（分析化学专业论文）电泳中介微分析及其在生化分析中的应用.pdf

聊城大学硕士学位论文 摘要 i 乜泳巾介微分析技术( e m m a ) 是在毛细管电泳基础上发展起来的，基于各反应物、 产物在高压电场作用下迁移速率不同，在一根毛细管内完成试剂的混合和反应，随后产 物和反应物在毛细管内被分离为独立的区骷至检测器被检测。e m m a 既包含了毛细管 电泳( c e ) 高效分离的特性，也融合了流动注射分析( f i a ) 自动化的优点，它的出现 为分析化学的发展提供了新契机，也为微流控分析技术( p t a s ) 提供了种新思路。 e m m a 突出优点如下：第一，分析物和试剂的混合是在电场作用下的电泳混合。无额 外稀释和区带展宽效应；第二，混合、反应、分离甚至检测均集成于封闭的毛细管内， 不仅提高了分析效率，避免外界污染，而且可用于短寿命反应产物的检测以及快速反应 动力学的研究；第三，样品和试剂用量极少，可大大降低分析成本，特别适合于细胞间 _ 、 液、筚细胞等生化分析；第四，便于自动化、小型化，因此可基于此技术研制床旁 ( p o i n t o f - c a r e ) 医检仪器等 因电泳中介微分析具有上述优点，自从它诞生以来引起分析工作者的广泛关注，现 已用于酶( 包括酶基体、酶的激动剂和抑制剂等) 分析、柱内衍生、小分子测定等诸多 领域。术实验室利用e m m a 技术巾的区带一区带模式了测定了简单金属离予f e n 和 c u 2 + 以及两种酶，利用连续模式测定了食晶中的氨基酸的并研究了环糊精与药物的包合 作丌】等 本文主要做了以下五个工作： 1 、电泳巾介微分析法测定铁( i i ) 和铜( i i ) 利用l b 泳r 卜介微分析通过与邻菲罗啉的络合反应完成了对f e 2 + 和c u 2 + 的同时测定 在压茇作用下，淌度较小的邻菲罗啉在金属离子区带之前首先进样，加高电压后，两区 彳停电泳在磷酸缓冲液中( p h = 4 s ) 混合、反应形成络合物并实现电泳分离。研究了缓冲 液p i i 、试剂和样品区带长度对分离效果的影响。对于f 一+ 和c u 2 + 两离子，方法的检测 堕丝查堂! ! 主兰丝堡塞 限( s n = 3 ) 分别为1 6a n d1 1p l i i o i l ，线性范围分别为5 0 1 0 6 3 o x i o m o l l ( r = o 9 9 7 9 ) 和8 0 x 1 0 - 5 3 o x l 0 4m o l f l ( r ；o 9 9 9 6 ) 。采用标准矿样验证了测定f e 2 + 的可行 性。 2 、电泳q ，介微分析法测定超氧化物歧化酶 基于超氧化物歧化酶( s o d ) 对邻苯三酚自氧化的抑制作用和电泳中介微分析 ( e m m a ) 技术建立了一种测定s o d 的新方法。采用“三明治”式不同p h 缓冲液部 分填充法，一方面有利于邻苯三酚的自氧化反应，便于观察s o d 的抑制作用，另一方 面则有利于反应产物与反应物的分离对溶液填充模式、反应条件等实验参数进行了优 化结果表明在最优条件下，邻苯三酚自氧化反应的抑制率1 与s o d 浓度c 在1 0 0 x 1 0 1 6 0 0 1 0 2p g 几范围内呈良好的线性关系，回归方程为： 1 ( 产o 0 8 9 5 c ( p g l ) + 1 7 6 3 3t r = o 9 9 7 3 ) 。 3 、电泳巾介微分析技术对肤凝乳蛋白酶的研究 基于胰凝乳蛋白酶对h i - 苯甲酰一l 一酪氨酸乙酯( l - b t e e ) 的水解作用和电泳巾介 微分析( e m m a ) 技术建立了一种测定胰凝乳蛋白酶的新方法，采用区带一区带 ( p l u g - p l u g ) 模式，对酶的活性及米氏常数进行了测定，并考察了金属离予c ( 激活 剂) 和c u 2 + 、n i 2 + ( 抑制剂) 对酶活性的影响。催化前后产物吸光度丰日对标准偏差( r s d ) 分别为2 3 4 茅1 13 4 6 4 、毛细管电泳间接紫外检测酱油中的游离氨基酸 以三疑甲基氮基甲烷( t r i s ) ( p h = 1 0 5 0 ) 为缓冲液，苯甲酸为背景电解质，利用毛 细管电泳一间接紫外检测 方法分离测定了酱油中的丙氮酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 谷氨酸及天冬氨酸在优化条件下，上述六种氨基酸于5m i n 内实现了基线分离，各物 质吸光度的相对标准偏差( r s o ) 均小于5 。线性范围为l o 1 0 0 0i s m o l l ，检铡限 ( s f n = 3 ) 分另i j 为2 0 ，3 5 ，4 0 ，5 0 ，3 5 ，5 0p m o l l ，六种氨基酸的加标回收率均在 9 5 9 一1 0 4 2 范围内。 聊城大学硕士学位论文 5 、毛细管电泳法研究环糊精与芦丁和氯霉素的相互作用 基于毛细管电泳淌度移动法，同时测定了f ，一环糊糙与芦丁和氯霹素在硼酸缓冲液 ( p h 一8 6 ) 中的包台常数及包台反应的热力学参数。在优化后的测定条件下，2 5 c 时 测得芦丁和氯霉素与p c d 的包合常数分别为9 8 5 和1 2 0 4l t o o l ，结果与文献值相当。 两包合反应的焓熵互补现象明显，探讨了包合反应的机理，并采用m m 2 力场对b c d 与两种药物分子包合物的稳定构型进行了分子力学模拟，结果与实验相符。 关键词：毛细管电泳f b 泳中介微分析。金属离子，超氧化物歧化酶，胰凝乳蛋白酶， 氮基酸，b 一环糊精，芦丁。氯霉素，包含常数。热力学参数。 聊城大学硕士学位论文 a b s t r a c t e l e c t r o p h o r e s i sn l e d i a t e dn l i c r o a n a l y s i s ( e m m a ) i sat e c h n o l o g yd e v e l o p e df r o l i t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s u p o na p p l i c a t i o n o fa l le l e c t r i cf i e l da c l o s st i l e c a p i l l a r y ， d i f f e r e u tc o u l p o n e l l t ss u c l la sr e a g e f s ，a n a l y t e sw i t h i ut i l es a m l ) l ei n i g r a t ea td i s t i n c t r a t e st o w a r d st h eo p p o s i t e l yc h a r g e de n do ft h ec a p i l l a r yd e p e n d i n go nt h e i rr e s p e c t i v e e l e e t r o p h o r e t i cm o b i l i t i e s i nt h ee l e c t r o p h o r e t i cm e d i u m b a s e do nt h e i rd i f f e r e n t e l e c t t o p h o r e t i cm o b i l i t i e s ，b o t hm i x i u ga n dr e a c t i n gw i l lb ec o m p l e t e dw i t h i nas i n g l e c a p i l l a r y t h e n ，t h ep r o d u c t sa n dr e a g e n t sa r es e p a r a t e di n t o d i s t i n c tz o u e sa st h e y i l r o c e e da l o n gt i l ec a p i l l a r y a ts o m ep o s i t i o na l o n gt h ec a p i l l a r y , a l lt h ez o n e sa r e d e t e c t e d e m m ah a s a d v a n t a g e s o f h i g he f f i c i e n c y o ft r a d i t i o n a l c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) a n da u t o m i z a t i o no ff l o wi n j e c t i o na u a l y s i s ( f l a ) s o ，i t se m e r g e n c e o f f e r sa l lo p p o r t u n i t yf o rt h ed e v e l o p m e n to fa u a l y t i c a lc h e m i s t r ya n dp r e s e n t san e w i d e af o rm i c r ot o t a la n a l y s i s ( p - t a s ) i t s s p e c i a la d v a n t a g e sa r ea sf o l l o w s f i r s t ， e l e c t r o l l h o r e t i cm i x i n go fa n a l y t e sa n dr e a g e u t si si l e r f o r l n e dw i t h o u ta d d i t i o n a | d i l u t i o n a u dd i f f u s i o no ft i l ec h e l u i c a ls p e c i e sc o n t a i n e dw i t h i nt h e s ez o n e s s e c o n d ，c o n l p o u e n t s i n a yb em i x e d ，r e a c t e d ，s e p a r a t e da n dd e t e c t e dw i t h i nas i u g l ec a p i l l a r y t h i sn o to n l y i m p r o v e st h ea u a l y t i c a le f f i c i e u c ya n da v o i d sp o s s i b l ep o l l u t i o n ，b u ta l s oc a l lb eu s e di n t h ed e t e c t i o no fs h o r t - l i f ep r o d u c t sa n dt os t u d yh i g h r a t er e a c t i o nk i n e t i c s t h i r d ，i tn s e s o n l yav e r ys m a l lv o l u u l eo fs a m p l e sa n das m a l lq u a n t i t yo fr e a g e u tt h a tc a l ll _ e d u c et i l e c o s ti na n a l y t i c a lp 1 4 a c t i c e ，i ti ss u i t a b l ef o rb i o a n a l y s i si nc e l l u l a rf l u i da n ds i n g l e c e l l e s p e c i a l l y f o r t h ，i tc a l lb ea u t o m a t i z e da n dm i n i a t u r i z e d b a s e do nt h o s e ，p o i n t - o f - c a r e d i a g n o s t i ci l l s t r u l n e n t sc a l lb ed e v e l o p e d e m m ah a ss ou l a n ya d v a n t a g e st h a ti th a sb e e n p a i dm u c ha t t e n t i o nb ym a u y a n a l y s t ss i n c ei t si n c e p t i o n n o wi th a s b e e nu s e di nav a r i e t yo ff i e l d ss u c ha se n z y m e a c t i v i t ya s s a y , d e t e r l n i u a t i o no fe n z y m ep r o m o t e r sa n di n h i b i t e r s ，i n c o l u m ud e r i v a t i o n s 5 壁! 堕查兰堡主兰焦堡窒 一一 a n ds e p a r a t i o no fs m a l lm o l e c u l e s t i l ed e t e r m i n a t i o no fm e t a li o n sa n dt w oe n z y m e sb y i i ，ep l u g p l u gf o r m a to fe m m aw e r ep e r f o r m e d ，w h i l es e v e r a li m p o r t a n ta u l i n oa c i d si n f o o da n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np c y c l o d e x t r i na n dt w ok i n d so fm e d i c i n e sw e l es t u d i e d u s i n gc o n t i n u o u sf o l n l a to fe m m a w 1 h ep r e s e n td i s s e r t a t i o nc o n s i s t so ff i v ep a l t sa sf o l l o w s ： 1 d e t e r n d n a t i u no fh e a v ym e t a li o n sb ye l e c t r o p h o r e t i c a l l ym e d i a t e dm i c r o a n a l y s i s s i m u i t a n e o u sd o t e r m i n a t l o n 3o ft w ot r a n s i t i o n m e t a l i o n s 【f e 2 + ，c 0 + )a f t e r c o n l p l e x a t i o uw i t h0 - p h e n a n t h r o l i n e ( p h e u ) w e r ei n v e s t i g a t e db ye i e c t r o p i l o r e t i c a l l y m e d i a t e dn l i e r o a n a l y s i s ( e m m a ) t i l es l o w e ro - p h e n a n t h r o l i n ez o n ew a si n j e c t e d s p a t i a l l yb e f o r eaf a s t e ra n a l y t ez o n ec o n t a i n i n gf e 2 + a n dc u ”i naf u s e d - s i l i c ac a p i l l a r y u n d e r p r e s s u r e u p o na p p l i c a t i o n o ft h e h i g hv o l t a g e , t h ea n a l y t e z o n ew a s e l e e t r o p h o r e t i c a l l ym i x e dw i t ht h er e a g e n tz o n e ，a n dt h e nt h ec o m p l e x e sw e r ef o r m e d a n ds e p a r a t e di nap h o s p h a t eb u f f e r ( p u = 4 t h es e p a r a t i o nb e h a v i o rw a si n v e s t i g a t e d w i t hr e s p e c tt od e p e n d e u c e0 1 1t i l eb u f f e rp h ，a t t a l y t ea n d1 e a g e n tz o n el e n g t h i nt h i s m e t h o d ，t l i el i n e a rc a l i b r a t i o nr a n g e sw e r e5 - 3 0 0 ( r = 0 9 9 7 9 ) a u d8 0 3 0 0p m o l l ( r = 0 9 9 9 6 ) w i t hd e t e c t i o nl i m i t so f1 6a n d1 1p h i a l 几f o rf e 2 + a n dc u 2 + ，r e s p e c t i v e l y t h em e t h o d w a sa l s ov a l i d a t e db ya n a l y s i so ft h es t a n d a r dr e f e r e n c em i n e r a ls a m p l e s 2 e i e c t r o p i l o r e i i c a i i ym e d i a t e dm i c r o a n a l y s i so fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e t h es u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o o ) a c t i v i t yw a ss t u d i e dt h r o u g hi t si n h i b i t i o n o f p y r o g a l l o la u t o x i d a t i o nw i t he i e c t r o p h o r e t i c a l i ym e d i a t e dm i c r o a n a l y s i s ( e m m a ) a n i n j e c t i o nn m d e lo fs a n d w i c hw a su s e d i nt h ep r e s e n ts t u d y , ap a r to ft h ec a p i l l a r yw a g , f i l l e dw i t ht h eb u f f e rb e s tf o rt h ea u t o x i d a t l o ua n di n h i b i t i o n ，t h er e s to ft h ec a p i l l a r yw a s f i l l e dw i t ht h eb u f f e rb e s tf o rt i l es e p a r a t i o no fs u b s t r a t ea n dp r o d u c t t h er e a c t i o n c o n d i t i o n sa n dm o d e lo ff i l l i n gc a p i l l a r yw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d u n d e rt i l eo p t i m u m 堕塾查兰翌主堂焦堡塞 一 c o n d i t t o n s t h el i n e a rc a l i b r a t i o nr a n g ew a sl , o o x l 0 2 6 o o x l 0 2i i g ，l a n dt h el i n e a r r e g r e s s i o nw a s1 ( ) t o 0 8 9 5 c ( p g l ) + 1 7 6 3 3 ( r = 0 9 9 7 3 ) 3 e i e c t r o p h o r e t i c a l l ym e d i a t e dm i c r o a n a l y s i so fc h y m o t r p s i n c h y m o t r y p s i nc o u l dc a t a l y z et h eh y d t o l y z a t i o no fn - b e o z o y l l t y r o s i n ee t h y le s t e r l - b t e e ) u n d e rac e r t a i nc o n d i t i o n s b a s e do nt h i s ，t a c t i v i t yo fc h y m o t r y p s i na n d m i c h a e l i sc o n s t a n tw e r es u c c e s s f u l l yd e t e r m i n e du s i n ge m m at e c h n i q u ew i t hp l u g - p l u g f o r m a t t h ee f f e c t so fm e t a li o n s ，c a ”( p r o m o t e r ) ，c u 2 + a n dn i 2 + ( i n h i b i t e r s ) o nt h e h y d r o l y z a t i o n o fl - b t e ew e r ea l s os t u d i e di nt h i sw o r k t h er e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o n s ( r s d ) b e f o r ea n da f t e r c a t a l y s i sw e r e2 3 4 a n d3 4 6 ，r e s p e c t i v e l y 4 d e t e r m i n a t i o no fa m i n oa c i d si ns a u c eb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t hi n d i r e c t u l t r a v i o l e td e t e c t i o n b yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t hu l t r a v i o l e td e t e c t i o n ，s i xa m i n oa c i d so fa l a n i n e ， s e r i n e ，v a l i n e ，l e u c i n e ，g l u t a m i ca c i da n da s p a r t i ca c i dw e r ed e t e c t e di n1 r i s ( p h = 1 0 5 0 ) w h e r eb e n z o i ca c i dw a si t ss e t t i n ge l e c t r o l y t e u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e s es i x a m i n oa c i d sw e r ew e l ls e p a r a t e dw i t h i n5m i n u t e s t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) o ft h em e t h o dw a sb e t t e rt h a ns t h el i n e a rc a l i b r a t i o nr a n g ew a s1 1 ) - 1 0 0 0p m o l la n d t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s2 0 ，3 5 ，4 0 ，5 0 ，3 5a n ds op m o l 几r e s p e c t i v e l y t h e i rr e c o v e r i e s w e r ea l li nt h e r a n g e0 f9 5 7 3 1 0 4 4 6 5 u s eo fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i st os t u d yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np c y c l o d e x t r i na n d t w om e d i c i n e so fr u t i na n dc i l i o r a m p h e l i i c o i i n c l u s i o nc o n s t a n t so fr u t i na n dc h l o r a m p h e n i c 0 1w i t hp - c y c l o d e x t r i ni nb o r i ca c i d b u f f e r ( p i l 8 6 ) w e r ed e t e r m i n e ds i m u l t a n e o u s l yu s i n ge l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f t m e t h o d a l o n gw i t ht h e i rt h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r si n v o l v e di nt h ei n c l u s i o nr e a c t i o n s 。 u n d e ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s 。t i l ei n c l u s i o nc o n s t a n t sw e r e9 8 5a n d1 2 0 4l ，m o lf o rr u t i n 7 聊城大学硕士学位论文 a n dc h l o r a m p b e n i c o la t2 5 c ，r e s p e c t i v e l y , w h i c hw e l - ew e l lc o m p a r a b l ew i t ht h o s e r e p o r t e di nt h el i t e r a t u r e s ar e l a t i o n s h i po fm u t u a lc o m p e n s a t i o nb e t w e e ne n t h a l p ya n d e n t r o p ye x i s t e di nt h e s ei n c l u s i o nr e a c t i o n s t h e i ri n t e r a c t i o nm a c h i n ew a sa l s od i s c u s s e d t h es t a b l ec o n f i g u r a t i o n so ft h ei n c l u s i o n sw e r ec a l c u l a t e du s i n gm m 2 f o r c ef i e l d ，w h i c h w e r ew e l li na g r e e m e n tw i t he x p e r i m e n t a lr e s u l t s k e yw o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，e l e c t r o p h o r e t i c a l l ym e d i a t e dm i c r o a n a l y s i s ， m e t a l i o n s ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，c h y m o t r y p s i n ，a m i n oa c i d ， p - c y c l o d e x t r i n ， r u t i n ， c h i o r a m p h e n i c o i ， i n c l u s i o n c o n s t a n t s ， t h e r m o o y n a m i cc o n s t a n t s 8 聊城大学硕士学位论文 前言 毛细管电泳( c e ) 是继高效液相色谱之后的又一新型液相分离分析技术，它使分析 科学得以从微升进入纳升水平，并使单细胞分析乃至单分子分析成为可能。c e 具有高 效、快速、分离模式多、运行成本低等突出优点，在各个分析领域，特剐是生命科学研 究领域中的应用日趋广泛。但c e 致力于样品组分的高效分离和灵敏检测，分离管道内 不涉及化学反应。而诞生于七十年代中期的流动注射分析( f 认) 可在非平衡条件下， 高度重现地连续注入样品、反应和检测，并可以作为一种自动化、简便易操作的进样和 分离寓集技术，与多种化学分析手段蹶用。目前为止，流动注射分析方法的应用已渗透 到分析化学的各个领域，从而促进了分析的自动化。使得分析速度大大提高，但f i a 不 涉及样品组分的分离，使得应用范围受到了限制。电泳中介微分析( e m m a ) 是九十年 代初期在f i a 和c e 基础上诞生的项新的分析技术，它融合了c e 和f i a 两种技术的 优点，大大促进了分析科学的发展，同时对研究热点一微分析系统( p - t a s ) 的研究提供 了种思路。 电泳中介微分析是近年来迅速发展的测定技术，受本人学识和水平的限制望各位 老师和专家对不足之处提出批评指正。 杨冬芝 2 0 0 5 年4 月 聊城大学硕士学位论文 l 绪论 1 1 毛细管电泳发展简介 i 1 i 毛细管电泳发展概况 毛细管电泳( c e ) 是近年发展最快的分析化学研究领域之一。1 9 6 7 年h j e r t e n 首先报 道了开管毛细管电泳1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 等在7 5 p m 内径的毛细管内用高压进行分离， 创建了现代毛细管电泳i i 1 9 8 8 1 9 8 9 年出现了第一批c e 商品仪器。1 9 8 9 年第一届国 际毛细管电泳会议召开，标志着- - f l 新的分支学科的产生。短短的几十年内。c e 符合 了以生物工程为代表的生命科学各领域中对生物大分子( 肽、蛋白质、d n a ) 的高效分离 分析的要求。因而得到了迅速发展，c e 正逐步成为生命科学各领域及其它学科实验室 中一种常用的分析手段最近几年，以毛细管电泳为核心技术，以芯片为平台的锻全微 分系统( 珥一t a 。s ，又称芯片实验室) 迅速崛起i l ，它将成为现代技术韵主流并可能引 起分析化学的一场革命。 目前毛细管电泳已经有多种分离模式可供选择，如最基本的毛细管区带电泳 ( c z e ) 、能够分离中性物质的毛细管胶束电动色谱( m e k c ) 1 4 1 、利用凝胶作支持物的毛 细管凝胶电泳( c g e ) 1 5 i 、将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内的毛纲管等电聚焦( c i e f ) ”i 、比较老的毛细管等速电泳( c i t p ) 闱以及将h p l c 高选择性和c e 高效分离性相结 合的毛细管电色谱( c e c ) 1 9 l 等。另外。作为c e 核心部件一毛细管的研究也非常广泛， 早期的研究主要集中于改进毛细管材料以及长度、形状等，目前集中在管壁改性和涂层 上。如动态修饰、表面涂层、使用凝胶柱和填充柱等。c e 对检测器灵敏度的要求相当 高，故检测是c e 中的关键问题。迄今为止除了原子吸收与红外光谱外，其它检测手段 如紫外榆溺器( u v ) 、激光诱导荧光检测( l i f ) 、质谱检测器( m s ) 、电化学检测器( e c ) 、 化学发光检测器( c l ) 等均已用于c e 。 总之，发展新型检测器，提高u v 等检测器灵敏度，以及发展c e 和其它分离以及 检测方法的联用技术是c e 研究的重点之一。 1 1 - 2 毛细管电泳的应用和一些发展趋向 毛细管电泳的应用十分广泛，分离对象从无机离子到有机离子，有机分子及生物大 聊城大学硕士学位论文 分予可以说儿乎所有物质通过适当的方式都可以基于f 乜场力的作用，在毛鲺i i 管中进行分 离。应婀领域包括医药卫生、农林牧渔、轻工食品、化工环境、生命科学等诸多领域。 它的些重要应用包括以f ：d n a 、肽和蛋白质的分析i 、手性分离i “i 、药物分析和临 床检测i 2 i 、环境l t f i 测和离予分析i ”i 、单细胞、单分子检测、毛细管电泳芯片( c l i i p ) i i 等。 2 l1 l j = 纪是! 警命科学人发展的 琏纪，完成入类基因缀计蚴后，届基因时代的基圜纽学 和蛋白组学将迅速发展，功能基因的分离、检测，功能蛋白的分离测定对c e 提出了更 商的罂求，c e 发展的热门方向之一的c h i p 是将一个实验室的工作集成到一块很小的芯 片上。实现了仪器的微型化，目前已经用c h i p 在实验室完成诸多分子的检测和分析i i s 2 4 1 ， 针对芯片系统赡以进行样品自动更新和自动前处理的微观尺寸的芯片结构和宏观羹的 试样高效衔接方面的困难，也提出多利，微流控；岱片结构1 2 9 2 6 l 。可以预见，不久就会出现 各种专用的基因检测疾病诊断的小型c h i p 和仪器；另一方面，9 6 支或更多毛细管的毛 缨管阵列电泳仪，将会舁_ | 予药厂中产龋质量的检测及大量医学临床检验。同时，将会研 $ 1 1 1 1 1 适合c e 的各利检测器，以进行单细胞和单分子的检测。单细胞检测为在分子水平 上了解细胞的各种行为提供了强有力的工具，而单分子检测1 2 7 - 2 s o 为在单个分予水平j ：，i ： 展化学动力学、反应动力学等研究提供了可能性；此外，c e 在环境科学中吐玉会有较大 的发展余地。c e 是正在发展的研究领域，有许多理论问题及实际问题有待解决，更需 翌其它领域的研究人员来扩大其应用范围c e 的成长为生命科学、材料科学、环境科 学提供了又强有力的研究手段。c e 将在不断解决难题中得到发展。 4 聊城大学硕士学位论文 1 2 电泳巾介微分析及应用研究进展 电泳中介微分析( e m m a ) 技术是以柱内反应为基础，以毛细管作为中介，利用 毛细管i 乜泳系统进行分离分析的一项新技术。1 9 9 2 年b a o j 与r e g n i e rf e 首次利用电 泳巾介微分析技术对葡殉糖6 磷酸脱氢酶进行了分析1 2 纠。自此电泳中介微分析凭借其 所需样羹少、反应时问短、分离效率高、集化学反应与分离分析于一身等优点吸引了众 多研究者的关注1 3 0 - a 1 2 1 基本原理 电泳f i 介微分析( e m m a ) 是两利一或两种以上的物质在毛细管内进行反应，然后在 商琢l 乜场作用下分离产物、剐产物及末完全反应物等的过程。因此，它大致可分为四个 阶段： ( 1 ) 被分析物和分析试剂进样；( 2 ) 混合及反应开始； ( 3 ) 控制反应条件和产物的形成；( 4 ) 剽余反应物或产物的检测。 被分析物以a 来表示，分析试剂用r 来表示，两者反应生成可检测的同标产物p ， 因此柱内不可逆反应可表示为：a a + r p p 给定电场下各种物质的迁移速度有所不同，我们假定在所选电场下v p v a v r ， 以区带模式进样为例，该模式原理示意如图1 - 1 。 图1 - 1 区带一区带模式e m m a 原理图 f i g a 1t h es c h e m a t i cd i a g r a mo f 洳g - 一蠼m 瞄d # fe m m a a 被分析物( a b s t r c t ) 。r 分析试荆( r e a g e n t ) p 产物【p r o d u c t ) 迁移速度( v e l o c i t i e s ) ：v p v ) v r 一 口蟹圈 聊城大学硕士学位论文 由上图可知电迁移速率小者先于电迁移速率大者进样，因而在同样时间内。迁移 速率大者所走过的距离要较长一些，从而使两区带混合，渗透，在适宜条件下发生反应。 经毛细管l 乜泳分离产物，剩余反应物等，最后砭检测器榆测。根据所检测到的信号，可 以对物质进行定性或定最分析。 t , 2 2 数学描述 1 2 2 ie m m a 的进样、混合模式 在e m m a 中，分析物和分析试剂的进样一般采h 传统的c e 进样方式如压差进样 1 3 3 1 ，| u 动进样1 3 4 l 等。 对于压差进样，其进样长度w r 可由下式得出： 坼：竺生( 1 t ) 3 2 l l l 、7 其q 1 i 为毛细管两端压力差，d 、l 分另i j 为毛细管内径与长度，n 为溶液料i 度，t ， 为进样时间。对于电动进样，进样长度为： w f = ( 1 a , p + l u 。) e t p ( i 一2 ) j e i | ，队、分别为电泳淌皮和电渗淌度，e 为电场强度。进样量的多少依赖于分 析灵敏度及毛细管电泳系统的物理性质等，一骰进样量范围为o 1 2 0n l 。 具体到e m m a ，它有如下几种不同模式： 第一，“区带一区带”模式( p l u g p l u gf o r m a t ) 3 5 - 4 0 * 在该模式巾分析物和分析试剂作为两个独立区带顺序进样，其中淌度小者先进样， 在电场作用下甄区带在某一时刻混合或称合并。这种模式的优点是样品和试剂用量极 少，且产物也更易与反应物分离，但由于反应时问短，产物生成少。因而灵敏度较低。 根据分析的需要区带之间可以留有距离，也可连续。如果区带中几种被分析物与分析试 剂反应后不易分离或被分析物质不纯而影响反应的进行。则可以采用两区带隔开一段距 离进样，保证在两区带混合前几种成分达到分离。产物区带长度l 。为： 。甏螂堋一彬 ( 1 - 3 ) 聊城大学硕士学位论文 其中w f 、w s 分冕l j 为分析物和分析试剂快慢两区带的宽度，“为快慢豫区带的 淌度楚， i f 。为速度较快区带与产物区带的淌度差。 第一，连续模式( c o n t i n u o u sf o r m a t ) l j 5 “删。 在该模式q ，一般先使试剂充满毛细管及缓冲液池，被分析物区带再被注入毛细管 内在电场作用下，被分析物和试剂连续发生反应，这种反应模式灵敏度远高于“区带 一区带”模式；而且停流孵育( i n c u b a t i o n ) 的 刻选择也不像“区带一区带”模式那 样严格。有时对反应介质和分离介质的需求发生矛盾时可以采用反应介质半填充毛细管 ( p a r t i a l l y f i l l e dc a p i l l a r y ) 模式。产物区带长度k 为： l ，2 而l f , p i ，( l - 哆) l - 4 ) 其中m 、| l 。速度较快区带和电渗流淌度，l 为毛细管长度。 第三，移动边界模式( m o v i n gb o u n d a r yf o r m a t ) 1 4 6 1 。 在该模式中淌度较小的物质( 试剂或待分析物) 首先充满毛细管，而淌度较大的 物质装入r l 极端的缓冲液池，在电场作用下，两物质相互渗透并发生反应。该模式的浓 度检测灵敏度与“区带一区带”模式相比提高一个数量级，但试剂或待分析物消耗相对 较大产物区带长度l 。为： l ，：掣尝( t - s ) i ，：= - - - - - - - - - - - - - 二- - - - - - 一 9 r h f + u 。，r u 。+ i - t 。j 其中山、i l 。分别为速度较慢区带和产物区带的淌度。由式( 1 - s ) 可知，移动边界 模式e m m a 的产物区带长度l 。与进样时间没有关系，因而无需内标即可准确定量。 第四，流动闸式进样( f l o w - g a t e ds a m p l i n g ) 模式。 这种模式大多用于微芯片毛细管电泳中1 4 7 l 。试剂和待分析物分别装入各自的缓冲池 f 1 ，在电场作用下在交叉口处混合，瞬间切换电压，将少量试剂和待分析物的混合物引 入电泳分离通道，完成反应、分离和检测过程。 1 2 2 2 混合及反