（发育生物学专业论文）人工嵌合启动子的构建及其胁迫诱导性分析.pdf

独创声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位i 淦文作者签名： 一字交旁碲 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂接可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签窖：蟾一， 签字日期：2 0 0 年歹月r j 日 一字遗毒移 (，o ( 签字日期：2 0 0 小尹 山东师范大学硕士学位论文 人工嵌合启动子的构建及其胁迫诱导性分析 中文摘要 高盐、干旱和低温等非生物胁迫是影响植物生长和作物生产的较为广泛的不利生境，运 用基因工程方法培育抗性品种是重要的抗逆生物学途径。在植物的胁迫应答中，基因的表达 调控起着重要的作用。植物中存在大量胁迫相关的基因，当受到某一环境因素的胁迫时，植 物会调节这些胁迫相关基因的表达，产生相应的适应性。目前已有许多胁迫相关基因被克隆， 并被用于植物抗逆基因工程中，得到了一些有一定抗逆能力的转基因植株。但在基因工程实 践中常用来控制目的基因表达的启动子主要是c a m v 3 5 s 启动子，该启动子可使目的基因过 量表达，但它是无环境、组织和时间特异性的组成型的表达。利用组成型表达启动子控制抗 性相关基因的过量表达虽然可以提高植物在逆境条件下的抗逆能力，但正常环境条件下细胞 内组成型过量表达抗逆蛋白则是一种能量浪费，且正常环境下细胞内的抗逆蛋白长时间过量 的积累可能妨碍植物的正常生长代谢，引起植物的形态发生改变，造成转基因植物生长发育 严重停滞甚。解决此矛盾，可以用逆境胁迫专一诱导的启动子，但目前鉴定的胁迫诱导启动 子的活性仍不满足要求。本实验意在摸索人工构建受多种胁迫强诱导的启动予。 目前已有许多环境胁迫诱导的基因及其启动子被克隆，且有些启动子已被详细研究， 确定了这些启动子行使其功能的关键片段，并鉴定了一系列与转录因子相互作用的顺式作用 元件，如干旱应答元件d r e ，a b a 应答元件a b r e ，光应答元件g - b o x 等。本实验从已发表的 论文中获得了r d 2 9 a 、e r d l 、c o r l s a 、l t i 3 0 、k i n l 五个胁迫诱导基因的启动予序列，这五个启 动子均受多种胁迫诱导，它们均含有多个胁迫应答元件。本实验用p c r 方法从这五个胁迫诱 导启动子上分别获取了它们的关键片段，由于r d 2 9 a 启动子是目前常用的诱导活性较高的 启动子，本实验以r d 2 9 a 启动予上的关键片段到其a t g 后1 5 b p 的2 6 9 b p 片段m p 为基础， 在其5 端依次连接其它关键片段的单体或二聚体，构建了六条人工嵌含启动子，分别为 e r d l + k i n l + e o r l 5 a + m p 、l t i 3 0 + e r d l + k i n l + e o r l 5 a + m p 、e r d l + k i n l + e o r l 5 a 十l t i 3 0 + m p 、 e r d l + k i n l + c o r l 5 a + r d 2 9 a + m p 、e r d l + c o r l 5 a + c o r l 5 a + r d 2 9 a + m p 、 e r d l + e r d l + c o r l 5 a + r d 2 9 a + m p 。又克隆了r d 2 9 a 全长启动子作为对照。选用p b l l 2 1 作为植 物表达载体，该载体上有由c a m v 3 5 s 启动子调控的g u s 基因。将这六条人工构建的嵌合启 动子和r d 2 9 a 全长启动子分别取代p a l l 2 1 上的c a m v 3 5 s 启动予，使它们控制位于其后的 g u s 基因的表达。p b l l 2 1 载体和重组表达载体分别导入农杆菌g v 3 1 0 1 ，转化拟南芥愈伤组 织，冷处理后瞬时表达分析表明这些重组启动子均具有诱导活性。这些载体导入农杆菌 坐查些翌奎兰堡主兰垡堕苎 l b a 4 4 0 4 后，叶圆盘法转化烟草，p c r 鉴定烟草转化株。下一步将用高盐、干旱、低温和 a b a 处理分别处理这些烟草转化株，g u s 活性定量分析鉴定各个启动子的诱导活性。 关键词：非生物胁迫诱导表达启动子嵌合启动子g u s 活性 中图分类号：q 7 8 2 山东师范大学硕士学位论文 a r t i f i c i a lc h i m e r i cp r o m o t e r sc o n s t r u c t i o na n ds t r e s sr e s p o n s i v ea c t i v i t y a n a l y s i s a b s t r a c t a b i o t i cs t r e s s e ss u c ha ss a l i n i t y , d r o u g h ta n dl o wt e m p e r a t u r ea f f e c tp l a n tg r o w t ha n dc r o p p r o d u c t i o ne x t e n s i v e l y u s i n gg e n ee n g i n e e r i n gm e t h o dt oc u l t i v a t er e s i s t a n tp l a n ti st h ei m p o r t a n t a p p r o a c hf o rr e s i s t a n tb i o l o g yr e s e a r c h t h er e g u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o np l a y sa ni m p o r t a n tr o l e i np l a n ti nr e s p o n s et os t r e s s e s t h e r ea r em a n ys t r e s s - r e l a t e dg e n e si np l a n t p l a n tc a l lr e g u l a t e s s t r e s s r e l a t e dg e n e se x p r e s s i o na n di m p r o v et h et o l e r a n c eu n d e re n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s n o ws o m a n ys t r e s s - r e l a t e dg e n e sh a v eb e e nc l o n e da n du s e df o rt h er e s i s t a n c e - e n g i n e e r i n gr e s e a r c h ，a n d s o m et r a n s g e n i cp l a n t sh a v eb e e ng o tw h i c hc o u l dt o l e r a t et h es t r e s s e st os o m ee x t e n t 。t h em o s t f r e q u e n t l yu s e dp r o m o t e rf o rr e g u l a t i n gt h ei n t e r e s t e dg e n e se x p r e s s i o ni sc a m v 3 5 sp r o m o t e r w h i c hc a no v e r e x p r e s st h ei n t e r e s t e dg e n e s ，b u tt h ee x p r e s s i o ni sn e i t h e re n v i r o n m e n t ，t i s s u en o r t i m es p e c i f i c ，i ti sc o n s t i t u t i v e t h o u g hi tc a ni m p r o v et h ep l a n tt o l e r a n c eu s i n gt h ec a m v 3 5 s p r o m o t e rt oe x p r e s st h er e l a t e dg e n e si ns t r e s se n v i r o n m e n t , t h ee x p r e s s i o no fr e s i s t a n tp r o t e i n w a s t e st h ee n e r g yi nn o r m a le n v i r o n m e n ta n dt h ea c c u m u l a t i o no f t h e p r o t e i nc a ni n h i b i tt h ep l a n t s n o r m a lm e t a b o l i s m ，c a u s i n gt h em o r p h o l o g yc h a n g eo ft h e p l a n t ，r e s u l t i n gi ng r o w t ha n d d e v e l o p m e n tr e t a r d m e n to ft r a n s g e u l cp l a n t s i no r d e rt os o l v et h ep r o b l e ma sa b o v e ，p e o p l ec a n u s et h es t r e s ss p e c i f i ci n d u c e dp r o m o t e r s ，b u tt h ea c t i v i t yo ft h e s ep r o m o t e r si d e n t i f i e da sf a rs t i l l c a n tc o n t e n tt h en e e do fr e l a t e dr e s e a r c h 。s ot h ee x p e f i m e m 蜘p t st oc o n s t r u c ta r t i f i c i a l c h i m e r i cp r o m o t e r sw h i c hc a nb es t r o n g l yi n d u c e db ys e v e r a ls t r e s s e s n o ws om a n ys t r e s si n d u c e dg e n e sa n dt h e i rp r o m o t e r sh a v eb e e ni s o l a t e d ，a n ds o m ep r o m o t e r s w e r ei d e n t i f i e di nd e t a i l ，c o n f i r m e dt h ek e yf r a g m e n t sb yw h i c ht h ep r o m o t e r sp e r f o r m e dt h e i r f u n c t i o nm a i n l y s c i e n t i s t sh a v ea l s oi n d e m i f i e das e r i e so fc i s - e l e m e n t sw h i c hi n t e r a c t e dw i t ht h e t r a n s c r i p t i o nf a c t o r , s u c ha sd r o u g h t - r e s p o u s i v ee l e m e n td r e , a b a - r e s p o n s i v ee l e m e n ta b r e ， l i g h t - r e s p o n s i v e e l e m e n tg - b o xa n ds oo n w e g o tf i v e s t r e s s i n d u c e dg e n e s p r o m o t e r s e q u e n c e ( e g r d 2 9 a ，e r d l ，c o r l5 a ，l t i 3 0 ，k i n l ) o nt h eb a s i so fp r e v i o u sp u b l i c a t i o n s , a n dt h e s e p r o m o t e r sa r ea l li n d u c e db ys e v e r a ls t r e s s e s t h e ya l lh a v es t r e s s r e s p o n s i v ee l e m e n t sa n dt h ek e y f r a g m e n t sh a v eb e e nc o n f i r m e d w eg o tt h ek e yf r a g m e n t sf r o mt h ef i v ep r o m o t e r su s i n gp c r m e t h o d b e c a u s er d 2 9 ap r o m o t e ri s r e l a t i v e l ys t r o n g l yi n d u c e do n e ，o nt h eb a s i so f2 6 9 b p 3 山末师范大学硕士学位论文 f r a g m e mm p f r o mr d 2 9 a p r o m o t e rk e yf r a g m e n tt o15 b pd o w n s t r e a mo ft r a n s l a t i o ni n i t i a lc o d o n a r gw ec o n s t r u c t e ds i xa r t i t m a lc h i m e r i c p r o m o t e r s ： e r d l + k i n l + c o r l 5 a + m p 、 l t i 3 0 + e r d l + k i n l + c o t l 5 a + m p , e r d l + k i n l + c o r l 5 a + m 3 0 + m p e r d l + k i n l + c o r l 5 a 十r d 2 9 a + m p , e r d l + c o r l 5 a + e o r l 5 a + r d 2 9 a + m p , e r d l + e r d l + c o r l 5 a + r d 2 9 a + m p , t h e nw ec l o n e dr d 2 9 a f u l l l e n g t hp r o m o t e ra sc o n t r 0 1 t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp b l l 2 1w h i c hw es e l e c tt ot r a n s f o r m a t t o b a c c oc o n t a i n st h eg u sg e n ec o n t r o l l e db yc a m v 3 5 s p r o m o t e r t h es i xc h i m e r i cp r o m o t e r s 罐 r d 2 9 af u l l - l e n g t hp r o m o t e rs u b s t i t u t e dt h ec a m v 3 5 s p r o m o t e ro f p b l l 2 1 ，t h e nt h e yc a r l r e g u l a t e t h eg u se x p r e s s i o n t h ec o n s t r e u c t sw e r em o b i l i z e di n t oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sg v 3 1 0 1 ， t h e nt r a n s f o r m a t e da r a b i d i p s i sc a l l u s a f t e rc o l dt r e a t m e n t , t r a n s i e n te x p r e s s i o na n a l y s i si n d i c a t e s t h a tt h er e c o m b i n a n tc o n s t r u c t sc a na l lb ei n d u c e d t h ec o n s t r e u c t sw e r em o b i l i z e di n t o a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sl b a 4 4 0 4 ，t r a n s f o r m a t e dt o b a c o ow i t hl e a f - d i s cm e t h o d t h e t r a n s g e n i cp l a n t sw e r ei d e n t i f i e db yp c r m e t h o d a f t e rn a c l ，d r o u g h t , l o wt e m p e r a t u r ea n da b a t r e a t m e n to ft h et r a n s g e n i ct o b a c c op l a n t s ，t h eg u s a c t i v i t yc a nb ei d e n t i f i e d ，t h e nw ec a na n a l y s i s t h e s ep r o m o t e r s i n d u c e da c t i v i t y , a n dt h i ss t e pi si np r o c e s s k e yw o r d s ：a b i o t i cs t r e s s i n d u c e de x p r e s s i o n p r o m o t e r c h i m e r i cp r o m o t e rg u s a c t i v i t y c a t e g o r yn o ：q 7 8 4 山东师范大学硕士学位论文 第一部分：文献综述 一、菲生物胁迫诱导基因表达的信号通路 植物生长在特定的环境条件下，因此外晃环境的各种胁迫如高盐、干旱、低温等对植 物来说是不可避免的事件【l 】。外界环境胁迫不同程度影响着植物生长发育过程及状态，甚至 对植物产生致死作用 2 1 。植物对生长环境的依赖性同植物生长环境条件的动态性，要求植物 迅速应答和有效适应外界环境条件的改变。在长期进化选择的过程中，植物形成了一整套比 较完善的适应外界环境胁迫的信号感受、转导和应答机制【3 】。植物对环境胁迫的适应是多方 面多层次的。一方面，植物在组织、形态结构和生长发育等方面高度适应生长环境；另一方 面，植物通过基因的表达调控适应外界环境条件的波动。在植物的胁迫应答中，基因的表达 调控起着重要的作用。植物中存在大量耪追相关的基因，当受到某一环境因素的胁追对，檀 物会调节这些胁迫相关基因的表达，通过特定基因的迅速激活或钝化，或产生相关的保护物 质，或改变植物的代谢方式，甚至调控植物的发育进程以适应夕 界环境条件。下面将高盐、 干旱、低温等胁迫时植物从胁迫感受到特定相关基因表达的信号转导的研究进展做一回顾。 l 、从n a + 胁迫到基因表达的信号转导通路1 4 】 s o s s i g n a l i n gp a t h w a yf o ri o nh o m e o s t a s i su n d e rs a l ts t r e s si n a r a b i d o p s 括s a l ts t r e s s e l i c i t e dc a 2 + s i g n a l sa r ep e r c e i v e db ys o s 3 ，w h i c ha c t i v a t e st h e p r o t e i nk i n a s es o s 2 a c 曲a t e d s o s 2 p h o s p h o r y l a t e ss o s l ，ap l a s m am e m b r a n en a + h * 馘t i p o n e tw h i c ht h e nt r a n s p o r t sn a * o u t o f t h ec y t o s o l - t h et r a n s c r i p tl e v e lo f s o s li sr e g u l a t e db yt h es o s 3 s o s 2k i n a s ec o m p l e x s o s 2 些查堕蔓查兰堡主兰垡笙奎 a l s oa c t i v a t e st h et o n o p l a s tn a + h + a n t i p o r t e rt h a ts e q u e s t e r sn 0i n t ot h ev a c u o l e n 蠢e n t r y si n t o t h ec y t o s o lt h r o u g ht h en a + t r a n s p o r t e rh k t lm a ya l s ob er e s t r i c t e db ys o s 2 a b l lr e g u l a t e st h e g e n ee x p r e s s i o no f n h x l ，w h i l ea b l 2 i n t e r a c t sw i t hs o s 2a n dn e g a t i v e l yr e g u l a t e si o n h o m e o s t a s i se i t h e rb yi n h i b i t i n gs o s 2k i n a s ea c t i v i t yo rt h ea c t i v i t i e so fs o s 2t a r g e t s d o u b l e a r r o wi n d i c a t e ss o s 3 一i n d e p e n d e n ta n ds o s 2 d e p e n d e n tp a t h w a y 在盐胁迫过程中，细胞内离子动态平衡的调节对植物耐盐性至关重要。植物细胞对盐。 分胁迫的一个重要反应就是产生胞质内c a 2 + 浓度的瞬时升高和随后的c a 2 + 受体蛋白的表达 或活性激活【5 1 。到目前为止，关于盐胁迫信号途径的体内受体和下游产物还鲜为人知，尽 管这样，在拟南芥中s o s 通路的发现初步揭露植物参与离子胁追反应的组分和机制。朱健 康等从拟南芥中鉴定了与控制离子稳态及耐盐性相关的胁迫信号传导通路中的三个组分 s o s l 、s o s 2 和s o s 3 。对5 0 s 突变体n a + l i + 敏感性遗传分析发现s o s l 是s o s 2 ，s o s 3 的上 位基因，处于通路的最下游1 6 1 。这些s o s 突变体在培养萋中含微摩尔k + 和c a z * 时出现缺k + 症状。当外界补充毫摩尔c a 2 + 时，s o s 2 和s o s 3 突变体n a + 、k + 含量低的现象被缓解s o s l 突变体表现出高渗敏感，而s o s 2 和s o s 3 突变体不表现高渗敏感。这些现象表明s o s 信号 通路调控n a + 和k + 稳态化并且此通路被c a 2 + 活化。s o s 3 是e f 手型c a 2 + 结合蛋白的新的亚家 族【7 1 ，这些蛋白与钙调磷酸酶( c a l c i n e u r i n ，2 b 型蛋白磷酸酶) 的b 亚基及动物神经传感 器有较高的序列相似性【7 】【射。与钙调蛋白( c a l m o d u l i n ) 或钙牵蛋白( c a l t r a c t i n ) 相比，钙 调磷酸酶预测有3 个e f 臂，以低亲和力结合c a 2 十 9 1 【，这些蛋白家族中仅某些成员包含一 个n 端豆蔻酰化的基序( m o t i f ) 。s o s 3 的豆蔻酰化，帮助将s o s 3 及与它相互作用的蛋白( 如 s o s 2 ) 定位于膜上，因为它们的目标转运蛋自( 如s o s t ) 定位于膜上。除与s o s 2 相互作 用在耐盐中发挥作用外，s o s 3 也可与其它一些蛋白包括类s o s 2 的蛋白( 如p k s ，蛋白激酶 s ) 相互作用。s o s 3 与s o s 2 的相互作用以及s o s 2 的活化都依赖c a 2 + 。在植物中s o s 3 作为 盐耐受决定子的功能离不开c a 2 + 的结合以及n 末端十四烷酰化。 s o s 2 编码含4 4 6 个氨基酸残基的丝氨酸苏氨酸激酶。在s o s 2n 末端有一个2 6 7 个氨 基酸残基形成的催化结构域( d o m a i n ) ，这一结构域与酵母s n f i ( 蔗糖非发酵s u c r o s e n o n f e r m e n t i n g 激酶) 以及哺乳动物a m p k ( a m p 活化的蛋白激酶) 序列有高度相似性。s o s 2 的激酶活性是其发挥耐盐性功能所必需的。s o s 2c 末端有调节结构域，它与催化结构域的相 互作用可造成自身抑制0 1 【他1 。调节结构域有一个2 1 个氨基酸残基形成的基元( m o t i f ) ，是 s o s 3 与s o s 2 相互作用的位点，也是激酶的自身抑制结构域。s o s 3 与此基元结合可破坏s o s 2 激酶的自身抑制，此基元的缺失可造成s o s 2 不依赖s o s 3 的组成型活化 7 l ”】。此外，催化结 6 坐查塑蔓查兰堡主堂垡丝苎 构域上1 k 1 6 8 突变为a s p 也可导致s o s 2 组成型活化n s o s 信号通路通过调控末端的运输系统来调控离子稳态，质膜的n 矿i - f 反向转运蛋白 s o s i 在转录以及转录后水平受s o s 信号通路的调控。s o s i 预测在胞质侧有一个长的亲水性 的尾巴1 1 4 】，膜转运载体具有长的胞质尾巴来作为它们转运溶剂的感受器。遗传生化证据表明 s o s 信号通路各成分分级发挥作用。首先c a2 + 与s o s 3 结合，而后s o s 3 与s o s 2 相互作用，激 活s o s 2 激酶活性，s o s 2 使s o s l 磷酸化。s o s l 在s o s 3 s o s 2 调控下使n a + 外排，从而建立新 的离子稳态。r u s 对h l c t ls o s 3 双突变体的分析发现a t h l c i i 的功能干扰可抑$ l j s o s 3 j 盐敏 感表型，离子浓度分析证实a t h k t l 控制植物6 p n a + 的内流f 1 6 1 。很有可能在盐胁迫下，s o s 3 及s o s 2 负调控a t t 1 的活性。2 c 型蛋白磷酸酶a b i i 调控n h x l 基因的表达，而另一种2 c 型 蛋白磷酸酶a b l 2 与s o s 2 相互作用，通过抑制s o s 2 激酶活性或抑制5 0 s 2 目标蛋白的活性负调 控离子内源稳定。 2 、从渗透胁迫到基因表达的信号转导通路 高盐、干旱及低温等不利环境因素都会对植物产生渗透胁迫，影响植物正常的生长发育， 严重时导致植物死亡。为了适应或抵抗这些不利的环境状况，植物会作出各种反应来维持本 身的水分状况，以避免或减轻缺水对细胞的危害。目前对这方面的研究，重点集中在植物缺 水引发的分子反应和信号传递。根据近年来的报道，许多植物基因的表达受上述干旱、高盐 及低温胁迫的诱导 1 7 l f l8 】1 1 9 1 1 2 0 1 2 ”。根据基因产物的作用，可将上述这些胁迫诱导的基因分为 两大类。 第1 类基因的编码产物包括：直接保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白( 如渗调蛋白、 l e a 蛋白、c o r 蛋白、水通道蛋白、离子通道蛋白、载体蛋白、分子伴侣和m k n a 结合蛋白 等) ；渗透调节因子( 如脯氨酸、甜菜碱、一些糖类等) 的合成酶：以及毒性降解酶( 如谷胱 甘肽s 转移酶、可溶性环氧化物水解酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化物酶 等) ，使细胞各种生理生化代谢活动能维持正常进行。这一类基因产物的具体功能受到广泛重 视，研究得比较透彻。利用l e a 蛋白基因、c o r 蛋白基因、脯氨酸合成酶基因以及甜菜碱合 成酶基因等进行转化，获得了一些耐早耐盐耐低温性状得到改善的转基因植物瞄】 2 3 1 2 4 1 。 第2 类基因编码的产物包括：传递信号和调控基因表达的转录因子( 如b z i p 转录因子、 m y c 转录因子、m y b 转录因子及d r e b 转录因子等) 1 9 1 ：感应和转导胁迫信号的蛋自激酶( 如 m a p 激酶、c d p 激酶、受体蛋白激酶、核糖体蛋白激酶和转录调控蛋白激酶等) ；以及在信号 转导中起重要作用的蛋白酶( 如磷酸酯酶、磷脂酶c 等) 最近在撖南芥中和烟草中也发现双 7 山东师范大学硕士学位论文 组分系统( t w o c o m p o n e n ts y s t e m ) 基因的存在，其基因产物为“感受器”( s e n s o r ) 和“反应 调节器”( r e s p o n s er e g u l a t o r ) 合二为一的激酶蛋白。拟南芥的双组分系统基因a t r r l 和a t r r 2 受干旱、高盐及低温的诱导【2 5 1 ，烟草双组分系统基 园n t h k l 也受高盐胁迫处理的诱导 2 6 】。 r 一 i f u n e l l o l e u p r a 疆州s il r 盼u 舢j o 刚帕0 t e l n 8 d e h y d r a t i o ni n d u c i b l eg e n e sa n dt h e i rp o s s i b l ef u n c t i o n si ns t r e s st o l e r a n c ea n dr e s p o n s e g e n ep r o d u c t sa r ec l a s s i f i e di n t ot w og r o u p s t h ef i r s tg r o u pi n c l u d e sp r o t e i n st h a tp r o b a b l y f u n c t i o ni ns t r e s st o l e r a n c e ( f u n c t i o n mp r o t e i n s ) ，a n dt h es e c o n dg r o u pc o n t a i n sp r o t e i nf a c t o r s i n v o l v e di nf 1 r t h e rr e g u l a t i o no f s i g n a l 虹a n s d u c d o na n dg e n ee x p r e s s i o nt h a tp r o b a b l yf u n c t i o ni n s t r e s sr e s p o n s e ( r e g u l a t o r yp r o t e i n s ) 2 7 1 以l e a 型基因的诱导表达为例说明该信号通路。 ，口h 菩# t o l m 孵 a b a - i n d e p e n d e n td r e b 2a n da b a d e p e n d e n tc b f 4u a n s e r i p t i o nf a c t o r sn 翟n s a 甜v 瓢【e 坐查塑蔓奎兰堡圭堂垡笙苎 d r e c r tc i s - e l e m e n t si nt h ep r o m o t e r so f l e at y p eg e n e s a b a - d e p e n d e n tp a t h w a y sr e g u l a t e l 阴t y p eg e n e st h r o u g hm y c m y ba n db z i pt y p et r a n s c r i p t i o nf a c t o r s a b a - d e p e n d e n ts i g n a l i n g i sm e d i a t e dt h r o u g hi p 3a n dc a f r y ln e g a t i v e l yr e g u l a t e si p 3l e v e l s a b ai n d u c e dc a ” s i g n a l i n gi sn e g a t i v e l yr e g u l a t e db y a b i i 2p r o t e i np h o s p h a t a s e2 c c b f sb i n dt o t h ec r t d r e e i s e l e m e n t so nt h ep r o m o t e ro f l e a - t y p eg e n e sa n di n d u c ee x p r e s s i o no f t h e s eg e n e s “副 在植物体中渗透胁迫诱导表达的晚期胚胎丰富蛋白( l e a ) 使植物体产生耐脱水性网。 这种l e a 型蛋白在不同的植物物种中，由r d ( 对脱水作出反应) 五r d 依脱水的早期作出反 应) ，圈( 冷诱导的) ，c 0 r ( 冷调节的) ，r a b ( 对a b a 反应的) 等基因编码口。lf j l , 在不同的物种 中这些蛋白的积累水平与胁迫耐受性相关表明它们在渗透胁迫下起一定保护作用。 m 基因在渗透胁迫下的诱导表达通过依赖a b a 和不依赖a b a 的两个信号通路调控。 工正“基因的启动子包含干旱应答元件d 趾粥r t 、a b a 陵答元件a b r e 和，或m y b 、m y c 识别 元件m y b r s 、m y c r s 等顺式作用元件。d r e 调控由高盐、干旱或低温引起的脱水反应， a b r e 、m y b r s 和m y c r s 调控在胁迫下对a b a j 盘答的基因的表达d md 2 。 对拟南芥a b a 缺失突变体l o s 5 ，l o s 6 的遗传分析揭示a b 埘拟南芥中- - 此- l e a 基因的盐 胁迫诱导表达所必需【3 3 1t 3 4 ，在非生物胁迫下，c a 2 + 和h 2 0 2 作为a b a 的第二信使引起气孔关 闭和基因表达d 5 】【3 6 1 ，瞬时表达分析揭示i p 3 和c a d p r 调控的钙离子通道参与a b a 诱导的c a 2 + 浓度改变，r c a 2 + 浓度瞬时升高调节如，以鲥和圈m 等的上尉型基因的表达p 7 l 。由缺失肌醇 磷酸一1 一磷酸酶自q 勿( f i e r yj ) 突变体得出的遗传证据表明，i p 3 的代谢对a b a 和非生物胁迫 信号转导起重要作用，f i e r yl 通过代谢降低i p 3 的水平而在该信号通路中起负调控作用【3 8 】。 盐a b a 诱导的信号转导过程至少部分依赖c a 2 + 依赖的蛋白激酶c d p k s 。玉米原生质体瞬时 表达分析表明胞质ca ：抖的浓度升高激活c d p k s ，激活的c d p k s 接着又诱导相应的胁迫应答 基因i i v a l 的表达。同时，c d p k 基因表达受2 c 型蛋白磷酸酶d b l l 的负调控。过量表：勘删 基因抑制了a b 卿c d p k 诱导的h v a l 基因的表达口9 】。 在渗透胁迫下依赖a b a 的厶弘基因的表达被b z i p 型转录因子和m y b m y c 类转录因子 所调节，它们分别识别a b r e 和m y b m y c 识别序列【柏】。拟南芥中b z i p 型的转录因子基因 排i a r e b l a b f 2 、a r e b 2 a b f 4 基因，被干旱、盐渍和低温胁迫诱导表达，在此过程中，a b a 对这些基因的激活是必需的【4 ”。a b f 3 和a b f 4 组成型的过量表达提高了r 一引占、r d 2 9 b 等l e d 基因的表达，这些转基因植株获得了提高的耐早性【4 2 】。 、 基本的螺旋一环一螺旋型转录因子，像a t l v i y c 2 ( r d 2 2 b p i ) 和a t m y b 2 ，调控a b a 应答 9 虫查堑蔓丕兰堡主兰竺丝塞 基因的表达。a t m y c 2 和a t m y b 2 组成型的过量表达导致兄d 2 2 j 嘲叫d 组成型的表达，并 且用a b a 处理后它们表达水平显著增加，这些转基因拟南芥植株提高了对渗透胁迫的耐性 1 4 0 1 。相反，在a t m y c 2 突变体中，r d 2 2 和么“d 抒基因的表达水平下降。 在l e a 型基因的调控表达中，存在一个不依赖a b a 的信号通路。在此通路中，这些基 因被结合于它们的启动子中d 觥r t 元件的转录因子所激活。这些转录因子被称为c r t 结合 蛋白c b f s 或d r e 结合蛋自d r e b s 。拟南芥中的d r e b s 被分为d r e b l ( d r e b l a = c b f 3 、“ d r e b l b = c b f l 、d r e b l c = c b f 2 ) 和d r e b 2 ( d r e b 2 a 和d r e b 2 b ) 。c b f l ，c 副叼、c & f ? 基因被低温胁迫诱导表达，d r e b 2 a 霸灿2 b 基因被干旱和盐溃诱导表达d o 4 3 1 。h a e k e 等 克隆至i j d r e b i 的另一个同源物c b f 4 ，与其它的d r e b i 不同，c b f 4 基因被干旱和盐溃诱导 表达，其参与到依赖a b a 的信号转导通路之中】。 在拟南芥中过量表达c b f s 基因可以激活d r e c r t 元件，从而导致一些工点基因的高 水平表达，提高了植株对冷和渗透胁迫的耐受性【4 习。然而c b f s 的组成型过量表达使植株即 使在正常的生长条件下也会引起严熏的生长停滞和种子减产。与其相比，在当c b f s 在胁迫 诱导型基因r d 2 9 a 的启动子的调控下进行表达时就不会引起这么明显的生长阻滞，这些转基 因植株在正常生长条件下低水平表达l e a 蛋白，但当用低温、盐溃或干旱胁迫处理时，l e a 蛋白高水平表达阳。在c b f s 过量表达植株中，除了l e a 蛋白被诱导过量表达外，一些渗透 保护物质和抗氧化物质也会被诱导表达，基因组范围的表达分析表明，c b f s 的过量表达也 诱导产生了a p 2 ，e r e b p 蛋白和r 2 r 3 m y b 7 3 等转录因子，这些转录因子调控渗透保护物质合 成基因和抗氧化剂基因的表达【4 ”。 3 、i c e l 调控的低温胁迫信号转导途径【4 8 】 1 0 鲁 c 眠c b 丹 、 - - - 4c l l r ；l 累e - 挂n c 觎! ! 豳g 。 嗍嘲硼 r e g u l a t i o no fac o l d - s t r e s s - r e s p o n s i v el r a n s c r i p t o m ea n df r e e z i n gt o l e r a n c e i c e li sa 坐查塑蔓茎兰堡主兰垡堡苎 一 c o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e dm y c - l i k eb h l ht r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，w h i c hi si n a c t i v eu n d e r n o n - s t r e s s c o n d i t i o n s l o wt e m p e r a t u r es t r e s sp r e s u m a b l ya c t i v a t e si c e l , w h i