（分析化学专业论文）lapo4eu荧光纳米粒子的合成及其在生物分析中的应用.pdf

之0g ( c 、0 o + j 、 口 岷 _ r 0 r 7 中莓 、凄， ，j ? ：； 曩专 7 p 髟。7 ： r ，声， j：一hv，i ； ，pw 。嚼” 一1蕊谭 一 ， 。 ?i豁i一 at h e s i si na n a l y t i c a lc h e m i s t r y s y n t h e ) i s ) fl a p 0 4 ：e uf l u o r e s c e n tn a n o p a r t i c l e s a n di t sa p p l i c a t i o ni nb i o l o g i c a l a n a l y s i s b yz h a n gx u e f e i s u p e r v i s o r ：v i c ep r o f e s s o ry uy o n g l i n o r t h e a s t e r nu n i v e r s i t y i 、 j u n e2 0 0 8 q j1“艇f矗引t一、苫j0，】1i l本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 i i的研究成果除加以标注和致谢的地方钋，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 i i 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 i l意。 学位论文作者签名：云蟛遁谚 日期：例1 、呷 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论文 的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北大学可以将学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 作者和导师同意网上交流的时间为作者获得学位后： 半年口一年口一年半口两年口 学位论文作者签名：虽比穆，2 乒导师签名：臼永硼 签字醐。 钞形刁d 7 签字嗍：瑚矗7 夕 ：j ，+ 东北大学硕士学位论文 摘要 l a p 0 4 ：e u 荧光纳米粒子的合成及其在生物分析中的应用 摘要 近年来，生物标记材料的研究与应用极大地促进了生物学研究的进步与发展。目前 广泛使用的有机染料和纳米金等生物标记材料因存在发射光谱宽、光热稳定性差、间歇 性发光和细胞毒性等诸多缺陷，有很大的应用局限。稀土荧光纳米粒子具有毒性低、化 学稳定性高、发光强度高而稳定( 无闪烁) 、s t o k e s 位移大、半峰宽窄和荧光寿命长等 一系列优点，将稀土荧光纳米粒子作为标记物应用于生物分析可以显著提高检测的灵敏 度，因此可望发展成为一类新型的具有巨大发展前景的发光生物标记材料。 本实验采用水热法合成l a p 0 4 ：e u 荧光纳米粒子，研究结果表明，合成l a p 0 4 ：e u 纳 米粒子的最佳条件为：反应温度1 3 0 ，反应时间1 2 0m i n ，稀土离子、柠檬酸钠和磷 酸钠的摩尔比为5 ：6 5 ：4 ，初始反应物浓度为0 1 m o l l 1 ，反应溶液p h 值为1 1 0 ，掺铕 比率3 0 。合成的l a p 0 4 ：e u 粒子稳定性和分散性良好，荧光寿命为1 9 6m s 。对制备的 纳米粒子进行表征，x r d 实验表明，制备了六方晶系的l a p 0 4 ：e u 晶体；t e m 实验表明 合成粒子结晶度较好；粒度分布实验表明，合成粒子的粒度为3 2 3a m ；i r 实验表明， 合成粒子表面包覆了柠檬酸根。 用制备的l a p 0 4 ：e u 纳米粒子通过共价作用标记牛血清白蛋白( b s a ) ，确定了标记 的最佳实验条件；在固相状态下，l a p 0 4 ：e u b s a 的荧光强度与b s a 的浓度有较好的线 性关系，回归方程为1 = 5 0 3 3 c + 1 6 0 0 ，相关系数r = 0 9 8 5 5 。据此，可以对标记b s a 进 行初步定量分析在p h 值为7 4 的磷酸缓冲溶液中，用l a p 0 4 ：e u 纳米粒子通过静电作 用标记了亲和素，标记亲和素保留了原有的反应活性，可以和生物素发生特异反应。以 滤膜作载体，标记亲和素生物素的荧光强度和亲和素的浓度呈良好的线性关系，回归 方程为l = 7 1 5 2 6 c + 1 6 0 0 8 ，相关系数r = 0 9 9 4 8 ；这为应用b a s 体系进行免疫分析检 测奠定了实验基础 关键词：l a p 0 4 ：e u ；荧光；纳米粒子；生物标记；牛血清白蛋白；亲和素 - i i - 东北大学硕士学位论文absct s y n t h e s i so fl a p 0 4 ：e uf l u o r e s c e n tn a n o p a r t i c l e s a n di t sa p p l i c a t i o ni nb i o l o g i c a l a n a l y s i s a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，t h eu s eo fb i o l o g i c a ll a b e l i n ga g e n t sh a sg r e a t l ya s s i s t e dt h es t u d i e si nt h e f i e l do fb i o l o g y c o n v e n t i o n a lb i o l o g i c a ll a b e l i n ga g e n t ss u c ha so r g a n i c d y e sa n dn a n o g o l d h a v es e v e r a ll i m i t a t i o n sc a u s e db yt h e i ri n t r i n s i cp r o p e r t i e s ，s u c ha sb r o a de m i s s i o np r o f i l e s ， p o o rp h o t o c h e m i c a ls t a b i l i t y , i n t e r m i t t e n te m i s s i o n ，a n dc y t o t o x i c i t ye t c c o n s i d e r i n g a t t r a c t i v eo p t i c a la n dc h e m i c a lf e a t u r e so fr a r e e a r t hf l u o r e s c e n tn a n o p a r t i c l e s ，s u c ha sl o w t o x i c i t y , l a r g ee f f e c t i v es t o k e ss h i f t s ，h i i g hf l u o r e s c e n c ee m i s s i o ni n t e n s i t ya n ds t a b i l i t y ， n a r r o wh a l fe m i s s i o np e a k s ，l o n gf l u o r e s c e n c el i f e t i m ea sw e l la s h i g h r e s i s t a n c et o p h o t o b l e a c h i n g ，b l i n k i n g ，a n dp h o t o c h e m i c a ld e g r a d a t i o n ，t h e yw e r ep r o p o s e dt ob ea p r o m i s i n gn e wc l a s so fb i o l o g i c a ll a b e l i n ga g e n t s ，w h i c hh a v et h ep o t e n t i a l i t ya n da b i l i t yt o o v e r c o m ean u m b e ro fp r o b l e m sa s s o c i a t e dw i t ht h ec o m m o n l yu s e db i o l o g i c a l l a b e l i n g a g e n t s ，s u c ha st h e yc o u l di m p r o v et h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yo fb i o l o g i c a lm o l e c u l e s h e r e ，t h el a p 0 4 ：e uf l u o r e s c e n tn a n o p a r t i c l e sw e r es y n t h e s i z e db yh y d r o t h e r m a lm e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e s tc o n d i t i o n st os y n t h e s i z el a p 0 4 ：e u n a n o p a r t i c l e sw e r ea s f o l l o w s ：t h er e a c t a n t sr e a c t e da t1 3 0 f o r1 2 0m i n u t e s ；t h er a t i oo fr a r e e a r t hi o n s ，s o d i u m c i t r a t ea n ds o d i u mp h o s p h a t ew a s5 ：6 5 ：4 ；i n i t i a lc o n c e n t r a t i o n so ft h er e a c t a n t sw e r e 0 1 t o o l l 1 ；p hv a l u e so fr e a c t i v es o l u t i o nw e r ei i 0 ；t h em o l a rp e r c e n t a g eo fe u r o p i u mi o n d o p i n gc o n c e n t r a t i o n sw a s3 0 t h ef l u o r e s c e n c el i f eo fl a p 0 4 ：e un a n o p a r t i c l e sw a s1 9 6 m s w i t hg o o dc r y s t a l l i z a t i o na n dm o n o d i s p e r s i o n t h ea s p r e p a r e do p a r t i c l e sw e r ec h a r a c t e r e d t h er e s u l t so fx r dt e s ts h o w e dt h a tp a r t i c l e s w e r el a p 0 4 ：e uc r y s t a la n db e l o n gt ot h eh e x a g o n a ls y s t e m t e mt e s t ss h o w e dt h a tt h e c r y s t a l l i z a t i o nw a sg o o da n dt h ea v e r a g ep a r t i c l es i z ew a s3 7 3n l nt h r o u g ht h ep a r t i c l es i z e d i s t r i b u t i o ne x p e r i m e n t i re x p e r i m e n ts h o w e dt h el a p 0 4 ：e uw e r ew r a p e db yc i t r a t e t h e l a p 0 4 ：e un a n o p a r t i c l e sc a nc o u p l ew i t hb s ab yc o v a l e n c ei n t e r a c t i o n ，a n dt h eo p t i m i z e d e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s 、m e 豫o b t a i n e d i ns o l i d p h a s es t a t e ，t h ef l o u r e s c e n ci n t e n s i t yo ft h e l a p 0 4 ：e u - b s ac o m p l e xw a sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fb s a , t h el i n e a re q u a t i o n w a si = 5 0 3 3 c + 1 6 0 0 ，w i t ht h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 8 5 5 h e r e b y , d e t e r m i n a t i o no fb s a h i i o。o-ir o。i-i。-i 东北大学硕士学位论文 a b s t r a c t c a nb ed o n e i l lt h ep h o s p h a t e - b u f f e r e ds o l u t i o no fp h7 4 ，t h el a p 0 4 ：e un a n o p a r t i c l e sc a nl a b e la v i d i n b ye l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o ns u c c e s s f u l l y m o r e o v e r , a v i d i ns t i l lk e p tt h e i ra c t i v i t ys o t h a tt h e y r e a c t e dw i t hd - b i o t i ns p e c i f i c a l l y u s i n gf i l t e rm e m b r a n ea sc a r r i e r , t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y o fl a b l e da v i d i n b i o t i nw a sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no ft h ea v i d i ni nac e r t a i nr a n g e t h el i n e a re q u a t i o nw a s1 = 7 1 5 2 6 c + 1 6 0 0 8 ，w i t ht h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 9 4 8 t h e e x p e d m e n t f lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h es y n t h e s i z e dl a p 0 4 ：e un a n o p a r t i c l e sc a nb eu s e d a sa c o m m o nf l u o r e s c e n tm a r k e r sf o r t h ed e t e c t i o no fb i o l o g i c a lm o l e c u l e s k e yw o r d s ：l a p 0 4 ：e u ；f l u o r e s c e n c e ；n a n o p a r t i c l e s ：b i o c o n j u g a t i o n ；b s a ；a v i d i n i v 一 一 i j 鏊 ， - ； h 东北大学硕士学位论文 目录 目录 声明i 中文摘要l i a b s t r a c t i i i 第1 章绪论1 1 1 纳米材料1 1 1 1 纳米材料及其制备方法”1 1 1 2 纳米材料表征3 1 2 用于生物分析的纳米材料4 1 2 1 纳米金5 1 2 2 量子点5 1 2 3 核壳结构纳米粒子6 1 2 4 高分子纳米微球“8 1 3 稀土纳米发光材料”9 1 3 1 稀土纳米材料的发光原理及性质9 1 3 2 稀土荧光纳米材料的特点1 0 1 3 3 稀土荧光纳米材料的合成1 1 1 3 4 稀土荧光纳米材料在生物分析中的应用“1 1 1 4 本课题标记的生物试剂“1 3 1 4 1 牛血清白蛋白1 3 1 4 2 生物素和亲和素1 3 1 5 本课题研究的内容和意义”1 4 第2 章l a p 0 4 ：e u 荧光纳米粒子的合成与表征1 7 2 1 实验仪器和试剂1 7 2 2 实验方法1 7 2 2 1 主要试剂的配制”1 7 2 2 2l a p 0 4 ：e u 纳米粒子的合成及纯化“1 8 2 2 3 荧光测定方法1 8 v 东北大学硕士学位论文目录 2 2 4l a p 0 4 ：e u 纳米粒子的表征1 9 2 3 结果和讨论1 9 2 3 1 实验条件的优化1 9 2 3 2l a p 0 4 ：e u 粒子溶液的纯化2 4 2 3 3l a p 0 4 ：e u 纳米粒子的发光机理2 6 2 3 4l a p 0 4 ：e u 纳米粒子稳定性和分散性的考察2 7 2 3 5 荧光寿命的测定2 8 2 3 6l a p 0 4 ：e u 粒子的红外光谱( i r ) ”2 9 2 3 7l a p 0 4 ：e u 粒子的x 射线衍射图( x r d ) 一3 0 2 3 8l a p 0 4 ：e u 粒子的透射电子显微镜成像( m ) 3 1 2 3 9l a p 0 4 ：e u 粒子的粒度分布”3 1 2 4 本章小结3 2 第3 章l a p 0 4 ：e u 共价标记牛血清白蛋白3 3 3 1 实验原理3 3 3 2 实验仪器和试剂3 3 3 3 实验方法3 4 3 3 1 主要试剂的配制3 4 3 3 2l a p 0 4 ：e u 纳米粒子共价标记牛血清白蛋白3 4 3 3 3 荧光测定方法3 5 3 4 结果与讨论”3 5 3 4 1l a p 0 4 ：e u 共价标记b s a 3 5 3 4 2 标记b s a 实验条件的优化3 6 3 4 3l a p 0 4 ：e u b s a 复合物的固相荧光检测”4 1 3 5 本章小结4 3 第4 章l a p 0 4 ：e u 荧光纳米粒子标记亲和素4 5 4 1 实验仪器和试剂”4 5 4 2 实验方法4 5 4 2 1 主要试剂的配制一4 5 4 2 2l a p 0 4 ：e u 标记亲和素4 6 v i 东北大学硕士学位论文 目录 4 2 3 被标记亲和素与生物素的特异反应4 6 4 2 4 荧光测定法4 6 4 3 结果和讨论4 6 4 3 1l a p 0 4 ：e u 标记亲和素4 7 4 3 2 被标记亲和素在滤膜上的吸附行为4 7 4 3 3 生物素在滤膜上的吸附行为及和标记亲和素的特异反应4 8 4 3 4 亲和素的加入量对荧光性能的影响”4 9 4 4 本章小结5 0 第5 章结论5 1 参考文献5 3 致谢6 1 v l i 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 纳米材料 1 1 1 纳米材料及其制备方法 “纳米”是英文n a n o m e t e r 的译名，是一种度量单位，1 纳米是十亿分之一( 1 0 9 ) 米。 纳米尺度一般是1n n l 到1 0 0n m 之间。当粒子达到纳米尺度以后，物质的性能就会发生 突变，出现特殊性能。这种具有既不同于原来组成的原子、分子，也不同于宏观物质的 特殊性能的材料，即为纳米材料。 纳米材料的性质和材料的形状、物相有关，制备的工艺和方法对纳米材料的结构和 性能有很大的影响。随着人们对纳米材料认识的深入，制备纳米材料的技术路线越加丰 富 田。 目前制备纳米材料常用的方法主要有固相法、液相法、气相法。固相法主要有低 温粉碎法、超声波粉碎法、热分解法、爆炸法。气相法主要有真空蒸发法、相化学反应 法、高温等离子体法、油面蒸发法。液相法应用较多，这一方法又可分为液相物理法和 液相化学法。这里介绍几种常用的液相化学法。 1 1 1 1 水热法 水热反应法是指在高温高压的水溶液中进行的一系列物理化学反应。在高温高压的 水溶液中，许多化合物表现出与常温下不同的性质。如溶解度增大，离子活度增加，化 合物晶体结构易转型等。水热反应正是利用了化合物在高温高压水溶液中特殊性质，制 备纳米粉末。在水热法中，液态或气态是传递压力的媒介。在高压下，绝大多数反应物 都能部分溶解于水，促使反应在液相或气相中进行。其特点是纯度高、分散性、粒度易 于控制f 。晶粒发育好，避免了因高温煅烧和球磨等后处理引起的杂质和结构缺陷。水 热处理过程中温度、压力、处理时间、溶媒的成分、p h 值、所用前驱物的种类以及有 无矿化剂和矿化剂的种类对粉末的粒径和形貌有很大的影响。然而水热法也有其局限 性，最明显的就是该法只能用于氧化物或对水不敏感的化合物的制备处理，而对于其它 一些对水敏感( 水解、分解、氧化等) 的化合物的制备就不适用了，这些问题解决则需 要通过非水溶剂热合成技术。 管航敏等【2 】报道了用水热法制备b a o n d 2 0 3 t i 0 2 ( b n t ) 系纳米粉体。在k o h 碱 性溶液中，以t i c l 4 ，b a c l 2 和n d ( n o ) 3 为反应物，先制备出b a o n d 2 0 3 - t i 0 2 ( b n t ) 1 _ 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 凝胶前驱体，再经低温水热处理，得到b n t 系纳米粉体。结果表明，用该法获得的b n t 系纳米粉体为立方相结构，稀土元素掺杂均匀，产物粒径小，分散性好。 1 1 1 2 微乳液法 微乳液是利用两种互不相溶的溶剂在表面活性剂的作用下形成个均匀的乳液，从 乳液中析出固相，这样可使成核、生长、纯化、团聚等过程局限在一个微小的球形液滴 内，从而可形成球形颗粒，又避免了颗粒之间进一步团聚。微乳液法具有实验装置简单、 操作方便，所得纳米粒子粒径分布窄，且单分散性、界面稳定性高；与其它方法相比粒 径易于控制，适应面广等优点。不过该方法制备的纳米粒子的产量比较小，比较适合于 实验研究，难以用于大规模生产。 l e e 等人【3 】在由带5 个环氧乙烷的壬基酚醚( p o l y o x y e t h y l e n e ( 5 ) n o n y l p h e y l e t h e r ， n p 一5 ) 、带9 个环氧乙烷的壬基酚醚( p o l y o x ye t h y l e n e ( 9 ) n o n y l p h e n y l e t h e r ，n p - 9 ) 、环 己烷和水组成的微乳液体系中，以稀土硝酸盐和氨水为原料，制备了e u 3 + 掺杂的纳米 y 2 0 3 ( 粒径为2 0 - 3 0r i m ) 。通过对l e e 等人的方法进行适当改进，r i t c e y 等人【4 1 以y c l 3 和n h 4 h f 2 为原料，制备了不同形貌的y f 3 纳米微粒。 1 1 1 3 溶胶凝胶法 溶胶凝胶法是指前驱物质( 水溶性盐或油溶性醇盐) 溶于水或有机溶剂中形成均 质溶液，溶质发生水解反应生成纳米级的粒子并形成溶胶，溶胶经蒸发干燥转变为凝胶， 该法为低温反应过程，允许掺杂大剂量的无机物和有机物，可以制各出许多高纯度和高 均匀度的材料，并易于加工成型。其优势在于从过程的初始阶段就可在纳米尺度上控制 材料结构嘲。该法的优点是设备简单，操作方便，反应温度低，制备的纯度高，微粒细 小，粒径分布均匀，并且通过改变工艺过程制备不同形态的产物 6 1 。不足之处是原料成 本高，制备周期较长，产率低。 s a n 等 7 1 用溶胶凝胶法制备了粒径为2 0 。8 0n m 的有机纳米微粒。张慰萍等人【8 】将 y ( n 0 3 ) 3 和e u ( n 0 3 ) 3 加入到s i ( o c h 3 ) 的乙醇溶液中形成溶胶，再经陈化和干燥，然后将 所得干凝胶在9 0 0 c 左右处理得到了粒径为5 0 姗的y 2 s i 0 5 ：e u 3 + 纳米微粒。在另一项研究 工作中，王介强等人【9 l 以y ( n 0 3 ) 3 为原料，通过在0 下缓慢滴加氨水得到溶胶，再经室 温下氮气吹干，然后将得到的干凝胶置于流动的氧气气氛下煅烧，最后制得了粒径为 6 0 r i m 左右的y 2 0 3 纳米微粒。y a n g 笔j ；1 1 0 l 在室温常压下用溶胶凝胶法制得粒径为l 肛2 0n m 的金红石形态的二氧化钛颗粒。 2 ，“ 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 1 1 1 4 沉淀法 沉淀法是制备纳米材料最常用的方法之一，也是软化学合成纳米材料最早采用的一 种方法1 1 1 - 埘。沉淀法的基本原理是在包含一种或多种离子的可溶性盐溶液中加入沉淀剂 如o h - 、c 2 0 4 冬、c 如 、h 2 p 0 4 等，或在一定温度下使盐溶液发生水解，形成各种不溶 性的沉淀物从溶液中析出，所得的沉淀再经过虑、洗涤、干燥、焙烧，而得到所需的产 物。其特点是操作简单，成本较低，组成均匀，适用于批量生产难溶氧化物、氢氧化物、 无机盐等的纳米粒子。不过，由于沉淀反应中同时进行着成核、生长、纯化以及凝聚等 多种过程，实验中很难将这些过程隔离开来分别进行研究。 李强等人【1 4 】用沉淀法制备y 2 0 3 纳米微粒时，由于y 3 + 具有较强的水解特性而很难直 接沉淀出其氧化物，通常采用的方法是用碳酸盐、草酸盐或尿素等先沉淀出无定形的中 间产物( v 2 ( c 0 3 ) 3 、y 2 ( c 2 0 4 ) 3 或y ( o h ) c 0 3 ) ，然后在对其进行高温处理得到晶态的y 2 0 3 纳米微粒；v c g g c l 等人1 1 5 1 6 】通过在n a f 和n a 3 v 0 4 的乙醇水混合溶液中加入稀土离子的硝 酸盐溶液，在7 5 下分别制备了掺杂不同镧系离子的l a f 3 和l a v 0 4 发光纳米微粒，其粒 径小于1 0n m 。 1 1 2 纳米材料表征 1 1 2 1x 射线衍射法 x 射线是一种波长很短( 约为1 0 - 3 - 1 0r i m ) 的电磁波，能穿透一定厚度的物质， 并能使荧光物质发光、照相乳胶感光、气体电离。在用电子束轰击金属“靶”产生的x 射 线中，包含与靶中各种元素对应的具有特定波长的x 射线，称为特征( 或标识) x 射线。 x 射线衍射法是目前测定晶体结构的重要手段，应用极为广泛。各种晶体结构、结 晶的程度和颗粒的大小都可用x 射线衍射法来测定。 通过测量掠射角0 ( 入射或者衍射x 射线与晶面间的夹角) ，即可计算出样品晶体 结构的晶面间距，这就是x 射线衍射分析晶体结构的依据。而在实际的测量过程中，一 般通过测试结果中的三强峰和标准卡片中的三强峰进行对比来确定材料的物相，还可以 通过s c h e r r e r 公式计算晶体的粒径。 1 1 2 2 透射电子显微镜( 耵潮) 透射电子显微镜是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中 的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关， 因此可以形成明暗不同的影像。通常，透射电子显微镜的分辨率为0 1 0 2n m ，放大倍 3 - 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 数为几万百万倍，用于观察超微结构，即小于o 2 , u m 、光学显微镜下无法看清的结构， 又称“亚显微结构”。 透射电子显微镜的成像原理可分为三种情况：a 吸收像：当电子射到质量、密度大 的样品时，主要的成相作用是散射作用。样品上质量厚度大的地方对电子的散射角大， 通过的电子较少，像的亮度较暗。早期的透射电子显微镜都是基于这种原理。b 衍射像： 电子束被样品衍射后，样品不同位置的衍射波振幅分布对应于样品中晶体各部分不同的 衍射能力，当出现晶体缺陷时，缺陷部分的衍射能力与完整区域不同，从而使衍射体的 振幅分布不均匀，反映出晶体缺陷的分布。c 相位像：当样品薄至1 0 0a 以下时，电子 可以传过样品，波的振幅变化可以忽略，成像来自于相位的变化。 由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后 的成像质量，必须制备更薄的超薄切片，通常为5 0 1 0 0n m 。对于液体样品，通常是挂 在预处理过的铜网上进行观察。 1 1 2 3 场发射扫描电镜( f e s e m ) 热场发射扫描电子显微镜是一种最新型的高分辨扫描电镜。它是利用电子束从样品 表面激发出各种物理信号( 主要是二次电子) 来实现成像，从而实现了形貌的观察。与 一般扫描电镜相比，它能以更高的分辨率观察固体样品表面显微结构和形貌，是研究材 料表面结构与性能关系的重要工具。广泛应用于物理、化学、生物、地质学等领域的研 究和产品检验。 1 1 2 4 荧光光谱( p l ) 当外界的光照射样品时，样品中的电子将从基态被激发到激发态，此时由于样品中 的电子被激发，处于激发态的电子会自发地从激发态跃迁至基态，并且将吸收的能量以 荧光的形式发射出来，通过测定发出光的波长和强度，就得到了样品的荧光谱图。通过 荧光的波长可以判断发射峰的能级情况，通过荧光的强度可以判断发光情况【1 3 】。 1 2 用于生物分析的纳米材料 目前，主要有如下5 种类型的纳米粒子可用作生物探针：( 1 ) 金纳米粒子；( 2 ) 半 导体量子点；( 3 ) 核壳型荧光纳米粒子：( 4 ) 高分子纳米微球；( 5 ) 稀土纳米材料。以 前无法实现的检测项目，由于纳米生物探针的引入，目前已经逐渐成为可能。其中以金 纳米粒子、量子点、核壳型荧光纳米粒子、稀土纳米材料为代表的纳米生物探针正在常 规免疫分析、生物芯片、荧光生物成像测定、癌细胞的转移与示踪、生物分子多颜色多 组份同时标记检测、食品及环境中强致病性病原菌的检测以及生物反恐等领域发挥着越 4 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 来越重要的作用，稀土纳米材料作为生物探针在这方面的研究进展十分引人注目【协1 9 1 。 由于稀土纳米材料是本论文重点研究的对象，所以有关稀土纳米材料的应用将在1 3 4 中单独讨论。 1 2 1 纳米金 金纳米粒子作为特殊标记物进行生化分析的研究始于2 0 世纪6 0 年代。1 9 6 2 年 f e l d h e r r 2 0 等用金纳米标记细胞进行电子显微镜研究；1 9 7 1 年t a y l o r 2 1 】首次将金纳米微 粒引入免疫技术中，他首先将胶体金和抗沙门氏菌抗血清结合后与该菌一起培养，用电 镜观察吸附在胶体金表面的抗体定向将胶体金颗粒固相载体上的抗原位置移动。当胶体 金颗粒标记的抗体在抗原位置聚集到一定密度时，就会出现肉眼可见的粉红色斑点。最 近有用于d n a 分析的大量报道阎，之后基于金纳米粒子的等离子共振带光学特性建立 了许多d n a 分析方法【2 0 捌。 纳米金的制备一般是用氯金酸在异丙醇中，在硼氢化钠的作用下制备而成，直径大 多在1 2 0a m 之间。由于金纳米粒子作为标记物可和多种生物分子结合，具有制备简单、 较好的化学稳定性和均一性、生物亲和性好等优点，在生化免疫分析中发挥着突出的作 用。目前主要集中应用于生物传感器、疾病的诊断、基因检测等领域。在免疫分析方法 中，一般情况下胶体金作为标记物的灵敏度要低于放射性免疫、荧光免疫和酶联免疫。 为了改善这个缺陷，现在在组织化学的研究中多采用免疫金银染色法，应用于d n a 的 检测，灵敏度可达5 0p g m l 1 1 2 3 1 。 1 2 2 量子点 量子点( q u a n t u md o t ，q d ) ，又称为半导体纳米微晶体，是一种由i i - v i 族或i i i v 族元素组成的纳米颗粒，其粒径小于激子波尔半径【2 4 , 2 5 】。性质稳定，能够接受激发光产 生荧光，具有类似体相晶体的规整原子排布 2 6 , 2 7 。由于量子点粒径较小，其电子和空穴 被量子限域，因而它是介于体相材料与分子问的物质状态，展示出许多特殊的光、电、 磁、催化等性质【捌。 作为新型的荧光标记物，量子点优异的光学性能主要表现在以下几个方面【2 9 , 3 0 1 ：( 1 ) 紫外吸收光谱具有很宽的吸收范围，接受激发光的照射而发射很强的荧光，使其代替荧 光染料成为可能；( 2 ) 由于高于带隙能量的激发光都可以激发量子点，量子点的激发范 围很宽，因此可用同一波长激发光激发不同颜色的量子点，使它发射不同颜色的荧光达 到同时检测的目的：( 3 ) 量子点的荧光发射波长可以通过粒径大小和组成的材料来“调 5 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 谐”，从而可以制备出多种荧光光谱特征各异的量子点；( 4 ) 量子点具有较大的斯托克 斯位移和狭窄对称的荧光光谱峰，因此，在用不同光谱特征的量子点标记生物分子时， 可用荧光光谱仪识别、分析。( 5 ) 量子点比有机荧光染料分子稳定，可以接受长时间的 或反复多次的光激发，不易发生荧光漂白，其荧光寿命可达染料分子的1 0 0 倍以上；( 6 ) 量子点的表面还可以修饰上多个小分子或者蛋白等，构成选择性探针。上述所有优点集 中在一种荧光探针上非常难得。但要将量子点应用于细胞及组织样品的检测，必须使用 两性分子( 即一端能够连接在疏水结构的量子点上，另一端能够结合诸如抗体、肽等具 有识别作用的生物分子) 对量子点表面进行修饰。这样的两性分子包括经亲水改性的聚 丙烯酸、s i 0 2 、巯基乙酸、巯基丙酸等。 徐力等【3 1 l 用巯基乙酸作为保护剂及包覆剂在水相中制备了c d s 纳米晶粒，并以之标 记了牛血清白蛋白，比较了标记前后量子点吸收及荧光光谱的变化。结果表明，c d s b s a 与游离的c d s 相比，其吸收带边没有移动，但标记b s a 后的量子点其发射峰较标记前红 移了2 8n m 。 林章碧等p 2 】在水相中合成了被巯基丙酸包覆的c d t e 纳米晶粒，并在近生理p h 环境 条件下成功地通过静电相互作用将纳米晶粒标记在木瓜蛋白酶和胰蛋白酶上。酶活性分 析结果表明，被量子点标记后的木瓜蛋白酶能够将酯水解为醇和酸，标记后的酶保持了 原酶7 6 的活性。 2 0 0 4 年n i e 【3 3 】研究小组报道了一种基于量子点的多功能纳米探针用于活体癌症的 靶向定位和成像研究。他们首先将量子点用三元共聚物包裹，然后连接上可以识别肿瘤 的靶向配体。 量子点纳米荧光探针用于生物分子检测和动物活体的癌症诊断已经取得了可喜的 研究进展，然而量子点用作标记物仍然有许多问题需要解决 3 4 1 ：( 1 ) 在水中的溶解度 不好；( 2 ) 繁琐的生物分子标记过程及标记的稳定性问题；( 3 ) 溶液中的量子点存在 聚集的现象；( 4 ) 发光易闪烁；( 5 ) 不能解决背景荧光的干扰问题。 1 2 3 核壳结构纳米粒子 纳米粒子标记物特别是核壳型纳米粒子标记物，与经典的单分子发光标记物相比具 有许多特殊的优点，在当前发光标记物的研究中非常引人注目i 弱3 6 l 。 、 核壳型纳米粒子标记物通常由发光材料制成的功能性内核和外部可生物修饰的外 壳以及修饰在外壳表面的生物功能分子三部分组成，如图1 1 。这种核壳保护了功能性 6 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 内核免受外界环境的影响，从而避免溶液中淬灭剂和溶剂分子对发光中心的荧光淬灭， 可以提高发光标记物的发光效率，并大大提高以发光标记物分子为单位的抗体标记率， 从而提高生物检测的灵敏度。荧光纳米颗粒表面修饰上对目标抗原有特异识别和结合能 力的抗体后，可与靶细胞作用并将其标记上发强荧光的物质。该方法既消除了传统荧光 标记法的光漂白现象，检测灵敏度有了重大突破，而且避免了荧光染色剂对细胞的直接 毒副作用，使结果更加可靠。应用这一方法分别标记c d i o 抗体、羊抗体l g g 抗体以及 h a b l 8 ( 抗肝癌) 抗体，实现了对早期白血病、系统性红斑狼疮疾病的检测【了7 l 以及对 h e p g 肝癌细胞的有效识别。同时也实现了对单个细菌的快速检测，整个检测过程在 2 0 m i n 内即可完成，而常规的检测方法如s e m 法需要几天才能完成。 图1 1 核壳型生物纳米粒子的结构示意图 f i g 1 1s t r u c t u r eo ft h ec o r e - s h e l lb i o - n a n o p a r t i c l e 钧功蕾惨体材疆 r n a 斌d n a 抗体 激素 生长豳予 疆集曩 蘸分乎 w a r r e n 等【3 8 】在氯仿介质中在经z n s 包覆的c d s e 量子点的周围包覆了巯基乙酸，其中 的巯基与z n s 中的z n 原子结合，极性的羧基赋予了量子点水溶性，游离的羧基通过交联 作用可以与诸如蛋白质、肽以及核酸等生物分子的活性氨基结合。 何晓晓等【3 9 j 在室温下采用正硅酸乙酯水解产物包裹油包水微胶囊，一步制备了以联 吡啶钉配合物为核、s i 0 2 为壳的荧光纳米颗粒，用c n b r 修饰纳米颗粒表面，然后于p h 值为7 6 的p b s 分散相中标记羊抗a i g g 抗体。用传统荧光染料异硫氰酸荧光素标记羊抗 人l g g 为对照