（茶学专业论文）外源酶改善夏季绿茶品质的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 本文研究在夏季绿茶的初制过程中分别添加木瓜蛋白酶、单宁酶、纤维素 酶，然后通过理化成分测定，分析茶叶中内含物质的变化，探讨加工过程中添 加外源酶对夏季绿茶品质的影响，以期发现合适的酶来达到改进夏季绿茶品质 的目的。研究结果表明： 1 加工过程中添加木瓜蛋白酶后，茶叶中的茶多酚总量没有显著变化，而 氨基酸总量有所升高。在所有木瓜蛋白酶处理的茶样中，不论揉捻时间、酶浓 度和原料嫩度差异，处理样中的氨基酸总量都是要高出对照样。例如，在揉捻 1 5 m i n 鲜叶嫩度为一芽二叶时，所有木瓜蛋白酶处理的茶样其氨基酸总量平均值 为2 4 0 ，比对照( 2 2 0 ) 高9 0 9 。 2 加工过程中添加单宁酶后，茶叶中的茶多酚总量没有显著变化，而氨基 酸总量略有升高。此外，茶样中的儿茶素组分发生了很大的变化。具体表现为： 酯型儿茶素总量的下降和非酯型儿茶素的升高。例如，在揉捻1 5 m i n ，鲜叶嫩度 为一芽二叶时。单宁酶处理的茶样中，其酯型儿茶素总量平均值为1 3 8 0 ，比 对照( 1 5 9 4 ) 低1 5 5 4 ；非酯型几茶素总量为9 8 2 ，比对照( 9 4 0 ) 高4 5 7 ；儿茶素总量为2 3 6 2 ，比对照( 2 5 3 4 ) 低7 2 6 。 3 加工过程中添加纤维素酶后，茶叶中的茶多酚总量没有显著变化，而氨 基酸总量有所升高，可溶性糖含量也有所升高。所有纤维素酶的处理样中，虽 然揉捻时间、酶浓度、原料嫩度等条件不尽相同，但处理样中的氨基酸总量和 可溶性糖含量都是要高出相应的对照。例如，在揉捻1 5 m i n 鲜叶嫩度为一芽二 叶时，所有纤维素酶处理的茶样其氨基酸总量平均值为2 4 6 ，比对照( 2 2 0 ) 高1 1 8 2 ：可溶性糖含量平均值为3 1 6 ，比对照( 2 。8 7 ) 高l o 2 0 。纤维素酶的主要作用是促进多糖的水解，但试验结果表明，纤维素酶能明 显提高茶样中氨基酸总量，对此，可能的原因是：纤维素酶能破坏细胞组织结 构，从而使得细胞内部氨基酸的浸出更加容易。 4 木瓜蛋白酶的使用，目的是为了提高茶叶中氨基酸的含量，增加夏季绿 茶茶汤的鲜爽度：单宁酶的使用，目的是为了降解茶叶中的酯型几茶素，减轻 茶汤的苦涩味；纤维素酶的使用，目的是为了提高可溶性糖含量，增加茶汤的 浙江大学硕士学位论文 甜醇度，实验结果表明：三种外源酶的使用都达到了预期的目的；实验同时发 现，纤维素酶也可以提高氨基酸含量，而且效果要好于木瓜蛋白酶。 关键词：夏季绿茶；品质；外源酶；氨基酸：儿茶素组分 v h 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h ep r e s e n tp a p e r , p h y s i c a la n de h e r n i e a la n a l y s i sm e t h o d sw e e m p l o y e dt o s t u d yt h ec h a n g e so fb i o c h e m i c a li n c l u s i o n si ng r e e nt e ap l u c k e da n dp r o c e s s e di n s u m m e r , a f t e rb e i n gt r e a t e dw i t hp a p a i n , t a n n a s ea n dc e l l u l o s ee i l z y m e b a s e d0 1 3t h e e f f e c t so fe x o t i ce n z y m eo l lg r e e nt e ap l u c k e da n dp r o c e s s e di ns u n l m e l - i nt h i ss t u d y , t h ep a p e ra i m st od e v e l o pt h eg r e e nt e ap r o c e s s i n gt e c h n o l o g ya n dt of i n dt h ep r o p e r e n z y m et oi m p r o v et h eq u a l i t yo f g r e e nt e a 1 a f t e rb e i n gt r e a t e d 、 ，i t hp a p a i ni np r o c e s s i n gp h a s e i tw a sf o u n dt h a tt h e c o n t e n to ft e ap o l y p h e n o l si ng r e e nt e aw a sc h a n g e dal i t t l e , b u tt o t a la m i n oa c i dw a s i n c r e a s e dd i f f e r e n t l y t h ec o n t e n to f a m i n oa c i di na l lt r e a t e ds a m p l e sw a sm u c hm o l e t h a nt h ec o n t r o l ，a l t h o u g ht h et w i s t e dt i m e ，t h ec o n c e n t r a t i o no fe n z y m l ：a n dt e n d e ro f m a t e r i a lw a sq u i t ed i f f e r e n t f o re x a m p l e ，w h e nt h em a t e r i a lo f1b u d2l e a v e st w i s t e d f o r1 5 r a i n , t h ea m i n oa c i dc o n t e n to f t h es a m p l e sw h i c hw e l el l e a t e dw i t hp a p a i nw a s 2 4 0 ，9 0 9 h i g h e rt h a nt h ec o n t r o li na v e r a g e 2 i nt h es a m p l e st r e a t e d 、i t l lt a n n a s ei np r o c e s s i n gp h a s e t h ec o n t e n to ft e a p o l y p h e n o l sa n da m i n oa c i dc h a n g e dal i t t l e b u tc o m p o n e n t so fc a t e c h i nc h a n g e da l o t 1 1 1 cc o n t e n to fe g c ga n de c gd e c r e a s e d , w h e r e a st h ec o n t e n to fe g ca n de c i n c r e a s e d f o re x a m p l e ，w h e nt h em a t e r i a lo flb u d2l e a v e st w i s t e df o r1 5 r a i n , e c k ? ( 3a n de c gc o n t e n to ft h es a m p l e sw h i c hw e r et r e a t e dw i t l lt a n n a s cw a s 1 3 8 0 ，1 5 5 4 l o w e l t h a nt h ec o n t r 0 1 t h ec o n t e n to fe c r ca n de cw a s9 8 2 4 5 7 h i g h e rt h a nt h ec o n t r 0 1 a n dt o t a lc a t e e h i nw a s2 3 ，6 2 7 2 6 l o w e rt h a nt h e c o n t r 0 1 3 a f t e rb e i n gt r e a t e dw i t hc e l l u l o s ee n z y m ei np r o c e s s i n gp h a s e ，i tw a sf o u n d t h a tt h ec o n t e n to ft e ap o l y p h e n o l si ng r e e nt e aw a sc h a n g e dal i t t l e ，a n dt h ec o n t e n t o fa m i n oa c i da n dt h ec o n t e n to fs o l u b l es u g a rw e r ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y t h e c o n t e n to fa m i n oa c i da n dt h ec o n t e n to fs o l u b l es u g a r , w i t l lt h ed i f f e r e n tl e v e l so f t w i s t e dt i m e ，c o n c e n t r a t i o no fa l 驷ea n dt e n d e ro fm a t e r i a lw e r em u c h1 1 1 0 1 et h a n t h ec o n t r 0 1 f o re x a m p l e ，w h e nt h em a t e r i a lo f1b u d2l e a v e st w i s t e df o r1 5 m i n , t h e v 浙江大学硕士学位论文 a m i n oa c i da v e r a g ec o n t e n to f t h es a m p l e sw h i c hw e r et r e a t e dw i t hc e l l u l o s ec n z y n l e w a s2 4 6 ，1 1 8 2 r d g h e rt h a nt h ec o n u o l ( 2 2 0 ) ；t h ea v e r a g ec o n t e n to fs o l u b l e s u g a rw a s3 1 6 ，1 0 2 0 h i g h e rt h a nt h ec o n t r 0 1 t h ep u r p o s eo fu s i n gc e l l u l o s e 豇l z y m ew a s t op r o m o t et h eh y d r o l y z a t i o no f a m y l o s e ，w h e r e a s ，t h er e s u l ts h o w e dt h a t t h et o t a la m i n oa c i dw a si m p r o v e do b “o u s l yb yt h eu s a g eo f c e l l u l o s ee n z y m e i tw a s t h ep o s s i b l ee x p l a n a t i o nt h a tt h ef o r mo fc e l lw a sd e s t r o y e db yc e l l u l o s ee n z y m es o t h a tt h ea p p e a r a n c eo f a m i n oa c i dw a se a s y 4 t h ep u r p o s eo fu s i n gp a p a l nw a st oi m p r o v et h ec o n t e n to fa m i n oa c i da n dt o i n c r e a s et h es m o o t hf e e l i n go ft e a ；t h ep u r p o s eo fu s i n gt a n n u s ew a st od e c o m p o u n d t h ec o n t e n to f e g c ga n de c ga n dt od e c r e a s et h ea c e r b i t i e so f t e a t h e s ea r g u m e n t s w mt e s t i f i e db yt h er e s u l to f t h er e s e a r c h m e a n w h i l e ，t h eu s a g eo f c e o s ea l z y n l e a l s oc o u l di m p r o v et h ec o n t e n to f a m i n oa c i d ，a n dt h ee f f e c tw a sb e t ：t e rt h a nt h ee f f e c t o f p a p a i m k e yw o r d s ：g r e e nt e ap l u c k e da n dp r o c e s s e di ns u n m a e r ；l i q u o rq u a l i t y ；e x o t i c e n z y m e ；a m i n oa c i d ；c a t e c h i nc o m p o n e n t s i x 浙江大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 我国夏茶品质特点及品质改良技术 季节不同、茶树生长发育所处的生态环境、气温、光照、降雨量、湿度以及 茶园栽培管理条件不同，茶树新梢的生育特性、物理性状和化学成分的组成量亦 不同。因此，采用不同茶季鲜叶原料加工的茶叶品质亦不同。一般来说，不同季 节的绿茶，春茶品质最优，秋茶次之，夏茶最差。 春茶一般指从春季茶园开采之日起至小满前，即每年的3 月至5 月份采制的茶 叶。由于春季气温适中，光照柔和，雨量充沛，茶树氮代谢旺盛，碳代谢和糖类 化合物合成速度较为缓慢；另外，茶树经头年秋冬季期间较长时间的休养生息， 体内营养物质特别丰富。因此，春茶不但芽毫显露，芽叶嫩度好，持嫩性强，叶 质柔软而富有光泽，紫芽少，芽叶肥壮，同时，有利于提高与茶叶品质相关的一 些成分，如氨基酸、维生素等较为丰富，影响香气的物质二甲硫、戊烯、青叶醇 等含量较高，而苦涩味较重的茶多酚、花青素等含量较低，酚氨比是三个茶季中 最低的。采用春季优质鲜叶原料加工的茶叶，色泽光洁油润，香气高正、强烈、 持久，滋味鲜爽、浓醇、回甘，汤色清明，叶底柔软明亮。另外，春茶期间病虫 危害极少，无须使用农药，大气较为干净，茶叶极少受污染，可以说春茶是一年 中最优质的季节茶。 春茶品质特征：绿茶外形色泽翠绿光润，香气鲜香持久，汤色明亮清澈、绿 中泛黄，叶底鲜嫩柔软。 夏茶是指小满至立秋期间，即每年的6 月初至8 月上旬采制的茶叶。夏茶期间 气温高、光照强、雨量充沛，茶树生长迅速、生长期短，茶叶容易粗老，芽叶瘦 小，叶张单薄，对夹叶多、紫芽多。同时，夏茶期间茶树碳代谢旺盛，芽叶中带 苦涩味的儿茶素、花青素等物质含量增高：糖化物质的形成和转化较多，氨基酸 分解较快，含量明显减少，酚氨比为三个茶季中最高；具有清香型的戊烯醇、乙 烯醇等含量较低。因此，采用夏茶期间鲜叶加工的茶叶，特别是绿茶，色泽较浅， 香气较低，滋味鲜爽度较差，苦涩味较重，回甘味较少，叶底花青，品质较差。 夏茶的品质特征：绿茶外形色泽黄绿带青欠润，朴片带青黄色，内质香气低 短。滋味欠厚稍涩，汤色较浅带青绿，叶底青绿中夹杂有铜绿色芽叶 秋茶是指从立秋至茶园封园时止，即8 月中旬至茶季结束前采制的茶叶。秋 茶茶树生长的气候条件介于春夏之间，较为温和，晚秋的气温较低，有利于形成 花果香型，例如苯甲酵、苯乙醛等芳香类物质的形成和积累，含量较高，故秋茶 花果香特别突出。但是，由于秋季空气湿度较低，加上茶树历经春茶和夏茶两个 浙江大学硕士学位论文 茶季的大量采收，体内贮藏的营养物质显著减少，生产的芽叶较瘦小且大小不一， 叶张较薄，紫色芽多，酚氨比介于春夏茶之间，制成的秋茶浓度较低，滋味较为 淡薄，但苦涩味较夏茶轻，而且香气亦比夏茶高。 秋茶的品质特点：绿茶外形色泽黄绿欠润或青绿欠润，内质香气显秋香，滋 味平和酵正，汤色浅黄绿而明，叶底青绿偏暗。 1 1 1 夏季绿茶品质的一般特点 夏季绿茶外形较为粗老，色泽较浅，香气较低，滋味鲜爽度较差，苦涩味较 重，回甘味较少，叶底花青，品质较差。因此夏季采制的绿茶，消费者大多不愿 饮用。 1 1 2 夏季绿茶品质较差的原因分析 在分析夏季绿茶品质差的原因之前，首先分析一下绿茶滋味的构成特征以及 相关的生化基础。 1 1 2 1 绿茶滋味构成特征及生化基础 茶汤中的呈味物质有涩、苦、鲜、甜、酸、咸六大类，茶汤的滋味正是由这 六大类呈味成分综合协调形成的，而最能体现绿茶滋味特点的是涩、苦、鲜三种 滋味。茶汤滋味和茶汤中存在的化学成分密切相关o ”。 茶汤中的涩味物质主要是多酚类，多酚类中以儿茶素类所占百分比最高。儿 茶素类又可分为酯型儿茶素和非酯型儿茶素，其中的酯型儿茶素具有较强的苦涩 味，收敛性强，是涩味的主体；非酯型儿茶素稍有涩味，收敛性弱，回味稍甜， 因此茶汤中二者含量的多少对感观品质有很大影响。 构成苦味的成分主要是咖啡碱、可可碱、茶碱。这些生物碱作为单体存在 时属于苦味不强的苦味剂，需要与酯型儿茶素协同作用。因此，儿茶素组分中的 酯型儿茶素在茶汤滋味构成上，既是涩味成分，又具有苦味剂的效应。此外花色 素类和茶皂素对茶叶的苦味也有一定的关系。 茶叶的鲜爽味物质主要是游离氨基酸中的茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等，其 次是可溶性的肽类以及微量的琥珀酸等。氨基酸是一类以鲜味为主的物质，许多 研究都一致肯定它与绿茶滋味品质呈显著正相关。氨基酸不仅是茶汤鲜爽滋味的 主要来源，而且有些氨基酸还参与茶叶香气的形成。竹尾忠一等恒钉认为各种氨基 酸与滋味评价之间的复相关系数为0 9 8 4 ，各种氨基酸中以茶氨酸、天冬氨酸和 谷氨酸的影响较大。 1 1 2 2 夏季绿茶品质较差的原因 大量研究表明，夏茶品质较差的主要原因就是酚氨比高，即成茶中多酚类物 质含量高，而氨基酸类物质含量低。据化学分析发现，夏季鲜叶中的多酚类等苦 2 渐江大学硕士学位论文 涩类物质含量比春茶高2 0 以上，而氨基酸类鲜味物质却低1 5 ，这样就使得茶 汤的苦涩味比较重，鲜爽度不够。 此外，在夏茶生产期间，由于气温较高，光照较强，空气中的相对湿度较低， 茶树体内新陈代谢旺盛，新梢生长迅速，所以采摘下来的鲜叶容易粗老，芽叶瘦 小、叶张单薄、对夹叶多、紫芽多。同时，夏茶期间茶树碳代谢旺盛，芽叶中带 苦涩味的儿茶素、花青素等物质含量增高：糖化物质的形成和转化较多，氨基酸 分解较快，含量明显减少。 1 1 3 目前夏季绿茶品质改进的措施 1 1 3 1 提高夏茶品质的栽培技术 ( 1 ) 肥水管理 在夏季进行灌溉，可改善茶园小气候，不但能增加产量，使糖类不缩合成纤 维，而且有利于含氮化合物的合成，提高鲜叶嫩度。夏茶施肥应以速效性氮肥为 主，最好是尿素。据有关试验认为，凡亩产5 0 公斤干茶以上的茶园，如树势较好， 每亩可施尿素1 5 2 0 公斤。必须紧接夏锄后进行，一般在5 月2 0 e l 前施下为宜。 叶面追肥吸收转化代谢快，一般喷后只需l o 2 0 小时就可吸收和利用。夏茶生长 期间，连续两次叶面追肥，可增产5 6 ，而且可以提高茶芽中茶氨酸和咖啡碱 的含量。 有条件的茶区，在夏茶浅锄追肥后，蒋在茶树行间铺草覆盖，可以减少水分 蒸发，防止水土冲刷，抑制杂草生长，降低温度，增加土壤湿度，减轻高温对夏 茶造成的不良影响。据有关试验测定，铺草与不铺草对比，土壤有机质含量由o 8 5 上升到1 9 6 ，土壤湿度提高5 9 。这充分说明铺草能有效地提高土壤肥 力，增强蓍水保水能力，从而促进夏茶增产，有利于鲜叶内含物的增加，提高茶 叶品质。 ( 2 ) 覆盖遮荫 覆盖遮荫技术可以影响茶园小气候，有利于茶树的生长，促进茶叶品质成分 的形成和茶叶产量的提高。遮荫后的鲜叶叶张较大、柔软、韧性强，叶面较平展， 说明遮荫明显改变了夏暑茶叶片的组织结构，增强了鲜叶的持嫩性；覆盖遮荫技 术能提高茶叶中叶绿素含量，提高有利于制成“三绿”( 即外形色泽绿、汤色 绿、叶底绿) 的成份；另外，遮荫可以明显降低鲜叶茶多酚含量和咖啡碱含量， 明显提高氨基酸含量，显著降低粗纤维含量，这些鲜叶成分的变化，均有利于成 品夏茶品质的提高。 1 t 3 2 提高夏茶品质的加工技术 ( 1 ) 摊放 浙江大学硕士学位论文 在杀青之前进行适度摊放，有利于绿茶品质的提高。鲜叶撵放过程中的多酚 类、儿茶素含量逐渐减少，氨基酸，水溶性糖的含量明显增加，酚氨比值下降。 经摊放处理后，绿茶茶汤浓度、鲜爽度和香气均明显提高。但摊放必须适度，过 度摊放反而降低绿茶的品质。 ( 2 ) 蒸热杀青 日本研究发现，在绿茶加工中，如果采取蒸热杀青工艺，可使鲜叶中的苦涩 类物质茶多酚减少2 5 ，咖啡碱减少l o 5 ，鲜甜类物质氨基酸增加5 ，还原 糖增加7 4 ，且能有效地降低茶汤苦涩味。在蒸热杀青过程中，由于湿热作用， 一方面促使鲜叶中蛋白质发生水解，使氨基酸含量增加，另一方面可破坏多酚类、 儿茶素、咖啡碱等苦涩类物质，使其含量减少实践表明，采用蒸热杀青新工艺， 可明显减轻夏茶苦涩味。 1 2 酶对茶叶加工的影响 茶叶品质实际上是由茶叶内含化学成分综合作用的结果，而茶叶内含化学成 分组成及含量多少很大程度上取决于茶叶加工过程。不同的加工技术得到的茶 叶，其化学成分含量差异很大，从而造成不同的风味和品质。在传统的茶叶n i 过程中，由于伴生反应和副反应的大量发生，使得整个过程中化学反应极其复杂 而且难以调控，茶叶品质也会随之有很大的变化。另外，一种工艺条件对于茶叶 内质的形成具有不一致性，例如，适宜于形成香气成分的工艺条件，却不一定有 利于形成茶叶滋味等其他内质因子。酶技术应用有望改变上述情况。由于酶技术 具有快速高效、反应条件温和、反应专一性强以及容易调控等优点，使之在茶叶 加工中有很好的应用前景。 1 2 1 内源酶与茶叶品质形成 在制茶过程中，人们通过控制茶鲜叶中酶的活性和催化方向的变化，制造出 不同种类的茶叶。绿茶制造中较早钝化酶的活性以形成绿茶“清汤绿叶”的品质 特征：红茶制造中则需要充分发挥多酚氧化酶和过氧化物酶等氧化还原酶类的作 用：而半发酵茶类则要适当控制这些酶的作用程度。这些主要是利用和控制茶叶 中的各种内源酶的作用来形成各类茶叶特有的品质特征。 1 2 2 外源酶在茶叶加工中的应用 随着茶时加工技术的发展以及酶学在食品科学领域的渗透，茶内源酶的种 类、含量及自然属性已经不能满足生产上日益增长的需要，因此外源酶的利用便 引起人们的重视。现在茶叶加工中应用较多的外源酶有单宁酶，多酚氧化酶，纤 维素酶，果胶酶，蛋白酶等。这些外源酶在茶叶加工中的作用机理、应用茶类以 4 浙江大学硕士学位论文 及对品质的影响，见表1 1 m 1 。 表1 1 外源酶在茶叶加工中的应用 t a b l e1 1t h ea p p l i c a t i o no f e x o t i ce n z y m ei nt e a p r o c e s s i n g 下面就这几种外源酶的研究现状做一个简单的介绍。 1 2 2 1 多酚氧化酶 多酚氧化酶是茶树中天然存在的酶类。外源多酚氧化酶可以促进茶时中多酚 类物质转化并发生聚合、分解、氧化反应，形成构成红茶品质的主要生化成分， 从而提高红茶品质，因此，外源多酚氧化酶主要是用于红茶加工过程中。 ( 1 ) 多酚氧化酶在茶叶初制加工中的应用 早在七十年代，就有日本学者从茶树中提取多酚氧化酶，用于红茶的加工。 日本的农林水产省茶试站在红茶发酵过程中，添加i 微生物多酚氧化酶，或者 在揉捻过程中添加0 0 0 1 的微生物多酚氧化酶，所制得的成品红茶中，茶黄素 和茶红素的含量都有显著的提高，而且，汤色和香气也有不同程度的改善。前苏 联学者曾利用葡萄皮中的多酚氧化酶来改善红茶品质，在红茶初揉捻过程中加入 葡萄皮，并一起切碎发酵，加工制成的红茶也有较好的品质。谭震初等嘲利用幼 果傲为多酚氧化酶的载体，以2 0 3 0 的比例用于红碎茶的加工，能明显提 高成品茶的茶黄素的含量，减少茶褐素，从而改善红碎茶的品质。 ( 2 ) 多酚氧化酶在茶叶深加工中的应用 印度托克莱茶叶试验站利用外源多酚氧化酶生产速溶红茶，在发酵时向每 1 0 0 千克发酵叶中添加1 2 克来加速发酵，结果表明：多酚氧化酶的加入能促进 红茶内多种有利于品质提高的物质成分的形成，所制得的速溶茶苦涩味轻，鲜度 浙江大学硕士学位论文 好，香气浓强。日本学者曾研究在低档绿茶或者陈旧绿茶中加入多酚氧化酶，然 后进行发酵处理，从而将绿茶转变为红茶。在国内亦有相似的研究报道魄1 ，其主 要方法是，将鲜叶制成绿茶后，用沸水浸提得抽提液，在抽提液中加入从茶叶新 梢提取的多酚氧化酶，制得速溶红茶。 ( 3 ) 多酚氧化酶的固定化研究 李荣林等“”对茶叶饮料加工中的多酚氧化酶进行了固定化研究，应用海藻酸 钠和戊二醛交联法对多酚氧化酶进行包埋，取得了成功，并提出了固定化技术因 子的最优化组合：海藻酸钠浓度2 ，酶液与海藻酸钠的体积比0 7 5 ：1 ，前交联 戊二醛浓度0 2 5 ，氯化钙浓度0 i m o l l ，后交联戊二醛浓度0 0 2 5 ，交联时 间2 5 小时，酶经包埋交联后活力基本保留。雷福厚等嘲用漆酚一酪氨酸树脂为 固定化酶载体，与二价铜离子络合制备成高分子络合剂对多酚氧化酶固定化，得 出固定化多酚氧化酶的适宜p h 值为6 6 4 7 1 7 ，在6 0 c 放置2 5 m i n 后活力保留 5 0 7 。此外，雷福厚汹1 通过壳聚糖上的n h 。离子与二价铜离子生成不饱和络合 物，以高分子配位键法，对多酚氧化酶固定化，得出固定化多酚氧化酶的最佳p h 值为6 2 4 ，温度不超过3 0 ，在7 0 放置2 5 m i n 后酶活力保留3 1 1 。 1 2 2 2 单宁酶 单宁酶全称单宁酰基水解酶，它可以水解没食予酸单宁中的酯键。单宁酶是 一种诱导酶，它是由微生物在单宁酸存在的条件下诱导而产生的，产单宁酶的微 生物主要是真菌类的曲霉属和青霉属，尤其是曲霉属中的黑曲霉和米曲霉；另外 在细菌、酵母、植物中也有产单宁酶的报道。目前商品化的单宁酶主要来源于 微生物中的曲霉菌种。 ( 1 ) 单宁酶在茶叶深加工中的应用 单宁酶是一种水解酶，主要用于饮料生产中，用来防止浑浊。在速溶茶和茶 饮料的生产中，极易出现“冷后浑”现象，而“冷后浑”的发生对速溶茶及茶饮 料的冷溶性，滋味和香气都会产生很大的影响。这就需要通过采取物理、化学或 者酶处理法，消除或使之变成可溶物，在工艺上称为“转溶”，单宁酶是酶法转 溶茶乳酪的一种专一酶。t a k i c o “”将一种曲霉菌属a s p e g i l l u so r y z a e 所产生的 单宁酶作用于6 的红茶茶汤，发现单宁酶在茶汤p h 为5 6 、温度为4 5 的条 件下作用3 0 6 0 分钟时，茶乳酪产生的最少。t h o m a s 及m u r t a g h 研究了单宁酶 在红茶及绿茶茶汤中的作用情形，发现最佳作用条件为p h 5 6 、温度4 5 。邓 剑盈等研究指出，温度、溶氧和单宁酸是影响单宁酶生产的主要因子，单宁酶是 一种诱导酶，用催化动力学方法研究表明：向1 茶汤中加入3 的单宁酶液，在 3 5 、p h 6 0 条件下，反应速度最快，且得出如下动力学方程： v = o 9 0 s “s + o 2 0 2 。 6 浙江大学硕士学位论文 l a u r e ns 等“1 报道，用单宁酶处理红茶，茶汤中可溶性铁、钙的含量分别增 加了2 3 与1 5 。j a k s o n 和l e e 研究报道：添加单宁酶处理茶汤，茶中不利于品质 的铁、钙、镁和锌等离子的溶解性会增加，其中钙离子会参与茶乳酪的形成，铁 离子会影响茶汤的汤色，镁离子会影响风味。 微滤技术是目前茶叶深加工中应用最广泛、经济价值较大的技术之。但因 其膜污染和某些有效成分得率不高，影响其工效。丽添加外源单宁酶能有效避免 膜污染和提高得率。童鑫等旧1 选用0 2um 微滤膜对浓度为2 5 添加单宁酶的绿茶 液进行微滤处理，结果表明：外源单宁酶的加入能有效提高微滤工效和微滤液的 生化得率，微滤过程有利于单宁酶酶促反应朝产物方向进行。 ( 2 ) 单宁酶的固定化研究 目前，在单宁酶的固定化研究方面，已有很多成果。英国专利报道，单宁酶 用硅藻土固定( 2 5 r a g 单宁酶g 硅藻土) ，在4 0 、p h 5 5 条件下处理“冷后浑”， 效果很好。程琦等滔1 研究了单宁酶的固定化及其在酯型儿茶素水解反应中的应 用，采用自制的壳聚糖为载体，单宁酶与壳聚糖配比1 ：2 5 ，3 0 固定2 h ，活 力回收达2 3 6 3 3 1 ，偶联效率为8 4 9 8 8 o 。单宁酶和固定化单宁 酶的最适反应温度分别为4 0 和5 0 ，6 0 处理1 5 m i n ，残存活性分别为1 3 6 和6 0 3 。单宁酶和固定化酶的最适p h 分别为5 8 和6 4 ，单宁酶在p h 4 8 7 8 活力稳定，而固定化酶活力稳定范围在p h 4 8 6 8 。肖林等”比较了几种固 定化载体，确定了以壳聚糖为载体，用戊二醛作交联荆制得固定化单宁酶为最佳。 壳聚糖用量0 1 9 ，用3 戊二醛5 m l 交联4 h ，然后加入酶5 8 4 u ，于4 c 反应4 h ， 固定化酶活回收率可达7 3 。单宁酶经固定化后，热稳定性、p h 稳定性及最适 温度均有所提高，最适p h 降低。由于固定化单宁酶既可以保持酶的活性，又可 以反复使用，因此固定化单宁酶具有广阔的发展前景。 ( 3 ) 单宁酶在茶叶初制加工中的应用 曾洪涛研究了单宁酶在绿茶和乌龙茶上的应用，发现加入一定量的单宁酶 可以降低酯型儿茶素的含量，而茶叶中的酯型儿茶素是茶汤滋味呈现苦涩味的来 源，从而可以消除夏秋茶的部分苦涩味。 1 2 2 3 纤维素酶和果胶酶 成熟的植物细胞壁由胞间层、初生壁及次生壁构成。其构成成分包括纤维素、 半纤维素、果胶及木质素。其中次生壁的构成部分绝大部分是纤维素，它使细胞 壁产生强度和塑性；细胞与细胞之间则靠果胶物质结合在一起。如果使用纤维素 酶，果胶酶等提取，就可以改善细胞壁的通透性，从而增加细胞内含物的提取率。 ( 1 ) 纤维素酶和果胶酶在茶叶深加工中的应用 t s a i 及o h i o m l 比较了使用单宁酶、单宁酶纤维素酶和单宁酶果胶酶处理 7 浙江大学硕士学位论文 红茶茶汤，结果表明：添加酶处理比未添加者有较高的萃取率，且圆形物含量较多， 混合酶处理均比单独处理好。据谭淑宜呻1 报道：用0 3 纤维素酶液提取红碎茶、 绿茶水浸出物，提取率分别比对照高2 0 5 和1 9 6 ，处理效果相当明显：当使 用0 1 果胶酶提取红碎茶、绿茶水浸出物时，提取率分别比对照高5 4 和5 6 ：而且由于低温酶法提取使茶叶香气成分在提取过程中散失较少，大部分香气 成分得到保留，从而可以明显改善速溶茶香气。高碧穗等。1 研究了离心、冰浴和 酶处理对茶汤澄清度的影响，发现用酶处理效果最好，其中以纤维素酶及果胶酶 处理效果最好，1 0 乌龙茶液经0 3 0 4 纤维素酶作用1 2 h ，可使茶汤混 浊度最低，且具有最佳颜色。钱晓军等嘲3 做了果胶酶对绿茶，乌龙茶和红茶茶汁 酶解作用的研究，并确定了各自的最佳工艺条件，试验还比较了酶解液与未经过 酶解的绿茶浸出率，前者与后者相比较，绿茶、乌龙茶、红茶浸出率各自提高了 1 8 5 、1 7 4 、4 6 。梁靖等“”通过对纤维素酶的应用研究，探讨了在速溶 茶加工过程中，纤维素酶应用较合适的温度、时间及浓度，认为浸提温度为4 5 、浸提时间为6 0 r a i n 、添加量为0 1 5 u m l 是纤维素酶发挥作用的较佳条件。 李风娟等研究了低温浸提茶汁的最优工艺条件：浸提温度5 8 c ，浸提时间 3 8 m i n ，茶水比( g ：m 1 ) 为1 1 ：l ，纤维素酶用量0 1 7 ，浸提用水的p h 为4 1 4 5 。在此条件下浸提的一次浸出浓度、浸出率分别为2 5 2 0 9 l 、1 2 8 3 。此 外，k i n u g a s a 发现在绿茶罐装茶水中加入果胶酶可释放出大量芳樟醇和香叶醇， 而这两种物质是茶叶香气成分，说明添加果胶酶还可以改善茶叶香气。 ( 2 )纤维素酶和果胶酶在茶叶初制加i 中的应用 纤维素酶和果胶酶还被用于茶叶初制加工中。毛清黎等“”做了利用纤维素酶 和果胶酶提高红碎茶品质的研究，在萎凋叶揉切前，将酶液均匀喷洒，水分控制 在6 8 左右，发酵时问比常规时间延长1 5 4 5 分钟，干燥采用先高后低的方式， 所制得的成品茶中，水浸出物含量有明显的提高，纤维素酶和果胶酶的平均增幅 分别为8 3 4 和6 5 0 ，其他品质成分也有不同程度的提高，且外形色泽和颗 粒也有明显的改善。包先进2 1 在砖茶的加工中采用浓度为4 8 的纤维素酶， 在液叶比为3 ：1 0 ，4 5 5 0 c ，相对湿度8 5 以上，p h 值为5 o 6 0 的条件下，渥 堆砖茶湿坯只需2 5 3 0 小时，而传统的加温保湿渥堆要3 6 3 8 小时，而且纤维素 酶的引入可大大提高砖茶水浸出物的的含量及总糖含量，对品质有明显的改善作 用。 1 2 2 4 蛋白酶 茶叶中的蛋白质约占干物重的2 2 ，但其中只有1 2 为水溶性的。也就 是说，蛋白质中有9 0 是不构成茶汤滋味的。而蛋白酶可将茶叶中的蛋白质水解 成各种氨基酸，从而可以提高茶叶的香气和鲜爽度。 8 浙江大学硕士学位论文 ( 1 ) 蛋白酶在茶叶深加工中的应用 谭淑宜等1 研究报道，加蛋白酶的提取液中氨基酸含量增加很多，0 8 蛋 白酶液处理的红碎茶和绿茶，氨基酸提取率分别比对照高1 9 6 ，8 和7 2 8 ，而 且发现随蛋白酶浓度增大，氨基酸含量也呈增加趋势。郑宝东等1 研究结果表明 经木瓜蛋白酶处理后，茶汁中的可溶性蛋白质被分解，氨基态氮含量增加1 3 3 9 ，而且茶汁有明显的鲜味感，其风味得到改善；同时发现，用果胶酶和木瓜 蛋白酶混合处理效果比单一酶处理好，不仅茶提取液的粘度降低，氨基态氮含量 增加，而且茶汁膜过滤通量比未经过酶处理的茶汁要提高2 l 4 0 ，而单一蛋 白酶仅为9 1 0 。c h o k ok 等。3 将蛋白酶和单宁酶一起处理绿茶茶汤，绿茶 提取液中氨基酸含量提高，从而提高了鲜爽味，滋味得到改善，而且香气也得到 提高。罗盈昌等“”使用木瓜蛋白酶酶解处理茶汁，经过处理后的茶汁的膜过滤通 量比未经过酶解的茶汁要提高9 1 0 。 ( 2 ) 蛋白酶在茶叶初制加工中的应用研究 在红碎茶初制中，添加蛋白酶可以促进蛋白质的水解，既能提高氨基酸的含 量，又有可能减少不溶性复合物的形成。据曾晓雄等研究结果表明；在红茶加 工中添加蛋白酶，( 1 ) 氨基酸含量相对提高2 1 5 ，茶红素增加2 0 以上，而 茶褐素含量下降明显；( 2 ) 有利于红茶发酵，缩短发酵时间1 5 2 0 m i n ； ( 3 ) 红碎茶滋味强度和汤色明亮度增加，滋味醇和，粗青气减少，香气变好。 1 2 2 5 其它酶类 ( 1 ) o 一淀粉酶和葡萄糖淀粉酶 有研究报告认为，用0 2 的d 一淀粉酶和0 1 的葡萄糖淀粉酶混合物处理 乌龙茶茶汤，在室温下贮藏六个月都未发现有沉淀物产生，并能基本保持新鲜度。 ( 2 ) 溶菌酶 溶菌酶专一地作用于肽聚糖分子中n 一乙酰胞壁酸与n 一乙酰基葡萄糖之间的 l ，4 键，使细菌细胞壁变得松弛，最后壁破裂，细胞死亡。茶汤是一种热敏性体系， 高温长时间杀菌会产生不良气味。茶汤是一种低酸性的饮料，引起腐败的微生物 主要为细菌，加入此酶，可有效地防止和消除微生物污染，减少杀菌诱发的不良气 味。 ( 3 ) 过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶 过氧化氢酶最适p h 5 9 ，最适温度3 5 4 5 ，葡萄糖氧酶最适p h 3 7 ，最适 温度4 5 7 0 c 。两种酶常混合使用，用于脱除饮料中的氧气、护色、保护萜烯类 挥发性物质。茶汤是一种对氧很敏感的体系，在有氧条件下茶多酚、维生素、芳 香物质等很容易受氧化而降低品质。使用这两种酶有一定的提高品质的效果。 9 浙江大学硕士学位论文 ( 4 ) 果胶酸酯酶 日本学者对绿茶提取液中添加果胶酯酶进行过研究。结果认为，该酶能使茶 汤中沉香醇、香茅醇、橙花醇、顺茉莉酮等香气化合物大为增加，但其作用机理 尚不清楚。 1 2 3 外源酶在茶叶加工中的应用前景 ( 1 ) 目前，外源酶在茶叶加工中的应用研究主要集中在深加工上，而在茶叶原 料加工中的研究相对较少，有很多方面仍是空白。例如，乌龙茶和绿茶等茶类很 大一部分产量是在夏天生产的。夏茶苦涩味重、香气低，因而品质差。通过外源 酶技术来改善夏茶品质，应有很好的研究前景。 ( 2 ) 外源酶制剂价格是妨碍其应用的主要因素之一。茶叶加工中的广泛应用需 要开发廉价高效的酶制剂。例如，在茶饮料加工中，单宁酶用来消除茶乳酪效果 最好，但其昂贵的价格严重影响了其在工业上的大量应用。因此，如何采用经济 有效的方法来制备单宁酶是急需解决的问题。另外，目前在酶固定化方面已取得 不少成果，而相比之下，与之配套的生产设备方面研究却很少。因此，在酶固定 化技术研究不断深化的同时，需要开展相关工业化生产设备的研究。 ( 3 ) 目前，由于次生反应，一些酶类在茶叶加工中引起的品质变化以及机理并 不完全清晰，这就使得人们在使用这些酶制剂的时候有所顾忌，从而限制了其应 用。因此，对相关问题及工艺条件的进一步研究，将有助于推动酶制剂在茶叶加 工中的应用。 1 3 本试验研究的意义和目的 随着制茶工艺学的发展和各门科学技术的相互渗透，外源酶在茶叶加工中的 研究愈来愈多。茶叶加工中研究较多的外源酶主要有多酚氧化酶、单宁酶、纤维 素酶、果胶酶、蛋白酶等，这些酶在茶叶深加工以及红茶初制加工中已经有了不 少研究成果，但在绿茶加工中还没有相关的报道。而我们考虑到目前夏季绿茶品 质差的问题，所以考虑将外源酶引入到茶叶初制加工中，从而改变其内含物含量， 解决夏季绿茶普遍存在的苦涩味问题，以及增加茶汤的鲜爽度和醇和度，来达到 改善夏季绿茶品质的目的。 1 0 浙江大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 烘青绿茶 原料为不同嫩度的毛蟹品种，分别取自浙江省江山市，以及衢州市，加工工 艺完成于江山十罗洋茶场以及衢州正康特产公司茶场。按照烘青绿茶的基本工序 加工茶叶，基本工序为：摊放一杀青一揉捻一烘干，这批茶与一般的烘青绿茶的 区别在于揉捻工序中添加了酶，由于揉捻工序如使用揉捻机，将会使用更多的鲜 叶原料，以及大量的酶，从经济上这是不允许的，故揉捻工序使用了手工揉捻， 杀青叶的重量统一为5 0 0 9 ，液叶比为2 ：i 0 ( 液叶比指的是酶液体积与杀青叶重 量的比值，这是结合以前学者在红碎茶加工中的相关试验经验确定的比例) 。 2 1 2 试剂( 外源酶) 。 ( i ) 木瓜蛋白酶( p a p a i n ，e c 3 4 2 2 2 ) 来自木瓜，活力1 0 0 万u g ( 酶活定义：紫外分光光度法，在测定条件下 ( 3 7 度，p h 值7 o ) 每分钟水解酪蛋白释放出的三氯乙酸可溶物在2 7 5 n m 波长有吸 光度与1 微克酪蛋白的吸光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位，用u g 表 示) ，国药集团化学试剂有限公司提供。 ( 2 ) 纤维素酶( c e l l u l o s ee n z y m e ) 来自绿色木霉，活力i 5 万u g ( 活力定义同上) ，国药集团化学试剂有限 公司提供。 ( 3 ) 单宁酶( t a n n a s e ，e c 3 1 1 2 0 ) 来自米曲霉，活力5 0 0 u g ，日本k i k k o m a n 公司提供。 2 1 3 主要设备与仪器 2 1 3 1 茶叶加工过程所需要的设备： 大型滚筒杀青机； 干燥机 2 1 3 2 分析仪器 数显恒温水浴锅( 国华电器有限公司) ； 7 2 3 0 g 可见分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) ； u l t r o s p e c 3 3 0 0 紫外分光光度计( 美国b i o c h r o m 公司) ； f a 2 0 0 4 电子天平( 上海精密科学仪器有限公司) ； 浙江大学硕士学位论文 岛津l c - - 2 0 i o a 型高效液相色谱仪( 日本岛滓公司) ； 氨基酸自动分析仪 2 2 试验与分析方法 2 2 1 茶样的制作 茶叶加工过程基本跟一般的烘青绿茶制作方法相同，不同点在于手工揉捻跟 揉捻工序中均匀喷施酶液。酶浓度选择了0 5 ，1 o ，1 5 ，揉捻时间选择 了1 5 m i n ，2 5 m i n ，液叶比为2 ：1 0 ，鲜叶嫩度方面选择了一芽二叶，与一芽四叶， 以及一批更为粗老的原料。采用的杀青叶重量为5 0 0 9 ，所以添加的酶液的体积 为l o o m l ，揉捻过程中使用喷壶将酶液均匀喷洒。虽然采用了不同揉捻时间，但 揉捻之后，静置了相同