（分析化学专业论文）某些分析试剂及其金属配合物与蛋白质相互作用的研究与应用.pdf

摘要 本文共分为四章，研究了蛋白质与铬黑t 、变色酸偶氮化合物、 荧光镓试剂及其金属配合物的相互作用与生化分析应用。 i回顾了近年来蛋白质定量分析的一些主要方法，包括共振散射 法，分光光度法，荧光光度法和毛细管电泳法。 使用分光光度法研究铬黑t 与蛋白质的作用 研究蛋白质与偶氨氯膦i 和偶氮氯膦i i i 及其金属配合物之间的 结合作用，两种方法均可用于生物材料分析 应用共振光散射法研究了荧光镓试剂与蛋白质的相互作用，此方 法的分析特性优于常用的方法。 关键词：蛋白质，铬黑t ，偶氮氯膦i ，偶氮氯膦i ，荧光镓试剂，共 振光散射 a b s t r a c t t h et h e s i s ，w h i c hi s c o m p o s e d o ff o u r c h a p t e r s ，d e a l s w i t ht h e i n t e r a c t i o n sb e t w e e nb s aa n de r i o c h h r o m eb l a c kt c h l o r o p h o s p h o n a z o 【，c h l o r o p h o s p h o n a z oi i i ，l u m o g a l l i o na n dt h e i rm e t a lc o m p l e x s t h e c o n t e n t sa r ea sf o l l o w s l r e v i e w i n gs o m em a j o r m e t h o d sw i d e l yu s e di nt h e q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o fp r o t e i ni nr e c e n t y e a r s ，i n c l u d i n g r e s o n a n c e l i g h t s c a t t e r i n g ，s p e c t r o p h o t o m e t r y ， f l u o r e s c e n c ea n d c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s 2 s t u d y i n g t h ei n t e r a c t i o no f b s aw i t l le b t 3 r e s e a r c h i n g t h ec o m b i n a t i v ea c t i o n so fb s a w i t hc p aia n dc p ai i i t h e s et w om e t h o d sa r eb o ms u i t a b l ef o ra n a l y z i n gt h eb i o c h e m i c a l m a t e r i a l s 4t h ei n t e r a c t i o no fb s aa n dl u m o g a l l i o n i ss t u d i e db yr e s o n a n c el i g h t - s c a t t e r i n gt e c h n i q u e s t h e m e t h o di sb e t t e r t h a ns o m e e x i s t i n g p r o c e d u r e s k e y w o r d s ：p r o t e i n ，e b t , c p a i ，c p ai i i ，l u m o g a l l i o n ，r e s o n a n c el i g h t - s c a t t e r i n g i i 第一章近年来蛋白质测定主要研究方法的回顾 第一章近年来蛋白质测定主要研究方法的回顾 一个生物体从出生、繁殖下一代，到生命的结束，无时无刻不在进行着各 种化学和物理的变化。从现有的知识看，地球上所有生物体的全部活动都是由 不同的蛋白质来承担和调节的。 蛋白质是生命现象的物质基础，有着各种生理上的功能，并从整体上维持 生物机体新陈代谢活动的进行。蛋白质的功能是多种多样的。为了适应这些十 分不同的功能的需要，不同的蛋白质需具有不同的性质。蛋白质的研究对生命 科学、生物化学、临床医学等都有十分重要的意义，通过对蛋白质的定性分析， 可以了解其结构与功能之间的关系，揭示生命现象的奥秘。而蛋白质定量是生 化、药物、食品及临床分析最常涉及的内容，也是临床检验中诊断疾病及检查 疾病治疗后康复情况的重要指标，又是许多生化药物分离提纯和质量检验中最 常用的手段，某些生命物质如酶、多肽、蛋白质及蛋白质激素的分离纯化更是 离不开蛋白质的定量测定。 蛋白质的定量研究方法很多，且各具特色，近十几年来主要使用了共振散 射法、分光光度法、荧光光谱法和毛细管电泳法等。本文将回顾这些方法的原 理特点。 1 1共振光散射法在蛋白质分析中的应用 一、光散射现象 光散射现象广泛存在于光与粒子的作用过程中，是指当光通过介质时在入 射光方向以外的各个方向上所观察到的光现象。它源于光电磁波的电场振动而 导致的分子中电子产生的受追振动所形成的偶极振子。根据电磁理论，振动着 的偶极振子是一个二次波源，它向各个方向发射的电磁波就是散射波。光散射 与介质的不均匀性有关，除了真空之外的其它所有介质都有一定程度的不均匀 性，从而产生散射光只是由于介质中粒子大d , f i n ，产生不同种类的散射。 第一章近年来蛋白质测定主要研究方法的回顾 当介质中粒子直径远大于入射光波长( 。) 时，产生的散射可看成是反射和折 射：如果介质中粒子直径与入射光波长相近，便产生了t y n d a l l 散射；如果介质 中粒子很小如d 2 0 。时，便产生以r a y l e i g h 散射为主的分子散射。分子 散射是由于分子热运动造成的局部密度涨落引起的。分子散射比t y n d a l l 散射要 弱得多。但是，即便十分纯净的液体和气体都能产生分子散射【l 】。根据入射光 和散射光波长的不同，光散射又可以分为弹性光散射、非弹性光散射和准弹性 光散射三种。而其中弹性光散射又称为经典散射或者静态散射。r a y l e i g h 散射 是d 、 o 1 5 ) 、甘氨酸( o 5 ) 、硫醇等。p c t c r s o ng l 列出了近2 0 0 种化合物 影响l o w r y 法测定的浓度限量【3 s 】，但三十年多来有许多改进，如加入碘乙酸盐 脱氧胆酸盐或n 2 酰马来酰亚胺等试剂来消除二硫苏糖醇( d t t ) 、2 巯基乙醇 和半胱氨酸等含s h 化合物的干扰。p o r t i a n s k y 等1 3 9 1 提出加入表面活性剂十二烷 基磺酸钠( s d s ) 于l o w r y 法反应体系中，使显色反应迅速完成，缩短了反应 周期。 用可溶性核糖核酸1 4 0 1 或脱氧胆酸钠( d o e ) 作共沉淀的方法浓缩蛋白质样 品溶液，离心除去上清液后，用l o w r y 法测定沉淀蛋白质的量收到良好的效果。 因为l o w r y 法很灵敏，o 1 m g m l 或低于此浓度的样品仍可得到很好的显色反应， 这样的蛋白质浓度常常已把干扰物质的浓度稀释到一个不重要影响的水平。以 后所做对l o w r y 法的改进，都包括了加f o l i n 试剂后放置3 0 m i n 的条件。 l o w r y 法定量蛋白质简单、灵敏和准确，是一般实验室最广泛采用的方法。 其不足之处是蛋白质，蛋白质问测值差异较大，反应速度稍慢及有时出现的标准 曲线的非线性等。三十多年来，许多研究者针对这些不足做了许多改进，使方 法不断臻于完善至今仍不失为蛋白质定量的一种最重要和最广泛采用的方法。 4 4 一甲酸喹啉法 4 一甲酸喹啉( b c a ) 的钠盐是稳定的水溶性化合物，它在碱性环境中能与 9 、 第一章近年来蛋白质测定主要研究方法的回顾 一价铜离子生成紫色复合物，可以利用此性质来定量蛋白质1 。碱性条件下 蛋白质与两价铜离子反应( x 2 缩脲反应) 中生成的c u + ，可用b c a 试剂检测， 读取a 。，以测定蛋白质的量。反应式如下： p r o t e i n + c u “一盟寸 + c u 。+ b c a o o c 、 叫、 c o o c o o 。 在广泛的p h 范围内，反应生成的颜色与蛋白质浓度成正比。与l o w r y 法 相比，b c a 法的常规测定程序( 1 0 0 1 2 0 0 1 tg m 1 ) 与l o w r y 法相近，但b c a 法抗试剂干扰的能力和工作试剂的稳定性均优于后者，新配和配制一周的b c a 工作试剂对测定无影响；在6 0 c 反应3 0 m i n ，显色后l h 内读a 。：。值无变化， 可见此法显色很稳定。b c a 法除对还原糖的干扰敏感( 可能是该法使糖把c u 2 + 还原为c u * 的原因) 外。对其他干扰试剂，特别是对常用蛋白质增溶的去污剂， 对4 m o l l 盐酸胍或3 m o l l 脲这样的变性剂均无影响。此法测定不同蛋白质时， 测值变化差别较小，对含有约0 5 1 0 ug m l 的蛋白质样液可精确测定。 5 染料探针法 最早用于测定血清白蛋白的染料是甲基橙【4 2 i ，此后在七十年代中期又相继 报道了几种染料探针法( 染料结合法) ：金莲橙g i ”】、氨基黑1 0 be 4 ”、溴酚蓝、 溴甲酚绿和溴甲酚紫m 。以上几种染料探针法在试剂的稳定性、实验操作的 简便性、分析精密度及抗干扰能力等方面都优于劳里法，但其灵敏度不及劳里 法高。 1 9 7 6 年，b r a d f o r d t 4 8 1 建立了以考马斯亮蓝g 一2 5 0 ( c b bo 一2 5 0 ) 测定微量蛋 白质的方法。c b bg 2 5 0 在酸性溶液中i z ：l 红棕色，与蛋白质结合后变为兰色， 吸收光谱的最大吸收波长从4 6 5 n m 移至5 9 5 n m ，且a 。与蛋白质的浓度成正比 1 0 、 第一章近年来蛋白质测定主要研究方法的回顾 关系。b r a d f o r d 法具有一般染料结台法的优点，而其灵敏度可以与劳里法相比 拟，甚至超过后者目前在生化分析中得到广泛运用渺“j 。但该法易受一些表 面活性物质如去污剂、t r i t o nx 1 0 0 、十二烷基磺酸钠的干扰，吸收值随蛋白质 种类的不同而有较大差异，某些蛋白质测定时存在标准曲线非线性的问题。1 5 2 十年前国外已经有商品c b bg 2 5 0 试剂盒供应，提供染料试剂和标准蛋白 质，使方法规格化，使用方便，近几年国内也有配好的c b bg 2 5 0 染料试剂市 售，但价格比之自制要贵得多。按b r a d f o r d 法配制的试剂使用时有时会在比 色过程中出现沉淀。于是用正交设计考察了染料浓度、磷酸浓度、乙醇浓度、 蛋白质种类和显色反应时间等5 个因素，做5 种水平的实验，结合直观分析， 根据实验结果选出最佳条件为：c b bg 2 5 0 浓度为o 0 1 2 ，磷酸和乙醇浓度分 别为1 0 3 和o 7 4 m o l l ，反应5 m i n 后读气9 ，。按改进法、经典法配制的染料试 剂与市售试剂相比较，表明前者对5 种蛋白质测值差距减小，比较新配和储存 3 0 天后的试剂，前者在显色的灵敏度和稳定性方面优于后两者哪l 。 另外还发展起一些其他染料探针法，也已用于蛋白质的测定。m a t s u m o t o t 删 等将铬天青b 用于尿蛋白的定量测定，童沈阳等f ”l 将水溶性卟啉t p p s 用于染 色测定蛋白质。 蛋白质染料结合法比l o w r y 法简单( 一个试剂) 、更快( 5 r a i n ) 和不受某 些常用试剂干扰的优点，因而有取代l o w r y 法的趋势，但该法也受某些常用试 剂( 如去污剂) 的干扰，吸收值随不同蛋白质种类而有较大差别的缺点，某些 蛋白质测定时也有标准曲线非线性的问题。 6 染料金属络合物探针法 1 9 8 3 年。f u j i t a y t 5 6 1 等首次提出利用染料金属络合物测定蛋白质的方法。 其原理与b r a d f o r d 法类似，酸性条件下，染料一金属络合物可以和蛋白质作用， 引起吸收光谱的变化，最大吸收峰红移，且在最大吸收波长下吸光度与蛋白质 浓度呈正比。该法在灵敏度、选择性等方面都较染料探针法优越，特别是蛋白 质间测值差异较小，受到人们关注。 到目前已发表的这方面的文章约有十几篇，大多出自f u j i t a y 等人。他们 的工作很系统，也很有特色，利用表面活性剂作为分散剂、稳定剂和增敏剂a 在进行蛋白质定量的同时，研究了溶液中染料一金属络合物的存在状态及其与 第一章近年来蛋白质测定主要研究方法的回顾 蛋白质之间的作用，并对反应的机理进行了初步的探讨。他们还利用倒数光谱 来提高方法的灵敏度m 1 及将此方法应用于流动注射分析( f i a ) m 】。有关这方面 的研究隋况见下表： 染料一金属 表面检测范围测定样品 络合物活性剂 ( r i m ) ( ug l o m l ) p r _ l o ( v 1 3a 唱 6 0 00 , - - 4 0 0 尿蛋白 5 6 】 p v _ m o ( v i ) p v a6 8 00 3 0 0 白蛋白p 9 j c a s _ a l ( i i i ) p g n p6 3 012 5 2 5 0 人血清白蛋白【删 r c i g a n ) - 1 t i t o n x 一1 0 06 4 01 2 5 1 5 0 人血清白蛋白f ”】 m o ( v 1 ) p 0 - s p f - u ( v i ) t r i t o r d q 1 0 l5 5 52 0 一5 0 0 白蛋白【6 l 】 0 - s p f - t i ( i v ) 2 0 ，3 0 0 尿蛋白【蜊 c a b - b e 0 i 、 2 0 1 5 0 人血清白蛋白 1 0 一1 0 0 ( f i a ) d b p f - t i ( i v ) t w n8 06 0 5m 0 尿蛋白旧1 c a s - f e ( 1 1 1 ) 6 6 0 白蛋白呻】 其中p r m o ( v i ) 络合物探针法比较成熟，已广泛应用于临床学上检测尿蛋白瞄删 和脑脊液中的微量蛋白畔刊，均取得满意的结果。 f u j i t ay 等通过对染料和染料一金属络合物溶液状态以及络合物和蛋白质 的热力学参数的分析，认为其间是一种疏水或疏水库仑作用田16 1 1 0 目前这方面 的作用机理尚不十分清楚，进一步的工作还有待开展。 另外还有些其他的定量方法，如银结合法( s i l v e rs t a i n i n g ) 1 7 2 1 胶体金 ( d o l l o i d a lg o l d ) 亲和法p 3 1 等。这些方法各有优点及其局限性，根据不同情况， 选择适当方法进行蛋白质的测定，才能达到准确的要求。 几种常见方法比较见下表： 方法灵敏度 干扰蛋白质间差异 取缩脲法 低多 小 l o w r y 法 较高多 中等 b c a 法高 少小 染料探针法 高较少 中等 络合物探针法 高少 小 第一章近年来蛋白质测定主要研究方法的回顾 分光光度技术不仅能够用于蛋白质的定量测定，还可以进行蛋白质的特性 研究。示差光谱法即可用于蛋白质大分子与配基间相互作用的研究，以便探讨 蛋白质分子的若干特性，如血红蛋白与小分子化合物间的反应，当植酸盐与血 红蛋白结合后，就会导致血红素存在环境的变化，其光谱性质会相应发生极微 小的变化利用示差分光度法分析即可获得满意的结果】。示差光谱法还可探 讨蛋白质芳香残基所处环境，极性或非极性，数量的多少并可以检测和追踪 蛋白质分子中q 一螺旋、b 折叠等相互问构相的转化过程m 】。 1 3 荧光光谱法在蛋白质分析中的应用 荧光光谱法用于蛋白质的测定时，常用的几种方法是内源荧光法、荧光探 针法、荧光偏振、时间分辨荧光光谱法以及激光诱导时间分辨免疫分析法。 1 内源荧光法 蛋白质中存在着t r p 、t y r 、p h e 残基，能够吸收2 7 0 3 0 0 n m 的紫外光而 发出紫外荧光。当测定体系中加入小分子配体( s m ) 时s m 与蛋白质发生相 互作用，会导致蛋白质荧光的淬灭，利用s m 对蛋白质内源荧光的淬灭这一现 象可以确定蛋白质与s m 的作用类型及其结合部位等。马贵斌1 7 6 1 等通过药物分 子头孢菌素、氟哌酸等对白蛋白荧光的淬灭作用，确定了氟哌酸在人血清白 蛋白中与色氨酸残基的距离及药物分子可能进入的区域和位置。d e r - b a l i a ng p 等【7 7 1 基于生物素使抗生物素蛋白的天然荧光熄灭测定了生物素化蛋白质的生物 素部分的数量。k u n t s o nj r 等f 7 ”则利用荧光淬灭测定蛋白质与d n a 及配体间 相互作用。 2 荧光探针法 对于蛋白质的研究仅利用其内源荧光是不够的，需要通过外源荧光性质的 研究才能获得更多关于蛋白质分子的各种信息，这就使得荧光探针放对蛋白质 分析有着极其重要的意义，已成为蛋白质微量检测及溶液的构相分析中不可缺 少的手段之一。 ( 1 ) 荧光染料探针法 一些荧光染料在与蛋白质作用后，荧光强度会显著增大，利用其荧光增值 第一章近年来蛋白质测定主要研究方法的回顾 可以测定蛋白质的含量。w e n zi 等m i 将荧光胺用于蛋白质的检测。丁文娣等m i 用邻苯二甲醛测定球蛋白，可以测至1 5 1 0 g m l 。另一方面，蛋白质的存在 将对某些荧光染料起淬灭作用，由淬灭的程度亦可进行蛋白质的测定。 吸附或共价结合在蛋白质上的染料荧光光谱特性的变化，实际上是由于蛋 白质构相的变化所引起微环境变化的信号，利用它们对环境极其敏感的特点， 根据其在不同蛋白质分子中的量子产率、峰位置及谱带宽度的变化，就可以推 知许多关于蛋白质的信息如物化特性、构象稳定情况及变化等。 a n s ( 8 苯胺基一1 萘磺酸) 能够与去辅基血红蛋白结合，结合前在水溶液 中a n s 量子产率和荧光峰波长分别是o 0 0 4 和5 15i l m ，结合之后量子产率明显 增大，荧光峰蓝移，相应变成0 9 8 和4 5 4 n m 。可以推断出蛋白质与a n s 结合 部位是疏水性很强的微区，其他证据还证明，a n s 和去辅基血红蛋白的结合部 位是它与血红素结合的部位】。 l i nt i 等【蜊发现芘和香豆素的几种衍生物具有较高的荧光量子产率，是蛋 白质的理想荧光探测试剂。并利用其对环境极其敏感的特点，进行单个细胞内 蛋白组分的微环境探讨。 近几年有关荧光染料探针的研究更为活跃，又发展出很多新的染料探针， 如：羟甲基吲哚花青系列染料1 8 ”、长波激发香豆素衍生蛋白探针i “1 等，并都已 成功地用于蛋白质的分析工作。这一领域的发展前景还是十分广阔的。 ( 2 ) 稀土荧光探针法 稀土荧光探针的应用为蛋白质的研究工作开辟了一条新的途径。可用于研 究蛋白质分子与金属离子结合部位的结构类型，如m u l q u e e np 等删以t b ( i i i ) 为 探针研究了钙调蛋白的c a ( i i ) 结合部位，h o r r o c k 等【蚓以e u ( i i i ) 为探针研究了小 白蛋白c a 0 i ) 的结合部位。 t b ( i i ) 或e u ( i i i ) 荧光寿命的测定能够给出蛋白质分子的构象及构象动力学 方面的信息。a u s t i n 等m 使用t b ( i i i ) 为探针研究了钙调蛋白的构象动力学。 另外稀土螯合物也可以作为荧光探针进行蛋白质的分析，如铽的螯合物己 用于蛋白质的定量测定陋叫。 3 荧光偏振 利用荧光体在转动扩散速度上的差异而导致偏振荧光的差别，建, - r 2 r 荧光 第一章近年来蛋白质测定主要研究方法的回顾 偏振测定法【9 0 】。测定了荧光偏振，就能够获得许多蛋白质分子的信息，如形状 大小构象等，从而了解蛋白质与配体问结合部位的亲和性及化学计量，研究其 间的相互作用和动力学。 当一些小分子如辅酶、辅基、药物等与特异蛋白质反应时，就会改变其荧 光偏振特性，如果结合的紧，结合后蛋白质分子的弛豫时间长，荧光偏振就大， 反之偏振就小。马贵斌等剐利用荧光偏振和能量转移技术研究了维生素b 6 与 芦丁和蛋白质的作用，给出了药物与蛋白质缔合的离解常数，而且测出了v b 6 和芦丁在人血清蛋白中的结合位置，以及与第2 1 4 位色氨酸残基的距离。 4 时间分辨荧光光谱法 时间分辨荧光光谱法是依据待测组分荧光衰减特性的差异而进行选择性测 定，可以消除瑞利和拉曼散射的干扰又可以根据荧光寿命的差异对荧光光谱 重叠组分进行测定，为复杂体系的荧光测量提供了选择性基础。 时间分辨荧光免疫分析以具有较长荧光寿命的荧光基团作为免疫标记， 利用时间分辨荧光测量技术进行测定。一方面可以在荧光分子定量中获得高灵 敏度，另一方面可以通过时间分辨技术使选择性可以得到改善，这样就可以定 性和定量分析微量蛋白质。 某些镧系元素的螯合物荧光寿命较长，适于作为荧光免疫标记，c h i s t o p o n l o s 等【9 2 1 以e u ( 1 i d 螯合物标记的抗生蛋白链菌素作检测试剂，用时间分辨荧光法 测定甲胎蛋白。 5 激光诱导时间分辨免疫分析法 在稀土络合物时间分辨荧光光谱和免疫分析的基础上发展起来的激光诱导 时间分辨免疫分析法在灵敏度、专一性、稳定性等方面均可与放射免疫分析相 媲美，是超微量蛋白质免疫分析的有力手段，已用于人体血清中甲胎蛋白的测 定m 1 及人尿中免疫球蛋白g 的测定畔i 。 以上，我们对分光光度法及荧光光谱法在蛋白质定量测定和定性分析中的 应用作了简单介绍和评述。随着新型分析试剂的开发和新的分析方法的出现， 它们在蛋白质分析中的应用会更加广泛。 第一章近年来蛋白质测定主要研究方法的回顾 1 4 毛细管电泳法在蛋白质分析中的应用 毛细管电泳( c e ) 是近十几年来发展起来的一种分离分析技术，兼有普通 电泳和色谱的双重优点，以其高效、快速、运行成本低、信息量大和易于自动 化等特点倍受生物化学和临床药物等领域的专业人士的青睐，被认为是九十年 代最重要的分离分析手段之一哪l 。最近几年人们开始把c e 应用于包括蛋白质 在内的各种临床指标的检测，它很有可能成为未来临床实验室的一种不可缺少 的分析技术。本节以血液蛋白为主要对象对毛细管电泳这种新技术在临床上的 应用和发展前景进行评论。 一、血液蛋白的毛细管电泳分析 1 血清蛋白 血液具有高度不均一性，组成复杂，一般说来很难分析。电泳方法是在所 有的临床实验室中普遍采用的一种分离血清蛋白的生化分离方法。在人体血清 中已查明有3 0 0 多种不同的可溶性蛋白质，但其中大部分含量极低。在多数电 泳方法( 包括c e ) 的检测限下。琼脂糖凝胶电泳( a c e ) 或醋酸纤维膜电泳可 将血清蛋白分为清蛋白、a ，、n ：、b 、y 球蛋白等五条主要区带，聚丙烯酰胺 凝胶电泳、免疫电泳等则可分离成3 0 5 0 条区带，显示出许多微量的血清蛋白。 早在1 9 8 3 年，当毛细管电泳还是一种鲜为人知的技术时，j o r g e n s o n 和l u k a c s 9 6 1 就首先用毛细管区带电泳成功地分离到血清蛋白的五条谱带但他们用的分析 时间过长( 约4 0 m i n ) 。大约十年之后c h e n 和他的合作者们【9 7 】的研究表明c e 可以和a g e 相媲美。他们采用不涂层的石英毛细管柱p h = 1 0 0 的缓冲液， 2 1 4 r t m u v 检测，在9 0 s 内除可清晰地将血清蛋白分为q1 、d2 、1 3 、y 球蛋白 和清蛋白等五个谱峰外，还有少量的前清蛋白。在增加缓冲液的离子强度后， 分辨率进步提高可在2 5 0 s 内得到1 0 个峰。c h e n 蜘又用c e 方法分析骨髓 瘤患者的血清样品，并以a g e 法作为对照，发现c e 不仅能再现a g e 的分析 结果，而且更容易看到不正常峰的存在。与此相似，k i m 等1 9 9 1 分析了患有肝硬 化、肾病综合症、多克隆y 病的患者的血清，把得到的c z e 结果与a g e 相比， 6 第一章近年来蛋白质测定主要研究方法的回顾 进一步证实了c e 的高分辨率，并且认为其在再现数据分析、快速、自动化等 方面的优点可能使之成为一种新的分析血清蛋白的技术。另外，他们计算了五 条主要谱带的面积与其相对应的蛋白浓度的关系，两者间的线性关系良好，与 a g e 的结果相关性也很好。这表明毛细管电泳具有很好的可靠性和重复性，可 用于诊断血清蛋白的异常情况。k l e i n 和j o l l i t ￥采用c e 和a g e 两种方法对1 0 0 例成年男女的血清进行了分析，得到的五条主要蛋白带的百分含量间有差别。 这是因为c e 方法采用2 1 4 n m 处肽键的吸收进行检测，而a g e 是利用对染色带 光密度的测定来定量的，要涉及到染色时间、温度、染色剂浓度、显色时问等 多种因素，误差相对太些。采用“加入法”或“免疫消去法”可对血清蛋白的 毛细管电泳图上的峰进行认证。所谓加入法是把纯蛋白样品加入到血清中，观 察峰高增加。免疫消去法是将血清与某种蛋白的抗体混合后，观察峰高的降低。 前清蛋白在血清中的正常浓度范围是2 0 0 - 4 0 0 m g l ，占总血清蛋白的0 3 ，多数 c e 方法都可检测到，而其它一些电泳方法很少显示前清蛋白的峰。 2 免疫球蛋白 血清中的y 球蛋白部分含有多种免疫球蛋白( i g ) ，这类抗体蛋白能与抗原 特异反应。以消除或排除抗原异物，保护机体免受侵害，y 球蛋白含量的变化 与许多疾病的发生有关，这类病统称y 球蛋白病。典型的y 病可分为五类：多 克隆症、有正常不均一免疫球蛋白的单克隆症、蛋白中含有本周蛋白的高y 球 蛋白症、有减少的不均一免疫球蛋白的单克隆症、有多个单克隆带的寡克隆症。 毛细管电泳的一个重要应用是可以利用电泳图上_ r 球蛋白的特殊峰形来诊断y 球蛋白病。把c e 与免疫消去法相结合可以确认引起y 病的异常免疫球蛋白的 种类，对疾病的诊断提供重要信息。k l e i n 和j o l l i f f 利用c e 和a g e 两种方法 对一患有y 病病人的血清进行了分析，在a g e 上，表现为1 3 部分有点升高，被 认为是运铁蛋白升高。而在c e 图上则可清楚地看到有一个小峰从运铁蛋白分 出来，诊断患有i 吐型轻度y 病。最近，r c l a r k 等邮1 利用毛细管区带电泳( c z e ) 和琼脂糖凝胶电泳( a g e ) 两种方法对3 0 5 例单克隆病患者的血清样品进行了 分析。c z e 方法采用不涂层的毛细管柱，p h = 1 0 的硼酸缓冲液，在1 2 0 s 内即可 完成一个样品的分离，y 、1 3 、o ：球蛋白和清蛋白的迁移时间的相对标准偏 差分别为0 6 1 、0 7 5 、0 5 0 、0 4 9 ( n = 5 i ) 。得到的c z e 结果与a g e 相同， 第一章近年来蛋白质测定主要研究方法的回顾 有些甚至更好。c z e 可以清楚、快速地判断出血清蛋白的电泳图上不正常峰形 是否由单克隆蛋白引起，而如果不采用免疫电泳( i e p ) 或免疫固定电泳( i f ) ， a g e 是不可能做到这一点的。这些结果表明c z e 完全可以取代普通平板电泳 技术对血清蛋白的峰形做定性判断。 3 脂蛋白 血清中的脂肪以水溶性的脂蛋白形式存在。脂蛋白由脂类和载脂蛋白 ( a p o ) 组成，按密度大小分为五类：乳糜微粒( c m ) 、极低密度脂蛋白( v l d l ) 、 中等低密度脂蛋白( i d l ) 、低密度脂蛋白( l d l ) 和高密度脂蛋白( 皿l ) 。 与这些脂蛋白相关的载脂蛋白至少有a e 五种。利用毛细管电泳( c r r p ) ( 在 电泳之前先要用脂类染色剂对血清样品染色) 可将血清脂蛋白分为1 4 个部分 1 1 0 2 。这1 4 个部分前6 个部分属于h d l ，主要载脂蛋白是a i 、a i i ；7 - 1 4 部分 是含有载脂蛋白b 的脂蛋白，可分为v l d l 、i d l 、l d l 。从c e 图中1 4 个部 分的峰形、峰高变化可直接判断出血清脂蛋白代谢是否发生异常；可对高脂蛋 白血症进行分类；表征家族性l c a t 缺乏症等脂肪、脂蛋白代谢的遗传性缺陷。 另外，利用c i t p 还可以监测药物治疗中脂蛋白的变化，预测冠心病的发生。 t a d c y l l 0 3 】不s d s 加到运行缓冲液中，利用聚丙烯酰胺涂层柱，在1 2 m i n 内一次 将h d l 和l d l 混合物中的载脂蛋白分开。这是h p l c 和平板电泳做不到的。 r l c h m a n n 等【1 “1 用毛细管凝胶电泳与p c r ( 聚合酶链式反应) 方法相结合，对 遗传脂蛋白b 1 0 0 缺少症进行了研究和认证。 4 血红蛋白 人体内正常的血红蛋白有3 种：h b a ( q ：且2 ) 、h b a 2 ( q2 62 ) 和h b f ( o zy2 ) n 正常成年人的血红蛋白成分主要是h b a 和h b a 2 ，h b f 是胎儿和初生婴儿的主 要血红蛋白成分。异常的血红蛋白是由于0 链变异或缺失a 链造成的。常见的 血红蛋白病有镰刀型贫血、n 、b 地中海贫血症等。最近的研究发现可以用毛 细管区带电泳( c z e ) 和毛细管等电聚焦( c i e f ) 两种方法分离血红蛋白溶液。 0 n g 等 t o s | 人利用c z e 对正常人和怀疑有地中海病患者的血红蛋白样品进行了分 离，在p h = 1 1 8 的磷酸缓冲溶液中，8 m i n 内明显区别出正常人和b - 地中海病 人的血红蛋白样品。k l e i n 和j o l l i f f 的研究表明不一定要用极端p h 来分离血红 蛋白，他们采用中性的缓冲液对a s c 、a s 、s - c 等不同血红蛋白变体进行了 第一章近年来蛋白质测定主要研究方法的回顾 有效的分离。朱明德”“1 、m o l t e n i ”、h e m p e 1 等人用c i e f 对血红蛋白a 、a 2 、 a c 、f 和血红蛋白变体s 、c 、d 等进行了分离，分析时间一般在2 0 m i n 之内， 比c z e 的分析时间长，但分离效果高，利用等电点与迁移时间的线性关系还可 以对h b 变体定性分析。朱明德岬利用c i e f 对a - 地中海病进行了认证。 二、展望 在过去的5 年中毛细管电泳的发展已引起了生命科学各领域以及相关学科 的极大重视，它作为一种重要的分离分析方法已开始被许多分析实验室接受， 很有希望在不久的将来广泛应用于临床检验。从前文所述，己可以看到c e 有潜 力改善目前的几种常规血液蛋白检测。它的高分辨率、操作自动化、低消耗、 分析时间短等特点可能对血清和血红蛋白的分离分析带来一次技术上的突破。 为了提高c e 在临床医学上应用的能力，还需要进一步改善检测灵敏度。可以预 期，随着实验手段和仪器制造的不断改进，毛细管电泳将会在血液蛋白等临床 分析领域不断普及，最终成为临床实验室中一种不可缺少的分析技术。 通过以上四部分对蛋白质定量分析方法的介绍，我们了解到生物分析试剂 与探针的研究与应用是生物分析化学的重要组成部分。当前，生命科学、临床 医学和环境科学的发展对生物活性物质的分析方法提出了更高的要求，而且研 究生物相关物质与试剂和探针的作用机理有利于弄清活性物质在生物体内的作 用机制。 在现有的研究工作的基础上，本论文将研究生物活性物质与染料如铬黑t ， 变色酸偶氮染料( 包括偶氮氯膦i 和1 1 1 ) ，荧光镓试剂的直接或其金属配合物 组成的多元体系中的相互作用及其分析特性，提出了一些适用于生化分析的新 方法和新体系。 1 9 第二章铬黑t 与蛋白质作用研究 第二章铬黑t 与蛋白质作用研究 2 1 引言 蛋白质是生物体中一类重要的生物大分子，它不仅对于维持生命过程是 十分重要和必不可少的，而且与遗传密码的翻译、信息的转录、d n a 的复 制等都有密切关系。有关生物大分子与小分子探针反应机理的探讨，是生命 科学、临床医学和化学研究的重要内容之一，已经引起科学工作者的广泛关 注和兴趣。部分研究成果o “1 已经用于临床医学检验和生命科学研究中生 物大分子的分析检测。这对于推动生命科学的研究具有重要的现实意义。 在蛋白质的测定方法中，染料结合法是较常用的方法之一，它不需要特 别的装置，操作简单，灵敏度也较高，干扰物质少，迄今为止，染料结合法 的应用已有五十年，所用的染料有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿、溴甲酚 紫和溴酚蓝等，这些都是阴离子染料，一般认为同蛋白质分子中的赖氨酸和 精氨酸残基作用。根据染料与蛋白质的反应建立蛋白质的分析方法的研究已 有不少报道但寻求简单方便准确的蛋白质测定方法仍是研究热点。本节中 讨论的铬黑t f e b t ) 是测定金属阳离子的试剂，由于其分子结构中含有磺酸 基，在酸性条件下能够与正电荷的蛋白质分子作用，吸光度与蛋白质浓度成 正比，可以用于蛋白质的测定。通过实验确立了最佳反应条件，讨论了离子 强度、表面活性剂等对反应的影响，研究了干扰物质对测定的影响，测定了 人血清样品。与经典的考马斯亮蓝法相比，本法灵敏度较高，体系简单稳定， 线性范围宽，干扰少适用于实际生物样品中蛋白质浓度的测定。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器和试剂 u v 一2 4 0 型紫外一可见分光光度计( 日本岛津公司) ； p h s 一2 型酸度计( 上海第二分析仪器厂) ：l c m 比色池。 e b t ( a r 级) ：称取e b t ( 上海新中化学厂产品) 0 1 1 6 1 2 9 ，以水溶解并 第二章铬黑t 与蛋白质作用研究 稀释至2 5 0 m l ，工作溶液浓度为1 0 1 1 0 一m o l l ，按需要以水稀释： 牛血清白蛋白( b s a ) ：称取0 0 5 9b s a ( s e r v a ) ，以水溶解，稀释至1 0 0 m 1 浓度为5 m m l ： h c i - n a a c 缓冲溶液：将浓度为1 0 m o u l 的n a a c 溶液和1 n 的盐酸分别取 5 0 m l ，4 6 2 5 m l 混匀，在酸度计上调节至p h 3 4 9 ； n a c l 溶液：称取o 5 8 5 9n a c i 溶解于水中，稀释至1 0 0 m l ，浓度为0 1 m o f f l ； 所用试剂均为分析纯，用水为去离子水。 2 2 2 实验方法 于1 0 m l 比色管中，依次加入1 0 1 1 0 。m o f f le b t 溶液2 m l ，p h 3 4 9 的 h c i - n a c l 缓冲液4 m l ，和一定量的b s a 工作溶液或样品溶液，用水稀释至1 0 n i l ， 混匀，放置5 n f i n 后，用1 0 m m 吸收池，以水作参比，在5 1 6 r i m 处测量吸光度 a ，相同条件下测量无蛋白质的试剂空白溶液的吸光度a 0 ，由a ( 哦- a ) 计 算蛋白质浓度。 2 3 结果与讨论 2 3 1 吸收光谱 图2 1 为依次加入0 1 0 5 n i lb s a 溶液的e b t - b s a 溶液在p h 3 4 9 的吸收光 谱。可见，e b t 与蛋白质有一定的结合作用。这可能是e b t 的- s 0 3 ( 图2 2 ) 部 分带负电，而与带正电的蛋白质发生作用。由图中可见e b t 的最大吸收波长为 5 1 6 n m ，加入b s a 后最大吸收波长未变，吸收强度增加，且随着b s a 加入量 的增大，a 变大。 2 3 2 反应酸度影响 一般认为，酸性染料与蛋白质的结合作用只在酸性、弱酸性介质中存在 这种情况下蛋白质带正电，而染料带负电。在染料蛋白质体系中，酸度对结 合反应影响很大。通过测定，发现体系在p h 3 4 9 处a 最大( 如图2 3 ) ，迸一 步用p h 3 4 9 的邻苯二甲酸氢钾h c l ，h c l 甘氨酸，h c b n a a c 和柠檬酸- n a o h 缓冲溶液试验，表明h c i - n a a c 中e b t - b s a 体系的a o 和a 最大，选用此种 缓冲溶液，用量2 m l 。 第二章铬黑t 与蛋白质作用研究 f i 9 2 1a b s o r p t i o ns p e c t r ao f ( a ) e b t , ( b ) e b t - b s a 2 o 1 0 。m o f le a t , 1 0 0 m g lb s a p h 3 4 9 n a o ，s 0 ho h 0 2 n n = n f i 9 2 2s t r u c t u r e o fe b t 第二章铬黑t 与蛋白质作用研究 司 q 1 0 q o b q q 0 4 q 吃 f i 9 2 3e f f e c to fp h o na b s o r b a n e eo fe b t - b s a c o m p l e x v n 。c l ( m i ) f i 9 2 4e f f e c to f n a c io i la b s o r b a n c eo fe b t b s ac o m p l e x 第二章铬黑t 与蛋白质作用研究 2 3 3 离子强度的影响 酸性染料与蛋白质的结合是一种静电作用，因此离子强度对结合作用影响 较大。用浓度为o 1 m o l l 的n a c i 溶液试验离子强度的影响，结果表明，加入 n a c i 会使体系吸光度下降，随加入量不同，变化不同，如图2 4 ： 2 3 4 反应时间、温度对体系稳定性的影响 在室温下蛋白质与染料迅速结合，随后a 在3 h 内保持不变( 如图2 5 ) ， 若放置更长时间，a 逐渐降低，反应溶液出现不溶物，而空白反应溶液至少 可稳定5 h 。可见，本体系适用于大量样品的分析，测量吸光度不必严格记时。 同时试验了2 5 到3 5 的反应时间和稳定性，结果表明温度影响不大。如 图2 6 在反应时间，反应温度和操作方面，本法优于l o w r y 法、铬天青s - a i ( i i i ) 法( 需反应3 0 m i n ) ，更优于需要加热操作的方法，如邻磺酸苯基荧光酮( o s p f ) t i ( i v ) 法、4 5 - 二溴苯基荧光酮- t i ( r v ) 法、5 b r - p a p s c o ( i i ) 法。其稳定性也 好于b r a d f o r d 法和邻苯三酚红- m o ( i v ) 法。 t ( m i n ) f i 9 2 5e f f e c t o ft i m eo ha b s o r b a n e eo fe b t - b s a c o m p l e x t ( ) f j 9 2 6e f f e c t o f t e m p e r a t u r eo na b s o r b a n c eo f e b t - b s a c o m p l e x 2 3 5 表面活性剂的影响 考察了乳化剂o p ，s d s ，t r i t o n x - 1 0 0 ，t w e e n8 0 ，c t m a b 等五种表面活性 剂，它们的存在在不同程度上降低了体系的吸光度( 如表2 1 ) ，其中带电荷的 s d s 降低作用更为明显，表明它参与了竞争反应，使得e b t - b s a 复合物难以 形成。 t a b l e 2 1e f f e c to fs u r f a e t a n to i lt h ee b t - b s a ( 1 0 m g l ) s y s t e m 2 3 6 线性范围和灵敏度 按实验方法绘制b s a 的工作曲线，如图2 7 所示，线性范围是0 - 2 0 m g l ，工 作曲线相关系数为0 9 9 9 ，检测限为0 7 9 m g l 。本法灵敏度虽低于b r a d f o r d 法， 但高于溴酚蓝法，溴甲酚绿法等且线性范围是b r a d f o r d 法的2 倍多。 第二章铬黑t 与蛋白质作用研究 2 3 7 干扰物质 测定了金属离子、氨基酸等对e b t b s a 体系的影响，结果见表2 2 。 由表2 2 中可见，试验的几种氨基酸干扰不大，而无机离子中的z n n 、f e 2 + 干扰较严重。在实际测定中，样品本身的无机离子含量很低，而且。样品经常 要进行几十倍乃至几百倍的稀释，这就使各种干扰影响更小。 2 3 8 人血清样品的测定 将本方法用于测定人血清( 南开大学卫生院提供) 中蛋白质，血清以水稀 释1 0 0 0 倍进行测定，同时用b r a d f o r d 法对照测定：在1 0 m l 比色管中，加入适 量蛋白质标准溶液或样品溶液，4 0 m lc b bg - 2 5 0 溶液，稀释至5 0 m l 。5 m i n 后 在5 9 5 n m 处，试剂空白作参比，测量吸光度，由工作曲线得到蛋白质浓度。两 种方法列于表2 3 。本法与b r a d f o r d 法无显著差异，表明本法适用于生化材料 分析。 o 1 5 0 1 0 司 0 0