（微生物与生化药学专业论文）氯霉素的高灵敏时间分辨荧光免疫分析方法的建立.pdf

摘要 氯霉素的高灵敏时间分辨荧光 免疫分析方法的建立 硕士研究生：王雪 导师：金坚教授 专业：微生物与生化药学 摘要 氯霉素( c h l o r a m p h e n i c o l ，c a p ) 在食品中的残留导致了许多恶性疾病，并对 人体产生严重危害。美国、加拿大、欧盟和中国等许多国家规定了c a p 在所有 食品动物的可食用组织中不得检出，所以建立一种高灵敏的检测方法十分必要。 时间分辨荧光免疫分析方法( t i m e r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y ，t r f i a ) 是 近十年发展起来的一种新兴的非放射性免疫标记技术，具有灵敏度高、特异性强、 重复性好等优点，并且非常适合大规模样品的筛选。 本论文旨在建立高灵敏的、快速检测c a p 时间分辨荧光免疫分析方法 ( c a p t r f i a ) 。将c a p 与牛血清白蛋白( b s a ) 和卵清蛋白( o v a ) 偶联制备 免疫抗原与包被抗原，以c a p b s a 免疫新西兰大白兔制备c a p 多克隆抗体， 以c a p o v a 包被9 6 孔板为固相抗原，与c a p 标准品( 游离抗原) 竞争结合 c a p 抗体，用稀土离子e u 3 + 标记的羊抗兔抗体进行示踪，建立起间接竞争 c a p t r f i a 检测方法。该方法的灵敏度为0 0 0 8 n g m l ( 8 p p t ) ，测量范围0 0 0 8 酬- l o o n g m l ，不同时间进行的c a p - t r f i a 的效应点值e d 2 0 、e d 5 0 、e d s o 分别为( 2 5 7 5 0 4 4 2n g m l 、( o 9 1 7 _ _ _ 0 0 8 1 ) n g m l 、( 0 0 3 3 o 0 0 1 6 ) n g m l 。批内 变异系数6 8 ，批间变异系数1 3 5 。与琥珀酸氯霉素的交叉反应率为1 9 2 8 ， 与甲砜霉素的交叉反应率小于0 1 ，与青霉素、诺氟沙星的交叉反应率小于 0 0 1 。牛奶、蜂蜜、虾和鸡肉样品的平均回收率分别为7 9 7 、1 1 2 6 、9 2 1 和9 7 1 。考核方法的热稳定性显示有效期应在六个月以上。相比较，酶联免疫 吸附检测法( e n z y m e l i n k e di m m u n os o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 试剂盒的灵敏度是 0 0 5n g r r a ，t r f i a 有明显提高。由于酶受温度、p h 等各因素的影响，e l i s a 试 剂盒也存在稳定性差，易产生假阳性等诸多问题。研究表明，c a p t r f i a 是目 前报导的c a p 检测中最灵敏的方法，具有很好的应用前景。 关键词：氯霉素时间分辨荧光免疫分析方法多克隆抗体 a b s t r a c t tt j r _ 一 1 ui t r a s e n s l t l v e1l m e r e s o i v e d f l u o r o i m m u n o a s s a yf o rr a p i d d e t e c t i o no f c h l o r a m p h e n i c o l m a s t e rc a n d i d a t e ：w a n gx u e s u p e r v i s o r p r o f j i nj i a n s p e c i a l t y ：m i c r o b i o l o g ya n db i o c h e m i c a lp h a r m a c e u t i c s a b s t r a c t c h l o r a m p h e n i c o l ( c a p ) r e s i d u e si nh u m a nf o o dh a v el e dt oa l o to fs i d ee f f e c t s i n c l u d es e v e r eo rf a t a li l l n e s s e s i ti ss t i p u l a t e di nm a n yc o u n t r i e s ，s u c ha su s a ， c a n a d a , a u s t r a l i a , e um e m b e rs t a t e sa n dc h i n at h a tc a p n o tb ed e t e c t e di na n i m a l s u s e da s 南o d t h e r e f o r e , i ti si m p o r t a n tt od e v e l o pas e n s i t i v ea n ds i m p l em e t h o df o r c a pd e t e c t i o n t i m e - r e s o l v e df l u o r o i m m t m o a s s a y ( t r f i a ) d e v e l o p e di nr e c e n tt e ny e a r si sa k i n do fi n f a n tn o n r a d i o l a b e l e di m m u n o a s s a y , w h i c hp r o v i d e sh i g hs p e c i f i c i t y , h i 曲 s e n s i t i v i t y , g o o dr e p e t i t i o na n dc a l ld e a l 谢t l lal a r g en u m b e ro fs a m p l e s ar a p i da n ds e n s i t i v em e t h o do fi n d i r e c t c o m p e t i t i v e t i m e r e s o l v e d f l u o r o i m m u n o a s s a y ( t m f i a ) f o rc a pd e t e r m i n a t i o nw a se s t a b l i s h e di nt h i sp a p e r c a pw a sc o u p l e d 、) i ，i mc a r r i e rp r o t e i nb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n do v a l b u m i n ( o v a ) t op r e p a r ei m m u n ea n t i g e nc a p b s aa n dc o a t i n ga n t i g e nc a p o v a a n t i c a pp o l y c l o n a la n t i b o d yw a sr a i s e db yi m m u n i z a t i o ni nr a b b i t s c a p - o v aw a s c o a t e do n t ot h em i c r o t i t r ep l a t e c a po rs a m p l ew a sa d d e di n t ot h em i c r o t i t r ep l a t ea s ac o m p e t i t o r , a n di n c u b a t e dw i t hl i m i t e da n t i c a pa n t i b o d y ag o a ta n t ir a b b i t i g g e u ”c o n j u g a t ew a su s e dt oe n a b l ed e t e c t i o n r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e t e c t i o n l i m i to ft h ea s s a yw a s0 0 0 8n g m l ( 8 p p t ) f o ri n d i r e c tc o m p e t i t i v et r f i af o r m a t s n e a s s a yr a n g ew a s 0 0 0 8n g m l - 10 0n g m 1 t h ec o n c e n t r a t i o no fc a pf o r2 0 5 0 a n d8 0 b i n d i n gi n h i b i t i o n ( e d 2 0 ，e d s o ，e d s o ) w e r e ( 2 5 7 5 + 0 4 4 2 ) n # m l ， ( o 9 1 7 士0 0 8 1 ) n g m la n d ( 0 0 3 3 + 0 0 0 1 6 ) n g m 1 t h ei n t e r - a n di n t r a - a s s a y v a r i a b i l i t i e so ft h ec a p t r f i aw e r e6 8 a n d13 5 t h ec r o s sr e a c t i v i t yo ft h e c a p t r f i a 谢t hc h l o r a r n p h e n i c o ls u c c i n a t ew a s19 2 8 ，w h i l et h a tw i t h t h i a m p h e n i c o lw a sl e s st h a no 1 ，t h a tw i t hp e n i c i l l i na n dn o r f l o x a c i nw a sl e s st h a n o 01 t h em e a nr e c o v e r yo fc a pf r o mm i l k ，h o n e y , p r a w nm u s c l et i s s u e sa n d i l a b s t r a c t c h i c k e nm u s c l et i s s u e ss a m p l e sw a s7 9 7 ，112 6 ，9 2 1 a n d9 7 1 ，t h et h e r m a l s t a b i l i t yo fc a p t r f i af o r m a tw a sm o r et h a n6m o n t h s t h ed e t e c t i o nl i m i to f c a p - t r f i aw a ss i g n i c a n t l ye n h a n c e dc o m p a r e d 、丽t l lt h a to fe n z y m e l i n k e d l m m u n os o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) k i t si nm a r k e t sw h i c hi s0 0 5 n g m 1 t h ee l i s ak i t s h a v eah i g hr a t eo ff a l s ep o s i t i v ea n dt h es t a b i l i t yw a sn o tv e r yg o o d ，b e c a u s eo ft h e e n z y m ea c t i v i t yw a sm u c ha f f e c t e db yt e m p e r a t u r e ，p ha n do t h e rf a c t o r s i tw a s s h o w nt h a tt h ec a p t r f i aw i t hh i g hs t a b i l i t ya n do p t i m a lr a n g ei st h em o s ts e n s i t i v e a s s a y sr e p o r t e da n d w i l lb eu s e f u lt os c r e e nc a pr e s i d u a l ss i m p l ya n d e c o n o m i c a l l y k 呵w o r d ：c h l o r a m p h e n i c o l ，t i m e r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y ( t r f i a ) ， p o l y c l o n a la n t i b o d y 1 1 1 江南大学硕士学位论文 英文缩略词 缩写全称中文名称 c a p c h l o r a m p h e n i c o l 氯霉素 t i 己f i at i m e - r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y 时间分辨荧光免疫分析方法 b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n 牛血清白蛋白 d 翰o v a l b u m i n 卵清蛋白 m a m i x e da n h y d r i d e 混合酸酐法 e l i s a e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附检测法 n s b n o n s p e c i f i cb i n d i n g 非特异结合 c r c r o s s - r e a c t i v i t y 交叉反应率 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是芩人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名：目 期： 砌孑另多 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 圭!坦墨：三：垄 导师签名： 伊l 争 日 期： m 7 孑矽 第一章绪论 第一章绪论 人类的生存和发展要求外界提供安全的，有营养的，能促进健康的食品，其中食品 的安全性是最基本的要素。所谓食品安全是指食品中不应含有可能损害或威胁人体健康 的有毒有害物质或因素，不会导致消费者急慢性中毒或感染疾病，不会产生危害消费者 及其后代健康的隐患【l j 。当前，每年有数亿人因食用了不安全的食品而导致患病甚至死 亡，因而，食品安全已经成为全球关注的焦点问题之一，引起了各个国家的高度重视1 2 1 。 随着畜牧业规模化和商业化的发展，兽药及饲料添加剂在畜牧业生产中得到了广泛 应用。它能减低动物死亡率，缩短动物饲养周期，促进动物性产品的产量的增长和动物 集约化养殖的发展。c a p 是应用广泛的广谱抗生素，常用于动物各种传染性疾病的治疗 中，对各类家禽、家畜、水产品及蜂蜜制品各种传染性疾病的控制和治疗起重要作用。 但是c a p 对人的造血系统、消化系统具有严重的毒性反应，有可能引发人的再生障碍 性贫血；同时还会引起视神经炎、皮疹等不良反应。 近年来，我国的出口水产品及蜂蜜等频频被进口国检出c a p 残留，所谓的“氯霉 素风波”一波未平、一波又起，至今尚未解决。从当今国际贸易的特点看，产品质量安 全已成为最主要的贸易壁垒，c a p 的公害已成为全社会关注的热点【3 巧l 。 1 1 氯霉素简介 1 1 1 理化性质 c a p 的化学名称为d 苏式对硝基苯基1 二氯乙酰基1 3 丙二醇，分子式为 c l l h l 2 c 1 2 n 2 0 5 ，分子量为3 2 3 1 3 。c a p 是白色的针状或片状晶体，味极苦，性质极稳 定。水中微溶( o 2 5 ) ，但易溶于甲醇、丙醇、乙酸乙酯等有机溶剂水溶剂呈中性反应， 在p i l l 0 以上可失去活性【6 】。 1 1 2 作用及其机理 1 9 4 8 1 9 4 9 年确定其结构后，即通过化学合成方法大量生产，它是第一个可用人工 合成的抗生素。对其敏感的细菌有大肠杆菌、产气杆菌、伤寒杆菌、流感杆菌、沙门氏 菌、布氏杆菌、巴氏杆菌、克雷伯氏杆菌、胎孤菌等，大部分敏感菌株可被1 1 0 p g m l 的浓度所抑制。 c a p 的抗菌作用机理，在于抑制菌体蛋白的合成，它作用于核蛋白5 0 s 亚基上的肽 基转移酶，使肽链不能向新附着的氨基酸上转移，因而使肽链延长受到抑制，同时能特 异的阻止m r n a 和敏感的核蛋白结创7 1 。 江南大学硕士学位论文 1 2 残留危害及影响 近几年来，经国内外研究机构发现，c a p 不适当的适用于食用性动物中，很容易引 起c a p 在动物源性食品中残留超标，并对人体产生严重危害【8 j ，主要表现在： ( 一) 骨髓造血机能紊乱 c a p 对骨髓贩造血机能有抑制作用，可引起血小板减少性紫殿、粒细胞缺乏症、再 生障碍性贫血、溶血性等，多数在长期或多次用药的过程中发生。发生率约为 1 1 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 。骨髓的毒性分为两类：一是可逆性抑制。主要影响红细胞、血小板和 白细胞的形成。二是再生障碍性贫血。前者与剂量有关，药物的血浓度走过5 r t g m l 即 可出现；后者少见，发生较晚而极为严重，与c a p 的每日用量和总量均无直接关系。 ( 二) 对早产儿和新生儿的毒性 在早产儿和新生儿肝内有些酶系统发育尚不完全，葡萄糖醛酸结合的能力较差，因 此影响c a p 在肝中的解毒过程；此外，肾脏排泄能力亦较弱，能招致药物蓄积中毒。 ( 三) 胃肠道症状、口部症状 胃肠道反应主要有腹胀、腹泻、食欲减退恶心、呕吐则少见。口部症状如口腔粘膜 充血、疼痛、糜烂、口角炎和舌炎等。 ( 四) 其它不良反应 可引起视神经炎、视力障碍、多发性神经炎、神经性耳聋以及严重失眠。有时发生 中毒性精神病，主要表现为幻视、幻听、定向力丧失、精神失常掣9 。 1 3 残留现状 c a p 残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视。欧盟、美国等 均在法规中规定c a p 残留限量标准为“零容许量 ( z e r o t o l e r a n c e ) ，即不得检出。2 0 0 2 年1 月，欧盟以c a p 残留为由宣布全面禁止从中国进口动物源性食品。此项“禁令 封杀了中国每年约7 亿美元的相关产品出口。欧盟是我国蜂蜜传统出口市场，年进口蜂 蜜1 5 万吨，其中，自我国进口3 - 4 万吨，占其进口蜂蜜总量的2 7 左右，据我国海关 统计，2 0 0 1 年我国对欧盟出口蜂蜜4 3 万吨，占全球出口总量的4 1 。2 月7 日，英国 以c a p 超标为由停止销售中国蜂蜜，2 月中下旬，英国食品标准局在市场上抽样检测中 查出我国蜂蜜含欧盟禁用药物a p 残留，发生了上市中国蜂蜜被召回的恶性事件。 并影响到了中国蜂蜜对日本、加拿大等国的出口。 我国是一个水产养殖大国，养殖规模不断扩大，但养殖过程中滥用抗生素，已成为 一个严重的水产品安全问题。自2 0 0 1 年以来，我国出口水产品频频被进口国检出c a p 残留。2 0 0 1 年9 月底，欧盟因c a p 残留问题将中国产冻虾产品纳入其食品快速预警机 制，又于2 0 0 2 年初通过决议，自2 月1 日起全面暂停从中国进口动物制品；2 0 0 2 年1 月，美国f d a 也对我国虾产品发出预警通报1 9 - 1 3 1 ；3 月中旬，日本宣布对我国动物产品 实施严格检查，并公布了包括c a p 在内的1 1 种药物的残留限量。2 0 0 2 年1 到6 月，我 2 第一章绪论 国水产品对欧盟出口量、出口额比去年同期分别下降7 0 8 和7 3 。 药物残留已成为扩大国际贸易的主要障碍。针对这种情况，中国国家质检总局专门 就c a p 先后下发了两个紧急通知，禁止在出口产品的饲料、养殖( 包括环境、器械等的 消毒) 、加工、保鲜、包装和运输等生产环节使用c a p 。农业部已将c a p 从2 0 0 0 年中 国兽药典中删除，此药重新进入安全评价体系，在动物性食品兽药残留规定中规 定可食部分不得检出，并且在出口的日常检测中，将其列为必检项目，一旦发现超标， 一律禁止出口。 1 4 部分国家残留检测要求 1 1 9 9 9 年9 月1 3 日中华人民共和国农业部发布了动物性食品中兽药最高残留限 量的通知，规定了c a p 在所有食品动物的可食用组织中不得检出。 2 中国农业部已将c a p 从2 0 0 0 年版中国兽药典中删除列为禁药。 3 2 0 0 2 年1 月，美国食品与药品管理局( f d a ) 公布了禁止在进口动物源性食品 中使用c a p 。 4 欧盟的进口食品卫生标准规定“c a p 含量标准为不得检出。一其“不得检出的 含义是c a p 含量在1 p p b 以下，即含量在十亿分之一经以下【1 4 】。 5 德国部分州的特殊检测标准为0 2 p p b 。 6 我国方法检测限量值：牛奶0 2 5 n g m l ，肉类0 5 n g g ，尿液1 0 n g m l ，血清0 5 n g m l ， 蜂蜜0 1 n g g 。 1 5 氯霉素残留现有的检测方法及局限 对于c a p 残留，由于存在多种检测方法，因此各种方法的检出限问题已成为关注 的焦点。发达国家对检出限的要求越来越严格。近年来各种关于c a p 残留的检测方法 不断涌现，大致可分为三大类：第一类是微生物测定法，第二类是理化分析法，第三类 是兼有生物和化学的免疫分析技术。 1 5 1 微生物测定法 微生物测定法简单、费用少、速度快，常用于动物性食品兽药残留的初筛f 1 5 1 。其中 包括棉签法( s t o p ) ，杯碟法、纸片法、琼脂扩散法、t 1 r c 法、b b r t 法等，这些方法 都存在灵敏度低的缺点，微生物法易受组织中其它抗生素的影响，特异性低，灵敏度也 不高，但操作简便，样品用量少，预处理简单，在基层大规模筛选工作中有很大的应用 价值。 3 江南大学硕士学位论文 1 5 2 理化分析法 理化分析法包括高效液相色谱法【l 7 】( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ， h p l c ) 、气相色谱法【1 8 翻1 ( g a sc h r o m a t o g r a p h y ，g c ) 、高效液相色谱质谱联用法【2 2 - 2 4 ( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s ss e c t r u m ，h p l c - m s ) 和薄层层析法1 2 弼叫( t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，t l c ) 等仪器分析方法。理化分析方法中，h p l c 检测c a p 是一种 灵敏度较高、可靠性较强的一种方法，此法重复性好、假阳性少，可以进行定量鉴定， 但检出限较高，为5 - 1 0l ag k g ，回收率偏低。g c 的特点是高分离效能、高选择性、高 灵敏度、快速、应用广，还可用于制备高纯物质。其他的如氢焰离子化检测器( f i d ) 、 电子捕获检测器( e c d ) 、氮磷检测器( n p d ) 等，检出限一般为pg k g 级，也常用于 抗生素药物残留的检测。国际上公认的定量确认方法仍是理化分析法，主要是气相色谱 法和液相色谱法，这两种方法灵敏度高，结果准确，重复性好，假阳性少，缺点是样品 前处理过程复杂、仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，已逐渐不能满足发达国家及 食品加工企业对检测方法检出限的要求。 1 5 3 免疫分析技术 免疫分析技术是“迈向2 1 世纪的医学检验技术 之一，被列为2 0 世纪9 0 年代优 先研究、开发和利用的药物残留分析技术，联合国粮农组织( f a o ) 已向许多国家推荐 此项技术，美国化学会将免疫分析和气相色谱、液相色谱共同列为药物残留分析的支柱 技术。免疫分析技术主要有放射免疫分析技术( r a d i o i m m u n o a s s a y ，r i a ) 和酶免疫分析 技术( e n z y m ei m m u n o a s s a y ，e i a ) 等。 放射免疫分析法具有特异性强，灵敏度高，准确，快速，操作简便，易于标准化等 优点。但是由于放射免疫分析法需要较昂贵的液体闪烁仪或y 放射仪，且放射性同位 素对工作人员有一定的伤害，废弃物又不易处理，这些不利因素限制了该法的广泛应用 2 7 - 2 8 o 酶联免疫分析法中应用最广泛的是酶联免疫吸附检测法( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) ，e l i s a 法是c a p 残留检测中最为常用的一种方法。e l i s a 的 优点是特异性强，灵敏度高，操作简便，检测迅速，特别适用于大批量样品的检测【2 9 3 1 】。 目前，我国进出口检验检疫多采用德国r b i o p h a r m 、荷兰e o r o d i a g n o s t i c a 、英国r a n d o x 等公司生产的c a p e l i s a 检测试剂盒，但由于进口试剂盒价格昂贵，在一定程度上限 制了它的使用范围。国产e l i s a 试剂盒普遍存在灵敏度不够、假阳性率高、不稳定等 诸多问题，难以推广应用。 1 6 时间分辨荧光技术 4 时间分辨荧光免疫分析法( t i m er e s o l v e df l u o r o i s n m u n o a s s a y , t r f i a ) 是近十年发 第一章绪论 展起来的一种微量分析方法，是利用免疫反应的高度特异性和标记示踪物的高度灵敏性 相结合而建立的一类非放射性的新兴检测技术。近年来以其特出的优点逐渐为人们所重 视，目前，该技术已不局限于临床诊断领域，而渗透到生物学研究的各个领域。它是目 前最灵敏的超微量分析技术之一，其灵敏度高达1 0 s m o l l ，较r i a 的1 0 1 5m o l l 高出 3 个数量级1 3 引。采用t r f i a 方法建立的试剂盒具有效期长、无放射性污染、操作流程短、 灵敏度高、标准曲线量程宽、可全自动操作及应用范围十分广泛等优点。 1 6 1 基本原理 t r f i a 和通常的普通的荧光分析原理基本相同，只是t r f i a 采用了一种特殊的标 记物，即三价稀土离子( e l ，、t b 3 + 、s m 3 + 、d y 3 + 等) 及其螫合剂( 代替荧光物质、同 位素或酶) 标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，待反应体系( 如： 抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤 反应等) 发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对 荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目吲3 3 - 3 5 】。 t r f i a 的基本原理是：( 1 ) 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫 活性。( 2 ) 使抗原或抗体与某种稀土离子连接成标记抗原或抗体，这种标记标抗原或抗 体既保留其免疫活性，又保留稀土离子的荧光特性。在测定时，把受检标本( 测定其中 的抗体或抗原) 和标记抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载 体上的稀土离子量与标本中受检物质的量成一定的比例。通过延缓时间测量稀土离子的 荧光，消除自然荧光的干扰，从而使测定方法达到很高的敏感度l 蚓。 a + 圈 断销量舍物在保护 曩， 矬豫内形成 图1 2 时间分辨荧光免疫分析的基本原理 f i g 1 - 2 t h ep r i n c i p l eo f t i m e - r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y 1 6 2 时间分辨荧光免疫分析方法 时间分辨荧光免疫分析是以镧系元素如铕( e u ) 、钐( s i n ) 、镝( d ，) 、铽( t e ) 等稀土离 子为标记物，稀土离子需通过双功能螯合剂的桥联作用才能标记抗原或抗体，双功能螯 合剂的一端与e u 3 + 等连接，另一端同抗原或抗体分子上的氨基连接。常用的螯合荆有 n 厂【p 一异硫氰酸一苯基】一二乙烯三胺四醋酸( d t t a ) 、异硫氰酸一苯基一e d t a 及环 化二乙烯三胺五醋酸酐( c d p i a ) 等，它们含有带氨基羧酸或带异硫氰酸基羧酸等活性 基团，有很强的螯合稀土元素的能力【3 6 1 。 该类标记物具有以下特点：( 1 ) 以小分子量的稀土离子标记与酶和生物素等大分子 s 江南大学硕士学位论文 标记物相比，对于被标记物的生物活性和结构影响较小，同时，标记物更多、稳定性更 好、检测亦更灵敏。( 2 ) 这些离子可产生荧光，在游离状态下，该稀土离子的荧光信号 很弱，当其螯合物在紫外光或氮激光的激发下，从激发态跃回到基态时发射荧光，其荧 光激发光波长范围较宽，发射光谱峰范围窄，激发光和发射光之间有一个较大的s t o k e s 位移，可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离，有利于排除干扰、增强测 量的特异性，提高分辨率。( 3 ) 荧光信号为持久性，可反复测量，其荧光不仅强度高， 而且，荧光衰变时间长。利用时间分辨测量技术延缓测量时间，待测样品中短寿命 的自然荧光衰变后，再测定稀土离子的荧光，可消除自然荧光的干扰。还可以加入增强 液，使荧光强度可增强1 0 0 万倍，大大提高检测灵敏度。每秒钟检测样品1 0 0 0 次，结 果取平均值，有利于提高检测准确性。( 4 ) 将e u 3 + 等稀土离子标记免疫分子，就可建立 饱和或竞争的t r f i a 。t r f i a 能够克服酶标记物的不稳定和化学发光易受环境干扰及仅 能一次发光等缺点，使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到极高的信噪比，从而， 大大地提高了检测的灵敏度。( 5 ) 时间分辨荧光免疫分析还有一技术优势，即可以进行 多指标分析，若同时采用铕、钐、镝、铽等稀土离子标记不同的抗原或抗体，它们具有 不同的发射光谱和不同的荧光寿命，利用该特点可以进行双标记或多标记，就能够在一 次分析中得到多个数据。t r f i a 多标记的特点是其它免疫分析技术所不具备的瞰。3 5 j 。 根据免疫分析方法模式的不同，可以分为竞争法和夹心法两种。 ( 1 ) 竞争法：主要用于小分子抗原、半抗原及一些抗体的检测，如生物毒素、b2 微 球蛋白等【3 7 】，可采用直接竞争法或间接竞争法，直接竞争法一般在微孔板预先包被第二 抗体，先加入一定量的第一抗体和样品，孵育洗涤后再加入e u 3 + 标记的小分子抗原竞争 结合第一抗体。间接竞争法一般在微孔板预先包被抗原，加入一定量的第一抗体和样品， 孵育洗涤后再加入e u 3 + 标记的第二抗体进行示踪。而在一些抗体的检测中，标记抗体和 样品中的抗体通过竞争结合一定量的抗原来进行分析的。最后，通过孵育洗涤加入增强 溶液，所测得的荧光强度与样品的含量成反比，标准曲线为竞争抑制曲线。 ( 2 ) 夹心法；用于大分子生物活性物质的检测，该分析的微孔板包被一株抗体，稀 土离子标记另一株抗体，最后形成抗体抗原抗体标记物复合物，所测得的荧光强度与 样品的含量成正比，标准曲线为饱和平衡曲线【3 引。 1 6 3 时间分辨荧光免疫分析仪 目前，国内市场上常用的时间分辨荧光检测仪器有e g & g w a l l a c 公司的全自动 a u t o d e l f i a 1 2 3 5 ( 图1 3 ) 、半自动的v i c t o r l 2 3 0 、：v i c t o r l 2 3 4 、v i c t o r l 4 2 0 和国内厂家 生产的半自动时间分辨测量仪器( 图1 4 ) 。全自动d e l f i a 1 2 3 5 的操作实现全部自动 化，仪器包括样品架、样品条码识别器、液面传感器、吸样针、传送装置、孵育器、洗 板机、加样装置、孵育部分、测量部分、程序编制和数据处理的电脑等，可同时进行8 个品种、近千份测试，在电脑编程后，可自动进行样品识别、吸样、孵育、加增强液及 测量等步骤，在几个小时内最多可出近千份的结果，非常适合大样本、多指标的检测， 6 第一章绪论 如果用于食品安全的检测，可以进行大通量的筛查 图1 4半自动时间分辨荧光分析仪 f i g 1 4 t h es e m i a u t o - d e l f i a 1 7 本课题的立题目的、意义和研究内容 1 7 1 立题目的和意义 根据目前国内外检测c a p 各种方法的进展情况以及c a p 滥用及残留的严峻性，建 立一种克服各种检测方法缺点的灵敏度高，稳定性好，精确检测c a p 的技术势在必行。 如果我国食品出口到欧盟等市场，其检验检疫必须符合有关动物源性食品安全规定的要 求，在这方面我国产品的出口己屡次遭受损失。而且兽药残留限量也是贸易保护的一种 技术壁垒，有的国家利用检测污染物的技术优势，设置技术壁垒，此外欧盟委员会不断 严格动物源性食品c a p 的限量标准，其允许值常低于我国现有免疫学方法的检测限。 如果我们跟在国外进行研究的话，我们就无法超越国外的标准，也就随时有被限制的可 能。因此，尽快建立高灵敏、快速便捷的相关的检测，研制具有我国自主知识产权的试 剂盒，超越国外的技术壁垒是当务之急。另一方面，我国及欧盟、美国等国都明令禁止 江南大学硕士学位论文 使用c a p ，同样也要求检测方法灵敏度越高越好。 t r f i a 在医学等超微量检测领域中以其具有的更高灵敏度和精确度逐步替代了 e i a 等检测方法，因此我们采用t r f i a 技术，建立c a p 的高灵敏的t r f i a 的检测方法， 完善其应用基础研究，满足国内食品安全检测市场的迫切需要。应用t r f i a 检测c a p ， 其检测的灵敏度和精密度将大大高于酶联免疫，该方法在国内乃至国际上还极少有报 导，可以大大提高我国在兽药残留检测方面的技术水平。 1 7 2 研究内容 本研究的主要内容是建立高灵敏的c a p t r f i a 分析方法，并对建立的方法进行考 核，完成应用基础研究，为产业化发展打下基础。具体内容包括： 1 c a p 全抗原的合成与鉴定； 2 抗c a p 多克隆抗体的制备； 3 定量检测c a p 的间接竞争t r f i a 方法的建立； 4 c a p t r f i a 方法的考核。 8 第二章氯霉素抗原和抗体的制备 第二章氯霉素抗原和抗体的制备 为了建立免疫分析方法，首先必须制备出效价高特异性强的抗体。c a p 是小分子物 质( 分子量3 2 3 1 3 ) ，本身不具有诱导产生抗体的能力，为此，必须设法先将小分子c a p 与载体蛋白质偶联制备成全抗原，这是免疫分析的关键所在。 采用混合酸酐法，将c a p 分别和牛血清白蛋f 兰l ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) 和卵清蛋 白( o v a l b u m i n , o v a ) 偶联制备免疫抗原和包被抗原，通过质谱分析鉴定半抗原中间产物， e l i s a 确定偶联成功，以紫外扫描计算偶联率。以c a p b s a 免疫兔子制备多克隆抗体， e l i s a 评估抗体效价。 2 1实验材料 2 1 1 主要仪器 紫外可见分光光度计s p 2 1 0 0 u v 酶标仪 紫外扫描仪d u 一6 5 0 型架盘药物天平h c t p l1 质谱分析仪 漩涡微型振动器h 1 精密酸度计p h s 一3 t c 2 1 2 主要试剂与材料 氯霉素( c a p ) 牛血清白蛋白( b s a ) 卵清蛋白( o v a ) 弗氏完全佐剂和不完全佐剂 辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体 ( h r p 羊抗兔i g g ) 新西兰大白兔 氯甲酸异丁酯 c a p 单克隆抗体 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体 上海光谱仪器有限公司 b i o r a dm o d e l4 5 0 b e c k m a n 上海精密科学仪器有限公司 w a t e r sp l a t f o r mz m d4 0 0 0 上海青浦沪西仪器厂 上海天达仪器有限公司 上海生工 s i g m a 公司 上海西宝公司 s i g m a 公司 洛阳华美生物工程公司产品 江苏省原子医学研究所动物中心 宁波镇海翔宇化工有限公司 中国原子能研究院提供 洛阳华美生物工程公司产品 9 江南大学硕士学位论文 ( h r p 羊抗鼠i g g ) 其他试剂均为国产分析纯。 2 2 方法 2 2 1 氯霉素抗原的制备 混合酸酐法( m i x e da n h y d r i d e ，m a ) 合成抗原分为两步： ( 1 ) 氯霉素半琥珀酸酯( c a p - u s ) 的制备：将c a p 、琥珀酸酐、丙酮及吡啶混合，搅拌 溶解，6 0 c 回流反应2 h ，于旋转蒸发器中浓缩，得淡黄色粘稠液体。用乙酸乙酯洗出， 加1 mh c l 分层，取有机相，再用1 0 的n a h c 0 3 转溶后，用浓盐酸调p h 至2 ，用酸 乙酯萃取，取有机相旋转蒸发器浓缩，得淡黄色粘稠固体，取样做h p l c m c 。 ( 2 ) 称取c a p h s2 1 7 m g 溶于d m f3 m l 中，4 预冷1 0 m i n ，加入三丁胺，混匀； 并加入氯甲酸异丁酯，4 搅拌2 0 m i n 。以c a p ：b s a 为5 0 ：1 的摩尔比称取b s a ，溶于 5 0 的d m fl o m l 中，4 预冷。用1 mn a o h 调b s a 的p h 至8 。将上c a h s 液迅速 加入b s a 中，4 搅拌反应4 h 。所得产物以0 0 5 mp h 7 4 的p b s 透析3 d 。合成流程见 图2 - 1 。c a p o v a 的合成方法相同f 3 9 】。 曰 n 啦 f 竺蛩 o iq 曰 慨c 嚏莘寻心一c 吃r h 口 n 锄 2 ( 即p n 2 ) 的 最大稀释度。 2 3 结果 2 3 1 氯霉素抗原制备与鉴定 2 3 1 1 氯霉素半抗原的鉴定 c a p 的分子量为3 2 3 1 3 ，c a p h s 的分子量为4 2 3 1 3 ，图2 3 为c a p h s 的高效液 相色谱图，在1 0 8 4 m i n 的出峰为主峰，该峰经质谱仪分析的图谱见2 4 ，其分子量与 c a p 和c a p h s 一致，说明c a p 的活化成功，可以用于抗原合成。 1 3 一董蝴心曼：竺 慕鸯一 江南大学硕士学位论文 1 0 8 6 1 9 1 a 7 3080b j 器1 1 1 9 罗b 8 2 一1l 图2 3 c a p - h s 的高效液相液相色谱图 f i g 2 3 h p l co fc a p - h s 图2 _ 4c a p h s 的质谱图 f i g 2 4 m a s ss p e c t r ao f c a p - h s 2 3 1 2 全抗原的鉴定 采用间接竞争e l i s a 鉴定时，加入显色液a 、b 静置后，c a p 浓度为o n g m l 的孔 颜色显亮蓝色，c a p 浓度为1 0 0 n g m l 的孔几乎没有颜色。加入终止液后，颜色转为黄 色。酶标仪读取吸光值的结果见表2 1 ，该表数据显示，1 0 0 n g m l 的吸光值明显低于 o n g m l 的吸光值，因为此实验的步骤采用的是间接竞争e l i s a ，c a p 标准浓度越高， 与固相抗原竞争结合的抗体浓度越高，从而连接到酶标板上的抗体浓度越低。该表数据 表明，以m a 法合成的c a p b s a 抗原是成功的。 1 4 2 - 1 m a 法合成抗原e l i s a 鉴定结果 t a b l e 2 - 】e l i s ai d e n t i f i c a t i o no f a n t i g e np r e p a r e db ym ar e a c t i o n 采用分光光度法进行结合比率的估测：紫外扫描的结果见图2 5 。蛋白质在2 8 0 n t o 争 争 争 争 争 争 争 争 争 争 争 争 n 晤 缸慷 孙晦 融孵舡 睡 孙慷 一 n b 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 5 第二章氯霉素抗原和抗体的制各 处有特征吸收峰，c a p 的特征吸收峰在2 7 8 n m 处，由于二者的吸收峰几乎在同一波长 处，所以我们按照文酬4 u 提供的方法，根据波