m i n 过氧化氢模拟酶定量检测a g + 和c y s 3 5 第一节实验部分3 5 3 1 1 仪器与试剂3 5 3 1 2 圆二色光谱试验3 6 i v 目录 3 1 3a ，的检测卜3 6 3 1 4 半胱氨酸( c y s ) 的检测3 7 第二节实验结果与讨论3 7 3 2 1a g + 检测的设计3 7 3 2 2 链b 的优化选择4 0 3 2 3a g + 检测体系的灵敏性和选择性一4 1 3 2 4 半胱氨酸检测体系的设计一4 3 3 2 5 半胱氨酸检测体系的灵敏性和选择性4 3 3 2 6l 右论4 6 第四章基于g 四联体h e m i n 模拟酶的h 9 2 + 传感器设计4 7 q 第一节实验部分：4 7 4 1 1 实验仪器与试剂4 7 4 1 2h 9 2 + 的检测一4 8 第二节实验结果与讨论4 8 4 2 1h 9 2 + 检测的设计4 8 4 2 2 链b 的优化选择一4 9 4 2 3h 9 2 + 检测体系的灵敏性和选择性5 0 4 2 4 结论5 2 参考文献5 3 致谢6 2 硕士期间发表的论文情况6 3 v 第一章绪论 第一章绪论 第一节g 四联体简介 1 1 1g 四联体的形成和特点 - d n a 是生物体内重要的遗传物质，在生物体内通过基因表达精确有序地完 成各项生理功能。d n a 是一种长链聚合物，组成的单位称为核苷酸，而糖类与 磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架。每个糖分子都与四种碱基里的其中 一种相接，这些碱基沿着d n a 长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，是蛋 白质氨基酸序列合成的依据。d n a 存在形式多种多样，最常见的有d n a 单链和 双链。d n a 单链，即为分子中核苷酸的排列顺序。从结构上来讲是由脱氧核糖 核苷酸通过3 和5 磷酸二酯键相连而形成的高聚物。在大多数天然d n a 分子长链 的两端总是有一个核糖带有自由的5 磷酸( 即5 端) ，而另一端的核糖带有自由 的3 羟基( 即3 端) 。d n a 链的方向就是从5 n 3 端。d n a 双链且i d n a 的二级结 构是由w a t s o n 和c r i c k 在前人工作的基础上首先提出的，双螺旋结构是由两条反 向平行的多核昔酸链相互缠绕形成，碱基位于双螺旋内侧，磷酸与糖基在外侧， 通过磷酸二脂键相连，形成核酸的骨架。碱基平面与假想的中心轴垂直，糖环 平面则与轴平行，两条链皆为右手螺旋。 近期研究结果表明，在d n a 的二级结构中，d n a 并不单以双链的形式存在， 它的某些区段因功能需要和特定核苷酸序列而呈现特殊的结构。s u n d p u i s t 和 u g 在模拟一种原生动物棘毛虫的端粒d n a 时，人工合成了一段d n a 序列，发 现在一定条件下模拟的富g 单链d n a 可形成四联体结构，由此推测染色体端粒尾 的单链之间也形成了四联体。k a n g 等用实验证实了在晶体和溶液中富g 的d n a 也能够形成四联体结构1 。 富g 的核酸序列易于形成g 四联体，这在基因学中非常普遍，且在某些生理 学重要的区域已经得到证实，如端粒序列和基因生长区2 。g 四联体的形成可能 和某些生理学有关，例如人的端粒序列形成g 四联体后可以抑制端粒酶的活性， 干扰端粒的延长3 ，- 。这样，一些可以促进g 四联体形成的小分子物质就可能发展 成为抗癌药物孓7 。相似的，某些g 四联体在基因的复制方面也有一些抑制作用8 。 第一章绪论 g 四联体的基本结构单位是g 四分体，如图1 a ( b ) 所示，即在每个四分体的 中心有一个由4 个带负电荷的羧基氧原子通过h o o g s t e e n 氢键连接围成的“口袋”， 通过争四分体的堆积可以形成分子内或分子间的g 四联体。 与d n a 双螺旋结构比较，g 四联体螺旋有两个显著的特点：1 、它的稳定性 决定于口袋内所结合的阳离子种类弘1 1 ，如一价阳离子k + 或n a + 能稳定g - 四联体， 近来发现p b 2 + 对g 四联体也有很高的稳定作用。推测离子增强g 四联体的稳定性 可能是通过与四分体中8 个羰基氧原子的相互作用所致。2 、它的热力学和动力 学性质都很稳定1 2 - 1 4 。如在含k + 的溶液中d ( t t g g g g ) 4 在9 0 c 仍可稳定存在。就 目前对一些生物的d n a 序列分析得知，富含鸟嘿呤的d n a 序列多见于一些在功 能上及进化上都相当保守的基因组区域，许多研究表明，富鸟嘌呤的d n a 链所 形成的g d n a 可能是作为分子之间相互识别的元件之一，在生物体细胞中起着 一些特殊作用。 o 焱n h 2 氏 r ：! 雄i 静o ，h _ 矿r l 一i13-inh 、n h 湫：辙h欢：轼 hi 图1 1 鸟嘌呤( a ) 与g 四分体( b ) 1 1 2g 四联体结构的多样性 根据g 四联体结构的分子特性及螺旋取向，它可分为三种模式5 ：见图1 2 ， 一种为含有鸟嘌呤重复序列的4 个t t a g g g 单链所形成的分子间四联体，另一种 为富含g 的单链重复亚单位自身折回，通过g g 碱基对形成发夹型结构，然后两 个来自不同染色体的发夹型结构相互结合形成g 一四联体，故称为发夹型g ，四联 2 第一章绪论 体；第三类是具有4 个或更长的鸟嘌呤重复序列 ( t t a g g g ) n ，n 2 可以自身折 叠形成分子内的g 四联体结构，即自身折叠型四联体。 a bc 图1 2 三种g 四联连体结构，( a ) 分子间四链g 四联体，( b ) 分子间双链g 四联体，( c ) 分子内g 四联体 另一方面，由于链的方向的不同，相同的序列也可能形成不同的结构。可 能有s y n 也可能有a n t i 键1 5 ，它们的结构如图1 3 所示。当所有的四链都是平行时， 从分子水平看，链的不同方向性与在g 碱基和糖之间糖苷键的构成状态有关。即 所有的碱基在a n t i 构型里，骨干的凹槽都是相同尺寸的( 体系是完全的c 4 对称) 。 当其中含有反平行的结构时，为了正确的形成氢键，碱基一定在s y n 构型里。那 么这将影响与g 四分体相关的骨干的方向，因此造成不同的凹槽尺寸。当连续 的g 碱基都是a n t i 或者都是s y n 时，凹槽是中等尺寸；如果第一个是a n t i 第二个是 s y n ，凹槽宽些，如果第一个是s y n 第二个是a n t i ，那么凹槽将窄些。因此带有相 o hh s y n h n o hh a n t i o 图1 3 碱基与糖苷之间的键可以旋转，有两种优势构型：s y n 和a n t i 。 邻平行链的g 四联体糖苷键的设 为a n t i - s y n - s y n - a n t i ，凹槽分别为宽，适中， 3 第一章绪论 窄，适中。相反，变化链的结构的糖苷键设置为a n t i - s y i 】- a 玎t 山) ，1 1 ，凹槽是宽， 窄，宽，窄。对于双链分子间四联体和单分子分子内四联体有环用来连接结构 上的g 平面。由于环连接方向不同，所形成的四联体的结构也不同。 环是四联体中的一个重要组成部分，人体中大约有3 7 6 0 0 0 个序列能形成g 四联体，这些四联体中的一半包含有三个环，每个环的长度不多于三个碱基。 对于分子内四联体，四个g 平面被环分离。这些环具有不同的长度，有的是一个 碱基的短环，有的是多个碱基的长环1 6 。1 8 。染色体研究1 9 , 2 0 已经揭露了许多能够 形成这些结构的含g 序列，最常用的是能够被t 、a 碱基残余分离的连续的g 平面。 环的不同排布能形成不同的结构。在所有的平行结构中核酸在a n t i 构造中，而其 它的结构是由a r 】t i 和s y n 糖苷键的不同联结2 1 ，2 2 。环的长度和序列影响四联体的稳 定性和结构1 6 , 2 2 , 2 3 。在g 3 平面之间的环是单碱基的序列仅仅能形成平行结构，而 长环既可能形成平行结构也可能形成反平行结构。g 四联体的稳定性受到环序 列2 3 之5 和四联体侧面碱基的影响2 6 锄。由于d n a 序列和离子条件的变化会形成不 同结构的四联体。四联体的生理功能也随着四联体的结构的改变而改变，尤其 是与特异性蛋白相关的作用。可见环对，四联体的形成和稳定性有着巨大的影响。 a n t h o n yb u g a u te ta l 使用了g 3 t n 序列对环的影响进行了详细的研究2 9 。已经发现 特殊的分子内g 四联体环环相互作用例如h 键以及堆积作用能影响四联体的性 质2 啦9 ，3 0 。环长度对分子内四联体的形成也扮演着重要的作用，已经有一些关于 环长度对四联体重叠和稳定性的报道列删。 g 四联体螺旋同时表现为不同形式的结构，被称为多态性( p o l y m o r p h i s m ) 。 综上所述，g 一四联体螺旋多态性的基础在于3 1 ：( 1 ) 链的数量。同一寡核苷酸可在 分子内折叠也可在分子之间折叠。( 2 ) 链的排列方向。在四联体螺旋内4 条链可 有三种组合方式：4 条链都平行；2 条链平行而另2 条与之反平行；理论上，3 条链 平行而另1 条反平行也有可能，但目前尚未发现。( 3 ) 苷键构型。g 四联体内的g 碱基理论上可采取许多苷键的组合，但目前观察到的仅为全反或交替的顺一反构 型。同一g 四联体内平行链上的苷键构型必须相同，而反平行链的苷键构型必须 相反。( 4 ) 环的几何异构：当g 四联体为分子内或双分子结构时，环的不同跨越可 连接不同的g 链( g s t r i n g s ) 。譬如在双分子结构中，环可连接相邻或对角的链， 两个环可以头一头或头一尾方式排列。( 5 ) 离子的结合异构：不同的离子可以不同 的数量及不同的方式与g 四联体相互作用，如离子可以每一个或每二个g 一四联 体结合。 4 第一章绪论 1 1 3 研究g 四联体结构的方法 由于g 四联体结构的多样性，揭示g 四联体的结构对其应用有着十分重要 的意义。目前g 四联体的结构分析主要有以下几种方法： 1 1 3 1d n a 熔点分析( m e l t i n ga n a l y s i s ) d n a 在紫外区2 6 0 n m 呈现增色效应，其测得的解链温度( m e l t i n g t e m p e r a t u r e ，t m ) 对应着形成四联体部分的d n a ；在2 9 5 n m 处呈现减色效应，测 得的解链温度对应着四联体。通过升温和降温绘n o 9 5 温度范围内紫外吸收与 温度的变化曲线，比较2 9 5 n m 处紫外吸收值来判断g 四联体的是否形成，并可以 求出t m 值3 2 。还可以用圆二色光谱间接鉴定g 四联体的形成：2 9 5 n m 的正c o t t o n 峰和2 6 0 n m 的负c o t t o n 峰是分子内g 四链形成的标志3 2 。由此发现在1 0 0 m m o i l n a c l 和k c l 溶液中，2 6 0 n m 时的解链温度都是7 0 士2 ；而在2 9 5 n m 时两者的解 链温度是不同的，k + 溶液中的t m 为6 7 士3 高于n a + 溶液中的t m ( 5 0 。c 士1 ) 。 说明d n a 的端粒在n a + 和k + 溶液中存在两种不同的结构。这两种不同的g 四联体 结构具有结构相关性，其结构的改变依赖于离子浓度和g 一寡核苷酸( g o d n ) 浓度的变化。 利用g 四联体分子信标的方法来测定3 3 。g 四联体分子信标是一段富含g 的单链寡核苷酸探针，分别连有荧光基团( 6 羧基荧光素，州) ，和猝灭基团 ( 4 一( 47 一二甲基胺基苯基氮) 安息香酸，d a b c y l ) 。如图1 4 所示，当其折叠 成g 四联体结构时，荧光基团与猝灭基团得以靠近，荧光共振能量转移从而使 升温 j 岱四联体分子信标 图1 4g 四联体分子信标工作原理 得荧光猝灭，整体对外不显示荧光；当温度升高时，破坏了g 四联体结构，荧 光基团与猝灭基团分离，又恢复荧光。当加入不同浓度的寡核苷酸链，从3 0 。c 开始升温，每分钟升高1 到达9 5 。c ，记录不同浓度下的荧光值与温度变化的曲 5 第一章绪论 线，一阶导数求得熔点，比较浓度与熔点的关系，可以区分出g 一四联体的构型。 1 1 3 2 荧光及荧光共振能量转移的方法 近年来，我们实验室发展出3 5 , 3 6 利用d n a 与三苯甲烷类荧光染料( 结晶紫， 孔雀石绿) 的相互作用，根据结构不同的d n a ，其荧光吸收值的不同来区分四 联体，二倍体，单链以及结构不同的四联体。结晶紫和甲基紫这两种染料的结 构如图所示，三个苯环中间用碳连接起来，使苯环易于旋转，增加了摇摆的弹 性从而使整个分子的总极性很低，因此自由的孔雀石绿和结晶紫本身的荧光强 度都很弱。不同结构的d n a 使染料刚性结构增强的程度不同，其荧光强度也不 同，所以借此来区分四联体，二倍体，单链以及不同结构的四联体。 当体系中存在d n a 时，如果d n a 采用g 四联体结构，染料的三个苯环堆叠 到g 四分体的表面上，且带正电的二烷氨基和带负电的磷酸骨架相互作用，增 加了染料和g 四联体结合的稳定性，从而使染料的刚性结构更强，对应其荧光 强度也显著增强；当d n a 为双链结构时，其稳定染料的程度不如g 四联体，所 以其荧光值减弱，单链更次之。另外，研究发现，三苯甲烷类染料与分子间g 一 四联体和分子内g 四联体作用后的荧光强度也不同，分子内的g 四联体荧光更 强。 、 a c h 3 h a c 、，c h 3 n 、 c h ac h a b 图1 5 ( a ) 甲基紫，( b ) 孔雀石绿 1 1 3 3 核磁共振分析( n m r ) 通过核磁共振分析( n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ，n m r ) 可以较准确得出形成 的g 四联体的结构。含有g 一四分体的物质在核磁谱图上会出现亚胺基上的质子 峰，化学位移在1 0 5 n m 1 2 0 n m 之间。p a r k i n s o ne ta l 描述了在近似生理状态的k + 6 第一章绪论 浓度下，由四段连续的端粒d n a 的重复序列构成的g - 四联体的晶体结构，在这 个分子内四联体中，其d n a 的折叠和外观与含n a + 的四联体结构完全不同。组成 此分子内四联体的四段d n a 链全部呈平行排列，连接在其中的三核苷酸环t t a 弯曲并膨出于四联体核心之外，呈“螺旋桨 样排列，并能被端粒复合体成分 及与端粒相关的核膜蛋白质识别。而分子内四联体反平行结构则有两个侧环和 一个对角线环路，呈两段链平行而另两段链反平行的结构。相对于形成反平行 结构的类似“发夹”结构，形成平行结构的四联体在理论上来说更容易折叠和 解折叠，在重组过程中，四联体可能需要这种结构来完成其功能。因为若是形 成反平行结构的话，在折叠或解折叠时d n a 分子将会缠绕，打结卯。 1 1 3 4 聚丙酰胺凝胶电泳分析 聚丙酰胺凝胶电泳主要用于分离不同物理性质的分子，如大小，形状，等电 点等。在此主要用来观察不同构型的d n a 的流动性，从而比较分辨d n a 以及 g 四联体的结构3 8 , 3 9o 聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移速率主要取决于分子所带的净 电荷以及分子的大小和形状等因素，如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基磺 酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 简称s d s ) ，分子的迁移速率则主要取决于分子量。 因此分子量越小的g 四联体，流动性越快，反之越慢，所以会在平板上走出不 同的条带，假使走出多条条带则证明有多种结构共存。但是这种方法的缺陷是不 能辨别分子量相同的不同拓扑结构的四联体。 1 1 3 5 圆二色光谱分析 圆二色光谱是一种特殊的吸收光谱，他对手性分子的构象十分敏感，一般用 来判断g 四联体链的走向，平行的g 四联体结构还是反平行的g 四联体结构 3 8 , 4 0 。平行结构的g 四联体在2 6 0 r i m 附近有一正的c d 信号，在2 4 0 n m 附近有 一负的c d 信号；而反平行结构的g 一四联体，在2 9 5 n m 附近有一正峰，2 6 0 r i m 附近有一负峰或一侧翼；2 7 5 n m 附近的正峰是d n a 双链的特征吸收。所以混合 光谱则意味着溶液中有平行结构和反平行结构的四联体或是四联体与d n a 双链 共存。 7 第一章绪论 第二节g 四联体h e m i n 生物模拟酶简介 d n a 酶是能够展示不同酶活性的具有催化活性的d n a 分子。在生物催化领 域有着广泛的应用。1 9 5 6 年，一位年轻的科学家首先纯化并阐明了d n a 聚合酶 的生理功能，为随后生命科学的迅猛发展奠定了坚实基础，随后各种各样的d n a 酶如大肠杆菌d n a 聚合酶不断涌现。d n a 酶领域的一个重要发展是一些具有 过氧化物酶活性的d n a 酶发现4 1 , 4 2 。d n a 酶与r n a 酶和蛋白质模拟酶相比，具 有很大的优越性：- 一：d n a 模拟酶合成比较便宜，比较稳定，不易水解和热分 解4 3 ，4 4 。二：在同等条件下，由于d n a 的变异和自我复制能力，以d n a 为基础的 生物催化剂也优于传统的以蛋白质为基础的生物催化剂1 1 。因此，具有某种活性 的d n a 酶的开发引起了极大的关注4 5 4 6 。 目前广泛应用的d n a 酶是某些g 四联体与氯化血红素( h e r o i n ) 结合形成的 过氧化物氢模拟酶，催化过氧化氢参与的反应，并使反应速率以及反应程度大 大提高。在d n a h e r o i n 过氧化物酶模型体系的研究中，经常使用的催化d n a 片 段为富含g 序列i 拘c a t g 4 ，它含有连续的4 个g 序列，可以弯折成分子内的g 四联 体，与氯化血红素( h e m i n ) 结合后增强h e m i n 自身的催化活性。其中某些 d n a h e m i n 的过氧化物酶活性可以b l h e m i n 的高两个数量级4 7 。c a t g 4 增强h e m i n 催化活性的能力与g 四联体结构有关。但是到目前为止，能够增强h e m i n 的过氧 化物酶活性的g 四联体结构还不是清楚，存在着多种争论4 8 。 1 2 1g 一四联体与h e m i n 的作用方式 氯化血红素又名卟啉铁，血卟啉，氯化高铁血红素，是一个具有卟啉结构 h e m i n h e m a t i n 图1 6 氯化血红素的结构式 8 第一章绪论 的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上的氮原子与斗个亚铁离子 配位结合，再由氯离子取代其中的氢氧根离子即为氯化血红素，可以用做铁强 化剂及抗贫血药的有机化合物，是吸收率高的生物态铁剂。当氮原子与一个三 价铁离子配位结合，晶体中再带有一个h 配体轴的物质就叫做h e m i n ，其氢氧形 式口q h e m a t i n 。许多不同的亚铁血红素蛋白质都具有过氧化物酶活性，例如辣根 过氧化物酶4 9 ，细胞色素c 过氧化酶，肌球素和各种各样的细胞色素p 4 5 0 s 5 0 。虽 然h e m i n 本身以及其相关的化合物例如重氢h e m i n 都能够催化氧化一些反应5 1 ，但 它们的催化活性却要比酶低很多。当d n a 片段与h e m i n 发生特异性绑定时，却能 提高h e m i n 的催化活性。例如，h e m _ i n 和某些g 四联体结合后，催化活性大大提 高。 g 四联体与h e m i n 具体的的结合形式目前还存在一些争议，大多数观点认 为h e m i n 应该是堆积在末端的g 四分体平面上，如图1 7 所示，因为体积大的