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利用r a p d技术对我国主要养殖的罗非鱼种质鉴定研究 摘要 摘要 本文采用随机引物扩增多态性d n a ( r a p d ) 分析技术， 以尼罗罗非鱼( o . n i l o t i c u s ) , 奥 利亚罗 非 鱼 ( o . a u r e u s ) 及尼罗罗非 鱼“ 吉 富品系” 中5个子 代雄 性率不同的亲本组合为材料，检测了其基因组 d n a多态性，对这些我国主要 养殖的三个罗非鱼种类的种质鉴定进行了初步的研究。选用的2 0 个 1 0 碱基引 物中，1 8 个引物可获得扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳分离后，共检测出9 3 7 条 d n a片段，平均每个引物对不同的实验材料可扩增出 5条片段。其中 9个引 物产生了清晰的多态性图谱，共扩增出4 7 7 条片段，占总扩增片段的5 1 %。引 物 s i l l 、引 物 s 1 1 2 、引 物 s 1 1 8 、 引 物 5 1 4 3可分别对尼罗罗非鱼、 奥利亚罗 非鱼及尼罗罗非鱼“ 吉富品系” 扩增出特异性图谱， 可以用于上述种类的鉴别。 根据r a p d数据， 用n t s y s 软件计算出种类之间的相似系数， 并利用u p m g a 算法构建了谱系树。结果表明:尼罗罗非鱼和尼罗罗非鱼 “ 吉富品系”有很高 的相似性，而奥利亚罗非鱼与两者之间的亲缘关系较远。不同亲本组合之间子 代雄性率的不同也可能与亲本之间的遗传差异有关。本工作为建立以 p c r为 基础的罗非鱼种质快速鉴定及种群遗传多样性监测研究方法进行了初步的尝 试。对保护和利用我国养殖罗非鱼种质资源， 促进其养殖业的发展具有一定的 意义。 关键词: r a p d .罗非鱼、遗传距离、子代雄性率、 种质鉴定 一. 一一-一一- 1 利用r a p d技术对我国主 要养殖的罗非鱼种质鉴定研究 ab s t r a c t a p p li c a t i o n o f r a n d o m p o l y m o r p h i c d n a ( r a p d ) t o i d e n t i f y t h e t i l a p i a f i s h r a n d o m a m p l i f i e d p o l y m o r p h i c d n a ( r a p d ) a n a l y s i s w a s u s e d t o a s s e s s g e n e t i c v a r i a t io n s a m o n g f i v e p a r e n t a l c o m b i n a t i o n s fr o m t w o c o m m o n f a r m e d t i l a p ia : o r e o c h r o m i s . n i l o t i c u s a n d o . a u r e u s . 1 8 o f 2 0 r a n d o m 1 0 - m e r p r i m e r s p r o d u c e d 9 3 7 r e p r o d u c i b l e fr a g m e n t s , a n d 9 p ri m e r s g a v e c l e a r p o l y m o r p h i s m m a p p i n g w it h 4 7 7 fr a g m e n t s . f o u r p r i m e r s ( s i l l , s 1 1 2 , 5 1 1 8 , s 1 4 3 ) s h o w e d d i ff e r e n t r a p d fr a g m e n t p a tt e r n s f o r d i ff e r e n t s p e c i e s a n d s t r a i n s . t h e a m p l i f i e d p r o d u c t s w e r e s c o r e d a s p r e s e n t ( 1 ) o r a b s e n t ( 0 ) f o r e a c h d n a s a m p l e a n d a n i n d e x o f g e n e t i c d i s t a n c e w a s c a l c u l a t e d . t h e v a l u e w a s u s e d t o e v a l u a t e g e n e t i c v a r i a t io n b e t w e e n s p e c i e s a n d a p h y l o g e n e t i c t r e e w a s c o n s t r u c t e d . f r o m t h e r e s u l t , w e f i n d t h e s t r a i n o f g i f t s h a r e a h i g h s i m i l a r it y w it h t h e s p e c i e s o f o . n i l o t i c u s , w h i l e a l o w s i m i l a r i t y w it h o . a u r e u s . t h e d i ff e r e n c e o f m a l e r a t e o f t h e h y b r i d f 1 b e t w e e n d i ff e r e n t p a r e n t a l c o m b i n a t i o n s h a s a r e l a t i o n s h i p w it h t h e g e n e t i c v a r i a t i o n w it h i n t h e p a r e n t , t h e l o w e r t h e g e n e t ic v a r i a t i o n w it h i n t h e p a r e n t , t h e h i g h e r m a l e r a t e o f t h e h y b r i d f 1 . e v id e n c e i s p r e s e n t e d t h a t r a p d m a r k e r s m i g h t b e u s e f u l f o r s y s t e m a t i c i n v e s t i g a t i o n a t t h e l e v e l o f s p e c ie s a n d s t a i n s . k e y wo r d s : r a p d , t il a p i a , ma l e r a t e , s y s t e m a t i c s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 利用r a p d技术对我国主要养殖的罗非鱼种质鉴定研究 前言 月 口合 罗非鱼( t i l a p i a ) 是温水性鱼类，原产于非洲大陆及中东地区太平洋沿岸的 咸淡水区域，在分类学上，罗非鱼隶属于v形目( p e r c i f o r m e s ) ,丽鱼科 ( c i c h l i d d a e ) ，种类较多。罗非鱼在非洲有悠久的养殖历史，由于其肉质好、 产量高，并具有广食性、耐低氧、抗逆性强、繁殖力强、广盐性的特点，逐渐 传播到中美洲、南美洲和东南亚等地区，现已成为世界性的淡水或咸淡水养殖 种类。我国大陆地区自 1 9 5 6年起从越南、泰国、非洲等地逐渐引种饲养，并 进行杂交繁殖，有些罗非鱼的种和品种很受生产者和消费者的欢迎，成为我国 主要的养殖对象之一，在我国水产养殖中占 有很大的比例。 我 国 目 前 主 要 养 殖 的 罗 非 鱼 种 类 有 : 尼 罗 罗 非 鱼 ( o r e o c h r o m i s . n i l o t i c u s ) 、奥利亚罗非鱼( 0 . a u r e u s ) 、尼奥鱼及尼罗罗非鱼 吉富品系( g e n e t i c i m p r o v e m e n t o f f a r m e d t i l a p i a , g i f t ) .罗非鱼很容易 在种间自 行杂交，近年来，由于近亲繁殖、不合理引种及遗传渐渗现象，罗非 鱼的种质资源状况变得非常的恶化，引起罗非鱼类的退化和混杂， 造成生长速 度降低、体色变杂、性成熟提早、成熟个体小型化及杂种后代雄性率下降等不 良 后果，严重影响了我国罗非鱼养殖业的正常发展。为了更好地保护、利用和 开发罗非鱼种质资源，对罗非鱼的种质遗传研究就显得尤为重要。 为了有效地区分和鉴别我国主养的罗非鱼，我们利用rapd 技术，建立 罗非鱼种质快速鉴定的方法，为我国罗非鱼养殖的生产管理和优良品系的鉴别 提供依据。 罗非鱼在我国的引种情况 原产于非洲的罗非鱼类现己是世界性的养殖对象，除池塘养殖外，还是海 水养殖、流水及网箱养殖等集约化养殖的重要品种。大部分国家均引种进行养 殖。 台湾省是我国最早引进罗非鱼的省份，先后引入莫桑比克罗非鱼和尼罗罗 非鱼。而后莫桑比克罗非鱼与尼罗罗非鱼进行杂交获得成功，这一杂交品种被 称为 “ 福寿鱼” 我国大陆最早引进的是莫桑比克罗非鱼，在 1 9 5 6年由泰国引入我国广东 利用r a p d技术对我国主要养殖的罗非鱼种质鉴定研究 前言 省，随后 5 7年又从越南引入。但是在引入莫桑比克罗非鱼时由于忽视了对其 提纯工作，造成了品种退化，单养的人也少了，只将其作为福寿鱼杂交种母本 之用。 1 9 7 3年，浙江省淡水水产研究所许步助等人赴日考察时，由日 本引入大 红罗非鱼 1 2 尾、中红罗非鱼4 2 尾、小红罗非鱼3 0 尾和大红黑罗非鱼 1 1 3 尾。 据分析以上这些都系杂交种，经一些单位试养和繁殖后，未正式推广。8 0 年代 初广东省又从台湾省引入上述四个杂交种，现由珠江水产研究所从事选育工 作。 1 9 7 8 年，湖北水产研究所引进了加利利罗非鱼。 1 9 7 8年，长江水产研究所张锡来从尼罗河上游引入尼罗罗非鱼 2 2尾，其 中雌鱼 1 0 尾，雄鱼 1 2 尾，人们称为 “ 7 8 - 1 系” 。同年，湖北省也引进了3 0 尾 尼罗罗非鱼，简称 “ 7 8 - 2 ”系。这二批引入的尼罗罗非鱼均来自 尼罗河上游的 同一水域。1 9 7 9年经人工繁殖成功后，迅速在全国各省市推广养殖。尼罗罗 非鱼具有生长快、杂食性、耐低氧、个体大、产量高、肉厚、肥满度好、肉味 鲜美等优点，因而在我国已普遍饲养，此鱼可单养也可混养，也可与其他罗非 鱼杂交培养优质鱼种。 1 9 8 1年，珠江水产研究所从台湾省引进福寿鱼，后来广东省自 行制种推 广，1 9 8 5 年广东省全省饲养已达4 6 万亩。 此外， 1 9 8 1 年， 广州市水产研究所自台湾又引进奥利亚罗非鱼2 5 0 尾。 1 9 8 3 年，淡水渔业研究中心从美国奥本大学引入奥利亚罗非鱼种 3 3尾。随后我国 利用尼罗罗非鱼 早)与奥利亚罗非鱼 ( 占) 进行杂交，其 f 1后代的雄性率 高达9 0 % ，被人们称为 “ 尼奥鱼” ，且生长明显快于尼罗罗非鱼和莫桑比克罗非 鱼的杂交种 “ 福寿鱼” ，因而我国目 前主要养殖的罗非鱼除尼罗罗非鱼外，奥 利亚罗非鱼也成为一个重要的养殖品种。 1 9 8 5年湖南省水产局又从尼罗河下游引进了尼罗罗非鱼简称 “ 8 5系” ，并 与长江水产研究所共同进行研究推广工作。 1 9 9 2年，淡水渔业研究中 心从美国也引进了原产于尼罗和下游的尼罗罗 非鱼，简称 “ 美尼系” 。 1 9 9 4年上 海水产大学从国际水生生物资源管理中心 ( 菲律宾)引入尼罗 一一一一一一一 2 利用r a p d技术对我国主 要养殖的罗非鱼种质鉴定研究 前言 罗非鱼吉富品系，吉富鱼是在亚洲开发银行和联合国开发计划署的资助下由国 际水生生物资源管理中心 ( i c l r a m ) 与挪威、菲律宾有关研究机构协作， 利用 菲律宾当地的四个亚洲品系尼罗罗非鱼与新引进的四个原种非洲品系进行选 育，而培育出的新型尼罗罗非鱼。李思发 ( 1 9 9 6 ) 研究表明吉富鱼比我国引进 的其他品系尼罗罗非鱼生长速度快5 - 3 0 9 6 0 同一年，广东罗非鱼良种场从泰国正大集团引入尼罗罗非鱼的 “ 泰国品 系” ，浙江湖州水产研究所又从菲律宾引入尼罗罗非鱼 “ 埃及品系，o 1 9 9 5 年， 长江水产研究所又再次从尼罗河苏丹境内引入5 5 尾尼罗罗非鱼， 简称为 “ 9 5 品系，o 此外，罗非鱼其他的一些种类如安氏罗非鱼、齐氏罗非鱼及加利利罗非鱼 我国也先后引种过，但都未在全国形成推广之势。 表 1 简单概括了我国罗非鱼引种历史。 表 1 、我国引进罗非鱼状况一览 引种时 间 引入品种引种地 引种单位 ( 个人) 1 9 4 6 莫桑比克罗非鱼 新加坡吴根辉、郭启彰 ( 台湾省) 1 9 5 6 莫桑比克罗非鱼泰国 广东省水产研究所 1 9 5 7 莫 桑 比 克 罗 非 鱼越南 广 东 省 水 产 研 究 所 1 9 6 6 尼罗罗非鱼一 邓夭土 ( 台湾省) 1 9 7 3 大红罗非鱼 日 本浙江水产研究所 许步助 中红罗非鱼 日 本 小红罗非鱼日本 大红黑罗非鱼日本 1 9 7 8 加利利罗非鱼 湖 北 省 水 产 研 究 所 1 9 7 8 尼罗罗非鱼 “ 7 8 - 1 ” 系1尼罗河上游 长江水产研究所 1 9 7 8 ! 尼 罗 罗 非 鱼“ 7 8 - 2 系 尼 罗 河 上 游长江水产研究所 1 9 8 1 福 寿 鱼台湾省 珠江水产研究所 1 9 8 1 奥利亚罗非 鱼台湾省 广州水产研究所 1 9 8 3 奥利亚罗非鱼 美国奥本大学淡水渔业研究中心 1 9 8 5 尼罗罗非鱼 “ 8 5 系”尼罗河下游 湖北省水产局 1 9 9 2 尼罗罗非鱼 “ 美尼系”美国 淡水渔业研究中心 1 9 9 4 尼 罗 罗 非 鱼“ 吉 富 品 系 ” i c l r a m 上 海 水 产 大 学 1 9 9 4 尼罗罗非鱼 “ 埃及系”i c l r a m 1 浙江省湖州 水产研究所 1 9 9 4 尼罗罗非鱼 “ 泰国品系”泰国正大集团 广东省罗非鱼 良种中心 1 9 9 5 尼罗罗非鱼 “ 9 5 系”尼罗河苏丹境内 长江水产研究所 一一一一一 3 利用r a p d技术对我国主要养殖的罗非鱼种质鉴定研究 前言 我国对罗非鱼的引种工作己经有相当长的时间了。品种也不少。从引种情 况可以看出，我国目 前大范围养殖的是尼罗罗非鱼的一系列品系，还有奥利亚 罗非鱼以及尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼的杂交种 “ 尼奥鱼” 在我国现有的各品系尼罗罗非鱼中，除 “ 9 5品系”是刚引进不久，尚缺 乏研究之外，对其他各系的种质现状基本有一个共识，就是存在退化和混杂问 题。而且随着时间的推移，情况会更加的严重。退化的最明显表现是生活力降 低，生长速度减慢，成熟个体小型化，种质混杂 ( 主要是渐渗杂交) 。其中莫 桑比克罗非鱼和奥利亚罗非鱼的遗传渐渗是最主要的。 我国罗非鱼的养殖状况 自 1 9 5 6年罗非鱼引入我国以来，我国对罗非鱼的养殖己 有相当长的时间 了。从时间上看，我国罗非鱼的养殖，大致可以划分为以下三个时期:( 吴福 煌，1 9 9 8 ) 1 9 5 7 - 1 9 7 8年，是以莫桑比克罗非鱼为主的养殖时期，其间有过 “ 大红” 、 “ 中红” 、 “ 大红黑”等杂种罗非鱼的短暂养殖，但不久相继被淘汰。 1 9 7 8 - 1 9 8 5年，为尼罗罗非鱼、福寿鱼及莫桑比克罗非鱼三种并存的养殖 时期。此时期的特点是尼罗罗非鱼逐渐取代莫桑比克罗非鱼和福寿鱼的过渡阶 段。 1 9 8 5年以后，尼罗罗非鱼完全取代了上述两种鱼。同时尼奥鱼及其他一 些新品罗非鱼养殖开始起步。表2 列出我国主要养殖的罗非鱼种类。 目前， 罗非鱼在我国得到广泛推广， 在我国水产养殖中占有相当大的比重， 每年的产量都达数万吨，且还在逐年上升。江西省推广面积最大的品种为尼罗 罗非鱼，年产量达 0 . 2 3万吨。湖南省 “ 七五”期间全省推广罗非鱼养殖面积 达 2 8万亩，产量达 2 . 5万吨。广东省 1 9 8 4 年全省推广面积达 4 0 . 3 万亩，年 产量达2 万吨，年产值3 , 1 8 0 万元。从 1 9 8 1 - 1 9 9 0 年广东省累积推广罗非鱼养 殖面积 3 7 3 万亩次，产量为 2 2 . 6 万吨，产值达 1 亿元。 一. . . . . . . . . . 种 . . . . . . . . 4 利用r a p 技术对我国主要养殖的罗非 鱼种质鉴定研究 前言 表 2 ,我国养殖的重要罗非鱼品 ( 种)系 种类特性 尼罗罗非鱼生长快、 杂食性、 耐低氧、 个 体大、 产量高、 肉厚、肥满度好 奥利亚罗非鱼 可与其他罗非鱼混养， 培育优质品种，生长 迅速.个体大、食性广、耐盐、耐寒、耐低 氧、常用作与尼罗罗非鱼杂交用。适合于网 箱养殖 尼奥罗非鱼 具有明显的杂种优势，形态和尼罗罗非鱼相 似，生长快，喜食颗粒性饵料，雄性率高， 抗病力强 吉富罗非鱼 为改良 的尼罗罗非鱼新品系，生长速度比尼 罗罗非鱼快 6 0 % ，成活率高 5 0 % ,增产能力 强，起捕率高 受 养 殖者 和消费 者 欢 迎的 种 类 有 尼罗 罗 非 鱼、 奥 利亚罗 非 鱼以 及 尼 奥 鱼、 福 寿鱼 等， 它 们的 特点是 个 体大 、 生 长 快、 食 性广、 繁 殖力强、 病害 少、 产量 高、肉质鲜美等。 罗 非 鱼的 适应性 很 强， 适 合 于 在 各 种 水体中 养 殖。 我国 常 见 的 养 殖方 式有 池 塘单 养 和 混 养、 稻田 养 殖、 网 箱 养 殖、 流 水 高 密 度养 殖 及 海 水 养 殖 等。目 前 以 池 塘 混 养 方 式比 较 普 遍。 池 塘 混 养罗 非 鱼 是 在成 鱼池 中 搭 配 其 他 鱼 类 共 同 饲 养 的 ， 每1 , 0 0 0 平 方 米 的 水 面 可 投 放 苗 种8 0 。 一， 0 0 0 尾 不 等 。 一 般 可 产罗 非 鱼 8 0 - 1 5 0 公 斤， 高 产者 可达6 0 0 公 斤以 上 。 池 塘单 养则 一般 选 择比 较 肥 沃的 有 生 活 污水 流 入的 池塘， 1 , 0 0 0 平 方 米 的 水 面 产量 可达 1 , 0 0 0 公 斤以 上。 流 水 养 殖 及 网 箱 养 殖罗 非 鱼， 由 于 放 养 密 度 大 ， 投 喂 人 工 饵 料， 故 而 产 量 更 高 。 近 几 年 来， 沿 海 地区 尤其是 广东 广 西， 大 力 发 展罗 非 鱼的 海水 养殖， 利 用 其广盐 性的 特点，效果也很好。 我国 北方 地区也 开 展了 罗 非 鱼的 养 殖。 罗非 鱼类属 于 热 带 鱼类 。 虽 然北 方 气 温较低， 罗非 鱼不能自 然 越冬 ， 每 年需 从南方 运 输苗 种到 北 方 养 殖。由于 生 长 快， 经 夏季、 秋 季4 - 5 个 月 饲 养。 个 体 一 般 可达2 5 0 g / 尾。 投放 于 市 场， 增 加了北方地区的商品鱼的品种。 随 着 养殖 技术的 不 断发 展， 罗 非 鱼的 养 殖从 淡水发 展到 海 水; 从 池 塘等 粗 放 养 殖向 精 养 高 产 发 展 .1 9 9 0 年 ， 我 国 仅 罗 非 鱼 产量己 达5 0 万 吨 ， 推 广 养 殖 面 积 达1 5 0 万 亩以 上 。 养 殖 者 认 识 到 罗 非 鱼 不 仅易 于 养 殖， 且 饵 料 容 易 解决 ， 饲 料 转 化 率 也 极高 。 目 前 由 于 生 物 育 种 及 生 物 技 术 工 作的 进步 ， 选 育 优良 品 系 ， . 口. .曰 . . . 目. .门 . .曰. ._ 5 利用r a p d技术对我国主要养殖的罗非鱼种质鉴定研究前言 克服种质混杂及在养殖条件下的 “ 小化”现象，采用全雄养殖，可以使罗非鱼 生产更快的发展起来。 罗非鱼养殖过程中出现的问题 罗非鱼类是世界上目 前养殖最为广泛的鱼类之一。自引入到我国以来，现 已成为我国水产养殖的的重要对象。罗非鱼虽然是很有价值的养殖品种，但在 养殖过程中，不管是单养、混养或其他养殖模式，都存在着一个困扰养殖者的 问题，就是罗非鱼类的性成熟早，且世代间隔小。频繁的繁殖就产生大量的无 经济价值的小鱼苗，以致于影响整个罗非鱼群体的生长，同时也影响了池塘中 其他鱼类的生长。所以如何抑制其过度繁殖问题一直为人们所关注。 另一方面，罗非鱼类在生长上有一个很显著的特点是雌雄个体生长差异较 大。雄性个体比雌性个体生长快。根据李思发 ( 1 9 9 6 )实测，二龄雄性尼罗罗 非鱼比雌性尼罗罗非鱼生长速度快 2 0 - 4 8 % 。因而在生产中，培育和养殖全雄罗 非鱼一直是一个热点，它可以解决罗非鱼性早熟问题，也可以增加养殖效益。 全雄罗非鱼的获得方法有三: 1 、用雄性激素诱导的性别转化: 罗非鱼性别决定是由遗传基因所决定的。但从胚胎学观点来看，在胚胎期 或幼龄期，性分化是可塑的，性分化是在性激素影响下进行的。因此可用人工 方法， 在仔幼鱼早期采用投喂加入雄性激素的食物， 使雌鱼性功能上发生改变， 这样就能获得全雄性罗非鱼。雌性个体变为功能性的雄性个体，但其性染色体 组型并未改变。 处理时一般多采用甲基辜酮或乙炔基翠酮溶于酒精后，再拌入仔鱼饲料 中，充分搅拌，待饲料晾干除去乙醇后即可投喂。这种方法由于成本高，目前 尚未大量应用于实际生产中。 2 、三系配套法 湖北省水产研究所和长江水产研究所在罗非鱼性别转换实验的基础 l ， 进 一步进行罗非鱼性别生理遗传控制的研究。他们的实验证明，性激素诱导性反 转的罗非鱼具有正常的生殖机能，但性激素并不能改变鱼类性别的基因型，它 所改变的只是其表现型。对于性别控制机制，为早 x x - 名 x y型罗非鱼如莫桑比 侧- . -一. -一州. . . -. 一 . 一. 户 . .侧. . .口. . . . . . . . . 6 利用r a p d技术对我国主要养殖的罗非鱼种质鉴定研究前言 克罗非鱼、尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼，通过原系 ( 占 x y ) 、转化系 ( 早 x y ) 及雄性纯合系 ( 占 y y ) 的三系配套方法， 可控制罗非鱼性别， 得到全雄罗非鱼。 长江水产研究所等单位，以莫桑比克罗非鱼为材料，先用雌激素苯甲酸雌 二醇使正常的雄鱼转为雌性转化鱼.再用雌性转化鱼与自 然界中正常的雄性鱼 杂交，可筛选出一种超雄鱼纯合系。而后用超雄鱼与自 然群体中的正常雌鱼交 配，可得 1 0 0 % 的全雄罗非鱼。但由于超雄鱼制作困难，在生产上三系配套法也 应用不多。 3 ,杂交育种法 由于罗非鱼种间差异小，品种间容易杂交，产生全部是雄鱼或大部分是雄 鱼的子代。这一技术是解决罗非鱼全雄性养殖关键。 h i c k l i n g ( 1 9 6 0 ) 是首次报道通过种间杂交育种方法获得全雄罗 鱼后代的研 究者。他用莫桑比克罗非鱼与桑给巴罗非鱼进行杂交，期望得到不育的生长快 的杂种。但出乎意料的是，二者杂交后产生了全部是雄鱼的子一代，而且是能 育的。这极大的鼓舞了其他研究人员进一步做罗非鱼杂交育种的工作。以期获 得全雄罗非鱼子代的其他杂交组合。 在乌干达， p r u g i n i n ( 1 9 6 8 ) 用尼罗罗非鱼与桑给巴罗非鱼杂交也得到了 全 雄子一代。以上两种杂交组合在世界许多地方重复进行，成功率很高。 p r u g i n i n ( 1 9 7 5 ) 报道在以 色列用尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼也得到了全雄鱼子 代;在西非，l e s s e n t ( 1 9 6 8 ) 用尼罗罗非鱼与巨鳍罗非鱼杂交也得到了上述结 果。 1 9 7 5年， p r u g i n i n等人继续进行罗非 鱼杂交育种的研究。他们总结了子 一代雄鱼占 9 8 - 1 0 0 % 的其他杂交组合，并用这些杂交组合得到雄鱼百分率高的 子代 ( 表3 ) 0 随着科研成果应用于实践中，目前，世界各地养殖单性全雄罗非鱼的产量 逐步增加。1 9 7 9年在巴西养殖尼罗罗非鱼与桑给巴罗非鱼杂交子一代产量达 6 万公斤。同时巴拿马、哥斯达黎加也利用这一组合进行养殖。m i r e s ( 1 9 7 7 ) 报道以色列将尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼杂交后子代雄鱼可占8 0 - 9 0 % ，并将其 应用于商业养殖。1 9 7 9 年占 其全国池养鱼产量的 ( 2 , 2 3 0 吨)的3 8 % 0 c h e n ( 1 9 7 6 ) 报道莫桑比克罗非鱼与尼罗罗非鱼的杂交后代福寿鱼在我国 . . . . . 曰 . . 口 . 曰 . . 曰 口 . . . . . . . . . . . . . .-叫 -. . . . . . . . . 7 利用r a p d技术对我国主要养殖的罗非鱼种质鉴定研究前言 台湾省养殖相当普遍。根据 k u o ( 1 9 6 9 )估计，该杂种中雄鱼占 8 5 % 左右，l i ( 1 9 7 8 )报告台湾 1 9 7 7年福寿鱼产量已达2 2 , 0 0 0吨，八十年代大陆也引种福 寿鱼效果很好，深受华南地区的欢迎。 表3 ,罗非鱼的亲本组合与f l 子代的雄性率* 序号亲本组合子代雄性率备注 1 莫桑比克罗非鱼x 桑给巴罗非鱼 0 . m o s s a m b i c u s x 0 . h o r n o r u m 1 0 0 % h i c k l i n g ( 1 9 6 0 ) 2 尼罗罗非鱼x 桑给巴罗非鱼 0 . n i l o t i c u s x 0 . h o r n o r u m 1 0 0 % p r u g i n i n ( 1 9 6 7 ) 3 尼罗罗非鱼x 奥利亚罗非鱼 以n i l o t i c u s x 仅a u r e u s 1 0 0 % f i s h e l s o n ( 1 9 6 2 ) 4 尼罗罗非鱼x 多变罗非鱼 仅 n i l o t i c u s x 以v a r i a b i l i s 1 0 0 9 1 p r u g i n i n ( 1 9 6 7 ) 5 斯氏罗非鱼x 桑给巴罗非鱼 0 . s p i l u r n s x 0 . h o r n o r u m 1 0 0 % p r u g i n i n ( 1 9 6 7 ) 6 尼罗罗非鱼x 巨鳍罗非鱼 0 . n i l o t i c u s x 0 . m a c r o c h i i 1 0 0 % j a l a b e r t ( 1 9 7 1 ) 7 伏尔坎罗非鱼x桑给巴罗非鱼 0 . v u l c a n i x 0 . h o r n o r u m 9 8 -1 0 0 % p r u g i n i n ( 1 9 7 5 ) 8 伏尔坎罗非鱼x 奥利亚罗非鱼 0 . v u l c a n i x 0 . a u r e u s 9 8 -1 0 0 9 p r u g i n i n ( 1 9 7 5 ) * 注每一杂交组合中，排在前面的是雌性亲本，后面为雄性亲本。 我国除台湾省进行福寿鱼生产外，大陆地区近十年来一直进行尼奥鱼的工 作。 1 9 8 1 年， 厂 州市水产研究所和淡水渔业研究中心分别引种了奥利亚罗非鱼， 并进行了与尼罗罗非鱼杂交育种工作。其后代尼奥鱼雄性率高达 9 0 % 以上。江 山 ( 1 9 8 4 )的研究也表明尼奥鱼的雄性率一般高达 8 3 - 1 0 0 % ，平均在 9 2 % 以上。 并且其个体大小、生长速度、产量与耐寒性都优于福寿鱼，深受国内养殖者的 欢迎，并逐步替代福寿鱼，在我国许多地区推广，具有很高的经济价值 但是在实际生产中，尼奥鱼雄性率高低悬殊，养殖效果好坏不一。谢忠明 ( 1 9 9 5 )认为其主要原因在于亲本的纯度。如果亲本尼罗罗非鱼与奥利亚罗非 鱼种质不纯，其杂交后代雄性率就会下降。这说明保持亲本群体的纯度是保证 尼奥鱼具有较高雄性率的决定因素。 尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼在七、八十年代分别引入我国大陆养殖。近二 十年来，通过各种渠道引进我国的罗非鱼种类还在不断的增加。吴福煌 ( 1 9 9 8 ) 认为由于不合理的引种，繁育种群过小，间接引种、遗传渐渗及近亲繁殖等原 . . . . . . . . . . . . . . . . 8 利用r a p d技术对我国主 要养殖的罗非鱼种质鉴定研究 前言 因，引起我国尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼种质退化和混杂。这其中罗非鱼不同 品种间的遗传渐渗是最主要的， 它使得尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼亲本纯度降 低，造成尼奥鱼雄性率下降，生长速度降低，体色变杂等。 例如，我国淡水渔业研究中心1 9 8 3 年从美国奥本大学引进的3 3 尾奥利亚 罗非鱼鱼种，是 1 9 5 7年美国奥本大学从以色列引入的 1 雌 3雄奥利亚罗非鱼 的后代 李思发，1 9 9 5 ) 。由于长期的近亲繁殖，使得奥利亚罗非鱼发生了近 交衰退。 而尼罗罗非鱼我国引入的品系也很多， 主要有“ 7 8 - 1 系” 、 7 8 - 2 系” 、 8 5 系” 、 “ 美尼系， 、 “ 吉富系， 、 “ 埃及系” 、 “ 泰国系”和 “ 9 5系”等等。从整体上 来看，除近几年我国新引进的品系外，其他品系尼罗罗非鱼种质现况的一个共 同特点就是混杂和退化，而且随着时间的推移，这种情况变得更加的严重。另 外，引种不纯也有一定的影响，如引入的 “ 7 8 一 系”有 1 0 % 即3尾不是尼罗罗 非鱼，后经鉴定为加利利罗非鱼。这提醒我们在引种时一定要注意种的纯度。 在 国 外 ， 罗 非 鱼 种 质 资 源 退 化 和 混 杂 也 相 当 普 遍 ( t a n i g u c h i , 1 9 8 5 ; p u l l i n , 1 9 8 8 ) ， 也开展了一些研究i作加以 预防。 我国的 养殖业虽也面临同样的问题，但仍未引起足够的重视。要使罗非鱼在生产中继 续发挥其增产优势，保持各项优良 性状，就需要对我国罗非鱼的种质资源进行 监测和保护，以便对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼良 种进行提纯复壮，保证尼奥 鱼有较高的雄性率。 罗非鱼种质鉴定方面的 研究工作 罗非鱼的种质退化和混杂现象在国内外己相当普遍，许多研究人员对其种 质鉴定做了大量的工作，主要分为细胞水平、生化水平和分子水平三个层次: 染色体组型方面的研究 陈敏容 ( 1 9 8 3 )利用细胞学方法对莫桑比克罗非鱼，加利利罗非鱼、尼罗 罗非鱼的染色体组型进行比 较分析研究，并绘制了 它们各自的核型模式图，试 图找出它们之间的差异， 结果表明三种鱼染色体数目 一致，均为 2 n = 4 4 ，核型 分为三组.即 8 s m + 3 4 s t + 2 t ，且染色体组型形态基本相似，用常规染色方法难 一. 一-. 一一， -一一 - 9 利用r a p d技术对我国主要养殖的罗非鱼种质鉴定研究前言 以区分三种鱼的染色体，说明它们在染色体分化上基本是保守的。 吴婷婷 ( 1 9 9 7 )在对奥利亚罗非鱼染色体组型研究中，也得到了一致的结 果，即 染色体数目 为2 n = 4 4 ， 核型为 三组， 即8 s m + 3 4 s t + 2 t o 由此可见，尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼的染色体数目 相同，形态也相似， 它们之间是可以杂交的，并产生有生殖能力的后代。 生物化学方面的研究 6 0年代兴起的同工酶电泳技术也很快应用于罗非鱼种质鉴定方面。杨兴 琪 ( 1 9 8 4 ) 用淀粉凝胶垂直平板电泳比较分析了莫桑比克罗非鱼、 尼罗罗非鱼、 加利利罗非鱼的心、肝、肾、脑、 眼、 骨骼肌等6种组织的乳酸脱氢酶 ( l d h ) 与苹果酸脱氢酶( m d h ) 同工酶及其相对迁移性。发现这两种同工酶在各个种内 表现出组织的分布特异性，而且在各个种间有明显的差异。利用 l d h同工酶的 f 基因和m d h 同工酶的a , b , c , d 基因作为遗传标记，能够将亲缘关系相近的 这三种罗非鱼区别开来。李生武 ( 1 9 8 8 )用聚丙烯酞胺凝胶电泳研究了尼罗罗 非鱼和奥利亚罗非鱼及其杂种尼奥鱼的血清、肝脏、肌肉组织的脂酶 ( e s t ) 同工酶表明这两种鱼各自 有特定的酶谱，而 f l杂种酶谱中则出现了双亲所没 有的“ 新杂种酶带”和双亲的 “ 互补酶带” 。这说明用 e s t同工酶作为电泳遗 传标记是可靠的。根据它们的酶谱可将这两种鱼鉴别开来。 c h e n 和t s u y u k i ( 1 9 7 0 ) 的 研究 表明罗非鱼类血清蛋白的主要成分血清运 铁蛋白类型有明显的种间多态性，这种多态性是由不同的等位基因控制的。 a v t a l i o n ( 1 9 7 6 )用聚丙烯酞胺凝胶电泳对奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的运铁 蛋白带型进行研究，结果二者带型有差异， 可以用于种间的区分。 李思发 ( 1 9 9 5 ) 对尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的肌肉、 脑、心、 眼组织中 的 1 0种同工酶进行电泳分析表明，尼罗罗非鱼养殖群体中有一部分尼奥鱼， 但是由于尼奥鱼的外形酷似尼罗罗非鱼，从外形上肉眼难以鉴别出来，由此可 见我国尼罗罗非鱼养殖群体中己存在有遗传渐渗问题。如果用这种尼奥鱼被误 当作尼罗罗非鱼而与奥利亚罗非鱼杂交，则后代雄性率将会大大降低，且养殖 效果也很差。因而必须要保持尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼的种质纯净和防杂工 作。 . . . . . . . . 口. 1 0 利用r a p ) 技术对我国主要养殖的罗非鱼种质鉴定研究 前言 利用同工酶电泳方法，还可以鉴别不同品系的尼罗罗非鱼。赵金良等 ( 1 9 9 7 )用聚丙烯酞胺凝胶电泳分析了吉富鱼、埃及品系、 7 8 - 1 7 8 - 2 8 5 “ 美尼品系”的尼罗罗非鱼的肝脏 e s t 同工酶，其表型有明显差异。 d n a 分子标记的研究 随着分子生物学的发展，使人们认识到在生物进化的历程中，变异最先发 生在d n a分子上，因而在d n a 水平研究生物的物种起源、分类、进化和鉴定越 来越受到人们的重视。 b r o w n ( 1 9 8 0 )率先将限制性内切酶酶切图 谱用于分析人类群体的线粒体 d n a研究，发现人类广泛存在 m t d n a限制性长度多态性。酶切技术随后被广泛 应用。利用酶切产生的片段数目 和大小鉴别种内遗传组成和群体间的细微差 异，同时可作为鉴别物种的分子遗传标记。 曹萤等 ( 1 9 9 7 )用酶切 m t d n a技术检测了尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼的 m t d n a 酶切片段。测得两种鱼的线粒体基因组大小都约为 1 6 . 8 3 k b ，在使用的6 种内切酶中，只有 p v u 1 1 在所检测的 1 5 尾尼罗罗非鱼m t d n a产生了多态片段， 其中3尾鱼的 m t d n a产生了3 个片段，其余 1 2 尾的m t d n a产生了4个片段。 而 6种酶在 1 5尾奥利亚罗非鱼中均未检测到多态片段，说明奥利亚罗非鱼为 一超纯群体。由于p v u l l 的酶切结果不同，因此可以利用它对m t d n a的酶切结 果作为鉴别两种鱼的分子遗传标记。 同年，夏德全等 ( 1 9 9 7 )也利用 1 3种限制性内切酶对来自尼罗河上游和 下游的两个不同地方种群的尼罗罗非鱼分别进行了m t d n a 酶切分析。 研究发现， 两个种群中线粒体基因组大小很接近，都约为 1 6 . 9 k b ，每一群体内存在 m t d n a 酶切片段长度多态性，而且群体间在m t d n a分子水平上也有一定的差异。通过 图谱分析，构建了这两个不同地方种群尼罗罗非鱼 m t d n a酶切图谱，建立了 识 别它们的分子遗传标记。 酶切技术虽然克服了形态学鉴定及同工酶分析的局限性，但存在着操作程 序繁琐，工作量大、费用高等缺点，从而限制了它在生产实践上的应用。与之 相比，9 0 年代出现的r a p d 技术更具有优势。 r a p d 全称为随机扩增多态性d n a ( r a n d o m a m p l i f i e d p o l y m o r p h i c d n a ) . 一一一一-一-一一 1 利用 r a p e)技术对我国主要养殖的罗非鱼种质鉴定研究前言 r a p d 技术是1 9 9 0 年由 美国杜邦公司的科学家w i l l i a m s 和加利福尼亚生物研究 所的 w e l s h领导的两个小组同时创立的一种新的分子生物学技术 ( w i l l i a m s e t a l , 1 9 9 0 ; w e l s h e t a l , 1 9 9 0 ) 。 它是建立在p c r 技术基础上，以 随机的寡聚脱 氧核昔酸为引物对基因组d n a 进行扩增，它继承了p c r 技术高效、 廉价、 灵敏、 特异性强和易检测的优点，在基因组研究方面表现出独到的特点和优势: 1 ) r a p e)技术在基因定位上可以快速定向寻找同所定位基因相连锁的d n a分子 标记，进而快速完成基因的定位， 2 ) 由于每个 r a p d标记相当于一个序列位点，因而 r a p e)可以直接对基因组进 行连锁标记作图。它操作简便，不需要克隆制备、同位素标记、s o u t h e r n 标记和分子杂交等步骤。 3 ) r a p d技术可以在对物种没有任何分子生物学研究的基础上，对其进行 d n a 多态性分析并通过统计分析为种质鉴定提供分子水平的证据。 4 ) r a p e)引物没有任何特异性，合成一套引物可用于不同生物基因组分析，同 时d n a 样品需要量很少，一般为1 0 - 5 0 n g 基因组 d n a就足以进行一次分析 了。 由于 r a p d技术具有诸多优点，因而这项技术自诞生以来的短短几年内， 已渗入到生物基因组研究的各个方面，如遗传作图，基因定位，尤其是在生物 品种鉴定和物种亲缘关系上显示出广阔的应用前景。 l o w e ( 1 9 9 7 )报道在生物种质的鉴定研究中，有许多研究人员利用 r a p d 技 术。 b o r o w s k y ( 1 9 9 4 ) 利用r a p e)技 术 对 剑 尾鱼属的 鱼 类的系 统 发育问 题进 行了探讨， 其结果与传统的形态学及同工酶的研究的结果一致。 何舜平 ( 1 9 9 7 ) 利用 r a p d技术对鲤科的 5种鱼类稀有胸卿、中华细螂、唐鱼、草鱼、麦穗鱼 进行基因组 d n a多样性研究，同时辅以一定的统计学方法，探讨了稀有晌螂的 系统位置。b a r d a c k i 等人 ( 1 9 9 4 ) 利用r a p e) 技术对英国养殖的奥利亚罗非鱼、 莫桑比克罗非鱼和尼罗罗非鱼的几个品系进行了研究，并初步探讨了这几个种 之间的亲缘关系。这些研究均说明利用 r a p d技术并辅以适当的统计分析法研 究物种亲缘关系与系统演化、种质鉴定的可行性。 .一-. -一侧-一 1 2 利用r a p d技术对我国主要养殖的罗非鱼种质鉴定究 前言 本研究的内 容和目的 罗非鱼是世界上养殖最广泛的鱼类之一， 也是我国水产养殖的重要对象。 我国目 前饲养的尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼由于当初引进时数量少，性比不合 理 ( 吴福煌，1 9 8 8 )且引自 少数国家地区，使这两种鱼的遗传变异少，再加上 罗非鱼易于在种间的自行杂交，罗非鱼退化与混杂现象也相当严重。为了更好 的