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桂油生物降解及其产物分析 摘要 天然苯甲醛是一种品质优越、应用面广的食品香精，深受人们喜爱。 但是存在产量低、市场上供不应求的问题，新的天然苯甲醛生产方法正成 为人们研究的热点。生物技术生产香料近几年来成为人们热点关注的领域。 依靠广西丰富的肉桂资源，进行桂油生物降解为天然苯甲醛的研究具有重 要意义。 本文针对桂油生物降解体系，利用高效液相色谱法和紫外分光光度法 建立了对反应体系的定量检测方法。同时，分别以肉桂醛和肉桂酸为前体 物质，进行筛选具有降解能力菌种的实验。主要取得如下成果： ( 1 ) 利用高效液相色谱法建立了可同时分析生物降解复杂体系中苯甲 醛、苯甲酸、肉桂醛、肉桂酸的分析方法。最佳色谱条件是：甲醇：水： 冰醋酸( 5 5 ：4 5 ：o 0 5 ) 为流动相，流速1 o m l m i n 一，紫外检测波长2 4 6 n m 。 通过精密度和回收率实验，结果显示该方法准确、可靠，可用于以肉桂酸 或肉桂醛为前体物质进行微生物转化的检测及过程监控。 ( 2 ) 研究了苯甲醛、苯甲酸的紫外吸收特性，发现以无水乙醇为溶剂， 苯甲醛、苯甲酸及其混合物在2 3 4 n m 处的吸收值只与两者总摩尔浓度有关， 并且在一定的浓度范围内，总吸光度与浓度成线性关系。利用苯甲醛、苯 甲酸的紫外光谱特性，建立了可用于苯甲醛苯甲酸体系的快速分析方法。 该方法具有重要理论研究意义和较高的实用价值。 ( 3 ) 根据不同地质特点、不同气候条件，采集有代表性的环境土样， 并进行了菌种的分离和转化肉桂醛为苯甲醛的能力验证，筛选能将肉桂醛 t 降解转化为苯甲醛的菌种。从中选取转化能力相对较高的一株菌( 菌种2 拌) ， 进行了转化条件优化。 ( 4 ) 创新性地筛选到一株高转化能力的菌株m u c o r s pj x 2 3 ，该菌株能 高效、高选择性的将肉桂酸降解为苯乙酮，并进行了发酵、转化等条件优 化实验。在最佳条件下，转化0 5 9 肉桂酸底物后，苯乙酮的含量最高可达 3 0 2 9 l 。肉桂酸的转化率为8 9 2 ，苯乙酮的收率为8 3 4 。 关键词：高效液相色谱法紫外分光光度法天然苯甲醛桂油生物降解 b i o d e g r a d a t i o no fc i n n a m o no i la n di t s p r o d u c t sa n a l y s i s a b s t r a c t n a t u r a lb e n z a l d e h y d ei sa l li m p o r t a n ts p i c eb e c a u s eo fi t ss u p e r i o rq u a l i t y a n dw i d ea p p l i c a t i o n ，b u tt h ey i e l do fn a t u r a lb e n z a l d e h y d ew a ss ol o wt h a ti t c o u l d n tm e e tm a r k e td e m a n d n e wt e c h n i q u eo fp r o d u c i n gn a t u r a l b e n z a l d e h y d eh a sb e c o m er e s e a r c hh o t s p o t s r e c e n t l y ，p r e p a r i n gs p i c ew i t h b i o t e c h n o l o g y h a sb e e nd r a w nm o r ea n dm o r ea t t e n t i o no fr e s e a r c h e r s g u a n g x i p r o v i n c ei sr i c hi nc i n n a m o nr e s o u r c e ，s os t u d i e so nb i o d e g r a d a t i o no f c i n n a m o n o i li n t on a t u r a lb e n z a l d e h y d eh a v ei m p o r t a n ts i g n i f i c a n c e i nt h i s t h e s i s ，a n a l y t i c a l m e t h o d s b yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h ya n du vs p e c t r o p h o t o m e t r yw e r ee s t a b l i s h e d 。w h i c hc a nb e u s e df o rp r o d u c t sd e t e c t i n gi nt h es y s t e mo fb i o d e g r a d a t i o no fc i n n a m o no i l u s i n gc i n n a m a l d e h y d e o rc i r m a m i ca c i da sp r e c u r s o r s ，e x p e r i m e n t so fs c r e e n i n g b i o d e g r a d a b l es t r a i n sw e r et a k e na tt h es a u l et i m e t h er e s u l t sw eg o t a r e ： ( 1 ) as i m u l t a n e o u sq u a n t i t a t i v ea n a l y t i c a lm e t h o do fc i n n a m a l d e h y d e ， c i n n a m i ca c i d ，b e n z a l d e h y d ea n db e n z o i ca c i di nb i o d e g r a d a t i o nm i x t u r es y s t e m w a ss e t u p b y h p l c t h eb e s t c h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n sw e r e m e t h a n o l - w a t e r - a c e t i ca c i d ( 5 5 ：4 5 ：0 0 5 ) a st h em o b i l ep h a s e ，a n dt h eu v d e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a s2 4 6 n m i na d d i t i o n ，t h em e t h o di sv a l i d a t e db y a c c u r a c ya n dr e c o v e r ye x p e r i m e n t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em e t h o dw a s a c c u r a t ea n dr e l i a b l ea n di tc a nb eu s e df o rp r o c e s sm o n i t o ro fc i n n a r n a l d e h y d e o rc i n n a m i ca c i d sb i o d e g r a d a t i o n ( 2 ) t h eu v - a b s o r p t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fb e n z a l d e h y d ea n db e n z o i ca c i d w e r es t u d i e d i tw a sp r o v e dt h a tt h ea b s o r p t i o nv a l u eo fb e n z a l d e h y d e ，b e n z o i c a c i da n dt h em i x t u r ew e r ea l w a y sr e l a t e dt ot h e i rt o t a lc o n c e n t r a t i o na tt h e w a v e l e n g t ho f2 3 4 n mw i me t h a n o la ss o l v e n t , a n dt h el i n e a rr e l a t i o nb e t w e e n t o t a l a b s o r p t i o n a n dc o n c e n t r a t i o nw a sf o u n d w i 廿lt h e s eu v a b s o r p t i o n c h a r a c t e r i s t i c s ，t h es i m p l e ，f a s tq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sm e t h o dw a se s t a b l i s h e d t h i sm e t h o dh a si m p o r t a n tt h e o r e t i c a lr e s e a r c hm e a n i n ga n dh i g h e rp r a c t i c a l v a l u e ( 3 ) a c c o r d i n gt o d i f f e r e n t g e o l o g ya n dd i f f e r e n tc l i m a t e ，m a n ys o i l s a m p l e s w e r ec o l l e c t e d 码e e x p e r i m e n t s o f s t r a i n s s e p a r a t i o n a n d b i o d e g r a d a b l e s t r a i n s s c r e e nw e r et a k e n o n eh i g h e rt r a n s f o r m a t i o na b i l i t y s t r a i nw a st a k e nt oc i n n a m a l d e h y d e sb i o d e g r a d a t i o ne x p e r i m e n ta n dt h e t r a n s f o r m a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d ( 4 ) af i l a m e n t o u sf u n g u s s t r a i nn a m e dm u c o rs pj x 2 3w h i c hc a n t r a n s f o r m e dc i n n a m i ca c i di n t o a c e t o p h e n o n e w i 廿l i l i g he f f i c i e n c ya n d s e l e c t i v i t y w a si s o l a t e df r o ms o i l s a m p l e t h eo p t i m i z a t i o n c o n d i t i o n s e x p e r i m e n t sw e r et a k e n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eh i g h e s ty i e l dc a l lr e a c h 3 6 9 lo fa c e t o p h e n o n ew h e nc o n c e n t r a t i o no fc i n n a m i ca c i dw a s5 0 e g l t h e c o n v e r s i o nr a t eo fc i n n a m i ca c i dw a s8 9 2 ：t h ey i e l do fa c e t o p h e n o n ew a s 8 3 4 k e y w o r d s ：h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ；u l t r a v i o l e t s p e c t r o p h o t o m e t r y ；n a t u r a lb e n z a l d e h y d e ；c i n n a m o no i l ；b i o d e g r a d a t i o n 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：压分劲 学位论文使用授权说明 绯乡月孑。日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 商口时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：l 媚 导师签名： 训7 年芗月专。日 广西，叫錾习e 士茸q 立论文桂妯j u 切降，暖其产物分析 第一章绪论 1 。1 产品概况 苯甲醛( b e n z a l d e h y d e ) ，俗称苦杏仁油，分子式为c d i s c h o ，分子量为1 0 6 1 2 ， 它广泛存在于杏仁、核桃仁、橙花、风信子、玫瑰、肉桂、依兰、香茅、樱桃等蔷薇科 植物中，主要以苷的形式存在于植物的茎皮、叶和种子内，例如苦杏仁中的苦杏仁苷【l 3 1 。 苯甲醛是重要的精细化工产品m ，是目前用途最为广泛和开发最早的芳香醛产品之一， 被广泛用于药物、香料、染料等生产中。 苯甲醛的生产主要有化学法合成和从天然产物中提取得到天然苯甲醛，而且天然苯 甲醛的香气品质优于化学合成品，是一种应用面很广的食品香精。但现在天然苯甲醛的 产量还很低，国际市场上仍处于买方市场，急需补给。随着人们生活水平的提高，越来 越多的人开始重视天然产品的应用嘲，新的天然苯甲醛生产技术也正成为人们研究的热 点。 1 2 天然苯甲醛生产技术发展概况和发展趋势 1 2 1 天然苯甲醛研究概况 目前，制取天然苯甲醛的方法主要有化学合成法、天然提取法和生物转化法。 1 2 1 1 化学法合成天然苯甲醛 有专利报导了一种在碱性条件下制备苯甲醛的方法唧。该方法利用苯甲醛与乙醛在 碱性条件下合成肉桂醛的反应的逆反应机理进行，主要的反应式是： q h oc i - i ：c h c h o b 十c n ，c h 。当0 + h ：。 这是一个可逆反应，反应中把苯甲醛不断移走，肉桂醛与水的反应就往化学反应式 左边方向移动，即反羟醛缩合反应。在反应中，将生成的沸点较低的乙醛蒸出，可使反 ，西大学嗝曩士茸爿盘饨。文桂 量油降“蛾产啊，分析 应向有利于苯甲醛生成的方向进行。 美国最早采用肉桂油通过逆( 反) 羟醛缩和反应制取食用苯甲醛，并把其产品称为 天然苯甲醛i m l 2 1 。该方法的技术特点是，反应过程简单，设备要求低，容易实现产业化， 产品对人体无不良影响。 易封萍，李伟光【”1 等人曾用天然肉桂醛臭氧化制取苯甲醛，得到纯品达9 8 以上的 符合美国企业产品标准的苯甲醛。实验中主要是利用肉桂油中富含的肉桂醛，使之发生 臭氧化反应，然后还原裂解得苯甲醛。该方法的缺点是步骤比较复杂，反应条件苛刻， 而且前期的设备投资较大，收效慢。 崔建国，卢军，樊平0 1 4 1 等人曾利用桂叶油水解制备天然苯甲醛。该方法从桂油出发， 加入乳化剂直接使桂叶油中的肉桂醛通过水解得到苯甲醛，其技术工艺路线短、反应条 件比较温和。 诸富根”1 等人以天然肉桂醛为原料，于n a ：c 0 3 水溶液中进行反醇醛缩合反应实验， 得到食用苯甲醛。该方法的缺点是需引入对人体有害的相转移催化剂。 华盛香料公司【1 6 】进行技术改进，将肉桂的提取物一桂叶油与碱性物质的水溶液分别 通过多通道喷嘴雾化后喷入反应器，使桂叶油与碱性物质在雾化状态下进行反应，生成 苯甲醛，然后采用常规的方法从反应产物中收集苯甲醛，得率较高。 1 2 1 2 天然提取法制备天然苯甲醛 应用于食品行业的天然苯甲醛是以蔷薇科植物苦扁桃、杏及其它含有苦杏仁苷的果 仁为原料，经水浸渍、磨碎并压榨除油后，用水蒸汽蒸馏和碱洗等特殊处理，再重蒸以 除去氢氰酸而成【埘。这种方法只有将剧毒的氢氰酸彻底除去才能使苯甲醛成为合格品， 但这样会使生产成本极度增高。 有专利【1 3 】报导从蒜头果的果皮果肉提取精油和天然苯甲醛的方法：用水蒸气蒸馏提 取蒜头果精油，在常压或减压下对精油精馏分离提纯，可获得高纯度天然苯甲醛；也可用 有机溶剂提取新鲜蒜头果果皮果肉中的天然苯甲醛；再回收溶剂后获得富含天然苯甲醛 的油状物，再精馏分离提纯，获得高纯度天然苯甲醛。用该技术制取蒜头果精油和天然 苯甲醛，原料来源丰富，提取率高，生产成本低。 唐辉、陈治平1 9 1 等人以水蒸气蒸馏的方法从野巴旦杏中制备天然苯甲醛。其主要的 工艺路线是：将脱脂过的野巴旦杏仁粉在室温下蒸馏后，馏出液导入到氨水吸收掖中， 经石油醚萃取，加无水硫酸钠脱水后使用旋转蒸发仪浓缩后得到苯甲醛。 2 ，西大爿u 曩士奄茸叶垂支柱- j 渤h 肆a 日产物分析 1 2 1 3 生物转化法合成天然苯甲醛 近年来，有关利用微生物生产香精香料的报道越来越多，利用生物技术生产香料化 合物的方法正受到人们越来越多的重视。最近科学家发现利用微生物转化天然苯丙氨酸 可合成出苯甲醛口0 】，这就为苯甲醛的生产提供了一条新途径。有人曾用l 一苯丙氨酸特异 标记来阐述i s e 姗e r m ab e n z o m c m 的深层发酵代谢路径，通过研究知道苯丙氨酸通过两 个不同的降解途径可完全转化为香料化合物苯甲醛和苯丙醇。l 一苯丙氨酸通过氧化降解 途径转化为苯甲醛同样也被发现于细菌的代谢过程中。还有一种方法是，使用b 糖苷酶 和苯乙醇晴酶作催化剂来生产苯甲醛，这两种酶都存在于杏仁粉中【2 l 】。 1 2 2 生物法合成香料的研究现状 1 2 2 1 生物技术法简介 生物技术也被称为生物工程，最初的含义是利用生物将原材料转变为产品，它包括 传统生物技术和现代生物技术2 2 _ 2 4 j 。传统生物技术主要是通过微生物的初级发酵来生产 商品，其研究的主要目标是最大限度的提高效率，同时寻找到一些可以制备食品、食品 添加剂和药物的微生物。随着现代应用生物技术各个领域的深入发展，人们越来越采用 多学科方法来解决生产实践中的各种问题。现代应用生物技术是在基因工程、蛋白质工 程、细胞工程、酶工程、发酵工程、等先进的现代生物技术手段基础上产生和发展起来 的。酶工程是指在一定的生物反应器中，利用酶催化作用将相应的原料转化成有用物质 的技术，包括酶的生产应用、酶和细胞的固定化以及酶的分子修饰技术。酶是生物体内 产生的具有催化作用的蛋白质或r n a ，其催化效率是化学催化的千百倍【2 5 。2 7 l 。发酵工 程则是利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，再合适条件下， 通过现代化工程技术手段，由微生物某种特定功能生产出人类所需的产品，有时也称为 微生物工程，它包括菌种选育、菌体生产利用、代谢产物的生产利用以及微生物机能的 利用等【2 8 五9 】。与传统的化学合成方法相比，生物技术的还具有其自身的特点： 1 采用的催化剂酶可在温和的反应条件( 常温、常压和正常p h 值范围) 下进行； 2 催化效率相当高，具有很强的立体专一性和区域、对应体选择性； 3 生成过程中副产物少，易于分离纯化，即使有副产物，也是天然无害； 随着生物技术不断发展和成熟，采用生物法生产香料的工作也取得了很大进展 【3 2 】。随着人们生活质量的提高，消费者要求天然香料的愿望日益增加，并希望获得性 能更好的香料产品，采用生物转化法生产香料正好可以满足这些要求。 3 g - 西，蝴士茸q 盘越吁桂袖曼渤降蓐a 其产物分析 1 2 2 。2 生物技术法生产香料研究 近年来，有关利用微生物生产香精香料的报道越来越多。早期的研究主要集中在筛 选可产生芳香化合物的微生物菌种上，而现今微生物技术( 包括基因工程) ，正越来越多 地应用于提高生物催化剂的催化效率。利用生物技术法生产香料的方法很多，有微生物 突变技术、基因重组技术、植物组织培养、发酵技术等【3 3 】。日本m e r c i a n 公司采用啤酒 酵母突变经紫外线辐射发生突变而生成高含量的香兰素，这种产品可用于含醇产品中， 特别是葡萄酒中。发酵技术在香料工业中也越来越受到关注。位于美国威斯康辛州的国 际生物香料公司( i b f ) 已经使用发酵技术在番茄和可可香精制各中取得技术突破，它 们全部来源于天然物质，香气比常规产品提高了8 1 0 倍。许多细菌、霉菌和酵母菌都 可用来生产香兰素，一些微生物以阿魏酸、丁子香酚、异丁子香酚、香草醇、香草胺、 松柏醇、藜芦醇等化合物为前体，经发酵可获得香兰素口”。 总之，天然芳香化合物的生物生产技术能够生产的品种正在快速扩展，在未来的世 纪中，生物技术在香料工业中必将发挥巨大的作用。 1 2 3 桂油生物技术法合成天然苯甲醛前景展望 随着人类生活水平的逐渐提高，天然动植物香料受原料来源的限制，人们对天然的 香料的需求日益增加，从动植物中提取的天然香料难以满足增长需求，因此，生物技术 生产香料化合物受到人们越来越多的重视。 国内外对同属肉桂酸类衍生物的香草醛的研究报导很多 3 s - 4 1 ，己达到比较成熟的阶 段，以阿魏酸为底物采用生物转化法生产香草醛的研究1 4 2 取得很大进展。香草醛( v a n i l l i n ) 又叫香兰素、香草素或香兰醛，化学名是：3 一甲氧基一4 一羚基苯甲醛，也是一种重要的 香味物质之一，广泛存在于自然界中，如在香英兰豆、秘鲁香膏、苏合香膏、安息香膏、 爪哇香毛油、丁香花蕾油、丁子香芽油、香子兰的荚中等许多精油及植物中均有发现。 多用于食品，饮料，香料和医药等行业【4 3 1 。f e r i f e r th 等1 4 4 1 人对微生物转化过程中各种 微生物、植物细胞内合成和降解香草醛的代谢途径进行了广泛的研究。两步法合成路线 的提出为许多化学合成提供了更多途径h 5 1 。l a u r e n c el c s a g e m e e s s e n t 蛔等人采用“两 步法生产香草醛”的技术路线，先由阿魏酸转化生成香草酸，再进一步转化为香草醛。 郑志强【4 7 】等人采用两步法生物合成香草醛，并且进行了发酵放大试验。他们首先从实验 室保藏的菌种中筛选到一株能够将阿魏酸底物转化为香草酸的黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) s w - 3 3 ，相应的摩尔转化率为2 9 3 5 ；通过四次添加底物后，相应的摩尔转化 4 ，西，叫弗习e b 攀啦能口t桂袖生物降，i a 其，物分析 率可达到4 4 9 。为了提高产物浓度，对培养基和发酵条件进行优化，相应的摩尔转化 率为5 7 8 1 。提取得到的香草酸，用含香草酸的转化液，或者用提取的结晶香草酸， 加入朱红密孔菌s w - 0 2 0 3 发酵培养液，可得到转化产物香草醛。对培养基配方和发酵等 条件进行优化，朱红密孔菌s w - 0 2 0 3 转化香草酸生成香草醛的最大摩尔转化率可达到 7 6 3 。其合成方法如下： c o o h 阿魏酸 c o o h 香草酸 朱红密孔菌s w - 0 2 0 3 o c h 3 c h o 香草醛 o c h 3 苯甲醛作为香料在国外研究的历史由来已久。1 5 0 年前，苯甲醛是第一个被鉴定的 香料化合物。但是，遗憾的是目前对微生物法生产天然苯甲醛的研究报道较少。结合广 西丰富的肉桂油资源，如果能够找到可以利用肉桂醛转化为苯甲醛的菌种，利用生物技 术法直接或间接的将肉桂醛转化为苯甲醛，将是一个很有潜力和应用前景的合成方法。 1 3 肉桂醛和苯甲醛及其衍生物的分析方法 肉桂醛、苯甲醛及其衍生物的分析方法有多种，常用的有气相色谱法、液相色谱法、 紫外可见分光光度法等，结合本课题研究，下面分别介绍高效液相色谱法和紫外分光光 度法。 1 3 1 高效液相色谱法 1 3 1 1 高效液相色谱概述 高效液相色谱法是2 0 世纪7 0 年代以来发展起来的一项新型分离分析技术，具有分 离效能高，准确性好，分析速度快，检测灵敏度高和应用范围广泛等特点，特别适合于 高沸点，大分子，强极性和热稳定性差的化合物的分离分析测试等优点。 高效液相色谱按溶质在两相分离过程的物理化学原理可分为： ( 1 ) 吸附色谱( a d s o r p t i o nc h r o m a t o g r a p h y ) ：用固体吸附剂作固定相，以不同极 性溶剂作流动相，依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。 s 广西大曹嚏士增啦论文柱铺置渤降算曩其产物分析 ( 2 ) 分配色谱( p a r t i t i o nc h r o m a t o g r a p h y ) ：用载带在固相基体上的固定液作固定 相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分 离。根据固定相和液体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配色谱。 当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配色谱或简称正相色谱；若固定相的 极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反相色谱。 ( 3 ) 离子色谱( i o nc h r o m a t o g r a p h y ) ：用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有 一定p h 值的缓冲溶液作流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面 带电基团进行可逆性离子交换能力的差别而实现分离。 ( 4 ) 体积排阻色谱( s i z ee x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y ) ：用化学惰性的多孔性凝胶 作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。 ( 5 ) 亲和色谱( a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ) ：在不同基体上，键含多种不同特性的 配位体作固定相，用具有不同p h 值的缓冲溶液作流动相，依据生物分子( 氨墓酸、肽、 蛋白质、核碱、核营、核苷酸、核酸、酶等) 与基体上键联的配位体之间存在的特异性 亲和作用能力的差别，而实现对具有生物活性分子的分离。 与经典液相色谱法相比，高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、 短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质、扩 散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。 高效液相色谱法的特点主要表现在以下几个方面： ( 1 ) 分离效能高：由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色谱填充柱的柱效 可达2 x l o l 5 1 0 4 块m 理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱1 0 3 块m 理论塔板数的 柱效。 ( 2 ) 选择性高：由于液相色谱柱具有高柱效，并且流动相可以控制和改善分离过 程的选择性。因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合物及其同分异构 体，还可分析在性质上极为相似的旋光异构体，并己在高疗效的合成药物和生化药物的 生产控制分析中发挥了重要作用。 ( 3 ) 检测灵敏度高：在高效液相色谱法中使用的检测器大多数都具有较高的灵敏 度。如被广泛使用的紫外吸收检测器，最小检出量可达1 0 母g ；用于痕量分析的荧光检 测器，最小检出量可达1 0 。1 2g 。 ( 4 ) 分析速度快：由于高压输液泵的使用，相对于经典液相( 柱) 色谱，其分析 时间大大缩短，当输液压力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析时间仅需 6 广西，叫筘硬士掌位倒 文捌b 由生物饲叼及其产物分析 儿分钟到几十分钟。 1 3 1 2 高效液相色谱法的应用 高效液相色谱法适用于分析高沸点不易挥发、受热不稳定易分解、分子量大、不同 极性的有机化合物、生物活性物质和多种天然产物、合成的和天然的高分子化合物等。 它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有 机化合物的8 0 。 利用高效液相色谱法对苯甲醛、苯甲酸的测定也有一定的报道。甄攀1 4 8 】利用i - i p l c 测定了几种杏仁中苦杏仁苷的含量。张志虎，邵华 4 9 1 利用高效液相色谱分离，二极管阵 列检测器检测，建立了一种实用的工作场所空气中苯甲醛的测定方法。胡冠九【5 0 】通过对 水样衍生化、固相萃取预处理，利用串联h p l c 柱对包括苯甲醛、邻甲基苯甲醛、间甲 基苯甲醛在内的1 5 种醛酮类化合物作系统分离、测定，建立了适用于水和废水中低含 量醛酮类化合物的测定。而且，对于生物催化过程监控以及中间产物的监测方面，高效 液相色谱法应用也很广泛。苑广志 s u 在生物催化法生产对苯二甲酸i f , t a ) 菌种的筛选过 程中，建立了高效液相色谱法测定某些假单胞菌的发酵液中对苯二甲酸及中间产物对羧 基苯甲醛( 4 c b a ) 、对甲基苯甲酸( p - t o l ) 的分析方法。该方法可应用于检测菌种筛选过 程中发酵液实际样品，方法快速、高效，对菌种筛选工作具有较好的辅助和指导意义。 景丽洁【5 2 】等采用反相高效液相色谱法测定香兰素含量，建立了适用于香兰素成品的分 析，也可用于中间产品控制的分析方法。 而且，黄惠华1 5 3 利用聚焦式微波辅助萃取系统，结合h p l c 分析，对肉桂中的肉桂 醛和肉桂酸进行微波萃取分离和分析。张艾青，吴洪应【5 4 】采用高效液相色谱法，建立了 普力奇降糖胶囊中所含肉桂醛的含量测定方法。奇降糖胶囊处方中主药为肉桂，其主要 成分为肉桂醛。华剑，武超 5 5 1 对成药桂枝茯苓胶囊中肉桂酸、肉桂醛和丹皮酚的含量进 行了同时测定，并且所测三种主要成分之间无干扰。黄劲梅f 5 6 】等采用反相高效液相色谱 法同时测定胡黄连中香草酸、阿魏酸和肉桂酸三种有机酸的含量。 虽然，利用高效液相色谱法对苯甲醛、苯甲酸、肉桂醛、肉挂酸中的一种或两种物 质的测定方法有了一定的报道，但是，每种方法都有其各自的适用范围，而且，对四种 物质的同时测定并无报道。因此，在用生物技术法合成天然苯甲醛的过程中，对于目的 产物的测定，以及对可能会出现的中间产物的监测方法的建立都是必要的。 1 3 2 紫外可见分光光度法 7 广西大掣蝈曩士掣啦能演桂曲生物胃叫馘其产物分析 1 3 2 1 紫外可见分光光度法简介 研究物质在紫外( 2 0 0 - - 4 0 0r i m ) 及可见光( 4 0 0 - - 8 0 0r i m ) 区分子吸收光谱的分析方 法称为紫外可见分光光度法( u l t r a v i o l e ta n dv i s i b l es p e c l x o p h o t o m e t r y ) 。紫外一可见分光 光度法是根据物质的分子中价电子对波长为2 0 0 - - 8 0 0n l n 的电磁波的吸收特征所建立的 光谱分析方法，属于电子光谱。 紫外可见分光光度法具有以下特点： ( 1 ) 具有较高的灵敏度和一定的准确度，适用于微量组分测定。在仪器设备和其 他测量条件较好的情况下，其相对误差可到o 5 - 2 ，对于微量组分的测定己基本能 满足要求。测定物质的最低浓度，即灵敏度可达l 旷1 0 一咖l 。 ( 2 ) 应用范围广。几乎所有无机物和许多有机物的微量成分都能用此法进行测定。 ( 3 ) 操作简便、快速，成本低，易于推广。 1 3 2 2 紫外可见分光光度法的应用 紫外可见分光光度法由于自身所具有的特点和较高的仪器性能价格比，在整个分析 方法中占有重要地位。因此，在许多生产和科研领域中，它仍被广泛应用。尤其是在医 药、化工、冶金、环境保护、地质等诸多领域，紫外一可见分光光度法不但可以进行定 量分析，还可以对被测物质进行定性分析和结构分析，进行官能团鉴定、相对分子质量 测定、配合物组分及稳定常数的测定等。 用紫外吸收光谱法还可分析化妆品防晒剂中的二苯酮衍生物、肉桂酸酯等；祛臭剂 中的苯磺酸锌、六氯苯、卤代水杨酰苯胺等；食品防腐剂中的苯甲酸、山梨酸，抗氧化 剂中的抗坏血酸、没食子酸丙酯以及多种维生素；香料工业中的各种香料，如柠檬油、 香茅草油、留兰香油、杏仁油等。可见，紫外吸收光谱法已在轻工和化工产品分析中获 得广泛的应用【5 7 j 。 目前，在药物测定以及生物试样的分析中，紫外可见分光光度法的应用也已经非常 广泛。如s o l l r n a n 掣5 8 1 用紫外吸收法测定了在乙酰氨基苯酚、苯比巴妥、咖啡碱、可待 因磷酸盐、强的松、抗坏血酸和氯喹啉喹酸盐存在时止痛片中的水杨酰胺。k e l l y 5 卅评 述了用紫外一可见吸收光谱法测定水杨酸和阿司匹灵。紫外一可见吸收光谱法还广泛应 用于生物试样中蛋白质的分析。测定蛋白质含量通常有两种方法，即2 8 0n l n 处测量的 直接法和测定2 1 5 衄与2 2 5a m 处吸光度之差的间接法【删。此外，在酶法分析中，通过 测量2 8 2l l m 处青角甾醇的吸收可测定水解酶的活性【6 ”。 8 广西，叫擎固墨士学位论，巴桂油生物h 嶙及其产物分析 1 4 本课题的研究意义 随着人们生活水平的不断提高，人们越来越追求“天然、绿色”食品，并逐渐意识 到化学合成品对身体可能带来的副作用；同时，不少国家开始指定更为严格的食品法规， 强调食品安全的重要性。而从植物中提取出的天然苯甲醛由于受到原料来源，地域以及 气候等因素的影响，产量小，价格昂贵，不能满足日益增长的市场需求。因此，生物技 术法生产天然苯甲醛将是一种有效的替代方法。 我国是肉桂油的生产大国，其中广西和广东是我国肉桂油的主要产地蚴6 3 1 。最近十 年来肉桂的种植方兴未艾，发展势头迅猛。9 5 年广西生产桂油为6 4 1 5t ，到2 0 0 3 年仅 藤县就产桂油5 7 5 0t 。这些热带香料植物资源是宝贵的天然产物，利用天然香料研制的 日用品或食品将具有非常广阔的应用前景 6 4 1 。因此，从桂油中分离提纯肉桂醛，并积极 开发肉桂醛高附加值的下游产品已势在必行，对开发利用广西资源优势和发展地方经济 有重要的现实意义。 同时，对反应体系中各物质的分离和分析，是研究生产和质量控制中所必须的。生 物反应过程中，代谢途径复杂，副产物多，如何建立起一种快速、简便、价廉、准确的 检测方法对肉桂油生物技术法合成天然苯甲醛的过程跟踪、产物分析是需要解决的关键 问题。 1 5 本课题的研究方法及主要内容 依靠广西丰富的肉桂资源，若能以肉桂醛为原料，找到能利用肉桂醛转化成苯甲醛 的微生物，这将是一个很有潜力的生产天然苯甲醛的方法。目前，国内外还没有此类文 献报导，但从肉桂醛的结构上来看，只要能找到具有降解氧化作用的酶，实现肉桂醛到 苯甲醛的转化是可行的。肉桂油生物技术法合成天然苯甲醛主要有以下两种方法： 方法一，采用一步法，直接由肉桂醛生物降解为苯甲醛。 肉桂醛 ( c i n n a m a l d e h y d e ) c h o 苯甲醛 ( b e n z a l d e h y d e ) 9 氧化 o x i d a t i o n 苯甲酸 ( b e n z o i ca c i d ) ，。日大掣嘎士学位论文 方法二，采用两步法，肉桂醛被氧化为肉桂酸，然后通过生物降解为苯甲醛。 肉桂醛 ( c i n n a m a l d e h y d e ) 化 一c o o h c h o 肉桂酸 ( c i n n a m i ca c i d ) 生物降解 b i o d e g r a d a t i o n 苯甲醛 ( b e n z a l d e h y d e ) 根据生物转化特点，本课题开展主要研究内容如下： 1 建立复杂生物反应体系的定性定量分析方法。 为了同时测定肉桂醛、肉桂酸、苯甲醛、苯甲酸的含量，本试验采用高效液楣色谱 法建立了分析样品中的以上四种物质的方法。对简单体系，为了快速跟踪反应过程，建 立苯甲醛、苯甲酸紫外光谱分析方法。 2 筛选能将肉桂醛转化为苯甲醛的菌株。 在含桂油较多的地方采集土样，富集后平板分离，得到单个菌株，并进行转化能力 验证，以寻找到有转化能力的菌株，并选取有催化合成能力的菌株进行发酵条件优化实 验，找出最佳发酵条件。 3 采用两步法的思路，以肉桂酸为底物，进行菌种的筛选，并进行发酵和转化试验， 以期找到具有降解能力的菌株。 1 0 ，西大尊壤士掌位嗣 史柱爿i 生物瞩a l 产物分析 第二章肉桂醛生物转化体系分析方法的构建 2 1 反相高效液相色谱定量分析苯甲醛、苯甲酸、肉桂醛和肉桂酸的含量 在以肉桂醛为底物，利用生物技术法合成天然苯甲醛的过程中，由于肉桂醛、苯甲 醛易被氧化为肉桂酸、苯甲酸，因此准确测定反应体系中肉桂醛、肉桂酸、苯甲醛、苯 甲酸四种组分的含量，对优化转化条件，监控反应过程至关重要。对其中单一化合物或 两种组分的定量分析已有文献报道 6 5 - 6 9 】，对四种化合物的直接同时测定方法未见文献报 道。本研究根据生物反应体系特点，建立反相高效液相色谱法同时测定反应体系中肉桂 醛、肉桂酸、苯甲醛、苯甲酸的含量。 2 1 1 试验部分 2 1 1 1 仪器和试剂 实验中使用的主要仪器如下： ( 1 ) 高效液相色谱仪( w a t e r s5 1 0 泵，威玛色谱工作站，r h e o d y n e7 2 2 5 进样阀， s h i m a d z us p d 1 0 au v v i s 检测器，色谱柱为k r o m a s i l i o o ac 1 3 柱( 2 5 0r a m 4 6i n i i l ， 5 t i m ) ( 2 ) u v 一2 5 5 0 型紫外分光光度计( 日本岛津) ，波长范围1 9 0 - 9 0 0 呦，l c m 石英比色l m ； ( 3 ) y p l 2 0 0 型电子天平( 精确值0 0 0 0 1g ) ，上海精科实业有限公司； ( 4 ) d e r a 3 2 0p h 计，上海第三分析仪器厂； ( 5 ) 微量进样器，上海高鸽工贸有限公司； ( 6 ) t g e 1 6 a 高速离心机，上海安亭科学仪器厂： 实验中使用的主要药品和试剂如下： ( 1 ) 肉桂醛：分析纯，上海润捷化学试剂有限公司 ( 2 ) 苯甲醛：分析纯，天津化学试剂有限公司； ( 3 ) 肉桂酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司； ( 4 ) 苯甲酸：分析纯，天津市化学试剂一厂； ( 5 ) 甲醇：色谱纯，上海陆都化学试剂厂； ( 6 ) 冰醋酸：分析纯，广东汕头市西拢化工厂； 广西大茸嘲士葺呲论丈柱生物叫霉夏其产物分析 2 1 1 2 标准溶液的配制 精确称取苯甲酸、肉桂酸2 5 0m g ，量取肉桂醛i 0 0m l ，苯甲醛o 2 5m l ，用甲醇 溶解并稀释，置于1 0 0 m l 棕色容量瓶定容至刻度，取此混合标准溶液1 0 0 m l 置于2 5 m l 棕色容量瓶定容至刻度，以此混合标准溶液作为母液，配成系列浓度的混合体系标准溶 液。 2 1 1 3 样品处理 准确量取2 0 0 m l 反应液，置于2 5 m l 棕色容量瓶用甲醇定容；取此稀释液2 00 m l ， 置于2 5m l 棕色容量瓶用甲醇定容，样品经4 0 0 0r r a i n 离心、o 4 5l u n 滤膜过滤后进样。 2 1 2 试验结果与讨论 2 1 2 1 波长的选择 紫外可见分光光度计测得苯甲醛、苯甲酸、肉桂醛、肉桂酸的最大吸收波长分别 为2 4 9 、2 2 0 、2 8 9 、2 7 3n l n 。在反应液中，肉桂醛含量相对较高，肉桂酸是由肉桂醛氧 化而产生，在偏离最大吸收波长下检测，它们仍有较大的响应值；而苯甲醛是反应的目 标产物，苯甲酸由其氧化而得，二者含量相对较低，故选择检测波长时，主要考虑检测 波长对苯甲醛、苯甲酸响应的影响。从四种化合物的紫外吸收特征来看，根据在2 2 0 2 4 9 n n l 之间检测波长和苯甲醛、苯甲酸响应值的大小关系，本实验选2 4 6n l l l 作为检测波长。 2 1 2 2 流动相组成的优化 在利用r p h p l c 分离含有机酸的混合体系时，应尽可能使有机酸以分子形式存在， 一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解，同时为了改善有机酸的分离和减少吸附( 改 善峰形状) ，可在流动相中加入适量的有机溶剂 9 1 。经过试验，选甲醇水体系作为流动 相。当流动相流速定为1 0 m l m i n ，改变流动相中甲醇比例时，随着甲醇比例的提高， 各组分的保留时间均缩短。当甲醇的体积分数大于6 0 时，苯甲醛和苯甲酸色谱峰不能 完全分离；当甲醇的体积分数小于5 0 肉桂酸的出峰时间约2 0r a i n ，时间长且峰形不好； 当甲醇的体积分数为5 5 时，分离完全且出峰时间较理想。比较了不同