（分析化学专业论文）痕量物质的分离富集胶束毛细管电泳分析研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 自从鼬于1 9 8 4 年创立胶束毛细管电泳( m e k c ) 以来，由于其具有分离 中性物质的能力，m e k c 逐渐发展成为毛细管电泳( c e ) 中最重要的模式之一。 本论文将m e k c 分离技术与浊点萃取、场放大进样富集技术相结合，开展了提高 m e k c 灵敏度新方法研究，建立了中药中雷公藤内酯酮、防晒霜中二苯甲酮类防晒 剂、肾病患者尿液中白蛋白和转铁蛋白的k c 分离检测方法。主要研究内容包括： ( 1 ) 建立了浊点萃取胶束毛细管电泳联用检测中药雷公藤中有效成份之一雷 公藤内酯酮的方法。系统地考察了影响浊点萃取的分析条件。在最佳条件下，富集 倍数达到2 5 倍，检测限为5 9 8 1 0 。7m o 班，。该方法被成功用于雷公藤片及尿样基体 中雷公藤内酯酮的测定。 ( 2 ) 建立了浊点萃取胶束毛细管电泳联用分离检测防晒霜中三种二苯甲酮类 防晒剂( 2 ，4 二羟基二苯甲酮：b p 1 ，2 ，2 ，4 ，4 四羟基二苯甲酮：b p 2 和2 羟基 - 4 甲氧基二苯甲酮：b p 3 ) 的方法。系统地考察了影响浊点萃取和毛细管电泳分离 的诸因素。在最佳条件下，富集倍数达到2 0 倍，b p 1 ，b p 2 ，b p 3 的检测限分别 为：3 9 0 l o 7m o 儿，3 8 3 1 0 0m o 儿，6 4 2 1 0 培m o 儿。该方法被成功用于市售防 晒霜中b p 一1 ，b p 2 ，b p 3 的测定。 ( 3 ) 建立了在线场放大进样一胶束毛细管电泳联用分离检测肾病患者尿液中白 蛋白和转铁蛋白的方法。系统优化了影响胶束毛细管电泳分离和场放大进样的各个 因素，通过使用场放大富集方法，白蛋白和转铁蛋白的检测灵敏度分别提高7 7 6 和 4 5 3 倍，检测限分别为：0 2 4m g l 和0 4 6m g l 。该方法被成功用于肾病患者尿液 中白蛋白和转铁蛋白的分析。 关键词：胶束毛细管电泳：浊点萃取；场放大进样；雷公藤内酯酮；二苯甲酮； 白蛋白；转铁蛋白 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t m i c e l l 盯e l e 曲r o k i l l e t i cc a p i l l a d ，c h r o m a t 0 鲫h y ( 姬k c ) ，i n 仃0 d u c e db yt e r a b ee ta li n l9 8 4 ，h 嬲b e c o m eo mo ft h em o s ti m p o r t a l l tm o d e so fc a p i l l a 巧e l e c t r o p h r e s i sf o ri t s a b i l 时t 0 锄a l y z en e 曲赳a n f i l y t e s i k2 l i mo fm i sd i s s e r t a t i o ni s t 0d e v e l o pt h et e c h n i q u e so f 蝴b i r 蜥o no fm e k c 谢也c l o u dp o i n te x 缸a c t i o n ( c p e ) a n d 丘e l d a i i l p l i f i e ds a n l p l e 硒e c t i o n0 认s i ) f o r 仃a c ea n 甜y s i s e 伍c i e ma n ds e l l s i t i v em 甜l o d sw e r ed e v e l o p e df o r t h e ( 1 e t i e r i n i n 撕o no ft r i 咖1 1 i d ei nc 1 1 i n e s eh e r b a jm e d i c i n e s ，h y d r o p h o b i cb e n z o p h e n o n e s i ns u n s c r e e 如a n da l b u m 证( a l b ) a i l d 臼锄s f e r r 啦( t f i ) i nu 血l ew i 也虹d i l e yd i s e 舔e s 硼1 e m 萄0 rc 0 n t e n t sa r ed e s c r i b e da st h ef o l l o 、s ： 1 am e m o d h a sb e e nd e v e l o p e df o r 舭d e 钯n i l i n a t i o no ft r i p t 0 1 1 i d ei i l 仃a d i 缸。砌 c h i n e s eh e r b 乃勿纪，) 痧“历w 蜘砌fh 0 0 kf b ym e k cc o m b i n e dw i t hc l o u dp o 硫 e x 缸a c t i o n 晒o u sp a 舢l e t e r s 疆- e c t i n gc p ew e r eo p t i m i z e ds y s t e m a t i c a l l y u n d e rt h e o p t i m i z ec o n d i t i o n s ，a ne 埘c e n tf - a c t o ro f2 5w a so b “n e da 1 1 dt h ed e t e m i n a t i o n l h i t so f 、糯f o u i l dt 0b e5 9 8 1 0 。7m o 儿m o l l n ep r o p o s e dm e t h o dh a sb e e n s u c c e s s m l l ya p p l i e dt ot h ed e t e m i n a t i o no ft r i p t o m d ei nzw 观加，西ft a b l e ta n ds p i k e d u r i n es 锄p l e s ，d e m o n s 仃a t i n gt 1 1 ef e a s i b i l i 妙a i l dr e l i a b i l i 够o ft h ep r o p o s e dm e m o d 2 am e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e df o rt 1 1 es 印删i o na n dd e t e m i n a t i o no f 血优 h y d r o p h o b i cb e n z o p h e r l o n e s ： 2 ， 4 - d i h y ( 1 r o x y b e n z o p h e n o n e( b p 1 ) ， 2 2 ，4 ， 4 - t e 缸吐y d r o x y b e n z o p h e n o n e ( b p - 2 ) a n d2 - h y d r o x y - 4 一m 咄o x y b e n z 叩h e n o n e ( b p 一3 ) i n s u n s c r e e nb ym e k cc o m b i l l e d 诵廿lc l o u dp o 缸e x 饿l c t i o n v 撕o u sp 嬲i i i l e t e r sa 恐c t i i l g c p e锄dm e k cs e p 撇t i o nw e r e o p t i m i z e ds y s t 锄a t i c a l l y u n d e r 也e o p t i m i z e d c o n d i t i o n s ，a ne n r i c h m e n tf a c t o ro f2 0w a so b t a i n e da r l dm ed e t e n n i n a t i o nl i m i t so fb p 一1 ， b p 2a i l db p 3 、e r ef o u l l dt ob e3 9 0 1 0 7m o l l ，3 8 3 l o 7m o 。a i l d6 4 2 l o 罐m o 。 r e s p e c t i v e l y t h ep r e s e n t e dp r o c e d u r ew a ss u c c e s s 彻l ya p p l i e dt 0t l l ed e t e r i i i i i l a t i o no f b p - 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蹦m l 访e ds a i n p l e e 砸o n ；劬p t o n i d c ；妇p h e n o n c s ；a l b u i i n ； 雠f e 啦 硕士学位论文 l 雌s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究 工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和 集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：播与丕趁 日期：柳多年r 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。同时授权牛国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文 全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：荔l | i 良也 日期渺彦年，月心日 导师签名：水【自铋 日期：渺年r 月矿日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的规 定享受相关权益。圆童迨塞握童厦澄卮；旦兰生；旦二生；旦三生筮查! 作者签名：诱掘羞 日期：w 略耵月加 导师签名：3 挺l 砀加 日期：加占年上月疗日 本论文主要创新点 本论文主要研究了采用浊点萃取法场放大进样法预富集方法与胶束毛细管电 泳法联用方法用于实际样品中痕量成份的分离富集。 本文的创新点主要表现在以下几个方面： ( 1 ) 首次采用浊点萃取与胶束毛细管电泳检测联用方法测定中药雷公藤内酯 酮； ( 2 ) 首次采用浊点萃取分离与胶束毛细管电泳检测联用方法来测定防晒霜中 三种二苯甲酮类防晒剂： ( 3 ) 首次采用场放大进样富集进样胶束毛细管电泳法同时测定肾病患者尿样 中自蛋白和转铁蛋白的含量。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 1 1 毛细管电泳概述 第一章绪论 毛细管电泳( c a p i l l a 珂e l e c 仃o p h o r e s i s ，c e ) 是荷电粒子在毛细管中以电场为 驱动力、以电泳淌度差异来实现分离的一种现代分析技术。1 9 8 1 年，j o 玛e n s o n 【1 j 等 首次采用7 5 m 内径的硅熔毛细管在3 0l ( v 电压下分离氨基酸，获得了4 1 0 5n m 的 理论塔板数，开创了毛细管电泳( c a p i l l a 巧e 1 e c 仃o p h o r e s i s ，c e ) 分离分析方法的 先河，也标志着c e 技术的诞生。 毛细管电泳以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之 间电泳淌度或分配行为的差异而实现的液相分离分析新技术。粒子在毛细管内电介 质中的迁移速度等于电泳和电渗( e o f ) 两种速度的矢量和。通常认为，c e 采用的 石英毛细管柱在p h 3 的情况下其内表面带负电，与溶液接触时形成双电层。c e 中 所指的电渗是高电压作用下由双电层中水合阳离子或质子所引起的流体朝负极方 向的运动。正离子运动方向与电渗流一致，最先流出；中性粒子迁移速度即为电渗 速度，负离子运动方向与电渗流相反，但一般而言，电渗速度大于其电泳速度，故 它在中性粒子之后流出，各种粒子因其迁移速度不同得以分离。若待分离组分皆为 中性，则需在缓冲液中加入适当类型的表面活性剂，当其浓度超过临界浓度以后表 面活性剂即形成胶束，中性粒子在胶束相与水相之间分配，因其本身疏水性不同而 实现分离。 通过对毛细管及其填充物进行修饰、更换或改进，可以创造出各种不同的分离 模式：包括电泳、电色谱以及多种联用方式等。这与传统的电泳或色谱不同。典型 的电泳分离模式有毛细管电泳、等速电泳、等电聚焦等，典型的色谱分离有各种填 充毛细管电色谱、空管电动色谱等( 表1 1 罗列了一些毛细管电泳分离模式) 。在这 些分离模式中，c z e 和m e k c 是最常用的两种分离模式。 表1 1 毛细管电泳分离模式及其分类 1 2 胶束毛细管电泳( m e k c ) 1 9 8 4 年，日本京都大学融【2 】( 寺部茂) 等人将超过临界胶束浓度的阴离子 表面活性剂十二烷基硫酸钠( s d s ) 引入c e 缓冲液，形成由阴离子胶束构成的准 固定相，成功地分离了中性酚类化合物，提出了胶束毛细管电泳( m i c e l k e l e c 仃o k i n e t i cc 印i 1 1 a wc h r o m a t i ) g r a p h y ，m e k c ) 的概念。这是毛细管电泳历史上 一次划时代的变革，这种模式把电泳技术与色谱技术相结合，其突出特点是将只能 分离离子型化合物的电泳变成不仅可分离离子型化合物，而且也能分离中性化合物 的电泳，从而大大展宽了电泳的应用范围。在c z e 中，带电物质离子质量的大小和 电荷存在着差异( 荷质比不同) ，从而导致分离物质的电泳淌度不同而实现了彼此 2 硕士学位论文 k 队s t e r st h e s i s 问的分离，但是c z e 只能分离带电荷的物质，而不能分离中性物质，在掀c 中 含有两相( 水相和胶束相) ，中性分析物的非极性部分与胶束结合，以与胶束相同 的速率迁移，而极性物质呈游离状态，靠电渗流的作用进行迁移，分析物的分离主 要是依赖其在胶束相和水相间的分配。疏水性越强的物质与胶束相的相互作用就越 强，与胶束相相互作用的溶质的迁移时间介于与胶束相互作用的溶质的迁移时间和 胶束完全作用的物质的迁移时间。似c 的实验操作与c z e 相同，唯一差别就是 在操作缓冲溶液中加入超过临界胶束浓度( c 咖) 的表面活性剂。 1 2 1 胶束毛细管电泳分离原理 表面活性剂是一端为亲水性、一端为疏水性的物质。当它们在水中的浓度达到 其临界胶束浓度时，疏水性的一端聚在一起朝向里，避开亲水性的缓冲溶液，亲水 端朝向缓冲溶液，形成胶束。表面活性剂可分为阴离子型、阳离子型、两性离子型 和中性分子型等不同种类。原则上凡是能在水或极性有机溶剂中形成胶束的物质， 都可以用于m e k c ，但实际工作中，由于受毛细管电泳分离效率及其检测等方面的 限制，可供选择的表面活性剂种类并不多。选用表面活性剂时应考虑以下要点： 易溶于水中；经济易得；紫外吸收弱或无；能形成稳定的胶束；不与 样品发生有碍分离的作用；中性样品需选择离子型表面活性剂，而离子型样品 可以选择所有种类的表面活性剂。 m e k c 中常用的阴离子表面活性剂是s d s ，当浓度在8 9i i l 】【i l o l l 时( 2 5 时 c m 。约为8 1m m o l l ) ，s d s 单个分子靠拢彼此间的疏水端聚集形成网状结构的带负 电荷胶束。带负电的s d s 胶束不溶于水，在毛细管中作为独立的一相向阳极迁移。 由于在中性或碱性条件下电渗流淌度大于胶束淌度，所以s d s 胶束的实际移动方向 和电渗流相同，最终在阴极端流出。 在m e k c 中，中性溶质按其亲水性不同，在缓冲溶液与胶束之间分配。疏水性 大、亲水性弱的溶质分配在胶束中的多，分配到缓冲溶液中的少；反之，亲水性强、 疏水性弱的溶质，分配到缓冲溶液中的多，分配到胶柬中的少。当溶质进入胶束时， 以胶束的速度向阴极迁移；溶质进入缓冲溶液时，以电渗的速度迁移。在胶束中分 配系数越大的溶质，在柱中迁移时间越长，保留性越强，从而使亲水性稍有差别的 中性物质在电泳中得以分离，所以m e k c 实际上是以胶束做“准固定相”，溶质在准 固定相和水相间分配的以电渗流作驱动力的液液分配色谱与电泳的完美结合【3 】。 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 2 2 胶束毛细管电泳中常用的“准固定相 1 2 2 1 表面活性剂 当溶液中表面活性剂的浓度达到临界胶束浓度时，表面活性分子的疏水端聚在 一起形成胶束，构成m e k c 中最常用的“准固定相”。按表面活性剂亲水一端基团的 性质可分为一下几类： ( 1 ) 阴离子表面活性剂：分子的亲水端带负电荷，如十二烷基硫酸钠、十二烷基苯 磺酸钠等。 ( 2 ) 阳离子表面活性剂：分子的亲水端带正电荷，一般为有机胺的衍生物，最常用 的是季铵盐，如十六烷基三甲基溴化铵等。 ( 3 ) 两性离子表面活性剂：分子中同时存在酸性基( 如羧基、磺酸基或磷酸基) 和 碱性基( 如胺基或季铵基) ，在等电点( p i ) 时，为电中性；当p h p i 时，表 面活性剂呈阴离子型；当p h 3 0 0 - f o l d 0 0 5 - 3p p b 【7 l 】 c 照 c o c a i l l e 2 0 0 f o l d 2 i l g ，雌 【7 2 】 ，、7 _ fz u u i o i l j m e k c p h e n o 珂a c i d i ch e r b i c i d e f l u o r e s c e i n - 5 一i s o m i o c y a i l a 毫e ， u c e f l u o - r e s c e i n d i s o d i u m ， 5 一c a r b o x y f l u o r e s c e i n c z e p e p t i d e s c z e e d l a i n o r g a j l i cl e a d ( i i ) ， i n o 唱a i l i cm e r c u 巧( i i ) ， i n o 玛a j l i cs e l e m u m ( i v ) ， t r i i i l e n l y l l e a d ( i v ) ， c z e硒e t l l y l l e a d ( i v ) ， d i p h e n y l l e a d ( i ， p h e n y l m e r c u d ，( i d ， p h e n y l s e l e n i u m ( i i ) ， d i p h e n y l s e l e n i 啪( i d r h d ( 1 锄i n el2 3 c z e r i u o r e s c i e ns o d i 咖诎r i u o r e s c i e ns o d i 咖s a n c z e 艮一a g 伽i i s t s c z e m e t a l i o r 坞 c z e h i s t 锄i i l e h e r o i i l c 珏 c o c a i n e 1 4 7 8 0 0 0 11o 0 0 0 f o l d 0 1 - o 5n g ，m i【7 3 】 9 4 f o l d 一 1 0 8 f o l d - 【7 4 】 1 6 0 f 趴d 一 3 0 0 0 ，f o l d 一 【7 5 】 1 0 0 f o l d 7 3n m l 【7 6 】 1 4 9 0 f o i d o 1 1 3 2n 咖l 2 7 9 f o l d 2 4 1 5n g m l 3 4 0 f o l d o 3 0 0 2n g m l 8 1 3 f o l d 0 1 4 0 3n g m l【7 7 】 6 0 7 f o l d 0 2 5 4 4n 砌 8 7 0 f o l d 0