（光学专业论文）纳米光镊技术研究.pdf

中国科学技术大学博士学位论文摘登 摘要 光镊在它问世之初是被看作微小的宏观粒子( 微米量级) 的操控手段。经过 十余年的发展，它超越了这一界限，在生物大分子的操控、静态力学性质和在生 命过程中的动力学行为的研究方面做出了令人瞩目的成果。以纳米光镊技术为核 心的单个生物大分子的操控与检测技术，具有重大的应用前景，是一项正在蓬勃 发展中的新兴技术。 本论文围绕我们课题组所承担的“纳米光镊技术和装置研究”课题开展研究， 探讨了纳米光镊系统的设计理论，完成了具体装置的研制，从理论和实验对相关 的单元技术进行了详细的研究。 对生物大分子及他们之间的相互作用的研究，需要对多个生物大分子进行复 杂的协调的精细操作和高精度的测量。为此我们确定了所要研制的系统是包含有 三个光镊的，具备纳米操作精度的光镊系统。因而多光镊耦合及其纳米精度的定 位与操作是光路设计的重点。我们实现了光镊纳米精度的三维操作，特别是针对 主动操作方式作了详细讨论，给出了理论上最佳的三维操控光路设计与相关参 数：在理论分析的基础上，结合具体实验要求，设计并完成了纳米光镊装置的光 路和与之密切相关的操控系统，使得系统具有良好的操作性能，可实现纳米精度 的操作，并且保证了系统具有较大的操作范围。在光路设计中，我们发展了种 新的、实用化的环形光镊技术，并成功的应用于所研制的纳米光镊系统中，提高 了光镊的捕获效率，并且缩小了阱域，使系统的捕获效果和操作精细程度都得到 了提高。 要观测和研究生物大分子在活的生命过程中的行为，跟踪过程随时间的演 变，要求测量的空问分辨精度达到纳米量级、时间分辨精度达到毫秒。单一的探 测方法无法很好的同时满足这两个要求。为此，在我们研制的装置中，采用了双 路探测系统一四象限探测器和c c d 图像相关分析，结合它们在位移测量方面各自 的优点，使得光镊系统兼有高的空间分辨能力和时间分辨能力，达到了纳米和亚 毫秒精度。 对于纳米光镊系统，提高位移测量精度一直是人们追求的目标。在探测系统 的研制中，本文从原理、设计和测量误差等方面对两种方法均作了详细的分析： 中国科学技术火学博上学位论文摘要 改进了四象限探测器的电路和算法，减小了方法误差，引入光镊背向散射光技术 提高了信噪比，使得位移测量精度得到了提高：将图像相关分析方法用于对光镊 所捕获样品的动态过程分析，该方法有效地抑制了杂波信号和非目标信号的影 响，达到了更高的位移测量精度。并且建立了一套数值模拟方法，对相关图像分 析法的噪声影响进行了评估。纵向位移的测量是光镊技术的难点，我们在四象限 探测器中采用背散射光技术实现了纵向位移探测，并且第一次将图像信息熵概念 引入到动态图像分析中，实现了纵向位移测量。 光阱刚度表征了光镊的捕获特性，是进行生物大分子力学量测量的基础参 数。本文通过实验对比了光阱刚度的四种测量方法：流体力学法、外加周期驱动 力法、热运动分析法和功率谱法，为微小力测量奠定了基础。对较常用的光阱刚 度测量方法热运动分析法，我们提出了用蒙特卡罗模拟计算的方案，分析了 测量系统带宽对测量精度的影响，为采集系统设计提供了重要参考依据。利用所 建立的纳米光镊系统，分析了光阱刚度与实验条件的依赖关系，它是进行微小力 测量所必须考虑的影响因素。而且通过给出该系统中h e n e 光镊的测力分辨精度、 范围等参数，即对该光镊系统进行了标定，使得它成为了力学量研究的重要工具。 作为一套实用化的纳米光镊系统，通过初步的应用研究，表明该系统达到了 研究目标和设计精度。它可进行纳米精度的三维操控，并且能够实现纳米精度的 位移测量和微小力的测量。位移分辨精度可达亚纳米，测力分辨精度可达几个飞 牛顿，范围可达几个皮牛顿。该技术指标在国内领先，达到了国际先进水平。 关键词：光镊、环形光镊、光学微操作、位移测量、微小力测量、光阱刚度、纳 米光镊技术 中国科学技术大学博士学位论文摘要 a b s t r a c t o p t i c a l t w e e z e r sw a sc o n s i d e r e da sam a n i p u l a t i o nt o o lf o r m i c r o s p h e r e sw h e nit w a sj u s ti n v e n t e d h o w e v e r ，i th a sg o n eb e y o n dt h i s 1i m i ta f t e r1 e s st h a n t w e n t yy e a r s t h e r e h a v e b e e ns o m e i m p o r t a n t a c h i e v e m e n t si nt h er e s e a r c hf i e l do fb i o m o l e c u l e s s u c ha si t s m a n i p u l a t i o n ，s t a t i ca n dd y n a m i cm e c h a n i c a lb e h a v i o r s ，b yu s i n go p t i c a l t w e e z e r s a st h ec o r eo fm a n i p u l a t i o na n dd e t e c t i o nt e c h n i q u e so fas i n g l e b i o m o l e c u l e ，t h en a n o o p t i c a l t w e e z e r st e c h n i q u e h a ss h o w n g r e a t p o t e n t i a lf o ri t sf u t u r ea p p l i c a t i o na n db e c o m e sam o r ea n dm o r ei m p o r t a n t t e c h n i q u e i nt h i st h e s i s ，w h i c hi sb a s e do nm yw o r ko no u rp r o j e c t “t h ed e s i g n a n dd e v e l o p m e n to fn a n o o p t i c a l 一t w e e z e r ss y s t e m ”，t h ep r i n c i p l eo ft h e s y s t e md e s i g n w a s a n a l y z e d a n dd i s c u s s e d ，b a s e do nt h e a n a l y s e s a n a n o o p t i c a l t w e e z e r ss y s t e m w a sc o n s t r u c t e d a tt h es a m et i m e ，t h e i n v o l v e d k e yt e c h n o l o g i e s w e r e d e e p l y s t u d i e d t h e o r e t i c a l l y a n d e x p e r i m e n t a ll y t os t u d yb i o m o l e c u l e sa n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e ma t s i n g l e m o l e c u l el e v e l ，i ti sn e c e s s a r yt oc o n t r o la n dt om a n i p u l a t et h e ma n dt o m e a s u r et h e d y n a m i c s o ft h e i rm o t i o nw i t h h i g hp r e c i s i o n s o t h e m a n i p u l a t i n ss y s t e mm u s tb eam u l t i p l eo p t i c a l t w e e z e r sf o rp e r f o r m i n g c o m p l e xm a n i p u l a t i o n f o rt h i sp u r p o s e w ed e s i g n e da n dc o n s t r u c t e dat h r e e o p t i c a lt w e e z e r ss y s t e mw i t hn a n o m e t e rp r e c i s i o n o n eo ft h ek e yp r o b l e m s f o rs y s t e mc o n s t r u c t i o ni st h ep r o p e rc o u p l i n go ft h e s eo p t i c a lt w e e z e r s ， w h i c hs h o u l de n s u r en a n o m e t e rp r e c i s i o no ft h em a n i p u l a t i 0 1 1 t h et h r e e d i m e n s i o n a lm a n i p u l a t i o no fo p t i c a lt w e e z e r s ，e s p e c i a l l yf o rt h ea c t i r e s c a n n i n g ，w a sd i s c u s s e di n d e t a i l t h eo p t i m a ld e s i g np a r a m e t e r sw e r e d e d u c e dt h e o r e t i c a l l y b a s e do nt h et h e o r e t i c a ld e s i g na n de x p e r i m e n t a l r e q u i r e m e n t s ，t h eo p t i c a l l a y o u t a n d s c a n n i n g m e t h o d so f n a n o o p t i c a l t w e e z e r ss y s t e m ，w h i c hh a sh i g hm a n i p u l a t i o np r e c i s i o na n d l a r g ee n o u g hm a n i p u l a t i o nr a n g e ，h a sb e e nd e s i g n e da n dr e a l i z e d i nt h e s y s t e m ，t h ed o n u tb e a mw a su s e df o rt h ef i r s tt i m e i th e l p st oi m p r o v e t h et r a p p i n ge f f i c i e n c y ，r e d u c e st h et r a p p i n gf i e l d ，a n di m p r o v e st h e m a n i p u l a t i n gc a p a b i l i t ya n dp r e c i s i o n i l l 中国科学技术大学博士学位论文摘要 i no r d e rt oo b s e r v ea n dt of o l l o wt h em o t i o no fb i o m o l e c u l e sw i t hh i g h p r e c i s i o ni nt i m ea n di nd i s p l a c e m e n t ，ac o m b i n e dm e a s u r i n gs y s t e mw i t h o da n dc c da sd e t e c t o r w a sp r o p e r l yi n s t a l l e di nt h et w e e z e r s w h i c hs o l v e d t h e p r o b l e m t h a tn o s i n g l e d e t e c t o rc a n s a t i s f y b o t hd e m a n d s t h e p e r f o r m a n c eo ft h e s et w od e t e c t o rs y s t e m sc o m p e n s a t e dw i t he a c ho t h e r ， w h i c he n s u r e dt h a ta saw h o l et h e o p t i c a l t w e e z e r s c a nm e e tt h e r e q u i r e m e n t so nt h em e a s u r e m e n tp r e c i s i o nb o t h i nt i m ea n di n s p a c e a n o t h e rm a i nt o p i co fm yt h e s i si st oi m p r o v et h ep r e c i s i o no ft h e m e a s u r e m e n t ，w h i c hi saf o c u sp o i n tf o rt h en a n o o p t c i a l t w e e z e r s t h e s e t w om e a s u r i n gs y s t e m sw e r ea n a l y z e di nd e t a i la n daf e wn e wm e t h o d sw e r e d e v e l o p e d t od e a lw i t hn o i s ea n de r r o r a n a l y s i s ，w h i c hi m p r o v e d t h e r e s o l u t i o no ft h es y s t e m t h es p a t i a lp r e c i s i o nr e a c h e ss u b n a n o m e t e ra n d t h et i m e p r e c i s i o n r e a c h e ss u b m i c r o s e c o n d t h e s e n e w l yi m p r o v e d t e c h n i q u e si n c l u d e s ：l o wn o i s ea m p l i f i e ra n dd i g i t a ls i g n a l t r e a t m e n t c i r c u i to fq d s i g n a l ：t h eb a c k s c a t t e r i n g m e t h o df o r d i s p l a c e m e n t m e a s u r e m e n t ，w h i c hi m p r o v e s t h e s i g n a l t on o i s er a t i oa n dt h e r e s o l u t i o n ；t h ec r o s s c o r r e l a t i o nm e t h o dw a su s e di nt h ed y n a m i ci m a g e a n a l y s i sa n dg r e a t l yi m p r o v e dt h er e s o l u t i o no fd i s p l a c e m e n tm e a s u r e m e n t i nc c di m a g ea n a l y s i ss y s t e m ；t h ei n f o r m a t i o ne n t r o p yw a sf i r s t l yu s e d i no p t i c a lt w e e z e r st e c h n o l o g yf o rd y n a m i ci m a g ea n a l y s i s ，w h i c hs o l v e s t h ed i f f i c u l t yo fo p t i c a lt w e e z e r si nt h ea x i a ld i s p l a c e m e n tm e a s u r e m e n t w ea l s op u tf o r w a r dan u m e r i c a ls i m u l a t i o nm e t h o dt oe v a l u a t et h ee f f e c t o fn o i s eo nt h ep r e c i s i o ni nc c di m a g ea n a l y s i sm e t h o d t h et r a ps t i f f n e s si saf u n d a m e n t a lp a r a m e t e ro fo p t i c a lt w e e z e r sf o r m e c h a n i c sa n a l y s i so fb i o m o l e c u l e s i nt h et h e s i s ，f o u re x p e r i m e n t a l m e t h o d so ft r a ps t i f f n e s sm e a s u r e m e n tw e r es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e da n dt h e d e p e n d e n c e o ft h e t r a ps t i f f n e s s t ot h e e x p e r i m e n t c o n d i t i o n si s d e t e r m i n e d 。w ea l s ou s e dt h em o n t ec a r l os i m u l a t i o nt oa n a l y z et h e i n f l u e n c eo fd e t e c t i o ns y s t e mb a n d w i d t hf o rt h ef i r s tt i m e s o m e p r i m a r y a p p l i c a t i o n s h a v eb e e nd o n e u s i n g o u r n a n o o p t i c a l t w e e z e r ss y s t e m t h er e s u l t si l l u m i n a t et h a tt h es y s t e mi s t v 中国科学技术人学博十学位论文 摘要 s u c c e s s f u l l yd e s i g n e da n dc o n s t r u c t e dw i t ha d v a n c e dp e r f o r m a n c e i tc a n m a n i p u l a t es p e c i m e n w i t hn a n o m e t e rp r e c i s i o ni nt h r e ed i m e n s i o n s ，m e a s u r e i t sm o v e m e n tw i t hs p a t i a lr e s o l u t i o no fs u bn a n o m e t e ra n dt i m er e s o l u t i o n o fs u b m i l l i s e c o n da n dm e a s u r et h ew e a kf o r c ee x e r t e do n i tw i t ht h e a c c u r a c yo fs e v e r a lf e m t o n e w t o n s k e yw o r d s ：o p t i c a lt w e e z e r s ，d o n u to p t i c a lt w e e z e r s ，o p t i c a lm a n i p u l a t i o n ， d i s p l a c e m e n t m e a s u r e m e n t ， w e a kf o r c e m e a s u r e m e n t ，s t i f f n e s s ， n a n o p t i c a l t w e e z e r s v r 1 固科学披术人学博i j 学位论文绪论 第一章绪论 1 1 纳米光镊技术发展的科学背景 在科学迅猛发展的今天，单一学科的研究已不能适应科学自身发展的逻辑和 满足生产发展的需求。数、理、化、生等大学科间多学科、多角度的交叉联合研 究已成为当今自然科学发展的大趋势。尤其是，生命科学的发展不断向数学、物 理、化学等学科提出更多，更深层次的新问题、要求发展新概念和开拓新研究领 域。开发新的实验技术，方法和手段当然是其重要方面，新的实验手段往往成为 学科交叉的切入点，新研究方向的生长点。 纳米科技和生命科学被公认为是二十一世纪最有前途的领域，纳米生物学正 是这二大领域交叉的产物。所研究的纳米生物体系主要是生物大分子及其复合 体。生命科学的发展已经深入到生物大分子层次，提出了对具有生命活性的单个 生物大分子在生命过程中的行为进行研究的需求。即从生物大分子群体行为的研 究深入到对单个生物大分子及其聚集体的行为的研究，从而更深入的认识生命过 程的本质。已经提出了一些急待解决的、具有重要科学意义的生物单分子水平的 科学问题。另外一方面，物质在纳米尺度时，常具有既不同于宏观，也不同于微 观的所谓介观性质，这同样会在生物大分子层面上有充分的表现。可以预期，生 物单分子的研究将促成生命科学革命性的发展，并将广泛应用于生物、医学、农 学等领域，成为2 1 世纪生命科学领域的一个重点研究方向。这是分子生物学的 自然延伸和必然趋势。这种新形势需要物理、化学、数学等基础科学发展适应生 物单分子水平研究的新理论，新技术和新方法。 归根到底，对生物大分子的个体行为的研究无非是搞清其结构和功能。光学 显微术、x 一射线分析术、电子显微术、激光共聚焦显微术以及扫描探针技术等， 使人们对生物对象的空间结构有了越来越精细的了解。目前人们已经可以“看到” 它的静态原子排布，乃至电子的分布图像。然而，生命最本质的特性是具有活性。 它表现为生物的新陈代谢、生长发育、繁殖、遗传与变异、运动与感应等运动过 程。对于生命的了解，莫过于在活的生命状态中研究这一系列的运动演变，才能 揭示生命的本质。要在生物大分子个体水平上搞清它们在生命过程中的行为和功 能，这些手段有相当大的局限性。例如电镜，必须将细胞及相关分子经化学方法 中旧科学技术人学博士学位论文 绪论 处理固定后进行观察，此时，“生命活动”已经“中止”，展现的只是各阶段的非 连续性片段，更无法观察反应体系作用后将发生什么。 要对生物大分子在生命过程中的行为和功能进行实验研究，包括构象变化、 相互识别、相互作用等，以及在此基础上对生命过程的调控，必须要有合适的实 验手段。这种手段首先要能按照我们的愿望操纵和排布分子，又不造成损伤和对 它周围环境的干扰，从而可以跟踪观察它们在真实生命活动中的元过程，进行深 入的研究。同时又能对过程中的有关参量进行定量测量。光镊技术恰恰在这一点 上，比之众多先前的实验手段，具有不可比拟的优势。 1 2 纳米光镊技术一新兴的纳米生物技术 生物大分子的尺度为纳米量级，对它们的操控以及它们在动态过程中涉及的 位移测量应达到纳米精度，相互作用力的检测应为皮牛顿量级。要完成这样的研 究目标，即在单分子水平上探索生命运动的规律，必须发展相应的物理技术和方 法，特别是单个生物大分子的纳米精度操控与定位、纳米位移测量和皮牛力监测。 1 9 8 6 年光镊问世以来，短短十余年，光镊技术已从微米精度的操控与探测 发展到了纳米精度的操作与探测“删。技术上的这一跨越，集中表现在纳米精度 的位置操控和纳米精度的位移测量上。这一跨越的意义不仅仅是技术上迈入了一 个新的高度，而且从光镊技术的实际应用来看，也因此有了质的变化，成为研究 单个生物大分子在生命过程中的行为的有效工具，种重要的纳米生物技术。这 种纳米精度的光镊技术已经趋于成熟，成为一种具有独立内涵和外延的技术领 域。因而我们把它称之为纳米光镊技术。 尽管光镊技术本身在结构细节的分辨上，不能超越光波长的限制，但是由于 它兼具对个体进行“遥控”操作和静态动态力学量测量的独特优势，光镊技术往 纳米领域拓展、应用于单个生物大分子的行为与功能的研究，一直是人们孜孜以 求的目标。经过不同学科研究人员十余年的努力，新兴的纳米( 精度) 光镊技术 已经成长起来。 纳米光镊技术的标志性特点： 1 所能操控对象的尺度延伸到了纳米量级 能否操控纳米量级的粒子是纳米光镊技术首先要解决的问题。已经发展了多 2 中国科学技术火学博士学位论文 绪论 种方法来操控生物大分子，从而可以研究它们间的相互作用和运动特性。原则上 光镊可以直接操控小到数十纳米大小的微粒，但这样的微粒无法在光学显微镜下 辨认，人们采用了染色或荧光标记等办法以便于识别和操控这些微粒。特别是， 人们发展了一种生物分子的间接操控法，即采用光镊可以方便地操控的微米粒子 作为所谓的“手柄”，将生物分子粘附 其上，光镊操控这样的“手柄”就相当 于操控了生物分子”1 。图1 1 为这种操 控的示意图。聚苯乙烯小球表面黏附了 驱动蛋白，通过光镊操控小球，间接操 图1 1 ：光镊间接操作生物大分子 作驱动蛋白，研究它与微管的相互作用。 2 光镊阱位或微粒的操控定位达到纳米精度 作为一种单个生物大分子的操控以及在分子水平上研究生命过程的技术手 段，其操控定位精度当然要与大分子的尺度相当。在光镊技术中已经发展了一些 方法，可以实现精确的操控定位。例如用压电转镜叫1 或声光偏转器偏转光束“3 ， 实现光镊阱位的移动；也可用纳米精度的压电扫描驱动器移动样品池，而光镊不 动，因而样品池中被光镊捕获的微粒也固定不动，这也同样可以实现微粒相对样 品池的运动。这些方法的操控精度都可以达到纳米、亚纳米精度。 3 位移测量达到纳米精度 同样，无论是生物分子的识别还是生物分子的运动( 或位移) 都必然牵涉到 纳米量级精度的位置和位移的测定。在纳米光镊技术中，生物大分子位移的测量 是通过测量操控“手柄”一刚性微米小球的位移间接测量的。成像光学方法分辨 能力受波长限制，但刚性小球的定位精度可以达到纳米量级。常用的方法有四象 限位置探测法和c c d 图像相关分析法等n 3 。 4 可进行飞牛( f n ) 到皮牛( p n ) 量级的微小相互作用力的实时测量 在生物大分子水平，力学量是生命过程的重要参量。分子的力学性质、分子 间的相互作用都涉及皮牛量级的力。光镊恰好同时是力的探针，能够实现微小力 的测量。由于力非常小，测量的精度依然还是个问题，但是已经建立了几种方法。 通常，最大阱力采用流体力学法”1 ，也即测出光镊在液体中操控微粒所能达到的 最大速度，此时阱力与液体对小球的粘滞力相平衡。由此即可算出这一阱力：而 中国科学技术人学博士学位论文绪论 光镊中心附近，势阱很类似于简谐势， 则可用流体力学法或热运动分析法嘲 等方法确定光阱的刚度一类似于弹簧 的倔强系数。测出被捕获的微米小球偏 离光阱中心的距离，就可得出小球受到 的阱力，如图l 2 所示a 光镊对微小力 图1 2 ：光镊测力示意图 的测量范围可从飞牛到数十皮牛。 1 3纳米光镊技术在纳米生物学中的应用 光镊在它问世之初是被看作微小的宏观粒子( 微米量级) 的操控手段。光镊 的发明人a s h k i n 当时就敏锐地觉察到光镊在生命科学中的意义，他预言光镊“将 细胞器从它们正常位最移去的能力，为我们打开了精确研究细胞功能的大门”。 然而仅十余年的发展，光镊技术就超越了这一界限，在生物大分子的操控、静态 力学性质和它在生命过程中的动力学行为的研究方面做出了令人瞩目的成果。 这里按纳米光镊技术的特有功能，分几个方面给出一个概要的应用介绍： a 研究生物大分子的静态力学特性 通过光镊对单分子进行扭转、弯曲、拉伸等操作。研究其力学特性，是研究 较多的方向。例如，单个d n a 分子在光镊拉力作用下的非线性弹性拉伸应变的实 验研究n 3 ，这为研究单个d n a 分子构型提供了进一步的实验基础。再如，用光镊 测量了微管的刚度和驱动蛋白的扭转刚度。 b 研究生物大分子的动力学特性 光镊在生物大分子研究中晟重要的成果之是动力原蛋白的研究”1 。科学家 利用光镊观察到了生命运动的元过程，发现分子马达是以步进方式运动，并且测 量了其运动步长，单个驱动蛋白分子产生的力以及单个驱动蛋白的速度与a t p 浓度的函数关系。还利用光镊研究了肌动蛋白丝与单个肌球蛋白分子间的相互作 用凹1 ，测量了没有a t p 水解时单个肌球蛋白分子和肌动蛋白纤维分离时所需的力。 单个分子运动实验引发了对运动详细模型、a t p 水解环、单酶动力学的深入研究。 光镊逐渐成为一种研究分子动力结构的重要技术手段。 我国在利用光镊技术开展生物大分子层次的研究上也有了初步探索，例如测 中国科学技术大学博卜学位论文绪论 量了与生物免疫有关的大分子一抗体抗原间的相互作用 1 1 1 。 伴随纳米光镊技术的发展，一个新的研究分支一分子力学正在形成。预期将 推进分子机械学、分二子水平仿生优化设计等一系列研究。 c 对生物大分子进行精细操作 例如，日本和美国的科学家采用双光镊实现了d n a 分子( 2 纳米直径) 的扭 转、打结，这表明分子操作达到相当高的水平，为细胞内蛋白纤维相互作用等分 子力学的研究开辟了新的途径“。 d 分子水平上的特异性识别和生命过程的调控 以往对细胞或单分子的观察依赖于“微粒”之间自由运动而随机“配对”或 “配群”，无法进行“科学设计”，限制了研究的深度和广度。利用光镊技术可以 将拟观察“对象”或“对象们”以研究者的意愿进行“配对”或“配群”并观察 “配对”或“配群”后的新变化。这种操控使得生物微粒个体行为的研究真正从 “观测”上升到“科学实验”。特别是纳米光镊技术所具有的纳米量级的操控精 度和观测精度，使得这种“配对”的定位精度达到了分子尺度。这使人们能在纳 米精度上实时动态的研究诸如天然杀伤( n k ) 细胞特异性识别中的单分子机制并 显示其特异性相互作用，从而为解开细胞特异性分子识别之谜提供微观基础和新 的信息。 e 纳米生物器件的组装 例如，中国科技大学激光生物实验室首次实现用光镊排布微粒，形成稳定的 空间结构，这为生物器件的组装提供了一种可行的途径“。 这些初步的应用成果充分说明，纳米光镊技术必将发展成为一种重要的纳米 生物技术。 展望未来，我们预期纳米光镊技术将首先在下列问题的研究中得到应用： a 免疫调节中及其它配体一受体特异性分子识别的单分子机制及其意义 b 马达蛋白分子的运动特性研究 c 单分子水平的生物信号转导：揭示活细胞内分子一分子间生物信号传导 的动力学机制及生物学效应。 d 生物大分子的操控与排布，生物微器件的探索 中国科学技术大学博l 学位论文绪论 e 细胞与生物分子的力学性质研究 f 生物大分子问特异性相互作用的实验研究 光镊技术的进一步发展将是与具有高空间分辨本领的技术相结合，使之同时 具备精细的结构分辨能力和动态操控与功能研究的能力。预计这种结合将首先在 纳米光镊技术与扫描探针技术之间。纳米光镊技术作为一种操控手段还必将与其 它的测试手段相结合，如微弱荧光探测技术，膜片钳技术，扫描共焦显微术等。 这将使纳米光镊技术在生物学研究领域中得到更广泛、更深入的应用。 1 4 开展纳米光镊技术研究的意义 综上所述，一个物理与生物高度交叉、新实验技术和方法与重大生物学基 本问题相结合的纳米生物学领域正在兴起。以纳米光镊技术为核心的单个生物大 分子的操控与检测技术，在这新兴领域起着日益重要的作用。纳米光镊技术是 光镊技术发展中的一个新高点，是一项富有活力的新兴技术，是知识创新和技术 创新的源泉，新的规律、新的发现将为新理论的建立打下基础，给基础科学的发 展提供了新的机遇。 鉴于纳米光镊技术在研究生物大分子的个体行为和它在生命过程中的作用 方面的重要性，受到科技界的广泛关注，成为国际科技界的一大热点。国外一些 著名的大学和实验室都已经或计划开展这方面的研究，并已取得些原创性的研 究成果。例如美国斯坦福大学、普林斯顿大学、哈佛大学、伯克力大学、m i t 等， 德国欧洲分子生物学实验室、英国约克大学、日本庆应大学、丹麦哥本哈根尼尔 斯玻尔实验室等都已经在这个领域上进行了初步的探索。国内还有中国科学院北 京物理所等也在开展该方向的研究 l 3 1 o 这方面的研究也得到国内科技界的重视，已经纳入我国多个国家重点研究计 划。国家自然科学基金委早在1 9 9 7 年就列项支持生物与物理交叉课题“近场光 学研究生物大分子”( 1 9 9 8 - - 2 0 0 2 ) 的重大基金项目。在2 0 0 2 年支持的重大基金 项目中又把有关纳米光镊技术的研究作为其重点研究内容。在2 0 0 2 年支持的有 关纳米科技的重大研究计划中，也把它作为一个长远发展方向列入申请指南。有 关光镊的技术，装置和应用的研究也得到8 6 3 、9 7 3 等国家计划的关注和支持。 6 中田科学技术人学博卜学位论义绪论 中科院专门成立了纳米中心，纳米光镊技术也被列入其中。纳米光镊技术的研究 和开发还得到许多地方科技管理部门的重视。可以预期，纳米光镊技术必将在我 国有一个大的发展。 由于纳米光镊技术是一项正在发展中的新兴技术，装置复杂，技术要求高， 涉及多路光耦合、纳米精度的操控与测量、高分辨图像处理、微小力的测量( p n ) 、 显微成像技术、高灵敏低噪声电子技术和计算机技术等不同技术领域。如此高新 技术密集型装置所需投资也是非常可观的。目前国际上还只有少数实验室拥有此 类实验装置。 本课题所研制的纳米光镊系统正是在这一背景下，受到国家自然科学基金、 中国科学院纳米中心的大力资助，以满足我国纳米科技和生命科学单分子研究的 需要，提高我国在这一领域的研究水平，推动我国纳米科技和生命科学的进步。 尤其是国外尚无产品生产之时，研究具有我国自主知识产权的装置，有利于提高 我国高端科研装备的研制水平和国际竞争能力。 1 5 本文主要内容简介 本论文主要围绕我们课题组所承担的“纳米光镊技术与装置”研究课题开展 研究，探讨了纳米光镊装置的设计原理，研制了一台整机化的实用化的纳米光镊 装置，通过对相关的单元技术的理论与实验研究提高了装置的性能，并利用所研 制的装置开展了初步的应用研究。 在第三章中，详细分析了纳米光镊装置的光路设计。从部件选择、光镊形成 到多光镊耦合和光镊的三维自由操控等方面进行了分析研究，给出了理论上最佳 的光路设计与相关参数，并根据实验要求建立了纳米光镊装置的基本光路；作为 首次应用到纳米光镊技术中的重要单元技术一环形光镊在第四章得到了深入的 探讨。 纳米光镊技术的核心技术是纳米位移的测量和微小力的测量。第五章分析了 测量光镊中的微米小球的纳米量级位移的两种方法：四象限探测器法和c c d 图像 分析法，使纳米光镊系统能兼有高的空间分辨能力和时间分辨能力。我们从原理、 设计和测量误差等方面对两种方法均作了详细的研究；第六章中研究的是如何实 现光镊应用中所涉及到的微小力的测量。并且通过实验，对实现微小力测量的重 【 j 闺科学技术人学博士学位论文绪论 要参数一光阱刚度的不同测量方法进行了比较研究。在该章中，还通过理论分析 和模拟讨算，研究了测量系统带宽对热运动分析法测量光阱刚度的影响。并且基 于我们设计建立的纳米光镊装置，从实验上研究了光阱刚度随实验条件变化的规 律，给出了测力精度、范围等重要参数。 在上述研究工作的基础上，我们建立了一套性能优良的实用化的纳米光镊装 置。它配备有三个光镊，可操控捕获粒子进行复杂的三维操作，能够对被光镊所 捕获的微米小球进行纳米精度的位移测量，和对该过程中所涉及到的微小力进行 测量，测力精度可以达到几个飞牛顿，测量范围可以达到几个皮牛顿。采用该装 置，我们进行了一些初步的应用研究工作。 生里! ! 兰苎查查堂坚圭兰垡笙苎 堕堡 本章参考文献 l ，李银妹，光镊原理、技术雨i 应用中国科学技术大学出版社1 9 9 6 ， 2 f i n e r ，j t ，s i m m o n s ，rm ，s p u d i c h ，j a s i n g l em y o s i nm o l e c u l em e c h a n i c s ： p i c o n e w t o nf o r c e sa n dn a n o m e t r es t e p s n a t u r e ，1 9 9 4 ，3 6 8 ：1 1 3 - 1 1 9 3 ht c h e r t ，y m l i ，l r l o u ，h w w a n g i l l g hp r e c i s i o nm e a s u r e m e n t si na no p t i c a l t w e e z e r sf o r s t u d y i n gs i n g l eb i o m o l e c u em o t i o n p r o c e e d i n g so fs p i e ，2 0 0 2 v 0 1 4 5 3 6 ：7 5 8 1 4 r o b e r tm s i m m o n s ，j t f i n e r ，s c h ue ta 1 q u a n t i t a t i v em e a s u r e m e n t so ff o r c e a n dd i s p l a c e m e n tu s i n ga no p t i c a lt r a p b i o p h y s i c a lj o u r n a l1 9 9 6 7 0 ：1 8 1 3 1 8 2 2 5 尹良红，李银妹，楼立人，张达，陈洪涛空心新型光阱的实验研究中国激光2 0 0 3 ， 3 0 ( 3 ) ：2 1 1 2 1 5 6 f 1 0 r i ne 一l ，p r a l l ea ，s t e l z e rehk ，h s r b e rj k h p h o t o n i cf o r c em i c r o s c o p e c a l i b r a t i o nb yt h e r m a ln o is e a n a l y s i s ，a p p l p h y s a ：1 9 9 8 ，6 6 ：$ 7 5 一$ 7 8 7 c b u s t a m a n t e ，s s m i t h ，j l i p h a r d t ，d s m i t h s i n g l e m o l e c u l es t u d i e so fd n a m e c h a n i c a c u r r e n to p i n j o ni ns t r u c t u r a lb i o l o g y2 0 0 0 1 0 ：2 7 9 2 8 5 8 s v o b o d a ，k ，c fs c h m i d t b js c h n a p p ，a n ds mb l o c k d i r e c to b s e r v a t i o no fk i n e s i n s t e p p i n gb yo p t i e a lt r a p p i n gi n t e r f e r o m e t r y n a t u r e ，1 9 9 3 ，3 5 5 ：7 2 1 7 2 7 9 v e i g e lc ，c o l n c c i ol m e ta 1 t h em o t o rp r o t e i nm y o s i n ip r o d u c e si t sw o r k i n g s t r o k ei nt w os t e p s n a t u r e ，1 9 9 9 ，3 9 6 ：5 3 0 5 3 3 l o 周辉，李先锋，李银妹，楼立人等光镊技术测量抗体抗原太分子结合力新方法的建 立生物化学与生物物理学进展2 0 0 1 ，2 8 ( 6 ) 1 i y a r a i ，ry a s n d a ，k i a k a s h i ，e ta l t y i n gam o l e c u l a rk n o tw i t ho p t i c a l t w e e z e r s n a t u r e ，1 9 9 9 ，3 9 9 ：4 4 6 4 4 8 1 2 s h e n g h u ax u ，y i n m e il i ，l i r e nl o u ，h o n g t a oc h e n ，z h i w e is u n s t e a d yp a t t e r n s o fm i c r o p a r t i c l e sf o