（水产养殖专业论文）黄颡鱼肠道益生菌的筛选及其应用研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所星交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特另4 加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 面使用过的楷料，指导教师对此进行了审定。与我一同2 1 2 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：劫d 彩 时间：川口年b 月日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，印学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传播学位论文的全 部或部分内容，游时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适阁于本授权书 学位论文作者签名：南。秽导师摊：泺易诲 签名日期：刹夕年多月撕 签名日期：矽p 年 占月z 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 黄颡鱼肠道益生菌的筛选与初步应用研究 目录 摘要i 6 l b ；t r a c t i i i 第1 章益生菌在水产养殖中应用的研究进展1 1 1 益生菌的概念1 1 2 研究现状2 1 2 1 益生菌的种类2 1 2 2 益生菌的作用机理。2 1 3 益生菌剂在水产养殖中的应用5 1 3 1 饵料添加剂5 1 3 2 改善水质5 1 4 存在问题及发展前景6 第2 章黄颡鱼( 阳l 强j d 脚锹嬲f 观删c d ) 肠道菌群初步分析7 2 1 材料与方法7 2 1 1 实验材料7 2 1 2 取样7 2 1 3 细菌计数7 2 1 4 细菌的鉴定8 2 2 结果8 2 2 1 各段肠道的细菌数量8 2 2 2 各段肠道的细菌组成8 2 3 讨论9 第3 章1 株黄颡鱼肠道益生菌的筛选与鉴定11 3 1 材料与方法1 1 3 1 1 菌株及其来源1 1 3 1 2 供试鱼1 2 3 1 3 培养基1 2 3 1 4 产酶试验1 2 3 1 5 病原菌的拮抗试验。1 2 3 1 6 药敏试验。13 3 1 7 致病力测试1 3 3 1 8h s l 4 0 菌株的鉴定1 3 6 2 1 地衣芽孢杆菌的促生长效果3 5 黄颡鱼肠道益生菌的筛选与初步应用研究 6 2 2 溶菌酶活性的变化3 5 6 2 3 白细胞吞噬活性的变化。3 6 6 2 4 血清中总蛋白含量的变化3 7 6 2 5 血清中谷丙转氨酶活性的变化。3 8 6 2 6 攻毒结果3 8 6 3 讨论3 9 参考文献4 1 附录1 试验照片4 8 附录2 硕士期间发表论文5 0 致谢5l 黄颡鱼肠道益生菌的筛选与初步应用研究 摘要 本研究以黄颡鱼( p e l t e o b a g r u sf u l v i d r a c o ) 为试验对象，系统研究了黄颡鱼肠 道微生态结构特征，并筛选出黄颡鱼肠道中的一株益生地衣芽孢杆菌( b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s ) 并以不同浓度添加到饲料中，评价了地衣芽孢杆菌对黄颡鱼肠道菌群 以及机体非特异性免疫指标的影响。 ( 1 ) 对健康养殖的黄颡鱼肠道需氧及兼性厌氧菌群进行了研究。结果表明：前 肠的细菌数量为3 9 5 x 1 0 6 c f u g ，中肠的细菌数量为1 5 6 x 1 0 7c f u g ，后肠的细菌数量 为3 9 8 1 0 7c f u g 。对从肠道中分离出的1 2 1 株菌进行属( 科) 鉴定。前、中、后肠 分别鉴定出1 2 、9 、7 个属( 科) 。结果显示优势菌为肠杆菌科和气单胞菌属，次优 势菌为弧菌属和假单胞菌属。这些菌株分属于1 2 个属( 科) ，分别为棒杆菌属、芽 孢杆菌属、微球菌属、葡萄球菌属、肠杆菌科、假单胞菌属、产碱菌属、弧菌属、 气单胞菌属、莫拉氏菌属、不动杆菌属、黄杆菌属。 ( 2 ) 从正常养殖的黄颡鱼肠道中分离得到1 2 1 株细菌，通过产酶能力测试、 对常见病原菌体外拮抗作用以及对抗生素敏感性试验筛选出1 株益生菌h s l 4 0 。通 过测定h s l 4 0 菌株对黄颡鱼的致病性，并结合形态观察、生理生化试验和1 6 sr d n a 部分序列分析，对h s l 4 0 菌株进行了分类鉴定。结果显示，h s l 4 0 菌株具有很强的 分泌蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的能力，能够抑制温和气单胞菌( a e r o m o n a ss o b r i a ) 、 迟缓爱德华氏菌( e d w a r d s i e l l at a r d a ) 和鳗弧菌( v i b r i oa n g u i l l a r u m ) 的生长。h s l 4 0 菌株对氨苄青霉素、磺胺异恶唑、先锋霉素v i 等3 种抗生素产生耐药性，对另外 氟哌酸、新霉素等1 3 种抗生素均敏感或中度敏感。急性毒性试验表明试验剂量为 1 0 8 c f u m l 的h s l 4 0 菌株对黄颡鱼没有致病性。形态观察h s l 4 0 菌株为革兰氏阳性 可动杆菌，1 6 sr d n a 的部分序列分析显示h s l 4 0 菌株与丑l 纪h e n i f o r m i s 具有9 9 3 的相似性，系统发育树上h s l 4 0 菌株与b 1 i c h e n i f o 瑚西( f j 4 3 5 6 7 4 ) 聚为同一分支， 结合形态观察和生理生化试验结果最终鉴定h s l 4 0 菌株为丑l i c h e n i f o m 捃。 ( 3 ) 从黄颡鱼肠道菌群中筛选出1 株地衣芽孢杆菌h s l 4 0 ，研究了其生长特 征以及对p h 值、高温和高胆盐的耐受特性。结果显示：h s l 4 0 的最佳发酵时间为 1 6h ；h s l 4 0 有较强的耐酸能力，当p h 为2 时，作用2h 后可以检测到有1 0 z c f u m l 以上的活菌数；随着胆盐浓度的增加，h s l 4 0 活菌数逐渐减少，当胆盐浓度升高到 0 3 以上时，作用2h 后，h s l 4 0 存活数都低于1 0 4c f u m l ；h s l 4 0 对温度有较高 的耐受性，分别在9 0 和1 0 0 条件下处理h s l 4 01 0m i n ，h s l 4 0 活菌数量各为 5 6 x 1 0 6 e f u m l 和2 8 x 1 0 6c f u m l 。试验表明菌株h s l 4 0 可作为益生菌应用于黄颡鱼 饲料添加剂的开发。 ( 4 ) 饲料中添加不同浓度的丑l i c h e n i f o r m mh s l 4 0 ，连续投喂黄颡鱼5 6d ，通 过测定供试鱼肠道中需氧及兼性厌氧菌的数量和主要菌群组成比例的变化，探讨了 丑l i c h e n i f o r m m 对黄颡鱼肠道好氧及兼性厌氧菌群的影响。结果显示，投喂丑 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 l i c h e n i f o r m i sh s l 4 0 后，黄颡鱼肠道内细菌数量增加到1 0 1 0 8c f u g 左右，组间无显 著差异；黄颡鱼肠道内的主要菌群气单胞菌和肠杆菌的比例随着芽孢杆菌的投喂量 和投喂天数的增加而降低，而芽孢杆菌比例则显著升高。 ( 5 ) 饲料中添加不同浓度的& l i c h e n i f o r m i sh s l 4 0 ，连续投喂黄颡鱼5 6 天， 通过测定供试鱼的增重量、溶菌酶活性、白细胞吞噬活性、谷丙转氨酶活性、血清 总蛋白含量以及a h y d r o p h i l a 攻毒后的相对保护率，探讨了置l i c h e n i f o r m i s 对黄颡 鱼的生长和非特异性免疫功能的影响。结果显示，投喂添加及l i c h e n i f o r m i s 的饲料， 供试黄颡鱼不仅增重量有所提高，各项非特异性免疫指标也有所改善，s g p t 的活 性出现下降趋势；丑l i c h e n i f o r m i s 的最适添加浓度为5 x 1 0 8c f u g 。 关键词：黄颡鱼；肠道菌群；地衣芽孢杆菌；非特异性免疫 i i 黄颡鱼肠道益生菌的筛选与初步应用研究 a b s t r a c t y e l l o wc a r t f i s h ( p e l t e o b a g r u sf u l v i d r a c o ) w a st o o ka st h ee x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s a n df o c u s e do nt h ei n t e s t i n a lm i c r o f l o r a , t h e nas t r a i no fp r o b i o t i cb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s h s14 0w a si s o l a t e da n ds u p p l e m e n t e dw i ma p p r o p r i a t ea m o u n ti nd i e t st of e dy e l l o w c a r t f i s h ，t h ei n f u l e n e eo fd i e t a r yb 1 i c h e n i f o r m i so nt h er e s i s t a n c eo fy e l l o wc a r t f i s hw e r e d e t e r m i n e db yi n t e s t i n a lb a c t e r i a la n dn o n - s p e c i f i ci m m u n ef u n c t i o n ( 1 ) t h ea e r o b i ci n t e s t i n a lb a c t e r i a lf l o r a lo fy e l l o wc a r t f i s hp e l t e o b a g r u s f u l v i d r a c o w a si n v e s t i g a t e d t h et o t a ln u m b e ro fb a c t e r i ai nt h ef o r e g u t ，m i d g u t ，a n dh i n d g u tw e r e 3 9 5 x 1 0 6c f u g ，1 5 6 x 1 0 7 c f u g ，2 9 8 x 1 0 7 c f u g 1 2 1b a c t e r i a ls t r a i n sw e r ei s l o l a t e df o r m t h ey e l l o wc a r t f i s hp e l t e o b a g r u s f u l v i d r a c o t h ed o m i n a n tb a c t e r i aw e r ea e r o r n o n a ss p p , e n t e r o b a c t e r i a c e a , v i b r i os p p , p s e u d o m o n a ss p p 12 ，9a n d7t a x o n o m i cg r o u p sw e r e i d e n t i f i c a t e df r o mt h ef o r e g u t ，m i d g u ta n dh i n d g u tr e s p e c t i v e l y t h o s eb a c t e r i a ls t r a i n s i n c l u d ec o r y n e b a c t e r i u ms p p , b a c i l l u ss p p , m i s r o c o c c u ss p p , s t a p h u l o c o c c u ss p p , e n t e r o b a c t e r i a c e a , p s e u d o m o n a ss p p , a l c a l i g e n e ss p p , f i b r i os p p , a e r o r n o n a ss p p , m o r a x e l l as p p , a c i n e t o b a c t e rs p p , f l a v o b a c t e r i u ms p p ( 2 ) 121b a i t e r i as t r a i n si s o l a t e df o r mi n t e s t i n a lt r a c to fc u l t u r e dp e l t e o b a g r u s f u l v i d r a c ow e r eu s e df o rt e s t i n gt h ez y m o g e n i c i t i e so fp r o t e a s e ，l i p a s ea n da m y l a s e ，t h e a n t a g o n i s t i ca g a i n s t5k i n d so fc o m m o np a t h o g e n i cb a c t e r i a sa n dt h ea n t i b i o t i cs e n s i t i v i t y t h et o x i c i t yo fs t r a i nh s14 0s c r e e n e da sp o t e n t i a lp r o b i o t i cf o rp e l t e o b a g r u sf u l v i d r a c o w a se v a l u a t e d ，a n dh s14 0w a si d e n t i f i e da c c o r d i n gt oi t sm o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa sw e l la sh o m o l o g ya n a l y s i so f16 sr r n ag e n e s s e q u e n c e s t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a th s14 0h a v eh i g hz y m o g e n i c i t i e sa b i l i t ya n d i n h i b i t o r yt oe d w a r d s i e l l at a r d a ，a e r o m o n a ss o b r i aa n df i b r i oa n g u i l l a r u m h s 14 0w a s r e s i s t a n tt oa m p i c i l l i n ，s u l f a m e t h o x a z o l e ，v ic e f r a d i n e ，b u ts e n s i t i v eo rm e d i u ms e n s i t i v e t ot h eo t h e r13k i n d so fa n t i b i o t i c s ，s u c ha sf u l g r a m ，n e o m y c i na n ds oo n i tw a ss a f ef o r p e l t e o b a g r u sf u l v i d r a c ow h e nt h e yw e r ec h a l l e n g e db yah i g hi m m e r s i o nc o n c e n tr m i o n o fh s14 0a t10 8 c f u m l m o r p h o l o g yo b s e r v a t i o ns h o w e dt h a th s14 0w a sg r a m p o s i t i v e ， r o da n dm o t i l e t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a ts t r a i nh s 14 0c o m p r i s e ds e q u e n c e sm o r er e l a t e d t o 丑l i c h e n i f o 删西( 9 9 3 ) f r o mp a r t i a l16 sr r n ag e n e ss e q u e n c e s t h ei d e n t i f i c a t i o n s h o w e dt h a ts t r a i nh s14 0w a sb 1 i c h e n i f o r m i sb yt h ew a yo fm o r p h o l o g y b i o c h e m i s t r y c h a r a c t e r i s t i ca n d16 sr r n ag e n e ss e q u e n c eh o m o l o g ya n a l y s i s ( 3 ) as t r a i no fb 1 i c h e n i f o r m i sh s14 0 、 ，i t hh i g he c t o e n z y m e - p r o d u c i n ga b i l i t yw a s s c r e e n e df r o mp e l t e o b a g r u sf u l v i d r a c oi n t e s t i n e t h eg r o w t hc h a r a c t e r so fh s 14 0a n d t o l e r a n c eo fp h ，b i l es a l ta n dt h e r m a lw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e o p t i m u mf e r m e n t i n gt i m eo fh s 14 0w a s16h o u r s ；h s14 0h a ds i g n i f i c a n ta c i dr e s i s t a n c e ， i i i 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 t h es u r v i v a lc o u n t so fh s 14 0a b o u t10 2c f u m lc o u l db ed e t e c t e dw h e np hv a l u ew a sa t2 f o r2h o u r ；t h en u m b e ro fh s14 0r e d u c e dw i t ht h ei n c r e a s eo fb i l es a l tc o n c e n t r a t i o n ，l e s s t h a n1 0 4c f u m ln u m b e ro fh s l 4 0w a sd e t e c t e dw h e nm o r et h a n0 3 0 b i l es a l tw a s a d d e di nc u l t u r em e d i u mf o r2h o u r s ；i na d d i t i o n , h s14 0h a do b v i o u st h e r m a lr e s i s t a n c e ， t h en u m b e ro fh s l 4 0c a nr e a c h5 6 x1 0 6c f u m la n d2 8 x1 0 6e f u m la t9 0 * c a n d1 0 0 f o r10m i n u t e s t h es t u d ys h o w e dt h a th s14 0h a v eg r e a td e v e l o p m e n tp r o s p e c ti nt h e p e l t e o b a g r u s f u l v i d r a c om i c r o b i a lp r e p a r a t i o n sf o ri t st o l e r a n c ec h a r a c t e r i s t i c s ( 4 ) p e l t e o b a g r u s f u l v i d r a c ow a s f e d 、i t hd i e t ss u p p l e m e n t e d 、 ，i t hd i f f e r e n ta m o u n t o tb 1 i c h e n i f o m i sh s1 4 0 5 6d a y sa f t e rt h ei n o c u l a t i o n ，t h ei n f u l e n c eo fd i e t a r yb 1 i c h e n i f o 厂，”l 奢o nt h e r e s i s t a n c eo fy e l l o wc a r t f i s hw e r ed e t e r m i n e db ye x a m i n gt h e v a r i a t i o no fa e r o b i ca n df a c u l t a t i v ea n a e r o b i cb a c t e r i a lq u a n t i t ya n dc o m p o s i t i o no ft h e p r e d o m i n a n tb a c t e r i a s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h en u m b e r so ft h ei n t e r s t i n a lm i c r o f l o r a o fy e l l o wc a r t f i s hi n c r e a s et oa b o u tlxl0 5c f u ga f t e rf e e d i n g 丑l i c h e n i f o r m i sw i t hh s14 0 t h ed i f f e r e n c e sw a sn o tm u c he v i d e n ta m o n gt h eg r o u p s a f t e rf e e d i n g 谢t l lb l i c h e n i f o r m i sh s 14 0t h ep e r c e n t a g eo fa e r o m o n a sa n de n t e r o b a c t e r i a c e a ed i c l i n e da n d b a c i l u si n c r e a s e da st h ef e e d i n gd a y si n c e a s i n g ( 5 ) p e l t e o b a g r u sf u l v i d r a c ow a sf e dw i t hd i e t ss u p p l e m e n t e d 、析t ha p p o p r i a t e a m o u n to fb 1 i c h e n i f o r m i sh s14 0 5 6d a y sa f t e rt h ei n o c u l a t i o n ，t h ei n f u l e n c eo fd i e t a r y b 1 i c h e n i f o r m t s o nt h er e s i s t a n c eo fp e l t e o b a g r u sf u l v i d r a c ow e r ed e t e r m i n e db y e x a m i n gt h e i rg a i n e dw e i g h ，l y s o z y m ea c t i v i t y , p h a g o c y t i ca c t i v i t y , t o t a lp r o t e i n ，s g p t a c t i v i t yi ns e r u ma n dr e l a t i v ep e r c e n ts u r v i v a l ( r p s lb yc h a l l e n g i n gw i t l ll i v ea h y d r o p h i t h er e s u l t ss h o w e dt h ea d d i n gb 1 i c h e n i f o r m b si n t ot h ed i e t sc a nn o to n l ye n h a n c et h e i m m u n er e s p o n s ea n dt h er e s i s t a n c eo fp e l t e o b a g r u sf u l v i d r a c ot oa h y d r o p h lb u ta l s o i m p r o v et h e i rl i v e rf u n c t i o na n dp r o m o t et h e i rg r o w t ht os o m ed e g r e e t h ea p p r o p r i a t e a d d i n gd e n s i t yo fb 1 i c h e n i f o r m i sw a s5 x10 5c f u g k e yw o r d s ：p e l t e o b a g r u s f u l v i d r a c o ；i n t e s t i n a lm i c r o f l o r a ；b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ； n o n s p e c i f i ci m m u n e 黄颡鱼肠道益生菌的筛选与初步应用研究 第l 章益生菌在水产养殖中应用的研究进展 伴随着水产养殖业的高速发展，工业化、集约化水产养殖模式的日益扩大，水 产养殖的水环境质量日趋下降，水产动物病害频繁发生。抗生素的使用虽然对水产 动物疾病的防治起到了积极的促进作用，但随着科学的发展，其对人类的不良影响 逐渐显现出来。例如，抗生素可能引起机体微生态结构的失调，其大量使用会造成 耐药因子的传递而致使机体耐药性的产生。另外，抗生素的残留可以通过食物链的 积累间接影响人类的健康。b a l c a z a r ( 2 0 0 6 ) 研究表明耐药机制产生的一个方面是染 色体突变，染色体突变不能遗传；另一个方面是质粒重组，这种重组可在种群中快 速遗传。 随着人们对生活质量和健康的日益重视，微生态制剂越来越受到人们的关注， 大量实践证明，微生态制剂的成功应用可以减少抗生素的用量，提高养殖动物的免 疫力，进而抑制病原微生物的生长，对维持水产养殖业的可持续发展起到积极促进 作用。在日本、欧美、泰国以及印度尼西亚等国家的水产养殖业中，微生态制剂的 应用比较广泛并且创造了巨大的经济效益，微生态制剂将成为未来水产养殖动物病 害防治的一个新方向( 楼丹，2 0 0 9 ) 。 1 1 益生菌的概念 益生菌( p r o b i o t i c s ) 最初是由p a r k e r 定义为能够促进肠道微生态结构平衡的一 类微生物( p a r k e r ，1 9 7 4 ) ；1 9 8 9 年f p l l e r 对益生菌作了重新的定义，f i ，t l l e r 认为益 生菌( p r o b i o t i c s ) 是指通过添加到饲料中投喂，并对宿主的微生态平衡起到积极作 用的一类活的微生物。某些微生物能够对机体产生影响很早以前就被人们所发现， 经过试验研究，各种有益微生物( 益生菌) 不断地从细菌、酵母等微生物群落中筛 选出来。“p r o b i o t i c s ”一词被提出到现在，有关益生菌对宿主肠道微生态结构的影响， 益生菌与宿主抗病免疫的关系以及益生菌在机体内的代谢、作用机制等方面都进行 了大量的研究，同时也出版了多本有关益生菌的专著( l i l l ya n ds t i l l w e l l ，1 9 6 5 ； f p l l e r ，1 9 9 2 ：s a l m i n e n ，1 9 9 8 ；y u a n ，1 9 9 9 ) ，但主要应用研究多集中在陆生动物 方面。尽管微生态制剂在水产方面的应用研究可以借鉴陆生动物的研究结果，但对 于水生动物来说，益生菌的应用要复杂得多。其一，病原体可以生长在水生动物生 存的水体环境中，在一定条件下水产动物周围的病原体可以形成优势种群，但水生 动物不会出现异常现象( m o r i a r t y ，1 9 9 8 ) 。其二，水体环境中微生物可以独立生活， 也可以与宿主形成共生作用，一般生存于宿主的皮肤、腮或肠道上，与宿主共同分 享水生态资源。其三，水生动物在刚孵化出来时，机体的肠道功能系统发育未完全， 几乎没有生态群落，此时受水体环境的影响极大。所以，相对于陆生动物，研究水 生动物的益生菌最重要的是了解水生动物所处的周围水域环境( s k j e r m oe t a l ，1 9 9 7 ) 。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 水生生物中的益生菌除t 多 i - 来的菌种外也可能是动物本身含有的内源菌，如淡 水鱼中的气单胞菌和芽孢杆菌，海水鱼中的假单胞菌和副溶血性弧菌等( b a l c a z a r ， 2 0 0 6 ) 。内源微生物可能取决于宿主自身的基因，而周围的环境因素及饲料中含有的 外源微生物对水生生物肠道微生态平衡的影响大于陆生动物。 1 2 研究现状 1 2 1 益生菌的种类 各国对益生菌的种类的规定有所不同。1 9 8 9 年美国饲料管理协会( a m e r i c a n a s s o c i a t i o no f f e e dc o n t r o l0 m c i a l s ，a a f c o ) 和美国食品药物管理局( f o o da n dd r u g a d m i n i s t r a t i o n ，f d a ) 公布了总共4 3 种“通常认为安全并可直接饲喂的细菌微生物 作为微生态制剂开发菌株。1 9 9 9 年，中国农业部第1 0 5 号公告公布了可以直接添加 到饲料中菌种有1 2 个，中国农业部2 0 0 3 年在第3 1 8 号公告中再次公布了可以直接 作为添加到饲料中菌种有1 5 个，比第1 0 5 号公告中多了地衣芽孢杆菌 ( b 1 i c h e n i f o r m i s ) ，乳酸乳杆菌( 三1 a c t i s ) 和两歧双歧杆菌( b b i f i d u m ) 3 个菌种。 实际生产中应用的微生态制剂一般多个菌种复合加工而成。 1 2 2 益生茵的作用机理 为了更好的了解益生菌的作用机理，最适合的方法是把机体肠道作为益生菌生 存的生态系统。f i ，t l l e r ( 1 9 8 9 ) 明确的阐述了益生菌对陆生动物的作用机理。自上 个世纪9 0 年代以来，微生态制剂在水产业中已有较大的发展，但相对于陆生动物来 说，所有的作用机制都是经验性的，很少有细致的、从内在机理来分析益生菌对宿 主的作用( l a u r e n t e t a l ，2 0 0 0 ) 。总体来说，水产动物益生菌的存活与在机体中的 作用机理方式如下：分泌抑制物、竞争抑制、提供营养并促进宿主对营养成分的消 化吸收、增强机体免疫力。 1 2 2 1 分泌抑制物 石军( 2 0 0 2 ) 通过体内与体外试验均证实了益生菌具有良好的作用效果。有研 究报道，很多益生菌都能分泌某些被称为细菌素( b a c t e r o c i n ) 的物质，这些物质能 够抑制并杀死周围影响其生长的其它病原菌。乳酸菌分泌的细菌素主要是有机酸和 过氧化氢等物质，这些酸性物质通过降低肠道p h 值，改变病原菌的生存环境从而 达到抑制其生长和繁殖的作用( r i n g oa n dg a t e s o u p e ，1 9 9 8 ) 。很多相关报道都表明， 从水产养殖环境中分离出来的益生菌能够分泌对水产动物病原菌产生抑制作用的物 质。s u g i t a ( 1 9 9 8 ) 通过对分离自j a p a n e s ec o a s t a lf i s h 肠道中的一株芽孢杆菌1 2 n m 进 行研究，结果表明该菌株能分泌一种对海水鱼肠道中的某些病原菌具有较强的抑制 2 黄颡鱼肠道益生菌的筛选与初步应用研究 力胞外抑菌物质。b e r g h ( 19 9 5 ) 对比目鱼( h i p p o g l o s s u sh i p p o g l o s s u s ) 幼体肠道菌 群微生态结构进行研究并从中筛选出一株益生菌，研究发现有此菌株存在情况下， 致病弧菌的生长不会超过一定的范围。所有报道均表明益生菌分泌抑制物都是在实 验室通过实验产生的，但对于水产动物来说，其生存的环境与实验条件相差甚远， 即使实验条件下益生菌能够产生分泌物，但是这也不能证明益生菌在体内或在水体 环境下就一定能产生。然而，益生菌在体内的保护作用与体外的对病原菌抑制或杀 灭作用之间必然存在着一定联系。 1 2 2 2 竞争抑制 竞争抑制是益生菌发挥作用的一个重要机制，同时也是微生态中生态位理论观 点的体现。与陆生动物相似，在水产动物体内，益生菌对病原菌具有占位抑制与营 养抑制2 种竞争性抑制作用方式。益生菌进入机体后，最先发挥作用就是与病原菌 竞争黏附位点( 杜震宇，2 0 0 2 ) 。m o n t e sa n dp u g h ( 1 9 9 3 ) 也同样认为益生菌粘附于 宿主机体组织表面是其发挥作用的前提，只有粘附才能更好的定植并繁衍。益生菌 大量的占据机体内固定位点，在宿主体内适宜的生长条件下形成优势种群，抑制病 原菌的数量，致使病原菌对机体产生不了作用。g i b s o n 等( 1 9 9 8 ) 对牡蛎幼体抗病 力进行研究，报道指出，所分离的一株益生菌其分泌物能够抑制病原菌的黏附能力， 使自身在竞争占据黏附位点时处于优势。然而在某些特殊情况下，竞争除了使病原 菌数量减少之外，自身的数量也会减少，即益生菌在保证提供其有益作用的前提下， 本身数量下降的速度反而要高于病原菌。至于这种现象的确切机理，目前仍不清楚。 益生菌在机体内同样需要营养物质，当所需的营养成分不足时，机体又不能够 及时提供，此时益生菌必然会通过所用方法抢占营养资源，这就是益生菌的营养竞 争机制。益生菌具有比病原菌更有效的利用有限的营养物质的能力，这样就更进一 步地抑制病原菌的生长( p a r m o da n dj h a r i ，1 9 9 8 ) 。荧光假单胞菌( p s e d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) 通过与病原菌杀鲑气单胞菌( a e r o n o n a ss a l m o n i c i d a ) 竞争培养基中的 游离铁离子来控制的病原菌的数量，以此减少了养殖鲑鱼杀鲑气单胞菌病的发生等 ( s m i t he t a l ，1 9 9 3 ) 。r i c o m o r a 等( 1 9 9 8 ) 对一株益生菌作了研究表明，这株细菌 的优势是能够在有机物质缺乏的机质中快速生长，把这株细菌接种于硅藻培养物 中，另外加入的溶藻胶弧菌很难生长定植。第二个体外实验却明显表明该细菌株对 溶藻胶弧菌没有抑制作用。结合2 个试验得出结论，该菌株与溶藻胶弧菌竞争的是 硅藻的营养物质。v e r s c h u e r e 等筛选并研究了几株益生菌，该细菌能够提高卤虫成 活率并能促进卤虫的幼体生长率。体外试验显示，在有活菌存在的情况下卤虫没有 受弧菌的感染，但是在没有细菌存在下，仅仅是细菌胞外抑制化合物却不能保护卤 虫而免受弧菌的感染( v e r s c h u e r ee t a l ，1 9 9 9 ) 。这也体现了益生菌具有营养竞争的 机制。 4 黄颡鱼肠道益生菌的筛选与初步应用研究 1 3 益生菌剂在水产养殖中的应用 1 3 1 饵料添加剂 益生菌对增强机体新陈代谢、促进机体生长发育起到积极作用，添加到饲料中 投喂动物能促进其肠道的微生态平衡。参考陆生动物使用益生菌的经验，近几年随 着水产业的发展，应用于水产动物的益生菌如酵母菌( y e a s t ) 、乳酸菌( l a c t i ca c i d b a c t e r i a ) 和芽孢杆菌( b a c i l l u s ) 也相继增加。 芽孢杆菌是一种需氧的革兰氏阳性菌，能够耐受一定的高温，并对高胆盐和酸 碱有很强的耐受能力。g a t e s o u p e 等( 1 9 9 8 ) 发现芽孢杆菌孢子能够有效抑制某些属 的弧菌的生长，并且用芽孢杆菌孢子培养大菱鲆的幼体可以明显增加大菱鲆幼体重 量。刘克琳等( 2 0 0 0 ) 将芽孢杆菌添加到饲料中投喂鲤鱼，对其一些免疫器官的变 化进行对比表明，投喂芽孢杆菌血清中的补体、巨噬细胞明显增加；胸腺中的t 、b 淋巴细胞增多，淋巴细胞数目也相应增多。在对虾的育苗中，许章程( 2 0 0 6 ) 发现 将几种益生菌按照一定比例混合后添加到饲料中投喂，对虾的生长和发育，存活等 都相应的比未添加益生菌的对照组有所提高。 酵母菌( y e a s t ) 常生长在偏酸性的水体环境中，肠道内如有适宜的环境即可以 大量繁殖。其本身就可以作为鱼虾的饲料饵料，同时可以分解水体环境中的糖类。 研究发现，酵母菌添加到饲料中，在增加鱼体重量的同时，对弧菌的抑制效果也很 明显( s c h o l ze ta 1 ，1 9 9 9 ) 。促维仁( 1 9 9 2 ) 用酵母替代部分鱼粉添加到饲料中投喂 对虾，结果表明酵母具有提高成活率和增加产量的作用，同时也可以提高对虾的抗 病力。 1 3 2 改善水质 芽孢杆菌、硝化细菌和光合细菌等微生物在参与机体有机物的降解过程发挥着 多种生物作用，包括氧化还原、硝化与反硝化以及固氮作用等，溶解降低环境中的 h 2 s 气体、n h 4 + 和n 0 2 。等有害物质，从而减少水体中溶解氧的消耗，保证水体充足 的氧气，有利于改善水质，给水生生物创造良好的水体环境( 丁彦文和艾红，2 0 0 0 ) 。 枯草芽孢杆菌产生某些激素能够分解有机物质，便于水生动物的吸收，促进水生生 物的生长并达到净化水质的作用。消化