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博l 学位论文 摘要 表面增强拉曼散射( s e r s ) 分析是以拉曼散射为基础建立起来的分析表征技 术。由于其高探测灵敏度、高分辨率、水干扰小、可猝灭荧光、稳定性好等优点， s e r s 逐渐在生物学、诊断学、医学、材料科学、分析科学以及表面科学的研究中 得到了广泛应用，显示了光明的发展前景。本文主要从事s e r s 在生化分析领域 的应用研究，针对当前s e r s 技术在生物检测方面中的前沿问题，从此领域的现 状出发，结合新颖的识别元素，提出了一系列操作简便、选择性好、精确性高的 生物传感技术，初步验证了这些技术的实用性；同时，针对制备s e r s 标记物中 存在的焦点和难点问题，结合s e r s 机理和本实验室相关研究工作成果，设计并 制备了一系列新型s e r s 标记物，对其性能做了较为全面的考察：利用s e r s 机理 中距离效应理论，设计了相关实验，对金属纳米颗粒表面能量转移( n s e t ) 光谱关 系规则进行了考察。具体内容如下： 1 基于核酸适体的s e r s 传感器的构建以及应用研究 在第二章中，我们首次将核酸适配体( a p t a m e r ) 之间特异性的强相互作用和 s e r s 结合起来，设计了两种新型传感器并用于小分子的检测，既拓宽了s e r s 在生 化分析领域的应用范围，也提高了对目标物的检测灵敏度。 ( 1 ) 我们开发了一种基于构象变化核酸适配体的“无试剂”型s e r s 传感器用于 对小分子的直接检测。实验中，以a g 纳米颗粒为增强基底，在构建传感界面的过 程中引入了分子印迹类型的组装方法，使用模板将a p t a m e r 更有效地组装至i j s e r s 基 底上。检测过程简便省时，传感器再生性能良好，具有优良的选择性。与已经报 道的“无试剂”型s e r s 信标相比，我们使用了更加灵敏的信号增大的设计。以可 卡因为目标分子，利用此传感器可以测到lg m 的目标物，结果令人满意。 ( 2 ) 为了改善s e r s 适体传感器的灵敏度，我们将目标导致链置换型适体引 入s e r s 传感器的构建中。以a u a g 核壳纳米颗粒为增强基底设计了一种更加灵敏 的传感方案，并将其应用于对腺苷的检测。该传感器具有较好的选择性和再生性， 而且在优化了的实验条件下，在目标物浓度从2 0 l o 培m 到2 1 0 西m 范围内建立 了校正曲线，检测下限为1 o l o 墙m 。与一般基于构型变化直接检测的适体传感器 相比，灵敏度显著提高。 我们先后将两种构型的核酸适体与s e r s 技术结合，设计出了具有简便、快速、 灵敏等优点的新型传感器，揭示了s e r s 技术在a p t a m e r 传感设计中的巨大潜力。 2 基于拉曼染料和抗体双标记的s e r s 探针凝集的免疫分析 在第三章中，我们在纳米金颗粒表面修饰了拉曼染料和抗体来检测对应抗原。 纳米金颗粒表面的抗体与待测抗原发生免疫反应而引起纳米金颗粒的凝集，从而 i i s e r s 生物传感设计新方法及新型纳米颗粒s e r s 标记物的研究 导致拉曼活性分子的s e r s 效应增强。使用人i g g 为模型目标物，在o 1p g m l 到1 5 p g m l 的范围内可以得到一条典型的动态响应曲线。该方法为一步均相分析方法， 与传统的非均相s e r s 免疫分析方法相比，操作简单，快速省时，有望成为免疫凝 集分析的一种新方法。 3 新型核壳纳米颗粒s e r s 标记物的制备及性质研究 在第四章中，我们采用两种新型的合成方法分别制备了a u s i 0 2 核壳s e r s 标记物和以团聚金纳米颗粒为核，多聚l 赖氨酸保护的s e r s 标记物。 ( 1 ) 针对在制备金属为核、二氧化硅为壳的纳米颗粒s e r s 标记物中存在的 难点问题，采用改进的合成方法制备了包埋有染料的a u s i 0 2 核壳s e r s 标记物。 制得的颗粒分散良好，性质稳定，表面易通过氨基硅烷化试剂修饰氨基。该方法 简单快速，无需特殊设备，成功率高，且不需要带氨基或带巯基硅烷化试剂作为 偶联剂，有望成为一种简便合成s e r s 标记物的新方法。 ( 2 ) 结合经典s e r s 理论，制备了一种以团聚金纳米颗粒为核，多聚l 赖氨 酸为壳的s e r s 标记物。该方法依据聚合物与金纳米颗粒之间的静电作用，引发纳 米金的团聚并对团聚体起到保护作用。与以单个金纳米颗粒为增强基底的s e r s 标 记物相比，该颗粒s e r s 强度有了明显的提高。而且颗粒外层的多聚l 赖氨酸中富 含氨基，易于生物标记，在用于超灵敏的生物检测中有很好的前景。 4 s e r s 距离效应用于金属纳米颗粒表面能量转移( n s e t ) 光谱规则可靠性研究 在第五章中，利用s e r s 机理中较为成熟的距离强度效应，以a g a u 核壳纳米 颗粒与罗丹明6 g 为研究模型，对目前仍存在争议的纳米金属表面能量转移效率与 距离关系法则( n s e t ) 进行了考察，展示了s e r s 理论研究方面工作需要迸一步 深入展开。 关键词：表面增强拉曼散射；核酸适配体；纳米颗粒标记物；聚合物；免疫凝集； 生物传感器；能量转移 m 博 ：学位论文 a b s t r a c t s u r f a c e - e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ( s e r s ) i sah i g h l ys e n s i t i v ea n ds e l e c t i v e t o o lf o rt h ei d e n t i f i c a t i o no fb i o l o g i c a lo rc h e m i c a la n a l y t e sb a s e do nr a m a ns c a t t e r i n g i t sn a r r o w ，w e l l r e s o l v e db a n d s ，l o ws e r si n t e n s i t yo fw a t e ra n dh i g hs t a b i l i t ym a k e s e r sw i d e l yu s e di nm a t e r i a ls c i e n c e ，s u r f a c es c i e n c e ，b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i z a t i o na n d d i a g n o s t i c s t h i sd i s s e r t a t i o np r e s e n t e dh e r e i sf o c u s e do nt h ef a b r i c a t i o na n d a p p l i c a t i o no fn o v e lb i o s e n s o r sb a s e do ns e r s ，t h en o v e ls y n t h e s i sm e t h o d so f b i o c o m p a t i b l ec o r e - s h e l ls e r st a g sa n dp r o b i n gt h ev a l i d i t yo fn a n o m e t a ls u r f a c e e n e r g yt r a n s f e r t h ed e t a i l sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 p r e p a r a t i o no fa p t a m e r i cb i o s e n s o r sf o rs m a l lm o l e c u l e sb a s e do ns e r s i nc h a p t e r2 ，t w on o v e ls t r a t e g i e sh a v e b e e nd e v e l o p e di nt h ep r e p a r a t i o no f a p t a m e r i cb i o s e n s o r sf o rc o c a i n ea n da d e n o s i n eb a s e do ns e r s t h ec o m b i n a t i o no f a p t a m e ra n ds e r se n r i c h e st h ea p p l i c a t i o no fs e r si nb i o s e n s o r ( 1 ) ap r o o f - o f - p r i n c i p l eo far e a g e n t l e s sa p t a m e r i es e n s o rb a s e do ns e r sw i t h “s i g n a l o n ”a r c h i t e c t u r eu s i n gam o d e lt a r g e to fc o c a i n ew a sf i r s tr e p o r t e d t h i sn o v e l a p t a m e r i es e n s o rw a sb a s e do nt h ec o n f o r m a t i o n a lc h a n g eo ft h es u r f a c e t e t h e r e d a p t a m e ro nb i n d i n gt a r g e tt h a td r a w sac e r t a i nr a m a nr e p o r t e ri nc l o s ep r o x i m i t yt ot h e se r ss u b s t r a t e ，t h e r e b yi n c r e a s i n gt h er a m a ns c a t t e r i n gs i g n a ld u et ot h el o c a l e n h a n c e m e n te f f e c to fs e r s t oi m p r o v et h er e s p o n s ep e r f o r m a n c e ，t h es e n s o ri s f a b r i c a t e db yac o c a i n e t e m p l a t e dm i x e ds e l f - a s s e m b l yi m m o b i l i z a t i o ns t r a t e g y u n d e r o p t i m i z e da s s a yc o n d i t i o n s ，o n ec a nd e t e r m i n ec o c a i n ea t ac o n c e n t r a t i o no f1 m ， w h i c hc o m p a r e sf a v o r a b l yw i t ha n a l o g o u sa p t a m e r i cs e n s o r sb a s e do ne l e c t r o c h e m i c a l a n df l u o r e s c e n c et e c h n i q u e s t h es e n s o rc a nb er e a d i l yr e g e n e r a t e dt h r o u g hw a s h i n g w i t hab u f f e r ( 2 ) t oi n c r e a s e t h e s e n s i t i v i t y o fa n a p t a m e r i c s e n s o rb a s e do ns e r s ， s t r u c t u r e - s w i t c h i n gs i g n a l i n ga p t a m e rw a si n t r o d u c e dt ot h ef a b r i c a t i o np r o c e s s f i r s t ， a u a gc o l l o i df i l mo nap o l i s h e dg o l dd i s ci sp r e p a r e da se n h a n c e ds u b s t r a t ea n d m o d i f i e dw i t ht h i o l a t e dc a p t u r ed n a t h ef o r m a t i o no fa na p t a m e r d n ad e x p a n d e da n t i - a d e n o s i n ea p t a m e ra n dt e t r a m e t h y l r h o d a m i n e - l a b e l e dd n a u p l e xo f ( d e n o t e d t m r d n a ) i st h e nd e v e l o p e d ，i nw h i c ht m r - d n ac o u l da l s oh y b r i d i z ec o m p l e t e l y w i t hc a p t u r ed n a t h ei n t r o d u c t i o no fa d e n o s i n et h u st r i g g e r ss t r u c t u r es w i t c h i n go f t h ea p t a m e rf r o ma p t a m e r d n ad u p l e xt oa p t a m e r t a r g e tc o m p l e x a sar e s u l t ，t h e i v s e r s 生物传感设计新方法及新型纳米颗粒s e r s 标记物的研究 r e l e a s e dt m r d n ai sc a p t u r e do n t ot h es e r ss u b s t r a t e ，r e s u l t i n gi na ni n c r e a s eo f s e r ss i g n a l u n d e ro p t i m i z e da s s a yc o n d i t i o n s ，aw i d el i n e a rd y n a m i cr a n g e ( 2 0 x10 喝 m 2x10 。6m ) w a sr e a c h e dw i t hl o wd e t e c t i o nl i m i t ( 1 o 10 。8m ) m o r e o v e r ，h i g h s e l e c t i v i t y ，s t a b i l i t ya n df a c i l er e g e n e r a t i o na r ea c h i e v e d t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h es e r s - b a s e dt r a n s d u c e rm i g h tc r e a t e an e w d i m e n s i o nf o rf u t u r ed e v e l o p m e n to fn o v e la p t a m e r i cs e n s o r sf o rs e n s i t i v e d e t e r m i n a t i o ni nb i o c h e m i c a la n db i o m e d i c a ls t u d i e s ； 2 r e s e a r c ho nh o m o g e n e o u ss e r si m m u n o a s s a yb a s e do na g g r e g a t i o no f n a n o p a r t i c l es e r sp r o b e s i nc h a p t e r3 ，ao n e s t e ph o m o g e n o u ss e n s i t i v ei m m u n o a s s a yu s i n gs e r sh a sb e e n d e v e l o p e d t h i ss t r a t e g yi s b a s e do nt h ea g g r e g a t i o no fr a m a nr e p o r t e r - l a b e l e d i m m u n o g o l dn a n o p a r t i c l e s i n d u c e db yt h ei m m u n o r e a c t i o nw i t hc o r r e s p o n d i n g a n t i g e n s t h ea g g r e g a t i o no fg o l dn a n o p a r t i c l e sr e s u l t si nas e r ss i g n a li n c r e a s eo f r a m a nr e p o r t e r t h e r e f o r e ，h u m a ni g gc o u l db ed i r e c t l yd e t e r m i n e db ym e a s u r i n gt h e r a m a ns i g n a lo fr e p o r t e r u s i n gh u m a ni g ga sam o d e lp r o t e i n ，aw i d el i n e a rd y n a m i c r a n g e ( o 1i t g m lt o 15p g m l ) w a sr e a c h e dw i t hl o wd e t e c t i o nl i m i t ( 0 1p g m l ) u n d e ro p t i m i z e da s s a yc o n d i t i o n s t h es u c c e s s f u lt e s ts u g g e s t st h a tt h ea p p l i c a t i o no f t h ep r o p o s e dm e t h o dh o l d sp r o m i s i n gp o t e n t i a lf o rs i m p l e ，f a s td e t e c t i o no fp r o t e i n si n t h ef i e l d so fm o l e c u l a rb i o l o g ya n dc l i n i c a ld i a g n o s t i c s 3 t h es y n t h e s i so fc o r e s h e l ln a n o p a r t i c l e - b a s e ds e r st a g s i nc h a p t e r4 ，t w on o v e ls y n t h e s i sm e t h o d sh a v eb e e nd e v e l o p e di nt h ep r e p a r a t i o n o fa u s i 0 2c o r e s h e l ln a n o p a r t i c l e - b a s e ds e r st a g sa n dg o l d - a g g r e g a t e d ， d y e e m b e d d e d ，p o l y m e r p r o t e c t e dn a n o p a r t i c l e s ( 1 ) a ni m p r o v e ds y n t h e s i sm e t h o do fa u s i 0 2s e r st a g sh a sb e e nd e s c r i b e di n t h i sc h a p t e r t h ec o m m o np r o p e r t i e so ft h ec o r e - s h e l ln a n o p a r t i c l e b a s e ds e r st a g s i n c l u d i n ga u s i 0 2a r es t r o n gs e r ss i g n a la n de x t r a o r d i n a r ys t a b i l i t y t h em o s t e x c i t i n ga d v a n t a g eo ft h em e t h o di s i t ss i m p l i c i t ya n dt i m es a v i n gp r o c e d u r e a s c o m p a r e d t oo t h e r p r e p a r i n gm e t h o d sr e p o r t e db e f o r e b e s i d e s ，t h ep r o p o s e d m e t h o d o l o g ye l i m i n a t e st h eu s eo fv i t r o p h i l i cp r e t r e a t m e n td u r i n gt h ep r e p a r a t i o n ， w h i c hi sn e c e s s a r yi no t h e rp r o p o s e dm e t h o d o l o g i e s ( 2 ) g o l d a g g r e g a t e d ，d y e e m b e d d e d ，p o l y m e r p r o t e c t e dn a n o p a r t i c l e s ( g d p n s ) a r eu n u s u a l a g g r e g a t e s t h a ti n v o l v e c h a r g e - d r i v e na g g r e g a t i o n o f g o l d n a n o p a r t i c l e s p o l y ( l l y s i n e ) f u n c t i o n a l i z e dw i t hr a m a nd y ea n dap o l y ( l l y s i n e ) ( p l l ) o u t e rl a y e r u n l i k em o s to ft r a d i t i o n a lr a m a nt a g s ，a g g r e g a t i v eg o l dn a n o p a r t i c l e sa r e u s e di ng d p n sa st h ea c t i v es u b s t r a t ef o ri n c r e a s i n gt h es i g n a lo fs e r s f u r t h e r m o r e ， v 博十学位论文 t h eo u t e rp l ll a y e rc o u l dl o c ki na un a n o p a r t i c l e sm o d i f i e dw i t hr h o d a m i n eb i s o t h i o c y a n a t e ( r b i t c ) a n dl o c ko u te x t e r n a ld y em o l e c u l e s s p e c i f i c a l l y ，p l la st h e o u t e rl a y e re x p o s e sa na m i n o g r o u pr i c hs u r f a c et ot h es u r r o u n d i n ge n v i r o n m e n tt h a t s h o u l df a c i l i t a t et h ec o n ju g a t i o no fg d p n sw i t hb i o m o l e c u l e s ( a n t i b o d y a n t i g e n ， n u c l e i ca c i d ) t h e s ea d v a n t a g e ss u g g e s tt h ep o t e n t i a lo fu s i n gg d p n sa sr a m a nt a g s f o rm u l t i p l e xa n du l t r a s e n s i t i v ed e t e c t i o no fb i o m o l e c u l e s 4 t h ea p p l i c a t i o no fs e r sf o rp r o b i n gt h ev a l i d i t yo fn a n o m e t a ls u r f a c ee n e r g y t r a n s f e r ( n s e t ) s p e c t r o s c o p i cr u l e r i nc h a p t e r5 ，t h ef l u o r e s c e n tb e h a v i o ro fr h o d a m i n e6 ga td i s c r e t ed i s t a n c ef r o m a g a uc o r e s h e l ln a n o p a r t i c l es u r f a c ew h i c hf o l l o w sd 4d i s t a n c ed e p e n d e n c ew a s i n v e s t i g a t e db ys e r s t h i sr e s u l ti n d i c a t e st h en e c e s s i t yo ft h e o r e t i c a ls t u d i e si ns e r s r e s e a r c h k e yw o r d s ：s u r f a c e - e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ；a p t a m e r ；n a n o p a r t i c l et a g s ； p o l y m e r ；a g g r e g a t i o n - b a s e di m m u n o a s s a y ；b i o s e n s o r ；n a n o m e t a l s u r f a c ee n e r g yt r a n s f e r v i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 7 哆产辛 f 日期：0 8 年7 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 篙：器 导师签名：胍1 厂劲 日期：抄，3 年 日期：沙子年 7月7 日 7 月7 日 博 ：学位论文 第1 章绪论 1 1 拉曼散射的原理和发展 拉曼效应是分子的一种非弹性散射现象。当一束光照向介质时，大部分的光 透过介质或者被介质反射，另一部分光被介质向各个方向散射，其中，部分散射 光的频率与入射光频率有所偏离。这种频率发生改变的散射称之为拉曼散射。1 9 2 3 年德国的s e m k a l 从理论上预测了光的非弹性散射【lj ，而印度科学家拉曼( r a m a n ) 等在1 9 2 8 年首次在液体中发现了这种现象【2 】。由于发现并系统地研究了这种散射， 拉曼在1 9 3 0 年被授予了诺贝尔物理学奖，这种散射亦被称作拉曼光谱。 拉曼散射的产生过程如f i g u r e1 1 所示，当波数为1 o 的单色光打到分子时， 它和电子发生较强烈的相互作用，使分子被极化，从而产生散射光，其中h 为普 朗克常数。如果光子与分子间不发生能量的交换，即光子只改变运动方向而不改 变频率，这种弹性散射过程被称为瑞利( r a y l e i g h ) 散射( f i g u r e1 1 b ) 。在这个过 程中，处于基态( g r o u n ds t a t e ) e v = 0 的分子受入射光子办v 口的激发跃迁到不稳 定的虚拟的受激虚态( v i r t u a ls t a t e ) ，由于受激虚态非常不稳定，分子很快又跃迁 回基态，同时把吸收的能量厅v d 以光子的形式释放出来，即为瑞利散射线。非弹性 碰撞指的是在碰撞过程中，光子与分子发生了能量交换，光子的运动方向和频率 均发生了变化，这种散射过程称之为拉曼散射。如f i g u r e1 1 a 所示，被入射光激 发至受激虚态的分子随后跃迁至电子基态中的振动激发态( v i b r a t i o n a ls t a t e s ) e v = l 上，这个过程中分子吸收了入射光子的一部份能量( 厶，) ，最后释放出能量的 为h ( v 口厶1 ，j 的光子，通常称之为斯托克斯线( s t o k e s ) ；若开始分子处于振动激发 态e v = 1 上，受能量为办砌的光子激发跃迁至受激虚态，然后再跃迁到基态e v = o ，这时候光子从分子那里得到厶 ，的能量，称为反斯托克斯线( a n t i s t o k e s ) ( f i g u r e 1 1 c ) 。斯托克斯线和反斯托克斯线是统计力学对能量集居排布的结果，在常态下 高能态与低能态是并存的，但是由于分子的能量遵守b o l t z m a n n 定律，低能态的分 子数目总是比高能态上的分子数目多，所以通常斯托克斯线比反斯托克斯线要强 很多【3 】。在拉曼散射得到的这两种谱线中，斯托克斯线和反斯托克斯线与入射辐射 的频率差为厶v ，通常称之为拉曼位移( r a m a ns h i f t ) 。如果入射光能量和分子第一 激发态和基态的能级差很接近或一致时( f i g u r e1 1 d ) ，散射强度可得到1 0 6 数量 级的增强，这种现象被称为共振拉曼散射( r e s o n a n c er a m a ns c a t t e r i n g ) 。 s e r s 生物传感设计新方法及新型纳米颗粒s e r s 标记物的研究 r e a ls t a t e s v ir t u s ls t a t e v i b r a t i o n a i g r o u n ds t a t e h v o 咿蝴 j h h v o 一v ) | 1 1 嵋 h ( v o + 厶w s t o k e s r a y l e i g h a n t i s t o k e s r e s o n a n c e s c a t t e r i n gs c a t t e r i n g s c a t t e r i n g r a m a ns c a t t e r i n g ( a )( b )( c )( d ) f i g u r e1 1s c h e m a t i cd i a g r a mf o rd i f f e r e n ts c a t t e r i n gp r o c e s s e s 由经典理论推导出拉曼效应的关系式如下： 心邮一s 哪，+ 等( 害) 。c o s 2 n ( v , , + i p v ，+ 等。c o s 2 n ( v = - - y v m 其中，t 。为被极化的分子诱导偶极子，为其在基态的极化率，疋为激发波的振 幅，v 。为激发光的频率，f 表示时间，v 为振动频率【4 1 。拉曼的强度可以用下面的 这个关系式来表示： ro c 仃( y 髓) y 甜4 刀f e 灯 ( 1 2 ) 其中，尺为散射强度，仃( 吃) 为拉曼散射截面，磊为激发光能量，强为分子数目。 拉曼效应发现之后，很快就以拉曼效应为基础建立了拉曼光谱分析法。在分 子光谱系统中，拉曼位移厶1 ，基本落在与分子的转动能级、振动能级和电子能级之 间的跃迁联系的范围内，它相当于基团的振动频率、转动频率、或振一转频率以 及晶格振动频率。由此可知，拉曼光谱与红外光谱有异曲同工的特点。2 0 世纪3 0 年代末，拉曼光谱已成为非破坏性分析的主要方法之一。但是由于原始的拉曼光 谱以汞弧灯为激发光源，色散系统非常简陋，而且只有透明液体样品才适合于实 验，这一切技术上的困难使对于拉曼光谱的研究及应用进展非常缓慢。6 0 年代初 博上学位论文 期问世的激光技术给拉曼技术带来了新的生机，与早期使用的汞弧灯光源相比， 激光输出功率大且能量集中，单色性和相干性能好，几乎是线偏振【5 】。此外，分光 元件以及检测设备的改进促进了拉曼光谱的快速发展，特别是拉曼光谱仪与计算 机的联用进一步简化了拉曼光谱的记录和数据分析处理。从7 0 年代初期开始，激 光技术的新进展进一步促进了拉曼光谱技术的发展和应用。激光器的多谱线输出 和可调激光器的连续谱线输出，对在较大范围有吸收的样品，可以很方便地选择 合适的激光线进行共振拉曼光谱检测。拉曼光谱的应用也囊括了化学、物理、材 料、生物等多个领域。 对于纯度较高的样品来说，高能量密度的激光光源以及采样较多的分子数， 使得人们很容易获得拉曼光谱图。但对于研究表面的分子来说，拉曼光谱的灵敏 度还不能满足人们的要求。这主要由于在表面的物质往往是单分子层，甚至是亚 单分子层，可供采样的分子数目很少，因此不能获得足够的拉曼强度。 1 2 表面增强拉曼散射( s e r s ) 1 2 1s e r s 的发现 1 9 7 4 年，f l e i s c h m a n n 小组【6 】对吸附在粗糙银电极表面上的单层吡啶分子进行 拉曼散射检测，首次得到了超常的增强拉曼信号，而且拉曼信号随所加电位有明 显变化，说明增强信号由电极表面性质决定。但是他们认为这种增强是由于电化 学粗糙导致吸附样品分子数目增加所致。1 9 7 7 年，v a nd u y n e 小组【7 】和c r e i g h t o n 小组【8 】却分别独立研究发现，吸附在粗糙电极表面的吡啶的拉曼散射信号比与溶 液中相同数量的毗啶的拉曼信号增强了约6 个数量级，指出这是一种与粗糙表面 相关的巨大的表面增强效应，即所谓的表面增强拉曼散射( s u r f a c ee n h a n c e dr a m a n s c a t t e r i n g ) ，简称s e r s 。除了粗糙的银电极表面具有增强效应外，人们在利用其 他方法制得的粗糙银表面以及金属胶体表面也发现了非常强的s e r s 增强效应。 这一系列的研究使得s e r s 在表面科学、材料科学以及生物科学等领域得到了广 泛的应用。虽然s e r s 技术应用的非常广泛，但是人们对其机理却并没有完全的 了解。 1 2 2s e r s 的机理 s e r s 现象一出现就引起了人们对其增强机理的研究，人们提出了许多不同的 理论模型来解释这种现象。经典的光散射理论可以让我们定性地理解s e r s 过程p j 。 光与物质相互作用以后可以引起分子的振荡，产生次级发射，当入射电场强度不 是很大时，近似认为只诱导偶极发射，其诱导偶极矩可以表示为： 伽= ae( 1 3 ) s e r s 生物传感设计新方法及新型纳米颗粒s e r s 标记物的研究 其中，诱导偶极矩( t i n ) 与电场强度( e ) 及分子的极化率张量( 仅) 成正比。由 此可以看出，s e r s 的增强来源于作用于分子上的电场增强或者分子极化率的增 加。在理论方面，人们分别提出了对应于前者的电磁增强和对应于后者的化学增 强，这两种理论是目前公认的增强机理。 1 2 2 1 电磁场增强机理( e l e c t r o m a g n e t i ce n h a n c e m e n tm e c h a n i s m ) 电磁场增强机理是一种物理模型，又可称为表面等离子共振模型。当入射光 照射在粗糙的金属表面时，表面上的自由电子与入射光产生表面等离子体共振， 使得金属表面局域电磁场有显著的增强，由于拉曼散射强度与分子所处光电场强 度的平方成正比，因此极大增加了吸附在金属表面的分子的拉曼散射强度。 m o s k o v i t s i o 】认为，入射光与金属粒子表面等离子体共振导致部分区域的场增强； 另一方面，当入射光与拉曼活性分子发生相互作用后，产生的拉曼散射光同样可 以激发颗粒表面等离子体共振。假设入射场强增强为原来的2 0 倍，那么总的场强 即增加为原来的4 1 0 2 倍，由于信号强度与电场强度的平方成正比，所以最终的散 射强度增强为原来的1 6 1 0 5 。有关电磁场的理论研究已经取得很大进展。k n e i p p 小组【l l 】通过研究发现，根据电磁场增强机理，s e r s 增强因子( e f ) 和拉曼活性分子 与表面距离的1 2 次方成反比，即： ， ， 、1 2 e f 。i a ( v , ) l l a c v s ) l l ( 1 4 ) 厂- - i - a 其中i a ( v l ) 卜l 彳( y 。) 1 2 分别为拉曼活性分子处的激发场、散射场增强因子，为曲率 半径，d 为分子与表面的距离。这一距离效应已经被大量的实验所证实，它反映了 s e r s 效应的长程性【1 2 以4 。 虽然这些理论研究是建立在单个的颗粒为s e r s 基底的基础之上的，但是电磁 场增强机理同样可以解释纳米颗粒团聚能够产生更强s e r s 信号的原因以及偏振 光对团聚体中s e r s 强度的影响【1 0 】。如f i g u r e1 2 所示，当偏振光的电场方向与纳 米颗粒的中心连线方向一致时，在共振条件下，纳米颗粒表面自由电子被有效极 化，同时，诱导偶极子之间的相互作用可以产生放大的极化效应，从而极大增强 了分子周围的电场强度。如果两个方向垂直时，处于纳米颗粒间隙的分子不会受 到诱导电荷的影响，此时的s e r s 强度并不比其在单个纳米颗粒上的增强。通过理 论模拟，x u 等 1 5 1 6 】也证明了偏振光在纳米颗粒聚集体中对s e r s 的影响，并且估算 出纳米颗粒的间隙可以达到1 1 个数量级的s e r s 增强。 f i g u r e i2s i m p l eg r a p h i c a l i l l u s t r a t i o no f t h er e 2 b o n w h y l i g h tp o l a r i z e d w i t h t h e e v e c t o ra l o n g t h ei n t e r - p a r t i c l ea x i sc a r lr e s u i ti nh u g ee n h a n c e m e n t si nt h eg a pb e t w e e nt h et w on a n o p a r t i e l e s w h e r e a st b eo r l h o g o n a lp o l a r i z a t i o nc a n f o t 电磁场增强机理能够很好的解释散射强度与激发波长、入射光角度，分子偶极定 向以及表面粗糙度等有关，但是无法解释一些与分子化学性质相关的现象，如不 同吸附分子在同一基底上出现不同的增强效应，而且并不是所有吸附在基底表面 的分子都能产生s e r s 信号只有吸附在活性位点上的分子才出现强的s e r s 效应 等。这说明除了物理增强效应之外，必然还有化学增强的因素。 122 2 化学增强机理( c h e m i c a le n h a n c e m e n tm e c h a n i s m ) 化学增强的基本出发点是认为拉曼增强效应源于分子与金属之间的作用，导 致分子极化率增大，进而增大了拉曼散射截面所致。化学增强模型主要有增原子 模型( a d a t o m s m o d e l ) 和动态电荷转移( d y n a m i c a lc h a r g e t r a n s f e r ) 两种。增原子 模型p i 认为金属表面存在未被结合进入基底晶格的原子，这类原子可做为活性增强 位点与吸附于此位置的分