（微生物与生化药学专业论文）一种γ内酰胺酶的表达纯化与酶学性质的初步研究.pdf

摘要 一种( + ) 丫- 内酰胺酶的表达纯化与酶学性质的初步研究 摘要 ，一内酰胺酶是一种新型的酰胺酶，能够催化酰胺类化合物的酰胺键水 解。( + ) 丫一内酰胺酶能够高效拆分外消旋体丫- 内酰胺，获得光学纯的( 一) y 一内酰胺。光学纯的( 一) r 内酰胺是制备抗病毒药物阿巴卡韦( ( 一) a b a c a v i r ) 的重要中间原料，具有巨大的经济价值。与化学合成法相比， 生物催化具有的反应条件温和，特异性高，低能耗，底物专一性，重复使 用，催化效率高等优点，己代替某些化学合成法投入应用。微生物酶法拆 分外消旋体1 ，一内酰胺具有良好的应用前景。 本课题从产丫一内酰胺酶菌株m i c r o b a ct e r y u mh y d r o c a r b o n o x y d a n s l 2 9 - 9 - b - 4 中克隆出一段5 0 7 b p 的基因片段，连接至表达载体p e t 一3 0 a ( + ) 上，于大肠杆菌中获得高水平表达的重组( + ) 丫一内酰胺酶，酶蛋白的n 端和c 端分别引入了一段组氨酸序列，通过n i 亲和层析分离纯化重组( + ) r 内酰胺酶。最优条件下酶活可达2 0 6 u m g ，( 一) 丫一内酰胺收率为4 5 ， e b 值可达9 9 。蛋白单体分子量约为1 8 k d a ，由铁氧还蛋白和丫一内酰胺 酶两个结构域组成。最适温度和最适p h 分别是3 0 c 君1 36 5 ，5 0 。c 时l o m i n 即可失去全部活力。米氏常数为4 4 1 m m o l l 1 ，最大反应速率为 0 1 3 7 m o i l - m i n 。f e 2 + ( 2 m m o l l 。) 与d t t ( l o m m o l l 1 ) 对酶活有明显 的促进作用，酶蛋白被p m s f 强烈抑制，金属螯合剂与电子传递系统中的 一些重要因子( 如n a d ，n a d h ，n a d p h ，f a d ，f 心) 对酶活无明显影响。 北京化_ t 大学硕士学位论文 关键词：m i c r o b a ct e r i u mh y d r o c a r b o n o x y d a n s ，( + ) 丫一内酰胺酶，表达， 蛋白纯化 a b s t r a c t e x p r e s s i o n ，p u i u f i c a t i o na n dp r o p e r t i e s o fa n ( + ) 1 , - l a c t a m a s e a b s t r a c t 7 - l a c t a m a s ei so n ek i n do fn o v e la m i d a s e i tc a nh y d r o l y z et h ea m i d e b o n d so ft h ea m i d e s ( + ) 7 - 1 a c t a m s e sc a nb ea p p l i e di nt h ek i n e t i cr e s o l u t i o no f r a c e m i c7 - 1 a c t a m ，w h i c hc a np r o d u c e ( 一) 7 - 1 a c t a me f f i c i e n t l y t h e ( 一) 7 - 1 a c t a me n a n t i o m e ri sa ni m p o r t a n ti n t e r m e d i a t em a t e r i a lf o rt h es y n t h e s i so f ( 一) a b a c a v i r , w h i c hs e r v e s a so n ep o w e r f u la n t i v i r a l a g e n t s w i t h g r e a t e n o r m o u sv a l u e a d v a n t a g e s s u c ha sm i l dr e a c t i o n c o n d i t i o n s ， s t e r e o s p e c i f i c i t y , h i g hs p e c i f i c i t y t o w a r dt h e s u b s t r a t e ，l o we n e r g e t i c c o n s u m p t i o n ，b i o c a t a l y s tr e u s ec a p a b i l i t y , a n dh i g h q u a l i t yb i o c o n v e r s i o n m a k eb i o c a t a l y s i sa na l t e m a t i v em e t h o dt oc h e m i c a ls y n t h e s i so fc e r t a i n p r o d u c t s c o m p a r e dw i t ht h ec h e m i c a lm e t h o d s ，b e t t e ra p p l i c a t i o np r o s p e c t s w e r ed i s p l a y e do nt h es p i l ty - l a c t a mb yt h em i c r o b i a le n z y m a t i c t h e7 - 1 a c t a m a s eg e n ef r o mm i c r o b a c t e r i u mh y d r o c a r b o n o x y d a n sw a s c l o n e db yp c ru s i n gp r i m e r sb a s e do nt h en - t e r m i n a la n dc - t e r m i n a l a m i n o a c i ds e q u e n c e so fn a t i v ep r o t e i n t h eg e n ec o u l db eh ig h l ye x p r e s s e d i ne s c h e r i c h i ac o l if u s e dw i t hp o l y - h i s t i d i n e t a g sa tb o t hn - - t e r m i n u sa n d c t e r m i n u s t h er e c o m b i n a n te n z y m ec o u l db e o n e s t e pp u r i f i e db y i i i 北京化工大学硕上学位论文 n i - c h e l a t i n ga g a r o s e u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ey i e l do f ( 一h l a c t a mw a s 4 5 a n de e v a l u ew a s9 9 i th a sam o l e c u l a rw e i g h to f18 k d a m g n c o h a dt w od i s t i n c td o m a i n s ：t h ef e r r e d o x i nd o m a i nf u s e sw i t h ) , - l a c t a m a s e d o m a i n m g n c os h o w e do p t i m u mt e m p e r a t u r ea t3 0 。ca n do p t i m u mp ha t 6 5 ，a n di td e n a t u r a l i z a t e dw h e nt h et e m p e r a t u r ew a sr i s e nt o5 0 。ci n 10m i n m c i h a e l i sc o n s t a n to f m g n c o w a s4 41m m o l la n d z m a x w a s o 13 7 m 0 1 l 1 m i n f e 2 + ( 2 m m 0 1 l - 1 ) a n dd t t ( lo m m 0 1 l 1 ) e n h a n c e dt h e e n z y m ea c t i v i t y m g n c ow a ss t r o n g l yi n h i b i t e db yp m s en a d ，n a d h ， n a d p h ，f a da n df m nd i dn o tt a k ee f f e c to na c t i vi t yo fm g n c o k e yw o r d s ：m i c r o b a c t e r i u m h y d r o c a r b o n o x y d a n s ，7 - 1 a c t a m a s e ，g e n e e x p r e s s i o n ，p r o t e i np u r i f i c a t i o n i v 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任 何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要 贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明 的法律结果由本人承担。 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大 学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可 以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在量年解密后适用本授权 书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：圣堡塾日期：丝丝：i ：? 导师签名：日期： 第一章绪论 1 1 手性及手性药物 第一章绪论 1 1 1 手性及手性药物的定义 手性( c h i r a l i t y ) 是指化合物分子由于原子在空间三维排列的不同导致的结构 不对称性，即一个模型与其镜像不能够完全重合，就如同人的左右手不能完全重合， 互为镜象，具有此性质的分子被称为手性分子。两个对映体之间的“对映关系”如同 实物与镜像，但它们的存在并不相同，有的只是以单一的对映异构体形式存在，这种 具有手性性质的化合物被称为手性化合物。一对具有“对映关系”的互为镜象的化合 物称为“对映体”。对映体是由于原子或原子团的不同空间三维排列方式而产生的， 对映体之间具有几乎完全相同的物理化学性质，是自然界存在的本质属性之一【i 】。 这一属性使作为生物生命活动重要基础的大分子( 如：核酸、蛋白质、酶、多糖和受 体等) 具有了不对称性，出现了酶只能催化具有特定结构的手性底物，受体只与特定 的手性小分子化合物相结合的现象，这种现象被称为手性识别。手性识别引发了人们 对于手性药物的重视。经研究发现，药物的药理作用基于体内的大分子问的严格手性 识别和匹配，在通常情况下，同一化合物的不同对映异构体在生物体内的作用具有一 定的差别。经实践证明，含手性因素的化学药物的对映异构体在人体内的药理活性、 代谢过程以及毒性等方面往往存在着较大差异，服用纯手性药物可以减少用药剂量和 代谢负担，降低可能由某种对映异构体引起的副作用，节省资源和成本，减少环境污 染，因此，许多国家鼓励开发手性药物。近年来手性药物的研究受到普遍关注，并已 拓展到食品、化工等领域。手性这一命题对于化学、医药学和生物学具有重大的理论 和实践意义【n j 。 手性药物( c h i r a ld r u g ) 是指由具有药理活性的手性化合物组成的药物，其分子 的立体结构和它的镜像彼此不能重合，互为镜像关系而又不能够彼此重合的一对药物 结构称为对映体( e n a n t i o m e r ) ，对映体各有不同的旋光方向：左旋、右旋、外消旋， 分别用符号( 一) 、( + ) 、( ) 表示。药物分子的手性标记通常采用r s 序列标记法。对 于氨基酸、糖类、肽类、环多元醇及其衍生物的立体命名，也用d 、l 或俗名表示【4 j 。 大多数化学药品是由等量的左旋( s 型) 和右旋( r 型) 两种对映体组成的外消旋体，只 含一种对映体，即光学纯度较高的药物，与外消旋药物相比，光学纯度较高的药物具 有疗效好、副作用小等特剧引。 北京化工大学硕十学位论文 1 1 2 手性药物的作用机理 手性药物的药理作用是通过人体内大分子之间的严格手性匹配与分子识别来实 现的，即在人体内，药物与具有某种特定物理形态结构的受体起作用。在药物的两种 异构体中，只有一种更适合与受体的活性部位结合。如果两种立体异构体都能与受体 结合，结合程度将不太紧密，药物活性往往较低。在通常情况下，一种同分异构体能 够有选择性地进行结合，而另一种异构体则具有较低的活性或者没有活性。 人体内生物系统也具有不对称性，例如酶及细胞表面受体具有手性，外消旋体药 物化合物进入人体后，两种对映异构体的生理活性、药理及毒副作用往往有一定的差 别。某些药物的两种对映异构体具有极为相似的生理活性，仅仅是疗效强度有所差别， 如非甾体类抗炎药物蔡普生的( s ) 一异构体的生理活性通常比( r ) 一异构体高出2 8 倍左 右，f e n o p r o f e n 的( s ) 一异构体的生理活性比( r ) 一异构体高出约3 5 倍。某些药物的两 种对映异构体具有完全不同的生理活性，其中一种甚至对人体具有毒害作用。曾在欧 洲市场作为镇静剂出售的沙利度胺( t h a l i d o m i d e ) ，在以后的研究中才发现其( r ) 一 异构体有镇静作用，而( s ) 一异构体能引起胎儿畸形，因此造成当时多例畸变胎儿的 惨剧。与其类似的手性药物还有很多，如巴比妥药m p p b 与d m b b 、氯胺酮和乙胺丁醇。 还有一些手性药物的另一对映异构体只是表现出不同的生理活性，不具有很大的毒副 作用，如b 一受体阻断剂的活性在左旋体，右旋体则有着不同的生理活性1 6 7 j 。 1 2 手性药物的合成方法 目前手性药物的合成方法主要分为化学合成法与生物合成法两大类： 1 2 1 化学合成法 化学合成法即采用化学控制等手段来获得手性化合物，主要包括与化学拆分法与 不对称合成法【8 ，9 】。 ( 1 ) 化学拆分法 此方法是利用化学反应将对映异构体变为非对映异构体，再利用非对映体之间的 不同的物理性质将它们分开，最后分别分解为( r ) 型和( s ) 型对映异构件，从而达到拆 分目的。如对于非酸非碱的对映体引入酸性基团。这种方法操作方便且稳定，但具有 一定的局限性，化学拆分法的缺点是对于复杂化合物难以找到合适的配体，适用的化 合物类型也就有一定的限制。 2 第一章绪论 ( 2 ) 不对称合成 就是利用不对称因素，如手性试剂、催化剂作用于某种底物进行反应，最终获得 只有一个对映体的产品。 利用手性催化剂催化的反应是催化剂量型反应，具有手性增值效应，一个催化剂 分子可产生多个手性分子这与化学剂量型手性合成相比具有明显的优势。因此，手性 催化成为当今手性合成领域的研究热点。但由于手性化学催化剂的种类和数目均有 限，立体选择性也不高。目前，在化学手性合成中经常采用对映体纯辅助剂或以对映 体做为起始原料，作为纯辅助试剂的对映体价格昂贵、不利于回收和反复使用，而手 性起始原料则主要是一些天然产物( 如碳水化合物、萜类、氨基酸、甾体类等) ，这 些天然产物的“手性池”也具有一定的限制。 1 2 2 生物合成法 生物合成法即利用生物催化剂达到手性化合物拆分与不对称合成目的的方法。采 用微生物细胞或由细胞中分离出的酶作为催化剂，达到拆分外消旋体目的。主要有【l l j ： ( 1 ) 酶法拆分：利用生物酶作为催化剂对外消旋体进行拆分，得到光学纯的化 合物； ( 2 ) 酶法不对称合成：利用酶的高度立体选择性作用于手性的底物，选择性地 将手性的底物转化为光活化合物。 此外，还有微生物法、催化抗体法、现代生物技术等方法。 酶拆分的独特作用在于其由l 一氨基酸构成，活性中心所具有的不对称环境，有助 于对映异构体的识别。在特定条件下，酶只能将其中一个对映体转化为不同的化合物， 从而使两对映异构体彼此分开。理想的用于拆分的酶主要为水解酶，被广泛地用于拆 分外消旋醇和羧酸的酯酶，拆分的主要途径为立体选择性水解、酯化和转酯作用。除 此之外，氧化还原酶也经常被用来合成和拆分外消旋体。产生以上几种酶的微生物种 类繁多，如细菌、霉菌、酵母菌、放线菌等，其中霉菌和细菌较多。 目前酶转化法已成功地应用于合成1 3 一内酰胺类抗生素母核( 6a p a ，7a c a ，7 a d c ) 、 d 一泛酸手性前体、维生素c 、l 一肉毒碱、箔体药物、单旋氨基酸、前列腺素等【l 引。 1 2 3 生物合成法的特点 与化学法相比，生物合成法拆分手性化合物有以下几大特点： ( 1 ) 高立体选择性 生物合成反应在本质上属于酶催化反应，完全具备酶催化反应所具有的高度立体 北京化工人学硕士学位论文 选择性这一特点【1 3 】，它具备结构上的化学选择性和非对映异构体选择性，同时也具有 严格的区域选择性和对映体选择性； ( 2 ) 反应条件温和、设备简单、反应速率快、拆分效率高 生物合成反应条件一般为常温常压的中性条件，不需要高温高压等其它苛刻条 件，因此，设备简单，生产安全。另外，生物合成或生物转化反应属于酶催化反应， 也具备酶催化反应的高效性【1 4 1 ； ( 3 ) 收率高，成本低 生物合成反应属于酶催化反应，具备了酶学反应高效的特点，同时，也因为其反 应条件比较温和，可减低生产成本f l 5 。 1 3 生物手性化技术的应用与展望 随着立体化学、有机化学、药物化学、生物化学领域研究的逐步发展，人们对对 映异构体的生理活性差异的认识也日渐深入。在天然药物与半合成药物中，以单一对 映体形式存在的手性药物占绝对优势。一些以外消旋体形式销售的手性药物经过手性 化改造之后，其药效得以改善，并取得了良好的功效。手性技术发展至今，我们有能 力也有必要以单一对映异构体的形式筛选药物。不久的将来，在除去无效对映异构体 的拮抗作用、毒副作用后，能够从中发现有用的药物，并且由于筛选的范围逐步缩小， 这种以手性技术为基础的筛选方法成功率较高，相对的成本也较低。 目前生物手性化技术的研究内容主要有以下四个方面： ( 1 ) 寻找适合各种手性化合物的新生物催化剂和生物催化反应，应用生物催化 剂合成手性化合物的方法，扩大利用生物催化制备手性化合物的应用范围。 ( 2 ) 研究生物催化剂和生物催化反应以及手性合成的基础特点，如生物催化剂 固定化，有机相生物催化反应，化学修饰对不对称合成的影响，接口催化反应，辅酶 再生，多酶反应系统等方面的研究。 ( 3 ) 研究生物催化反应的反应动力学，热力学，酶催化与酶结构的高选择性的 关系及影响因素，提高酶催化选择的策略。 ( 4 ) 实用化研究具备工业应用前景的手性化合物，手性药物及中间体的生物合 成，开展抗体酶，核酶，人工合成酶的研究，扩大手性生物催化研究领域【l 6 1 。 推动手性药物合成的市场因素主要包括以下几个方面：单一对映体手性药物具有 药效高毒副作用低的优点，在市场上受到广泛欢迎；生物工程药物的高速发展大力推 动了手性药物的市场发展；制药企业销售单一对映体药物，可从中获取高额利润；某 些以外消旋形式销售的药物在手性化后销售形势良好。 在药物工业、农药、化妆品等领域，使用单一对映异构体代替外消旋体的要求也 愈加强烈。在制药工业中，以单一对映体形式存在的手性药物销售比重快速上升。总 4 第一章绪论 体上，手性产品的销售额正飞速度上涨。同时，在新药中手性药物所占比率也逐年增 大，并且其中绝大多数是以单一对映体的形式销售。市场与学术界、产业界正在共同 促进这一领域的发展。 近二十年来，生物催化在手性技术领域具有的无可比拟的优势已经得到了人们的 充分重识。目前获得光学纯化合物的要求日益强烈，已成为推动制药工业、精细化工 工业引入生物技术的最为强大的动力。以目前的技术，高选择性是生物催化最突出并 且无法替代的优势，这一优势最能体现在手性技术方面。利用生物催化剂的位点选择 性、区域选择性、立体选择性进行手性化合物对映异构体的拆分和不对称合成具有的 广阔应用前景，引起国际上生物技术化学合成研究和应用领域的学者以及工业界的高 度重视。利用水解酶进行的手性化合物拆分和不对称合成已取得一定的成果，同时 氧化还原酶和其它酶类的应用也正在迅速扩大，今后的研究方向主要是生物催化剂 的开发，应用领域的扩大，解决生物催化的不足和应用中的技术问题，如酶的稳定性， 辅酶的再生和大规模应用生产技术等。由此可见利用生物催化进行手性化合物的合成 将成为今后具有重大经济利益和社会效益的技术研究领域【1 7 】。 1 4 ( - ) 丫一内酰胺及其应用 ( 一) y 一内酰胺( ( 一) 2 一氮杂双环一 2 2 1 一庚烷一5 一烯一3 一酮，图l ：a ) 是合成许多 生物活性化合物的重要中间体，可用于合成手性药物阿巴卡韦( a b a c a v i r ，图1 ：b ) 。 o a h o n 今 h n b 图1 - 1a ( ) r 内酰胺；b ：阿巴忙韦 f i g 1 - 1a ( 一) 1 , - l a c t a m ；b ：( - ) a b a c a v i r n h 2 北京化t 大学硕一l 学位论文 1 4 1 阿巴卡韦简介 阿巴卡韦( 商品名z i a g e n ) 化学名为( 1 s ，4 r ) 一c i s - 4 一( 2 一氨基一6 一环丙胺基一9 一h 一 嘌呤- 9 - 基) 一2 一环戊烯一卜甲醇，是一种治疗艾滋病的强效药物，逆转录酶抑制剂，具 有较强的体外抗h i v 病毒活性、较高的生物利用度及易进入人体中枢神经系统等特点 【l 引。与拉夫米定，扎西他宾，司他夫定等逆转录酶抑制剂共同使用时疗效能够累加， 与齐多夫定合共同使用则具有协同作用，为治疗艾滋病提供了三重治疗的新方法。该 品自上市以来，已得到了越来越多的关注【1 9 】。 阿巴卡韦含有两个手性碳原子，因此具有4 个光学异构体，目前应用于临床治疗 的是( i s ，顺式) 异构体，该异构体的选择性合成具有重要意义。 阿巴卡韦能够以光学活性的r 内酰胺为原料进行合成。因r 内酰胺的拆分( 如 图1 - 2 ) 最为重要。 o ab 图1 - 2 a ( ) 7 内酰胺；b ：( + ) y 内酰胺 f i g 1 - 2a ( - ) 丫- l a c t a m ；b ：( + ) ? - l a c t a m 1 4 2 阿巴卡韦中间体的合成 阿巴卡韦的合成路线如下f 2 0 之2 】( 图卜3 ) ，以2 s ，5 r 构型的化合物i 为原料来合 成，其构型取决于中间体i ( 图1 - 3 ) 的构型。光学活性化合物i 的化学法合成，步 骤多，成本高，不利于工业化生产的应用【2 3 1 。生物法是化学法的补充，具有产物光学 纯度高，作为催化剂的酶易于获得，条件温和，污染小等特点。生物合成法与生物转 化法制备光活原料已成为重要的发展方向，并受到越来越多的关注【2 4 1 。 6 第一章绪论 u 心 中间体i c i 玲h 。 h n 少 h 。礅毗 竺h o - - ! 西内n _ 斟。 图1 - 3 阿巴卡韦的合成路线 f i g 1 - 3t h es y n t h e s i so f a b a c a r v i r 本课题拟通过微生物酶法来获得( 一) y 一内酰胺( 图1 - 4 ) 。文献曾报道一种氨基 核苷的合成【2 5 1 ，以7 一内酰胺为原料，酸水解，再还原获得化合物i ，最后与碱基反 应，得到核苷衍生物。这就提供了一种思路，即将( 一) y 一内酰胺通过一系列反应得 到中间体i 。可见，获得( 一) y 一内酰胺是合成阿巴卡韦的重要环节。而( 一) 丫一内酰 胺的制备方法也有很多种，其中生物转化方法拆分( ) 丫一内酰胺而得到( 一) r 一内酰 胺具有条件温和，产物光学纯度高，易于纯化，且不污染环境等诸多优点【26 ，本文即 是通过获得重组( + ) y 一内酰胺水解酶，达到拆分( ) 丫一内酰胺的目的。 o 酰胺水解酶 o ( 一) y - 内酰胺 + 图卜4 ( + 一) y 一内酰胺的酶法拆分 f i g 1 - 4e n z y m a t i cr e s o l u t i o no f 寸| 讯- l a c t a m o n j a 一 页 n n 7 叫圆 。穸窗 北京化t 大学硕士学位论文 | 4 3 ( ) r 内酰胺的拆分 到目前为止，有众多的国内外科学工作者投入到了y 一内酰胺的拆分研究中： m c c a g u er a y m o n d 2 7 】等人通过结晶法达到了拆分外消旋体的目的；t a l o rs t e p h e n 2 s 】 等人分离得到了一种内酰胺酶，催化获得了单一对映体。n a k a n oh i r o t o 2 9 】等人利用 脂肪酶拆分外消旋体，即利用脂肪酶的立体选择性，水解一种消旋体，从而达到拆分 的目的； b r a b b a nad 【3 0 】等人以n a c e t y l p h e n y l a l a n i n e 为唯一碳源筛选得到了一株 产r 内酰胺酶菌株，菌株中的( + ) y 一内酰胺酶可持续产生，而( 一) y 一内酰胺酶则在有诱 导物存在时才能产生；w i s d o mra 【3 1 】等人分离出了一种选择性水解r 内酰胺外消旋 体的酰胺酶；m a h m o u d i a nm t 3 2 l 等人提出了一种微生物酶法拆分t 一内酰胺外消旋体化 合物的方法；t a l o rs t e v e 3 3 】等人用完整微生物细胞应用于外消旋体的拆分，并取得 了良好的效果；t o o g o o d 掣3 4 】克隆了嗜热s u l f o l o b u ss o l f at a r i c h s 菌株中的丫一内酰 胺酶基因，分离得到r 内酰胺酶，该酶催化( ) 丫一内酰胺水解反应具有极高的选择 性，热稳定性强；李海泉等【3 5 】以n 一乙酰苯丙氨酸为唯一氮源，从土壤中筛选获得一 株具有较高立体选择性的菌株膨i c r o b a c t e r i u mh y d r o c a r b o n o x y d a n sl 2 9 9 ，利用该 菌株选择性地水解( + ) 1 ，一内酰胺。 1 5 基因的克隆与表达 1 5 1 基因克隆策略 聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c ti o n ，p c r ) 是上世纪8 0 年代中期发展起 来的体外核酸扩增技术。具有简便、特异、敏感、快速、重复性好、产率高、易自动 化等优点，能在数小时内将所要研究的目的基因或d n a 片段扩增至十万乃至百力倍。 其原理类似于d n a 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引 物。由变性、退火、延伸三个基本步骤构成：模板d n a 的变性：模板d n a 经加热至 9 5 左右一段时间后，使模板d n a 双链或经p c r 扩增形成的双链d n a 解离，成为单链， 以便与引物结合，为下轮反应作准备；模板d n a 与引物的退火( 复性) ：模板d n a 经 加热变性成为单链之后，温度降至5 5 。c 左右，引物与模板d n a 单链互补序列彼此配对 结合；引物的延伸：d n a 模板与引物结合物在t a q d n a 聚合酶的作用下，以d n t p 做 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对半保留复制原理，合成一条新的与模板d n a 链 互补的半保留复制链，重复循环变性、退火、延伸这三个过程，就可获得更多的半保 留复制链，这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环约需2 4 分钟，这样 2 - 3 小时就能使d n a 扩增量呈指数上升，将待扩目的基因扩增放大几百万倍【3 6 1 。 8 第一章绪论 如果己知目标酶蛋白序列或基因序列，即可利用p c r 直接克隆出目的基因，若不 知道目标酶蛋白序列或基因序列，通常可以采用以下方法解决： 第一种方法是直接从微生物中克隆出目的基因，方法主要有以下几种：基因文库 法：提取菌株总d n a 构建一个基因文库，利用杂交法、免疫法等方法进行筛选；鸟枪 法：提取微生物全部d n a ，随机酶切，与载体连接，转化到大肠杆菌或枯草芽孢杆菌 中，筛选转化子；pcr 扩增法：制备纯的蛋白酶，测定其n 端或c 端序列，根据氨 基酸序列设计引物，提取菌株总d n a 为模板进行扩增，也可将目标蛋白的可能序列 设计为引物。第二种方法是从环境中收集d n a 样品，进行随机切割，与表达载体相连， 转化至大肠杆菌或枯草杆菌，从中筛选目的基因1 37 。 1 5 2 重组蛋白的表达 目前，应用最广泛的表达系统为以下三类：大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和 c h o 细胞表达系统。 不同的表达系统和培养方法影响着下游的处理过程，目标蛋白是否形成包涵体、 目标蛋白表达后所处的位置( 胞内、细胞内膜、周质空间和胞外) 、蛋白表达量都与 所选择的表达系统密不可分。表1 - 1 列出了重组蛋白不同表达策略的优点和缺点，某 些缺点可以通过特定的方法进行改进，如给外源蛋白加标签，这样有助于可溶性外源 蛋白的选择性亲和分离纯化，同时也能保护目标蛋白不被某些蛋白酶降解【3 引。 1 6 蛋白分离纯化 蛋白的分离纯化方法有很多，例如盐析、等电沉淀、有机溶剂分级分离等。如果 要获得纯度高的蛋白制品，还需要进行进一步的纯化，柱层析法是最为常用的方法， 具有分离精度高、操作条件温和等优点，包括疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤、 亲和层析、逆流层析等，层析法分离是蛋白分离纯化过程中最为重要的纯化技术之一 【3 9 】 o 1 6 1 离子交换层析 离子交换层析是在蛋白质分离纯化过程中最为重要，是应用最为广泛的方法之 一。其原理是利用不同蛋白质的带电部分与具相反电荷的离子交换剂吸附作用的强弱 差异，凭借一定的置换条件，将其逐一分开，从而实现分离纯化。离子交换所采用的 介质多以离子交换纤维、葡聚糖凝胶或改性硅胶作为为固定相，借助酯化、氧化等化 9 j 匕京化工大学硕士学位论文 表1 - 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 t a b l e1 - 1a d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so fd i f f e r e n tp r o t e i ne x p r e s s i o ns t r a t e g y 降低蛋白酶对表达蛋白的降解作用 分 优 有利于二硫键的止确形成 泌 点 表 显著减少杂蛋白，简化纯化步骤，免去细胞破碎 达 至 表达水平较低 胞 外 缺 大多数蛋白不能进行分泌表达 点 有利于二硫键的止确形成，可得到确定的n 末端 细 优 显著减少杂蛋白，简化了纯化步骤 胞 点 周 质 空 间 多数蛋白不能进入细胞周质空间 表 缺 没有人规模选择性的释放周质空问蛋白的技术 达 点 周质蛋向酶可导致重组蛋白酶解 可保护重组蛋白不被降解 胞 优 包涵体易于分离纯化 内 点 重组蛋白不具有活性，对宿主细胞生欧影响小 包 涵 通常情况下可获得高的表达水平 体 表 蛋白需要进行体外的折叠和溶解 达 缺 收率低 点 具有不确定n 末端 不需要进行体外溶解折叠 胞 优 重组蛋白大多具有正确的结构和功能 内 点 可 溶 性 蛋 高水平的表达较难得到 白 表 缺 纯化步骤较复杂 达 点 蛋白质的可被酶解 i o 第一章绪论 学反应，将阳离子或阴离子基团引入介质表面，形成特殊剂型。蛋白质与离子交 换介质依赖于库仑力的静电作用进行吸附，吸附力的强弱取决于蛋白质与离子交换介 质所带的电荷量，因此交换离子的电荷密度越大，与交换介质的结合力就越大，在洗 脱时所需的流动相的洗脱强度也就越大。 1 6 2 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析是一项重要的蛋白纯化技术，又称为凝胶排阻、分子筛或凝胶过滤 层析。其原理是利用分子大小不同进行分离，不需要蛋白质与其他介质的化学结合， 这就大大的降低了因不可逆结合导致的蛋白质损失或失活。此方法还被用于脱盐、测 定分子量以及更换缓冲液或降低缓冲液的离子强度等方面。 在凝胶层析的洗脱过程中，分子量不同的物质在层析柱中受到的阻滞作用不同， 分子量大子凝胶分离范围的物质沿凝胶颗粒间的空隙随沈脱液流动而流出，不能进入 入凝胶颗粒内部，受到的阻滞作用小，路程短，先流出柱外：而分子量较小的物质则 进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，受到较大的阻滞作用，流动路程长，后流出层析 柱。这样，就使得待分离样品按分子大小先后流出柱子，达到分离的目的。 1 6 3 金属螯合层析 金属螫合亲和层析是一种基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和作用 对不同蛋白质进行分离的方法。过渡态金属离子能与电子供体如氮、硫、氧等原子通 过配位键结合，金属离子上剩余的空轨道作为电子供体的配位点，在溶液中被水分子 或阴离子占据。当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时，氨基酸残基的 供电原子( 如h i s 残基的氮原子、c y s 残基的硫原子) 将取代水分子或阴离子与金属离 子形成复合物，从而使蛋白质分子与固相介质表面结合。由于蛋白质表面的氨基酸种 类、数量、位置和空间构象有所不同，因此可通过其与金属配基的亲和力大小不同选 择性地加以分离纯化。 通常情况下，含有6 - 1 0 个h i s 的肽链就能和n i 离子牢固结合，提高洗脱液中咪 唑浓度才可以将结合后的蛋白洗脱下来。根据这个原理，可通过具有h i s t a g 的载体 将h is - t a g 直接表达在重组蛋白上，可方便地进行一步纯化，大大提高纯化效率，降 低蛋白由于纯化时间，降低失活可能。可利用h i s t a g 的后面的凝血酶作用位点 ( l e u v a l p r o a r g g l y s e r ) 或肠激酶作用位点( a s p a s p a s p a s p l y s ) ，用酶切除纯化后蛋 白的h i s - t a g ，获得天然状态下的蛋白。研究表明，使用金属螯合层析时，咪唑浓度、 溶液离子强度、p h 等条件都会对分离产生一定的可以预计的影响【删。 北京化工大学硕士学位论文 1 7 课题研究的意义及研究内容 生物催化是一项有机化学与生物学相结合的“绿色学科，反应多在水相、室温 和中性p h 的条件下进行，无需高压和极端条件，节省成本，具有环境友好性。此项 技术主要用于拆分手性化合物，获得光学纯手性药物或者全细胞生物转化以及生物合 成光学纯手性药物。生物催化反应与酶及微生物一样也具有多样性，此外，它具有高 度化学专一性、区域专一性和立体专一性的特点，能够高效地拆分手性化合物及生物 合成光学纯化合物的能力，有着巨大的市场前景。 ( 一) 丫一内酰胺作为合成抗艾滋病新药阿巴卡韦的中间原料，具有广泛的应用前 景。前人经过菌种筛选得到菌株m i c r o b a c t e r i u mh y d r o c a r b o n o x y d a n sl 2 9 - 9 ，该菌 株表达的丫一内酰胺酶，具有较高的立体选择性，能够选择性水解( + ) 丫一内酰胺，拆分 ( ) 丫一内酰胺而得到( 一) 丫一内酰胺。接着进行菌株m i c r o b a c t e r i u m h y d r o c a r b o n o x y d a n sl 2 9 - 9 的诱变育种，筛选到产丫一内酰胺酶的高产菌株 m i c r o b a ct e r i u m h y d r o c a r b o n o x y d a n sl 2 9 - 9 - b - 4 。本课题将从高产菌株 m i c r o b a c t e r i u mh y d r o c a r b o n o x y d a n sl 2 9 9 一b 一4 中克隆得到的目的基因，转化到大 肠杆菌中，获得重组( + ) 丫- 内酰胺酶，对其进行纯化，测定一系列酶学性质，明确 该酶的使用条件，为( ) 丫一内酰胺的高效拆分奠定基础。 本课题的研究内容主要包括以下几点： ( 1 ) 重组( + ) y 一内酰胺酶的表达纯化； ( 2 ) 重组( + ) r 内酰胺酶酶学性质的研究； ( 3 ) 重组( + ) y 一内酰胺酶结构信息的初步研究。 第一二章( + ) t - 内酰胺酶的表达与纯化 2 1 引言 第二章( + ) 丫一内酰胺酶的表达与纯化 生物转化是有机化学和生物学相互交叉的前沿学科，可以获得许多常规化学方法 不能或不易合成的化合物，广泛用于光学纯药物的生产。绝大多数生物转化反应所需 条件比较温和，产物单纯，便于纯化，且对环境不易造成污染，应用前景喜人。酶是 高度手性的催化剂，其催化的反应具有高度的立体选择性。酶和微生物种类繁多，可 利用微生物细胞所含的酶，或由细胞中分离出的酶作为催化剂，通过化学反应达到手 性合成或手性拆分的目的，因此生物催化的手性合成具有巨大的发展潜力。 本章研究内容主要包括： 从产丫一内酰胺酶菌株膨i c r o b a c t e r i u mh y d r o o a r b o n o x y d a n sl 2 9 - 9 - b - 4 中克隆 出目的基因，构建到质粒载体p e t - 3 0 a ( + ) 上，重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞 b l 2 1 ( d e 3 ) 中，乳糖诱导表达，获得胞内可溶性的重组( + ) y 一内酰胺酶，并利用n i - h i s t a g 亲和层析柱对蛋白进行纯化。 2 2 实验材料与仪器设备 2 2 1 主要试剂及药品 药品名称 正己烷、乙腈 异丙醇 乙酸乙酯 e d t a a g a r o s e y e a s te x t r a c ti o n 丫一内酰胺 n 一乙酰苯丙氨酸 t r y p t o n e n a c l 丙三醇 乙酸 乙醇 眯唑 纯度级别 色谱纯 色谱纯 分析纯 分析纯 分析纯 生化试剂 分析纯 分析纯 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生产厂家 d i k m a o i k m a 北京试剂公司 北京试剂公司 g e n et e c h 英国o x o i d 公司 上海求德生物化t 有限公司 上海求德生物化_ l 有限公司 英国o x o i d 公司 北京化= 厂 北京化工厂 北京试剂公司 北京试剂公司 a 】f ah e s a r 北京化工大学硕上学位论文 d j i 。i - 乳糖 甘氨酸 t r i s n a h 2 p 吼2 h 2 0 n a 2 m 0 4 1 2 h 2 0 n i s 0 4 7 h 2 0 考马斯亮蓝r 2 5 0 硫酸常那霉素 限制性内切酶 d n am a r k 睨 p r o t e i nm a r k e r 2 2 2 主要仪器 仪器名称 可见分光光度计 离心机 冷冻离心机 p c r 仪 金属浴 移液枪 移液枪 恒温磁力搅拌器 恒温振荡器 电子天平 分析大平 超纯水机 超声波仪 超声波细胞破碎机 灭菌锅 n a n o d r o p h p l c 系统 w a t e r s c hir a t p a ka s - h 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 t r a n s 2 k p r o t e i nm l e ri 北京欣经科生物技术有限公司 北京化下厂 北京化，i ：厂 m o v o n 北京化工厂 北京化工厂 北京化- t 厂 北京欣经科生物技术有限公司 北京欣经科生物技术有限公司 t a l 【a l a 北京天根生物技术有限公司 北京天根生物技术有限公司 仪器型号生产厂家 7 2 2 s上海精密科学仪器有限公司 a n k et g l 1 6 c 上海安亭科学仪器厂 r c5 bp l u sb e c k m a n e d c - 8 1 0东胜创新 m s 一1 0 0t h e 跳o - s h a k e r 2 0 h l 、2 0 0 i _ t l 、10 0 0 p l e f f e n d o f 1 0 0 0 5 0 0 0 l l o r a g o n m e d d o n g f a n gs h - 3 a 北京东方开物科学器材有限公司 t h z c 江苏太仓市实验设备厂 b s l 2 4 ss a r t o r i u s g a 2 0 0o h a u s e a s y p u r eu v b a r n s t e a d h s - 12 0 0 上海新芝生物技术研究所 j y 9 6 一南京新辰生物科技有限公司 m l s 3 7 8 0s a n y o n d - 1 0 0 s p e c t r o p h o t o m e t e r h p l 0 5 0h p 6 0 0 ew a t e r s t m 4 6 2 5 0 m m 。5u d a i c e l 1 6 第二章( + ) 1 , - 内酰胺酶的表达与纯化 n i h ist a g 亲和层析柱 脱盐柱 冷冻干燥仪 脱色摇床 a k t a - f p l c 2 2 3 菌株与质粒 2 m l 5 m l k 7 7 5