（法医学专业论文）脑缺氧损伤后细胞色素c、bcl2表达的实验研究.pdf

学位论文 大鼠 脑缺氧损伤后细胞色素c . b c l - 2 表达的实验研究 摘要 大鼠 脑缺氧损伤后细胞色素c , b c l - 2 表达的实验研究 ( 中文摘要) 研究生:张夔鸣 导师:廖志钢教授 研究背景 缺氧脑损伤( h y p o x i c b r a i n i n j u r y , h b i ) 是临床常见的病理现象， 也是法医实践中各种原因所致窒息情况下最常发生的病变以及主要的死 亡原因之一。中枢神经系统对缺氧敏感，脑组织耗氧量大、代谢率高， 组织氧和 a t p储备少; 脑以 有氧代谢为主，几乎没有无氧代谢能力，对 缺氧耐受差，缺氧对其结构和功能影响最早且严重。 脑缺氧时相继发生神经元能量供求失衡，膜内外离子梯度消失，无 氧去极化和细胞死亡。缺氧所致的神经元损害机制一般认为有坏死和凋 亡两种细胞死亡形式。坏死对缺氧损伤反应迅速，在损伤后很快出现; 凋亡是由基因控制的细胞主动死亡过程，需要新的蛋白质合成，以 d n a 的早期降解为特征，表现为迟发性的神经元死亡。缺氧后线粒体损伤， 细胞发生能量缺失和代谢功能障碍;并介导凋亡调节信号传递，是缺氧 后神经元损害的一个中心环节。线粒体膜通透性改变，释放细胞色素 c ( c y t o c h r o m e c , c y t c ) 活化特定的 c a s p a s e蛋白 酶， 导致细胞凋亡或 使呼吸链电子传递中断促使细胞发生坏死。b c l - 2蛋白定位于线粒体膜 上，对正常细胞的自 身稳定性起重要作用，调控细胞色素 c释放，抑制 神经元凋亡。 c y t c . b c l - 2 在外伤性、 缺血一 缺氧性、中毒性脑损伤后均会出 现 神经元中表达变化，在不同模型中，由于存在许多非缺氧影响因素，表 达变化的 规律也不尽相同。 缺氧后， 脑的不同部位神经元 c y t c , b c l - 2 表 达随损伤后不同时间亦呈现一定的变化规律。日 前单纯窒息缺氧所致神 学位论文 大鼠 脑缺氧损伤后细胞色素c , b c l - 2 表达的实验研究 摘要 经元损伤后c y t c , b c l - 2 表达变化情况报道较少，而其在机械性窒息缺 氧脑损伤后表达变化在法医学中意义更未见报道。 研究目的 在复制大鼠急性持续缺氧模型的基础上，研究脑缺氧损伤后不同时 间神经元中b c l - 2 和c y t c 分布及其表达变化。探讨缺氧后神经元损伤的 分子病理机制及规律，为脑缺氧损伤时间推断以及临床缺氧性脑损害的 评价提供动物实验依据，为今后法医实际检案提供理论基础。 材料与方法 健康s d 大鼠共5 5 只，体重2 0 0 2 5 0 克 ( 清洁级) ，随机分为正常对照 组， 假缺氧组，缺氧损伤组。缺氧组大鼠均采用密封容器，制作持续缺 氧模型 ( 将动物置于含有新鲜空气经过标定的约l 0 0 0 m l 广口 瓶内，瓶内 放钠石灰2 0 g ， 每瓶放入1 只大鼠，立即以 橡皮塞密闭， 至出 现烦躁不安、 喘式呼吸时开始计时， 持续缺氧2 0 分钟后取出) 。按缺氧后存活不同时间 断头处死，分为缺氧后即刻，3 0 m i n , 1 h , 3 h , 6 h , 1 2 h , 2 4 h , 4 8 h , 7 2 h 组。 应用神经元尼氏小体甲苯胺蓝特殊染色法观察脑缺氧后大鼠 皮质、 海马、丘脑神经元损害缺失情况;应用免疫组织化学技术研究缺氧后大 鼠 不同 脑区内 神经元中 c y t c , b c l - 2 表达变化情况。 结果 正常对照组及假缺氧对照组大鼠 脑内均有c y t c , b c l - 2 的低水平 表达。 急性持续低氧致缺氧后脑内 c y t c 和b c l - 2 表达上调。 c y t c 于脑 缺氧损伤后3 小时表达开始增加，与正常对照组和假缺氧对照组比较有显 著性差异， 并于伤后1 2 -2 4 h 达到高峰，在伤后4 8 h 仍维持较高表达水平， 以后逐渐回落，7 2 h 时己明显回落甚至消失。b c l - 2 在缺氧损伤后1 h 表达 水平开始增高，以后持续增强，至伤后第6 h 达到峰值，伤后第2 4 小时有 所回落， 至7 2 h 表达基本消失。缺氧致伤后，在大脑皮质、海马、丘脑 等脑区 c y t c 和b c 1 - 2 均表现出表达上调，表达变化规律具有明确的时间 学位论文 大鼠 脑缺氧损伤后细胞色素c . b c l - 2 表达的实验研究 摘要 相关性，其各自 在不同脑区的表达变化规律基本一致。 缺氧损伤后， 各脑区神经元内尼氏体出现不同 程度的减少及消失，提示缺氧后发生神 经元缺失。 结论 缺氧性脑损伤可诱导c y t c , b c l - 2 在不同脑区的表达变化，其变化 表现出一定的时序性规律，因而c y t c 和b c l - 2 均有可能作为一种客观指 标用于脑缺氧后损伤时间的推断。 观察c y t c , b c l - 2 表达升高的时间相关性、变化程度和异常分布可 能对脑缺氧后神经元存活状况、损伤程度的判定及可能的干预措施有一 定的参考价值。 关键词:脑缺氧 神经元缺失 细胞色素 c b c l - 2 尼氏体 免疫组织化学 大鼠 学位论文 大i脑缺氧损伤后细胞色素c , s c l - 2 表达的实验研究 摘要 a s t u d y o n c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 e x p r e s s i o n f o l l o w i n g t h e h y p o x i c b r a i n i n j u r y o f r a t s ( a b s t r a c t ) p o s t g r a d u a t e : z h a n g k u i - mi n g t u t o r : p r o f l i a o z h i - g a n g b a c k g r o u n d h y p o x i c b r a i n i n j u r y ( h 1 3 1 ) i s k n o w n t o a f a m i l i a r c l i n i c p a t h o l o g i c a l p h e n o m e n a ， a n d o n e o f t h e m a i n l y c a u s e o f d e a t h t h a t i n d u c e d b y s o rt s o f a n o x i c d a m a g e i n f o r e n s ic c a s e s . t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m ( c n s ) i s v e r y s e n s i t i v e t o h y p o x i a , b r a i n t i s s u e h a v e a h i g h o x y g e n - c o n s u m p t i o n a n d m e t a b o l i s m r a t e , m o r e o v e r , t h e r e s e r v e o f t i s s u e o x y g e n a n d a t p i s l i m it e d . t h e e n e r g y s u p p l y o f n e r v o u s t i s s u e d e p e n d o n a e r o b i c m e t a b o l i s m m o s t l y , w i t h l i tt l e c a p a b i l it y o f a n a e r o b i c m e t a b o l i s m a n d p o o r t o l e r a n c e t o a n o x i a . t h e l e s i o n o ft e n o c c u r s in e a r l y s t a g e w h e n h y p o x i a h a p p e n e d， w h i c h i n fl u e n c e d b r a i n s s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n e x t e n s i v e ly. a ft e r h y p o x i a i n j u r y , m a n y c h a n g e s e m e r g e i n n e u r o n s i n c l u d e l o s i n g t h e b a l a n c e o f e n e r g y s u p p l y a n d c o n s u m p t i o n , t h e io n g r a d i e n t b e t w e e n i n n e r a n d o u t e r m e m b r a n e o f c e l l d i s a p p e a r e d , a n a e r o b i c d e p o l a r i z a t i o n a n d c e l l d e a t h . t h e r e a r e t w o d i s t i n c t w a y s a b o u t n e u r o n s d e a t h a ft e r h y p o x i a : n e c r o s i s a n d a p o p t o s i s . n e c r o s i s i s t h e p a t h o l o g i c a l r e s p o n s e p r o c e s s o f i n fl a m m a t i o n , w h i c h o c c u r s r a p i d ly w h e n c e l l s a r e e x p o s e d t o a a n o x i c i n s u l t . a p o p t o s i s i s c h a r a c t e r i z e d b y d n a d e g r a d a t i o n a n d a c t i v e d e a t h p r o c e s s w h i c h b e c o n t r o l b y g e n e , t h i s p r o c e s s n e e d n e w p r o t e i n s s y n t h e s i z e d , t h e d e l a y e d d e a t h . h y p o x i c in s u l t t o n e u r o n s m i t o c h o n d r i o n n e u r o n s o ft e n o c c u r n d u c e d e f i c ie n c y o f 学位论文 大鼠 脑缺氧损伤后细胞色素c , b c 1 一表达的实验研究 摘要 e n e r g y a n d d y s f u n c t i o n o f m e t a b o l i s m , m e d i a t e t h e t r a n s f e r o f a p o p t o s i s s i g n a l , t h e d a m a g e t o m i t o c h o n d r i o n i s a k e y s t e p i n n e u r o n i n j u r y m e c h a n i s m . a c c o m p a n i e d a l t e r s o f t h e m i t o c h o n d r i a l p e r m e a b i l i ty , r e l e a s e d c y t o c h r o m e c f r o m m i t o c h o n d r i o n a c t i v e c a s p a s e p r o t e i n a s e w h i c h l e a d t o n e u r o n a p o p t o s i s , o r t o p r o m o t e n e u r o n s n e c r o s i s b y i n t e r r u p t i n g t h e e l e c t r o n i c t r a n s p o rt o f r e s p i r a t o r y c h a i n . b c l - 2 p r o t e i n l o c a t e s o n t h e mit o c h o n d r i a l m e m b r a n e , u n d e r g o e s a i m p o r t a n t r o l e t o k e e p t h e s t a b i l ity o f c e l l , a n d i n h i b i t s n e u r o n s a p o p t o s i s b y r e g u l a t i n g a n d m o d u l a t i n g t h e r e l e a s i n g o f c y t o c h r o m e c a n d o t h e r p r o - a p o p t o s i s p r o t e i n s . ma n y s tu d y h a v e o b s e r v e d t h e e x p r e s s i n g v a r i e t y o f c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 i n b r a i n a f te r t r a u m a , i s c h e m i a - h y p o x i a a n d i n t o x i c a t i o n . i n d i ff e r e n t m o d e l s , e x p r e s s i n g r u l e o f c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 i s d i ff e r e n t b e c a u s e o f m a n y n o n - h y p o x i a f a c t o r s i n v o lv e d . a ft e r h y p o x i a i n j u r y , c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 e x p r e s s in g d e m o n s t r a t e s o m e r e g u l a r l y v a r i e t y r e l a t e d w i t h t i m e c o u r s e o f p o s t - h y p o x i a i n d i ff e r e n t b r a i n r e g i o n s . i n p r e s e n t , t h e r e a r e f e w r e p o r t a b o u t c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 e x p r e s s i o n u n d e r o n l y o x y g e n d e p r i v e d b r a i n i n j u ry , t h e r e i s n o r e s e a r c h r e p o r t e d a b o u t t h e s i g n i f i c a n c e o f t h e e x p r e s s i n g i n b r a i n w h ic h b e c o n c e rn e d w i t h f o r e n s i c a p p l i c a t i o n s a ft e r h y p o x i c b r a i n i n j u ry i n d u c e d b y m e c h a n i c a l as p h y x i a . o b j e c t iv e s t u d y t h e e x p r e s s i o n c h a n g e s o f c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 f o l l o w i n g h y p o x i c b r a i n i n j u ry o n t h e b a s i s o f d u p l i c a t e a c u t e c o n t i n u a l h y p o x i a m o d e l , t o d i s c u s s t h e m o l e c u l a r p a t h o l o g i c a l m e c h a n i s m o f p o s t - h y p o x i a n e u r o n i n j u ry ; t o p r o v i d e t h e o r e t i c a l b a s i s f o r e s t i m a t i o n o f t i m e s i n c e b r a i n h y p o x i a i n f o r e n s i c a n d c l in i c p r a c t i c e . me t h o d s 学位论文 人鼠 脑缺氧损伤后细胞色素c , b c l - 2 表达的实验研究 摘要 f i ft y - f i v e s p r a g w e - d a w l e y r a t s w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o n o r m a l c o n t r o l , s h a m h y p o x i a c o n t r o l a n d h y p o x i c i n j u ry g r o u p s . t h e e x p e r i m e n t a l r a t s w e r e s u b j e c t e d t o c o n t i n u a l h y p o x i c b r a in i n j u ry b y a 1 0 0 0 m 1 a i r p r o o f e d g l a s s b o tt l e w i t h a n o x ic c o n d i t i o n . a c c o r d i n g t o th e d i ff e r e n t s u r v i v a l t i m e , t h e h y p o x i a g r o u p w e r e t h e n s u b d i v i d e d i n t o p o s t - h y p o x i a i n s t a n t , 3 0 m i n , i h , 3 h , 6 h , 1 2 h , 2 4 h , 4 8 h , a n d 7 2 h g r o u p s . t h e c h a n g e s a n d a b s e n c e o f n e u r o n s i n d i ff e r e n t b r a i n r e g i o n s w a s s t u d i e d b y n i s s l s t o i u i d i n e b l u e s t a i n i n g . t h e e x p r e s s i n g o f c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 i n b r a i n w a s s t u d i e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i s t ry ( i h c. re s u l t ( 1 ) i n t h e g r o u p s o f n o r m a l c o n t r o l a n d s h a m h y p o x i a c o n t r o l r a t s , t h e e x p r e s s i n g l e v e l o f c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 i s l o w . ( 2 ) t h e e x p r e s s i n g o f c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 w a s u p r e g u l a t e d f o l l o w i n g h y p o x i a . t h e e x p r e s s i n g o f c y t o c h r o m e c i n c r e a s i n g a t a t 3 h , r e a c h in g p e a k a t 1 2 - 2 4 h , a n d m a i n t a i n i n g h i g h e x p r e s s i o n l e v e l a t 4 8 h a n d f a l l i n g t o n o r m a l a t 7 2 h a ft e r b r a i n h y p o x i a . wh e r e a s , b c l - 2 w a s i n c r e a s i n g a t l h , r e a c h p e a k a t 6 h a n d f a l l i n g t o l o w e s t l e v e l a t 7 2 h a ft e r h y p o x i a . ( 3 ) t h e e x p r e s s i n g o f c y t c a n d b c l - 2 a r e b o t h u p r e g u l a t e d i n c e r e b r a l c o rt e x , h i p p o c a m p u s , a n d t h a l a m e n c e p h a l o n . t h e c h a n g e r e g u l a r i t y o f c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 s h o w s o b v i o u s r e l a t i o n s h i p w i t h t h e s u r v i v a l t im e a ft e r h y p o x ia . f u rt h e r m o r e , t h e e x p r e s s i n g o f c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 c h a n g e p a tt e rn s h o w e d n o d i ff e r e n c e i n t h e t h r e e b r a i n a r e a s . ( 4 ) n i s s l b o d y i n n e u r o n s c y t o p l a s m l e s s e n o r d i s a p p e a r i n v a r i o u s b r a i n r e g i o n s , t h a t s h o w s h y p o x i a i n j u r y l e a d t o n e u ro n s a b s e n c e . co n c l u s i o n h y p o x i a b r a i n i n j u ry c o u l d i n d u c e t h e e x p r e s s in g o f c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 i n v a r io u s b r a i n r e g i o n s a n d t h e c h a n g e s o f c y t o c h r o me c a n d b e l - 2 s h o w e d t i me s e q u e n c e r e g u l a r i t y . t h e r e f o r e , c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 c o u l d b e a p p l i e d t o e s t i m a t e t h e t i m e s i n c e h y p o x i a a s a n o b j e c t i v e i n d i c a t i o n . 学位论文 大鼠脑缺氧损伤后细胞色素c , b c l - 2 表达的实验研究 摘要 t h e t i m e r e g u l a t i o n o f c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 e x p r e s s i n g , t h e e x t e n t o f c h a n g e a n d a b n o r m a l d i s t r i b u t i n g o f c y t o c h r o m e c a n d b c l - 2 c o u l d b e a p p l i e d t o e s t i m a t e t h e s u r v i v a l s i t u a t i o n a n d d a m a g e d e g r e e , a n d t o f in d p o t e n t i a l p r o t e c t iv e m e a s u r e s . k e y wo r d s : b r a i n h y p o x i a n e u r o n l o s s c y t o c h r o m e c b c l- 2 n i s s l b o d y i m m u n o h i s t o c h e mi s t ry r a t 前言 大鼠脑缺氧损伤后细胞色素c . b c l -2 表达的实验研究 月 口青 i n t r o d u c t i o n 中枢神经系统耗氧量大，代谢率高，脑组织中的组织氧和 a t p储备 少，对缺氧耐受差，是机体对缺氧最敏感的组织。脑组织以有氧代谢为 主，几乎没有无氧代谢能力;在机体发生缺氧后，对其结构和功能影响 最早，也最严重。 线粒体是细胞呼吸的主要场所， 三狡酸循环和氧化磷酸化都是在线 粒体中进行，线粒体除了通过位于其内膜的电子传递链即呼吸链 ( r e s p i r a t o r y c h a i n ) 发挥细胞呼吸的功能外， 在维持细胞正常物质代谢 及离子转运中都具有重要作用。许多研究表明，在缺氧的脑、心脏和肝 脏，线粒体功能都受到明显的抑制，线粒体损伤可能是细胞缺氧损伤的 中心环节，除了细胞缺氧后线粒体呼吸链电子传递受阻，能量代谢障碍， 细胞内离子梯度失衡等以外， 缺氧对线粒体的影响还表现为细胞色素 c ( c y t o c h r o m e c , c y t c )释放， 活性氧( r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s , r o s ) 生成， 线粒体通透转运孔开放等w 脑缺氧所致的神经元损害机制多样，一般认为坏死和凋亡是细胞死 亡的两种形式。坏死对缺氧等原因引起的细胞损伤反应迅速，在损伤后 很快出现，坏死的发生往往与c a t + , n a t + 的内环境稳定有关;相反，凋 亡是一种由基因控制的细胞主动死亡过程，需要新的蛋白质合成，以d n a 的早期降解为特征，大多表现为迟发性的神经元死亡。凋亡具有其独特 的形态学及生化特征， 包括细胞固 缩，染色质浓集，凋亡小体形成，d n a 电 泳呈梯状条带等 。 c y t c 是构成细胞呼吸链的 主要成员之一， 在线粒体复合物i i i , n之 间传递电子。 c y t c 为一种可溶性色素蛋白，其色素辅基是含铁的叶琳衍 a 前言 生物， c y t c 由 细胞核基因编码， 经细胞质核糖体翻译生成c y t c 前体， 以不依赖跨膜电 位的蛋白 质转运方式进入线粒体，并与亚铁血红素基团 共价结合形成c y t c 1 1 . c y t c 分布于线粒体内 外膜之间，并与线粒体内 膜表面松散结合。 在线粒体介导的凋亡过程中，c y t c 释放是关键步骤， c y t c 以一个完整的功能性活性蛋白释放入胞质。c y t c 释放可引起两种 后果: 一是参与 a p a f - 1 介导的 c a p a s e 激活， 弓 起快速的细胞凋亡9 。 其二， c y t c 释放可引起细胞坏死，当细胞内存在大量c a s p a s e 抑制物时，c y t c 的释放就不能介导c a s p a s e 依赖的细胞凋亡:由于c y t c 释放入胞质，线 粒体内 c y t c 减少或缺失，可直接导致呼吸链电子传递中断，继而抑制氧 化磷酸化，促进氧自由 基生成， a t p 含量减少，最后导致细胞坏死s b c l - 2 编码癌基因蛋白，最先在人类b 细胞淋巴瘤t ( 1 4 ; 1 8 ) 染色体中 发现， b c l - 2 蛋白是该家族中抗细胞凋亡成员的代表，分布于线粒体外膜 的浆膜面，内质网膜和核膜， b e 1 - 2 家族成员大都含有一个c 一 末端的疏水 结构区， 通过它与线粒体外膜结合 a b c l - 2 具有稳定线粒体膜的功能， 阻止线粒体释放促凋亡因子，维持线粒体内膜跨膜电位，抗r o s 生成。 b c l - 2家族蛋白通过多种机制与线粒体相关信号作用来调节神经细胞凋 亡。b c l 一2 通过调节线粒体外膜上的线粒体通透性转运 (c m i t o c h o n d r i a l p e r m e a b i l i t y t r a n s i t i o n p o r e , m p t p )的开放来抑制凋亡蛋邮y t c 释 放， 阻断线粒体介导的 细胞凋 亡 a b c l - 2 可使线粒体保持充分的 a t p / a d p 转换，维持细胞的有氧/ 无氧呼吸过程，以此使线粒体能量代谢损伤产生 适应性反应h 许多研究表明， 各种原因 所致脑缺氧损伤 ( 包括窒息、缺血一 缺氧 性、化学中毒性等)后，出 现神经元和胶质细胞缺失、内源性保护反应 因子以及损伤后脑对某些因子出现敏感性增高。大量动物模型实验证实 神经元缺氧性损害所致神经元死亡要经历两个独特的阶段:第一阶段的 细胞死亡发生在缺氧损伤后即刻，其产生的机制主要与自由基形成、细 前言 胞内c a 离子聚集、兴奋性毒性氨基酸、细胞毒性水肿、细胞膜坏死性溶 解相关。而且这些机制往往也在随后发生的迟发性细胞死亡中发挥作用。 第二阶段为损伤后数小时出 现的迟发性或继发性神经元死亡， 此阶段表 现为神经元缺失， 且持续时间至少7 2 小时。其发生的机制则可能与缺氧 损伤刺激诱发过度地神经细胞凋亡有关，同时活化的小胶质细胞释放细 胞毒性细胞因子也是可能的促进因素。 许多研究者发现脑缺氧或缺血一缺氧损伤后神经细胞内 都会出 现 c y t c 和b c l - 2 表达增强过程，而且脑缺氧后c y t c 及b c l - 2 的表达呈现一定 的规律性变化，且其规律性变化具有一定的时间相关性。 提示c y t c 和 b c l - 2 有可能应用于法医病理学实践中，为缺氧损伤时间的推断提供依 据。本研究的目的，旨 在复制急性脑缺氧损伤动物模型的基础上， 检测 缺氧损伤后不同时间神经元中b c l 一和c y t。 表达分布变化情况， 对b c l - 2 和c y t c 应用于法医实践检案的价值进行初步评价。以期为各种原因 所致 脑缺氧损伤时间推断以及临床脑缺血一缺氧损伤诊断、预后及治疗提供 动物实验和理论依据。 第一部分大鼠脑缺氧损伤后细胞色素c表达的实验研究 第一部分 大鼠 脑缺氧损伤后细胞色素c 表达的实验研究 细胞色素c ( c y t o c h r o m e c , c y t c ) 是一种1 2 . 3 k d a ， 细胞核d n a 编 码的可溶性蛋白， 由1 0 4 个氨基酸残基组成。 它是呼吸链中必要成分之一， 在线粒体复合体m ( 泛醇:细胞色素c 氧化还原酶) 、w ( 细胞色素氧化 酶) 之间传递电子。 c y t c 的前体在胞质的游离核糖体中合成，通过非受 体介导的过程进入线粒体外膜，并与亚铁血红素结合形成c y t c 。生成的 完整c y t c 释放入线粒体内外膜之间， 松散地结合于线粒体内 膜表面， 功 能性c y t c 通过其表面的正电荷再与细胞色素氧化酶 ( c y t o c h r o m e o x i d a s e ) 相结合。细胞色素c缺乏时， 电子传递链被阻断， 将导致两方面 的后果: a t p合成减少及不完全氧化造成的超氧阴离子( r o s )过度生成， 而r o s是诱导凋亡的重要因素。 缺氧脑损伤后神经元发生坏死或凋亡过程中， 起重要作用的不只是 线粒体呼吸活性的丧失， 更重要的是细胞色素c自 线粒体的释放。正常情 况下细胞色素c定位于线粒体膜间隙，电稳定性地结合于线粒体内膜， 不 能通过外膜。大量证据表明， 在多种损伤模型中细胞色素c 从线粒体释放 至胞质是引发细胞死亡的关键步骤。在大鼠局灶性缺血后4 小时内， 大鼠 缺血侧半球中出 现胞质c y t c 染色阳性的神经元，而对侧非缺血脑组织中 则无染色阳性神经元， w e s 七 e r n 印迹证实胞质中的c y t c 来自 线粒体19 ) 。 大 鼠 脑缺血缺氧后， 海马c a l 区迟发性死亡的神经元胞质中c y t c 升高， 而 线粒体c y t c 相应减少，均证实c y t c 释放，且c y t c 释放早于d n a 裂解， 提 示 c y t c参与了 缺血缺氧后 神经元细胞凋亡机制。 k l u c k r m 等iu 发 现， 在凋亡细胞胞浆中结合状态的 c y t c增高，因为游离的 c y t c 前体转运入 线粒体后与血红素基团结合， 胞浆出 现结合状态的c y t c 激发细胞凋亡， 这是 c y t c 自 线粒体释放入胞浆所形成的，并非c y t c 转运障碍堆积所致。 第一部分大鼠 脑缺氧损伤后细胞色素c表达的实验研究 同时，这种释放具有时间和温度依赖性， 并需要胞浆的存在。p t r i c k g . s u l l i v e n ， 等 研究 实 验性 脑 损 伤后 细胞 色素 c 释 放， 发现皮质损伤后 c y t c 的分布基表达升高具 有显著的时间相关性。 作者采用w e s t e r n b l o t 法证实，神经元胞浆中c y t c 免疫反应性在损伤后3 h , 6 h , 1 2 h , 2 4 h 呈持 续增强，7 2 h 后又有所下降， 相反线粒体中的c y t c 含量则随时间变化而 不断下降。释放的c y t c 可参与a p a f - 1 介导的c a p a s e 激活，引起快速的细 胞凋亡;另外，由于c y t c 释放入胞质，线粒体内c y t c 减少或缺失，可 直接导致呼吸链电子传递中断，继而抑制氧化磷酸化，促进氧自由基生 成，a t p 含量减少，最后导致细胞坏死。 上述研究表明，c y t c 在缺氧损伤后出现表达水平的上调，而且这种 表达上调呈现出与时间相关的规律性，说明 c y t c 在缺氧所致神经元死亡 中发挥重要作用。 本研究利用密封容器持续脑缺氧模型致大鼠脑缺氧损 伤， 用免疫组织化学染色及尼氏 体特殊技术对重度颅脑损伤后c y t c 蛋白 在脑内的分布和时 序性变化进行定 位和半定量的 观测， 研究c y t c 在脑缺 氧损伤后的表达变化规律及脑缺氧损伤的分子机制， 对c y t c 应用于法医 学检案的价值进行评价，以 期为各种原因所致缺氧脑损伤时间的推测及 临床脑缺血一缺氧损伤诊断、 预后及治疗提供理论依据。 材料与方法 1实验动物、仪器及试剂 1 . 1实验动物及分组 s p r a g u e -d a w e l y 大鼠5 5 只， 雌雄不限， 4 -6 月龄， 体重2 0 0 -2 5 0 8 , ( 由四川大学华西实验动物中 心提供) 。 5 5 只大鼠随机分为1 1 组， 每组5 只大鼠， 其中缺氧损伤组按缺氧伤 后处死时间不同又分为缺氧后即刻， 3 0 m i n , l h , 3 h , 6 h , 1 2 h , 2 4 h , 4 8 h , 7 2 h 共9 个组，另外两组为正常对照组和假缺氧对照组。 第一部分大鼠脑缺氧损伤后细胞色素c表达的实验研究 弱;面积比 指阳性信号所占视窗面积的百分比。面积比 越大，阳性反应 细胞数越多。 观察各组各器官免疫组化阳性信号表达部位、 表达强度及 变化规律。反之，灰度值越低，阳性反应越强;面积比越小，阳性反应 细胞越少。 4 数据统计分析 实验检测数据均用均数士 标准差表示。实验数据采用 s p s s 1 0 . 0 ( s t a t i s t i c a l p a c k a g e f o r s o c i a l s c i e n t i s t s )软件进行统计分析， 统计分析方法用单因素方差分析( a n o v a ) ， 组间比 较采用 9检验， 详细步 骤见结果部分。 结果 1 . 大鼠 缺氧后的行为学观察 在缺氧过程中，动物呼吸逐渐加快，逐渐出 现发给，自 主活动减 少。 7 -8 分钟时， 动物开始出现烦躁不安、 挣扎、 呼吸加深加快，口 唇、 耳轮发组更为明显， 出现翻正反射消失， 痉挛样动作和喘式呼吸， 大小便失禁。 1 0 -1 5 分钟后各种活动减少， 呈现抑制状态， 结膜充血， 眼球突出明显，严重者出现呼吸暂停。 缺氧结束后3 h ， 大鼠恢复正常呼吸， 能自主觅食及饮水。 但活动 较缺氧前及对照组有所减少，易受 惊吓。余未见明显 异常 实验中 有2 只大鼠于 缺氧终末出 现死亡，1 只大鼠 于缺氧后i 小 时死亡。 死亡的大鼠不纳入实验统计，另外再补充3 只大鼠 进入损伤 组。 2 二缺氧鼠 脑的大体形态变化 缺氧损伤组大鼠脑大体病理学改变主要是脑表面不同程度充血、水 肿:软脑膜下可见血管扩张、淤血，未见蛛网膜下腔出血改变。部分鼠 脑可见软脑膜及蛛网膜张力轻度增高，缺氧组较对照组脑回轻度增宽， 第一部分大鼠 脑缺氧损伤后细胞色素c 表达的实验研究 脑沟变浅。 3 . h e 染色结果 缺氧组 o m i n , 3 0 m i n , l h 无明显变化， 脑缺氧损伤后 6小时仅可见 脑组织水肿，表现为毛细血管扩张，血管周围间隙增大，脑组织疏松， 胶质细胞水肿， 偶可见镜下蛛网膜下腔红细胞渗出; 2 4 -4 8 h 镜下可见神 经元出现明显的缺氧坏死改变:主要表现为神经元变形、变性，细胞核 深染、固缩，拉长或呈三角形 ( 照片1 -1 ) ， 有的神经元胞核变小，核仁 消失， 染色质浓缩边集于核膜下， 使核呈环状; 有的可见核变小，深染， 甚至核碎裂，表现为细胞凋亡的形态结构变化。深部皮层、海马部分神 经细胞肿胀，嗜酸性气球样变，胞浆变空，核淡染，核膜及核仁完整; 海马c a i 区及齿状回神经细胞数目减少。缺氧后7 2 小时，脑水肿现象有 所减轻，少量神经胶质细胞增生 ( 照片1 -2 ) 。正常对照组和假缺氧对照 组未见明显改变。 4 .尼氏体甲苯胺蓝特殊染色结果 神经元的n i s s l 体是神经元在缺氧时首先发生变化的结构之一，当神 经元变性时，尼氏小体的变化甚为敏感， 假缺氧与正常对照组大鼠脑组织 神经元胞浆中布满着深蓝色呈颗粒状的尼氏 体 ( 照片1 -3 ) ;缺氧组皮层 及 海马 神 经 元 胞 浆内 尼氏 体 着 色 浅 淡 ， 尼氏 小 体 形 态 模糊 或消失， 有 不 同 程度的溶解和脱失， 尤其以 海马 c a i 区神经元为甚。 缺氧损伤后3 h 即可 观察到海马神经元核周尼氏体减少，皮层神经元亦可见尼氏体部分消失， 缺氧后2 4 -4 8 h 改变较为明显 ( 照片1 -4 ) 。观察结果显示，与正常对照 组及假缺氧组相比，缺氧损伤组皮质神经元及海马c a i 区锥体细胞缺失明 显。 5 . 缺氧损伤后c y t c 的 免疫组织化学染色结果 5 . 1 c y t c 免疫组织化学阳 性染色 免疫组织化学染色阳 性信号主要出 现于 神经元细胞胞浆内， 胶质细 1 9 第一部分大鼠 脑缺氧损伤后细胞色素c表达的实验研究 胞内 亦有少量表达， 呈棕黄色颗粒状。 正常神经细胞胞浆中的c y t c 因定 位于线粒体内，在胞浆中呈点状分布， 对照组皮层、海马、丘脑中为点 状的阳性信号表达，呈弱阳性。缺氧损伤组阳性信号