（水产养殖专业论文）大口鳒Psettodes+erumei线粒体全序列的研究和鲽形目鱼类系统进化分析.pdf

大口缣p s e t t o d e se r u m e 线粒体全序列的研究和鲽形目鱼 类系统进化分析 摘要 本研究测定大口鲽( p s e t t o d e se r u m e i ) 线粒体基因组全序列，其长度为 1 7 ，3 1 5 b p ，共包含2 2 种t r n a 基因、2 个r r n a 基因、1 3 个蛋白编码基因和2 个 非编码区。各基因在线粒体上的排列位置，与脊椎动物共有的基因次序相同，其 中l 链仅编码8 个t r n a 和n d 6 基因。 分析大口缣基因组及各基因片段的碱基组成，整体来说a + t 的含量大于g + c 。 t r n a 和r r n a 基因碱基组成偏倚较小，蛋白质编码基因呈现显著的反g 偏倚，且 主要表现在第三个密码子上。以l 链为计算标准g c - s k e w = - o 3 2 ，a t - s k e w = o 0 8 ， 符合脊椎动物的g c 偏倚。 分析大口缣各基因的序列特征：t r n a 长度变异主要为插入和缺失；蛋白编 码基因除c 0 1 和c o i l l 分别以g t g 和c a c 为起始密码子外，其余1 1 个基因的起 始密码子都为标准起始密码子a t g 。终止密码子除t 从、t a g 及它们相对应的不 完全终止密码子t 、t a 外，n d l 以a g g 做为终止密码子，这种现象在鱼类中较少 见；2 2 个t r n a 中，t r n a s c a n s e 只识别出2 1 个t r n a 的二级结构，t r n a s e r ( g c t ) 则是用软件r n a s t r u c t u r e4 5 识别出其不规则的三叶草结构。在t r n a 基因的二 级结构中，碱基数目的变异主要存在于d h u 环，而非配对碱基对主要存在于接受 臂中；分析1 0 中鲽形目鱼类的轻链起始复制区( o l ) 的碱基组成和结构，大口 鲽的a + t 含量最少，仅为1 6 9 ，牙鲆次之为3 6 5 ，而其他种类均高于5 0 。 同时在鲽形目鱼类中，o l 具有典型的“s t e m - l o o p 结构，茎区结构较保守。 设计两对引物扩增大口缣左眼型和右眼型两个个体的控制区序列。两个个体 均在5 端存在相同的5 6 b p 重复单元，3 端存在相同的8 b p 重复单元，只是重复 数不同；左眼型个体在5 端有三个单倍型，重复次数分别为5 7 ：7 7 ：8 7 ；在3 端有两个单倍型，重复次数分别为8 和2 3 。右眼型个体在5 端有三个单倍型，重 复次数分别为3 7 ：7 7 ：8 7 。在3 端有两个单倍型，重复次数分别为6 和2 5 。同 时通过与其它鲽形目鱼类比较，标识出大口鲽控制区结构：终止相关序列( t a s ) 、 中央保守区序列( c s b f 、c s b - e 、c s b - d ) ，保守序列区序列( c s b l 、c s b - 2 、c s b 一3 ) 。 比较8 种鲽形目鱼类控制区全序列和只含有单拷贝重复单元的控制区碱基组成， 结果显示前者的种间差异明显大于后者，变异系数约是后者的两倍。两者的差异 是由于不同种类重复单元的碱基组成、长度及拷贝数不同。 建立两套系统树，其一为基于控制区部分序列，用b 工法和札法分析，对鲽 形目1 2 种鱼类进行系统分析，以鲈形目甲若鳢作为外类群。结果表明：在鲽形 目内部大口鲽分类地位最原始；鲽亚目先与鳎亚目聚在一起，后与缣亚目聚在一 起，这与形态特征相符。 其二为基于m t d n a 基因组( 控制区除外) ，用b 工法和m l 法分析，构建鲽形 目系统进化树，种类的选取包含1 0 种鲽形目鱼类和其他与鲽形目进化关系较近 3 0 种鱼类，并以鲱形目( 远东拟沙丁鱼和太平洋鲱) 作为外类群。用d a m b e 软 件计算平均碱基含量为a2 7 6 ：c2 9 4 ，g1 6 8 ；t2 6 2 ，转换( t s ) 颠换 ( t v ) = 1 1 8 。系统树结果表明( 1 ) 大口缣处于鲽形目系统分化的最原始位置， 和其他学者研究的结果完全一致。大口缣分类地位的确立；为今后研究鲽形目系 统起源至关重要。( 2 ) 鲈形目在系统分类中别分为3 、4 个类群，鲽形目只和鳄 科鱼类( 鲈形目- i ) 形成姐妹群，和鲈形目的其它类群关系较远。( 3 ) 本文虽 选取的鲽形目种类很少，但是在目前的水平来看，仍支持鲽形目是单系起源的说 法。 关键词：大口鲽；鲽形目；线粒体基因组；控制区；系统分析 a n a l y s i so ft h em i t o c h o n d r i a lg e n o m eo fp s e t t o d e se r u m e i a n dp h y l o g e n e t i ca n a l y s e so ff l a t f i s h e s a b s t r a c t a m p l i f i e dt h em i t o c h o n d r i a l ( m t ) g e n o m eo fp e r u m e i t h ew h o l es e q u e n c ew a s 17 ，315 b p i tc o n t a i n e d2 2t r a n s f e rr n ag e n e s ( t r n a ) ，2r i b o s o m a lr n ag e n e s ( r r n a ) ，1 3p r o t e i n - c o d i n gg e n e s ，2d o m i n a t i n gn o n c o d i n gr e g i o n s m o s tg e n e sw e r e e n c o d e db yt h eh - s t r a n d ，e x c e p tf o rn d 6a n de i g h tt r n ag e n e s o r g a n i z a t i o no fp e r u m e iw a st h es a m ea st h et y p i c a lv e r t e b r a t ea r r a n g e m e n t n u c l e o t i d ec o m p o s i t i o ni nm t d n ag e n o m eo fpe r u m e iw e r ea2 7 8 ，t 2 3 9 ，g1 6 3 ，c2 1 ，a + t5 1 7 ，as t r o n gb i a sa g a i n s tt h eu s eo f g g c s k e w = - 0 3 2 ，a t - s k e w = 0 0 8 ，w h i c hw e r et y p i c a li nv e r t e b r a t e s p e r u m e im tg e n o m e p r o t e i n - c o d i n gg e n e su s e da t ga st h ei n i t i a t i o nc o d o n s 、加t l lt h eo n l ye x c e p t i o no f c o ia n dc o i i i ，w h i c hu s e dg t ga n dc a c s t o pc o d o n si n c l u d e dt a a ，t a g ，t g g a n di n c o m p l e t es t o pc o d o n sto rt a t h eb a s e c o m p o s i t i o no fl i g h t s t r a n d r e p l i c a t i o n ( o l ) e x h i b i t e du n s i m i l a r i t yt o t h ec o r r e s p o n d i n gr e g i o ni nt h eo t h e r f l a t f i s h e s t h ea + to fo lo fp e r u m e iw a so n l y2 0 5 ，t h i sw a sm u c hl o w e rt h a n 3 6 5 ( p a l i c h t h y so l i v a c e u s ) a n do t h e rf l a t f i s h e s ( m o r et h a n5 0 1 i nf l a t f i s h e st h e s e c o n d a r ys t r u c t u r eo fo lc o n s i s t e do fac o n s e r v es t e m ( t t c c c 幸g c c t a a g g g 丰c g g a ) a n dl o o ps t r u c t u r e d e s i g n e dt w op r i m e rp a i r sl p r o h l o o pa n de r u 2 1 c x 4d i v i d e dc o n t r o lr e g i o n i n t o5 e n da n d3 e n d t h e r ew e r e5 6 b pt a n d e r n l yr e p e a t e ds e q u e n c ei nt h e5 e n da n d 8 b pt a n d e m l yr e p e a t e ds e q u e n c ei nt h e3 e n dr e s p e c t i v e l y t h e5 e n di ne y e ss i n i s t r a l s p e c i m e nh a dt h r e ed i f f e r e n tc l o n g s ，t h en u m b e rc o p i e sw e r e8 7 ，7 7 ，5 7 a n d3 e n d h a st w od i f f e r e n tc l o n g s ，t h en u m b e rc o p i ew e r e8a n d2 3 t h ec o n t r o lr e g i o ni ne y e s d e x t r as p e c i m e nh a dt h r e ek i n d so fd o n g si n5 e n d ，t h en u m b e rc o p i e sw e r e 7 7 ；8 7 ；3 7 ，t h e r ew e r et w oc l o n g si n3 e n d ，t h en u m b e rc o p i e s6a n d2 5 i ta l s o e x h i b i t e dt h et y p i c a lt r i p a r t i t es t r u c t u r ew i t hac e n t r a ld o m a i na n dt w oa d j a c e n t v a r i a b l ed o m a i n s ( e t a sa n dc s b ) a l lb l o c k so fc o n s e r v e ds e q u e n c e s ，t a s ， c s b d ，e ，f ，c s b 一1 ，2 ，3 c o u l db ei d e n t i f i e d t h ed i f f e r e n c eo fb a s ec o m p o s i t i o no f c o m p l e t ec rs e q u e n c e sw a sg r e a t e rt h a nt h a to fc rs e q u e n c ee x c l u d i n gt h er e p e a t e d r e g i o n si nn i n es p e c i e so ff l a t f i s h e s ，a n dt h ev a r i a t i o nc o e f f i c i e n to ft h ef o r m e rw a s a b o u tt w i c eo ft h el a t t e r ，w h i c hw a sm a i n l yd u et ot h es e q u e n c e sv a r i a t i o ni nb a s e c o m p o s i t i o n ，l e n g t ha n dc o p yn u m b e r so fr e p e a t e dr e g i o n s p h y l o g e n e t i ca n a l y s e do ff l a t f i s h e sw i t ht h eb a y e s i a na n dm lm e t h o db a s e d o nm t d n ag e n o m e ( w i t h o u tc r ) a n dc r o nb o t ht r e e s ，pe r u m e iw a st h el o w e s t g r o u pi nt h ef l a t f i s h e s , t h i sw a st h es a m e 醛m o r p h o l o g i c a ld a t a s om a k e ds 1 r e e v o l u t i o n a r yp o s i t i o no ft h ep e r u m e ii nf l a t f i s h e sw a sv e r yi m p o r t a n t l yt od i s c u s s t h eo r i g i n a lo ff l a t f i s h e si nt h ef u t u r e a to u rl e v e l ，t h er e s u l tc o n s i d e r e dt h a tt h e h y p o t h e s i so fm o n o p h y l e t i co ff l a t f i s h e sw a ss t a n d s f r o mo u rs t u d yi ts e e m e d t ol 】s t h a tf l a t f i s h e s ss i s t e rg r o u pw a sc a r a n g i d a e ( p e r c i f o r m e s - i ) 淅mah i 曲b o o t s t r a p s u p p o r tv a l u e k e yw o r d s ：p s e t t o d e se r u m e i ；f l a t f i s h e s ；m i t o c h o n d r i a lg e n o m e ；c o n t r o lr e g i o n ； p h y i o g e n e t i ea n a l y s i s 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼! 翅遗直墓他盂要挂别直明的：奎拦亘窒或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者答名：獬答字醐：& 垆月乡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位算文作者签名：劲奸龟誊 签字日期：a 力罗年月弓e l 、 导师签字：g v q 户n 签字日翌：7 年石月弓日 f 大口鲼p s e t t o d e se r u m e i 线粒体全序列的研究和鲽形目鱼类系统进化分析 0 文献综述 随着分子遗传学理论和技术的迅猛发展，分子系统( 发育) 孕育而生，它的任务是 通过生物信息学分析与基因树的重建，研究所代表研究对象之间的系统发育关系，解决 很多以前仅通过表型生理特征和化石记录难以解决的问题。线粒体d n a 因其特有的属性， 已成分子系统学主要研究手段。鱼类m t d n a 的研究广泛开展，促进了鱼类分类学的发展。 2 0 世纪5 0 - 6 0 年代，分子系统学的研究主要在蛋白质的水平上进行 ( g o o d m a n ，1 9 6 3 ) ，同时，应用同工酶电泳技术证明了动物群体存在大量的变异( h u b b y e w o n t i m l 9 6 6 ) ，这一新的分类方法才引起普遍的重视。7 0 年代，分子系统学研究进 入了核酸水平。8 0 年代以来，生物系统学已成为系统生物学( s y s t e m a t i cb i o l o g y ) 或 进化生物学( e v o l u t i o n a r yb i o l o g y ) 中重要的分支学科。尤其在最近二十年内，随着 分子生物学和计算机技术的进步及其应用，使得分子系统学得到飞速发展。 1 1 系统学的概念，研究领域 分子系统学是研究物种的发生系统及其进化过程中的相互关系的科学，通过对生物 大分子( 蛋白质、核酸等) 的结构、功能等的进化研究，来阐明生物各类群间( 包括己 绝灭的生物类群) 的谱系发生关系( m a d i s o n ，1 9 9 6 ) 。传统分类和进化关系的研究主要 依赖于形态学特征的分析，常会受主观因素和趋同进化所导致的性状的影响。由于生物 大分子本身就是遗传信息的载体，含有庞大的信息量，且趋同效应弱，因而其结论更具 可比性和客观性。分子系统学的上述特点，使其自诞生之日起，就逐渐在各种生物类群 的系统发生研究中得到了广泛的应用( 徐宏发和王静波，2 0 0 1 ) 。 分子系统学主要分为两个研究领域，即种群遗传学和系统发生学，前者主要研究种 内分化，后者主要研究物种多样性及种间系统发生关系。分子系统学研究的主要任务是 推断出某一特定类群系统发育的分支式样，并以系统树的形式表现出来( s w o f f o r de t a l ，1 9 9 6 ：钟扬等，1 9 9 4 ) 。 1 2 常用的分子标记 分子系统学常用的分子标记有同工酶电泳技术，限制性片段多态性，随机扩增多 态性d n a ，扩增片段长度多态性技术，微卫星d n a 指纹图谱技术和核酸序列直接测定。 大口鲅p s e tf o d e se r u m e i 线粒体全序列的研究和鲽形目鱼类系统进化分析 a ：同工酶电泳技术主要是系统学早期使用的标记技术，根据酶蛋白分子的大小，所带 电核及构型等不同通过电泳加以分离，经过特异性染色而在凝胶介质上显示带纹( 酶 谱) ，后进行系统分析。该技术操作简便，但在选择材料的代表性上难以保证( m a n c h e n k o ， 1 9 9 4 ) 。 b ：限制性片段多态性( r f l p ) 主要是利用限制性内切酶切割不同生物个体d n a 所产生 的长短不同的d n a 片段，通过电泳分离，s o u t h e r n 印迹后或特异探针进行杂交，经放 射性同位素或非放射性显色技术来揭示由于酶切位点的改变所引起的d n a 多态性。该技 术稳定可靠、重复性好，但特异探针较难得到、步骤繁琐、操作过程复杂、周期长，对 d n a 的需求量大，且信息量少，因而较少用在分子系统学方面( b o s t e i n ，1 9 9 3 ) 。 c ：随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 是依据p c r 技术发展起来的，设计一个寡核苷酸链作 为引物，对d n a 序列进行p c r 扩增而产生多态性片段，利用该片段多态性来分析系统关 系( w i l l i a m s e ta l ，1 9 9 0 ) 。该方法操作快速简便，对样品要求低，可同时检测多个位点。 但它是一种显性标记，不能将显性纯合杂合体分开。对反应条件敏感，重复性差 ( h a d r y se ta l ，1 9 9 2 ) 。 d ： 扩增片段长度多态性技术( a f l p ) 是r f l p 与p c r 技术相结合产生的分子标记，既有 r f l p 的可靠性，又有r a p d 的灵敏度( z a b e a u & v o s ，1 9 9 3 ) 。其基本步骤是：不同物种的 基因序列经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的片段 进行p c r 扩增( 在所有的限制性片段两端加上带特定序列的“接头 ，与接头互补的3 端有几个随机选择的核苷酸引物进行特异的p c r 扩增，只有那些与3 端严格相匹配的 片段才可被扩增) 。扩增产物经放射性同位素标记，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根 据凝胶上d n a 指纹的有无来检证多态性。该技术多态性高，d n a 用量少，检测效率高， 可靠性好，重复性高等优点，但由于其技术繁琐，费用高等缺点，而很少用于分子系统 学研究( c o se ta l ，1 9 9 5 ) 。 e ： 微卫星d n a 指纹图谱技术( s s r ) ，依据串联重复小片段在真核生物基因组中随机分 布，由于重复次数和程度的不同使所在的基因座位上呈现一定的多态性，微卫星d n a 的重复在进化中起着非常重要的作用( c h a r l e s w o r t he ta l ，1 9 9 4 ) 。该技术重复性好， 等位基因数目多，呈显性遗传，其指纹图谱有极高的多态性，结果稳定可靠。但是微卫 星座位突变几率高，对变异反应极其敏感。 f ：核酸序列直接测定技术是通过测定核酸一级结构中核苷酸序列组成，对序列进行分 4 大口鲰p s e t t o d e se r u m e i 线粒体全序列的研究和鲽形目鱼类系统进化分析 析，通过统计和比较序列碱基差异来研究物种间的进化关系，是目前用于分子系统学研 究中最常用和最可靠的方法。直接测序的基因序列，主要有线粒体d n a 和核糖体r n a 。 核糖体r n a 基因是高度复制的串联序列单位，它由1 8 s 、5 8 s 、2 8 s 以及被5 8 s 所分隔 的基因内转录间隔区i t s i 和i t s 2 共同组成( a v i s e & b o w e n , 1 9 9 4 ) 。动物线粒体d n a 是染色体外遗传物质，以共价闭合的环状双链d n a 存在，基因排列紧凑，结构简单、编 码效率高等特点使其成为分子系统学研究热点，是目前最常用也最的方法，接下来会详 细讨论线粒体的特点和应用( p o u y a u de ta l ，2 0 0 0 ；j o n d e t m ge ta l ，2 0 0 7 ) 。 1 3 系统树构建 系统发生分析的目的是尽可能的“重演已经发生并完成的历史，虽然无法实现真 正的再现，但是要尽量接近，更准确的评估。其主要步骤有：序列比对、建立取代模型、 建立进化树以及进化树评估。其中建立取代模型和建立进化树是最为关键的步骤。 1 3 1 序列比对 比对序列时，首先必须保证比对的序列具有同源性，既分析对象的某一位点必须能 确定可以追溯到共同祖先的同一位点，可以手工，也可用计算机专门的软件进行。当今 典型的比对过程包括：首先应用c l u s t a l w 程序，然后进行手工比对，最后提交给一个建 树程序( w i l l i a m & d a v i d ，1 9 8 8 ) 。 1 3 2 模型的方法和常用软件 精确的序列进化模型的发展是近年来一个特别活跃的研究领域，因为更完善的模型 会影响系统发生推论并能更好的理解分子进化。现有两种建立序列进化模型的方法。一 种是建立经验模型，也就是通过大量的序列来进行特性计算，如：简单地计算序列中的 明显替换。经验模型会应用固定的参数值，可这个参数值仅仅是通过一次计算得来，却 运用于其他所有数据，这使他们在计算上非常容易，因此使用这些模型要非常小心，因 为运用这样的模型所得到的结果可能是错误( j u k e s & c a n t o r ，1 9 6 9 ) 。另一种是根据d n a 或氨基酸的生物和化学特性来构建参数模型。例如，结合参数对d n a 序列进行转换和颠 换替代频率的描述。参数化的模型允许参数值来自于每次分析的数据集( k i m u r a ，1 9 8 0 ： t a j i m a n e i 1 9 8 2 ) 。 m o d e l t e s t 是构建核酸进化模型的主要软件，根据等级制似然比检验原理进行 d n a 替代模型的选择，能够筛选出最优的进化模型，采用尽可能少的参数，尽可能好地拟 合数据，估计模型的若干参数，如替代种类，碱基频率、不变位点和位点间替代速率异质 性等。检验结果可用于最大似然法分析和贝叶斯推论中( p o s a d a & c r a n d a l l ，19 9 8 ) 。 1 3 3 系统树构建方法 构建系统树常用的方法有算术平均的不加权的组对法( u p g m a ) 、最小进化法( m e ) 、 邻接法( n 3 ) 、最大简约法( m p ) 、最大似然法( m l ) 以及b a y e s i a n ( 贝叶斯方法) 。 a ： u p g m a 在过去的研究报道中被广泛采用，它假定谱系间物种的进化速率是近似恒 定的，进化距离和分歧时间存在着线性关系。但如果这个假使不成立，该种方法就可能 给出错误的拓扑图，现今u p g m a 法已经较少使用( s n e a t h & s o k a l ，1 9 7 3 ) 。 b ：m e 是根据某种替代模型来计算序列间的距离，从而构建进化距最小的树，作为构建 系统树的最优估计( k i d d & s g a r a m e l l a - z o n t a , 1 9 7 1 ) 。 c ： n j 法不以分子进化的等速为前提，而是考察数据组中所有序列的两两对比结果， 通过序列两两之间的差异决定进化树的拓扑结构和枝的长度( s a i t o ua n dn e i ，1 9 8 7 ) 。n j 法是目前最常采用的距离建树法。 d ：m p 法根据数据组中序列的多重对比结果，优化出的进化树能够利用最小的离散步 骤去解释多重比对中的碱基差异，当不同谱系的进化速率存在较大差异时，m p 法的可 靠性随之降低( f e l s e n s t e i n , 1 9 7 8 ) 。 e ： m l 法考察数据组中序列的多重比对结果，优化出拥有一定拓扑结构和树枝长度的 进化树，这个进化树能够以最大的概率来考察多重比对结果。m l 法假定的条件最少， 是理论上最有效的和统计学上最可靠的系统发育分析方法( f e l s e n s t e i n , 1 9 8 1 ) 。 f ：m r b a y e s 根据贝叶斯推论和m a r k o v 链m o n t ec a r l o 算法重建系统树的程序，目前已 经得到了广泛的应用。它不仅能够建树和估计特定分支格局的后验概率，还能估计替代 模型的参数值。因此，无论对于分子系统发育还是分子进化研究，都是很重要的 ( r o n q u i s ta n dh u e l s e n b e c k , 2 0 0 3 ) 。 对近缘序列，有人喜欢m p ，因为用的假设最少，远缘序列一般用n j 或m l 。相似度 很低的序列，n j 往往出现l o n g b r a n c ha t t r a c t i o n ( l b a ，长枝吸引现象) ，有时会严重干 扰进化树的构建( h e n d ya n dp e n n y ，1 9 8 9 ) 。当分子进化速率基本恒定时，地法和n j 法 6 大口鲮p s e t o d e se r u m e j 线粒体全序列的研究和鲽形目鱼类系统进化分析 所得到的结果相似，但当分子进化的速率差异较大时，札法的准确性明显好于n j 法 ( h a s e g a w ae ta l ，1 9 9 1 ) 。贝叶斯的方法则被认为太慢；对于各种方法构建分子进化树 的准确性，h a l l 认为贝叶斯的方法最好，其次是m l ，然后是m p 。其实如果序列的相似 性较高，各种方法都会得到不错的结果，模型间的差别也不大( h a l l ，2 0 0 5 ) 。 1 3 4 系统树的评估 进化树评估最常用的三种方法是1 t h eb o o t s t r a p2 d e l e t e - h a l f - j a c k k n i f i n g ( f e l s e n s t e i r g19 8 5 ；19 9 2 ) 3 p e r m u t i n gs p e c i e sw i t h i nc h a r a c t e r s ( a r c h i ee ta l ，19 8 9 ；f a i t h ， 1 9 9 1 ) 。 1 4 发展趋势 越来越多的分类学家和古生物学家开始利用分子数据，为形态学和古生物提供新的 证据。分子性状和形态性状的整合，再与化石证据相互印证将更为准确地提供物种进化 的过程和式样。通过同源基因或片断的比较分析以及对基因家族进化规律的探讨，将有 助于阐明d n a 片段及其变异的生物学意义，进而阐明生命现象的起源、联系和发展，最 终阐明形形色色的生命是如何进化、物种是怎样形成等等根本问题。与此同时，分子系 统学和分子进化研究的成果将会为物种资源保护，物种多样性等提供理论依据。 就目前的研究而言，m t d n a 是惟一一个能够提供一定数量的完整的细胞器d n a ，可 以从m t d n a 序列信息、基因组成及基因排列方式等方面进行多方位的分子进化研究，因 此在现有情况下m t d n a 的全序列研究成为动物分子系统发生最有力的证据，也理所当然 地成为当代分子系统学研究的热点之一。 2 1 鱼类线粒体基因组和控制区结构和特性 线粒体( m t d n a ) 是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的、重要的细胞器，是 细胞进行氧化磷酸化的场所，与生物体的新陈代谢、细胞凋亡、疾病和衰老有着密切的 关系。1 9 6 2 年n a s s 等从鸡胚细胞中发现了线粒体d n a( n a s s ，1 9 6 2 ) ，从此核外遗传系 统的研究逐渐成为了分子遗传学的重要研究领域之一( 钟金城，1 9 9 1 ) 。鱼类m t d n a 研 究始于8 0 年代中期，此后，鱼类m t d n a 的研究迅速发展，并广泛应用于研究鱼类系统 大口鳟p s p fr o d e je t u d ej 线粒体全序列的研究和鲜形目鱼类系统进化分析 分子学的各个方面( 陈复生等，2 0 3 3 ；李建华和王继文，2 0 0 5 ：赵凯，2 0 0 6 ) 2i 1 鱼类m t d n a 结构 鱼类线粒体基因组m t d n a 全序列大小通常为1 5 - - 2 0 k b ，双链闭合环状结构。包括 1 3 个蛋白质编码基因、2 个r r n a 基因、2 2 个t r n a 编码基因和2 个非编码区( 图1 ) 。 蛋自质编码基因分别为氢化辅酶i ( n a d h ) 脱氢酶的7 个亚基( n i ) i n d 6 、n d 4 l ) 、细 胞色素b 、细胞色素c 氧化酶的3 个亚基( c o i i i i ) 、a t p 合成酶的2 个亚基( a t p a s e 6 、 a t p a s e 8 ) 。2 个r r n k 基困( 1 2 s 、i 6 sr l q a ) 。2 2 个t r n a 基因自控制区逆时针顺序依 次为p h e 、v a l 、l e u 、i l e 、g l n ( l ) 、m e t 、t r p 、a l a ( l ) ，a s n ( l ) 、c y s ( l ) 、t y r ( l ) 、 s e t ( l ) 、a s p 、l y s 、g i y 、a r g 、h i s 、s e r 、l e u 、g l u ( l ) 、t h r 、p r o ( l ) 。位于m t d n a 的t r n a t r p 、t r n a a 1 a 、t r n a a s n 、t r n a c y s 、t r n at y r 区( w a n c y ) 的非编码区是轻 链起始复制起点( 0 0 ；位于t r n a p r o 和t r n a - p h e 之间的非编码区为控制区( c r 或 d - l o o p ) 。m t d n a 的两条链分别为重链( h ) 和轻链( l ) ，其中l 链仅编码n d 6 和8 个 t r n a ；其余基因皆由h 链编码( s p m y t e t a l ，1 9 9 8 ：h o c h a c h k a m o r a m s e n ，2 0 0 3 ) 。 。一t o “ 图i 鱼类线粒体基因组结构图 8 大口鳞p s e tt o d e se r u m e i 线粒体全序列的研究和鲽形目鱼类系统进化分析 f i g 1 s 仃u c t u r eo fm i t o c h o n d r i a lg e n o m ei nf i s h 注：内环标注的为轻链编码基因 2 1 2 特性( 与核基因比较) a ：结构简单、编码效率高 鱼类m t d n a 分子相对较小，结构基因排列紧凑，基因含量近乎恒定，几乎没有间隔 顺序和内含子。同核基因相比，m t d n a 编码效率较高，除复制起始区域外，其余都为基 因编码区( a n d e r s o ne ta l ，1 9 8 1 ；b i b be ta l ，1 9 8 1 ) 。在蛋白质编码基因中无内含子， 基因间分隔常少于l o b p ，两基因间几乎没有空间，有时甚至相互交叠，t r n a 基因和蛋 白质编码基因之间的这种交叠在鱼类和其他脊椎动物中非常普遍( c h a n ge ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 如a t p 酶6 和a t p 酶8 基因的阅读框重叠，在脊椎动物中均大于6 b p ，鱼类通常是l o b p 。 n d 4 和n d 4 l 基因也有重叠，但这一重叠在鱼类和其他脊椎动物中一般都小于7 b p ( g r a c h e ve ta 1 ，19 9 2 ；j o h a n s e ne ta l ，19 9 0 ) 。 b ：母性遗传，拷贝数多且单一 鱼类m t d n a 多数为母性遗传，一个个体就可以代表一个母系集团，有效种群大小为 核d n a 两性遗传方式的1 4 ，故较少的样本能反映群体结构( b r o w n ，1 9 7 4 ；m i c h a c l i se t a l ，1 9 8 2 ) 。单个细胞中有1 0 0 0 。1 0 0 0 0 个拷贝，容易从组织中分离纯化。一般鱼类在 机体内只有1 种m t d n a 分子存在，任何组织都可用于分析( d e n a o ，1 9 8 1 ；a v i s ea n d l n a s r n n a , 1 9 8 3 ) 。m t d n a 长度有变异，这种变异可以在不同种，同种不同个体间以及同一 个体内观察到，但这种长度差异并非源于基因数目，主要原因是控制区中存在不同数量 和不同长度的重复串联序列( n e s b o ，1 9 9 8 ) 。 c ：碱基使用不均衡 脊椎动物m t d n a 的碱基组成的特点：1 ) a + t 含量通常多于g + c 含量；2 ) 轻链上 a + c 含量大于重链( a s a k a w ae ta l ，1 9 9 1 ) ：3 ) g + c 和a + t 的不对称性通常用g c s k e w 和a t - s k e w 表现，它们的计算公式为：g c - s k e w = g - c ) ( g + c ) ；a t - s k e w = ( a t ) ( a + t ) 。脊椎动物中，g c - s k e w 都是负值，a t - s k e w 通常为正值，且在爬行动物、鸟 类和哺乳类中g c - s k e w 值较大，鱼类中较小( p e m aa n dk o c h e r ，1 9 9 5 ) 。 d ：进化速度快，不同区域进化速率不同 由于受到的选择压力小、缺乏修复机制等原因，m t d n a 的进化速率为核d n a 的5 9 大口鲽p s e tt o d e se r u m e i 线粒体全序列的研究和鲽形目鱼类系统进化分析 1 0 倍( b r o w n ，1 9 8 3 ) 。m t d n a 基因组内不同区域的进化速率不同，3 7 个编码基因和两 个非编码区域中，进化速率的排列为：r r n a ，t r n a 蛋白质编码基因 l - 链起始复制区 控制区。不同的区域适合不同水平的进化研究( m e y e r ，1 9 9 3 ) 。d - l o o p 、c y t b 和n d 4 基因由于进化较快，故适合种群水平差异的检测，亦可用于种间分析；r r n a 基因进化慢， 常用于种或科以上水平的研究。 2 1 3 鱼类控制区的结构和特点 控制区( c r ) 又称d _ l o o p ，一般位于t r n a - p r o 和t r n a p h e 基因之间，是整个m t d n a 基因组序列和长度变异最大的区域，也是变化最复杂，却又被了解最少，最吸引人的区 域( d o u z e r ya n dr a n d i ，1 9 9 7 ) 。该区域包含h 链的起始复制区( 0 h ) ，终止结合序列区 ( t a s ) ，保守序列框( c s b ) ，l 链的启动子( l s p ) 及h 链的启动子( h s p ) ，在线粒 体基因组中起着特殊而又重要的作用( 苏瑛，2 0 0 5 ) 。 控制区被分为三个主要的区域，以c s b - f 和c s b - 1 作为划分的边界：分为终止相关 序列( t a s ) 、中央保守区序列( c s b f 、c s b - e 、c s b - d ) ，以及保守序列区序列( c s b - 1 、 c s b 一2 、c s b - 3 ) 。对控制区结构功能的研究将有助于了解d n a 的复制、转录的机制和进 化的规律( l e ee ta l ，1 9 9 5 ；r a v a g oe ta l ，2 0 0 2 ) 。 a ：终止序列区是控制区变异最大的区域，包含与d n a 复制终止相关的序列t a s ，位于 控制区的5 端。在脊椎动物的终止序列区常常存在重复序列，其拷贝数在种间，甚至 个体间都不相同，是m t d n a 长度变异的主要原因。一般每个重复序列中都含有一个保守 的t a s ，t a s 可能是与h 一链复制终止有关的信号，同时重复的序列能够形成稳定的二级 结构，该结构也是保证重复序列稳定存在的原因。脊椎动物t a c a t 与它的反向互补序列 a t g t a 常常一起出现，形成二级结构中的发夹结构( s a c c o n ee ta l ，1 9 8 7 ) ，鱼类中也 存在这一结构。 b ： 中央保守区是控制区最为保守的区域( s a c c o n ee ta l ，1 9 9 1 ) ，几乎所有的种类都 十分保守，包含c s b - f ，e ，d ，c ，b ，a 。l e e 等( 1 9 9 5 ) 对众多鱼类的序列进行比较时，仅识 别了c s b d 的存在。刘焕章对比哺乳动物和些鱼类序列，识别了鲭鲅鱼类的c s b - f ， c s b - e ，c s b d 。并指出c s b - e 识别的标志是关键含有g t g g g - b o x 。 c ：保守序列区包含3 个保守区c s b 一1 ，c s b 一2 ，c s b - 3 ，在哺乳动物中一般都存在保守 序列c s b 一1 ，相似性高的c s b - 2 和c s b - 3 则不一定存在( s a c e o n ee ta l ，1 9 9 1 ：s b i s ae ta l ， 1 0 大口鲽p s e ft o d e se r u m e i 线粒体全序列的研究和鲽形目鱼类系统进化分析 1 9 9 7 ) ，鱼类保守序列区中c s b 一1 的存在不具有普遍性( l e ee ta l ，1 9 9 7 ；c h e ne ta l ，1 9 9 8 ) 。 研究表明c s b - 1 与m t d n a 的复制起始相关。鱼类的c s b 一1 ，c s b 一2 ，c s b 一3 已被成功识别， 只是不同鱼类的c s b - 1 ，2 ，3 的一般形式稍有不同，其中c s b 一1 最为保守。同时，还发现 许多鱼类在c s b 一3 后，控制区的3 存在重复序列。 2 2 线粒体d n a 在鱼类分子系统学中的应用 2 2 1m t d n a 在鱼类系统与群体关系学中的应用 利用d n a 序列进行鱼类的进化研究具有许多优点：( 1 ) 分子序列的信息代表了遗传 本质，不受标本个体发育的环境条件影