（内科学专业论文）不同剂量阿托伐他汀对脂多糖致大鼠急性肺损伤的影响.pdf

_ 愀愀 不同剂量阿托伐他汀对脂多糖所致大鼠急性肺损伤的影响 摘要 目的：观察不同剂量阿托伐他汀钙对脂多糖( l p s ) 所致的急7 性肺损伤大鼠外周血中性粒细胞凋亡和肺组织细胞间粘附分子1 ( i c a m 1 ) 、血管细胞粘附分子1 ( v c a m 1 ) 及支气管肺泡灌洗液 中白介素8 ( i l 8 ) 表达的影响及其相关性；探讨阿托伐他汀钙在脂 多糖所致大鼠急性肺损伤中的作用及可能机制。方法：通过s d 大鼠 尾静脉注射l p s 建立急性肺损伤模型。9 0 只雄性s d 大鼠随机分为 模型组( 18 只，简称l 组) 、空白对照组( 1 8 只，简称n 组，) 、干 预组( 即不同剂量阿托伐他汀组，简称t 组) 分3 个亚组：阿托伐 他汀5 m g k g 组( 简称t l 组，1 8 只) 、阿托伐他汀1 0 m g k g 组( 简称 t 2 组，18 只) 、阿托伐他汀2 0 m g k g 组( 简称t 3 组，1 8 只) 】，模型 组和干预组尾静脉注射l p s ( 6 m g k g ) 复制大鼠急性肺损伤模型，对照 组尾静脉注射生理盐水，各组又在注射脂多糖2 小时、4 小时和8 小 时后分别处死6 只大鼠。取大鼠右肺下叶h e 染色观察病理改变，并 根据病理学改变进行相应评分；采用原位缺口末端标记技术 ( t u n e l ) 法检测外周血中性粒细胞凋亡率；并使用实时荧光定量 p c r 即( r e a l t i m er t - p c r ) 法检测左肺组织匀浆中细胞间粘附分子 1 ( i c a m 1 ) m r n a 和血管细胞粘附分子1 ( v c a m 1 ) m r n a 的 表达及双抗体夹心酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) 测定支气管肺泡灌 洗液中i l 8 的表达水平。结果：1 2 0 0 倍光镜下大鼠右肺组织h e 染 色病理结果显示n 组大鼠肺组织的小叶结构清晰，肺泡腔干净，肺 泡间质无炎性细胞浸润，支气管黏膜上皮完整，l 组、t 组肺内大量 炎性细胞浸润，伴出血、透明膜形成，提示肺损伤模型成功。肺损伤 的五级分类依据肺泡和间质炎症及出血、肺水肿、肺不张和透明膜形 成；各组间病理改变严重程度依次为l t 1 t 2 t 3 n ，且两两比较 有统计学意义( p o 0 5 ) 。2 大鼠外周血中性粒细胞凋亡率n 组最高， t 组和l 组都低于n 组，有显著性差异( 尸 o 0 5 ) ，t 组表达高于l 组， 有显著性差异( 尸 o 0 5 ) ，t 组各亚组之间表达：t 1 t 2 t 3 ，各组之 间有显著性差异( 尸 t 3 ，各组之间有 显著性差异( 尸 t 3 ，各组之间 有显著性差异( 尸 o 0 5 ) 。时间表达趋势为4 小时最高，2 小时最低。 5 根据统计学同质性原则，用s p s s 软件对t 组和l 组外周血中性 粒细胞凋亡数据和肺组织i c a m 1 、v c a m 1 m r n a 表达数据及支气 管肺泡灌洗液i l 8 表达数据分别进行直线相关分析，提示它们呈负 相关( f 0 4 8 3 ，p 0 0 5 ；r = - 0 6 3 3 ，p t 2 t 3 n ( p 0 0 5 ) 2 n e u t r o p h i la p o p t o s i so f r a t e si ng r o u pta n dg r o u pla r el o w e rt h a nt h e g r o u pn ，t h e r ew a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) ，g r o u pt w a sh i g h e r t h a ng r o u pl ，t h e r ew a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e 职0 0 5 ) ，t h es u b g r o u p so f 5 g r o u pte x p r e s s e d ：ti t 2 t 3 ，g r o u pt 1a n dg r o u pt 3a r es i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p 0 0 5 ) e x p r e s s i o ni nt h et i m et r e n dw a st h a tt h el o w e s t p o i n tw a s4h o u r sa n dt h eh i g h e s tp o i n tw a s 2h o u r s 3 t h ee x p r e s s i o nb e t w e e nt h ei c a m 一1a n dv c a m - 1w a st h es a m e t r e n d g r o u pt a n dg r o u plw e r eh i g h e rt h a nt h eg r o u pn ，t h e r ew a s s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p t 3 ，g r o u pt 1a n dg r o u pt 3a r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t ( p 0 0 5 ) e x p r e s s i o ni nt h et i m et r e n dw a s t h a tt h el o w e s tp o i n tw a s4h o u r sa n dt h e h i g h e s tp o i n tw a s2h o u r s ，w h i c hg r a d u a l l yi n c r e a s e d 4 t h ee x p r e s s i o no fi l 一8i nb r o n c h o a l v e o l a rl a v a g ef l u i d ( b a l f ) w a s c o n t r a s tw i t ht h ea p o p t o s i so fn e u t r o p h i l s ，g r o u pta n dg r o u plw e r e h i g h e rt h a nt h ee x p r e s s i o no fg r o u pn ，t h e r ew a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p t 3 ， g r o u pt 1a n dg r o u pt 3a r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t ( p 0 0 5 ) e x p r e s s i o ni nt h e t i m et r e n dw a st h a tt h el o w e s tp o i n tw a s2h o u r sa n dt h eh i g h e s tp o i n t w a s4h o u r s 5 t h ed a t ao fn e u t r o p h i la p o p t o s i sa n dl u n gi c a m - 1 ，v c a m - lm r n a 6 e x p r e s s i o nd a t aa n db r o n c h o a l v e o l a rl a v a g ef l u i di l - 8e x p r e s s i o nw a s a n a l y s e db yl i n e a rc o r r e l a t i o na n a l y s i sw i t hs p s ss o f t w a r e ，s u g g e s t i n g t h a tt h e yw e r en e g a t i v e l yc o r r e l a t e d ( f - 0 4 8 3 ，p 0 0 5 ；1 - = 一0 6 3 3 ，p 0 0 5 ； 产r - = 一0 7 6 5 ，p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ：g i v e na t o r v a s t a t i nc a l c i u me a r l yc a nr e d u c el u n gi n j u r y , a n d i t se f f e c tc h a r a c t e r i z e sc o n c e n t r a t i o nd e p e n d e n tm a n n e r t h em e c h a n i s m m a y b ea t o r v a s t a t i nc a l c i u mt a b l e t sa f f e c t e dt h ee x p r e s s i o no fa t o r v a s t a t i n ； c e l la d h e s i o nm o l e c u l e ( i c a m - 1 ) 、 v a s c u l a rc e l la d h e s i o nm o l e c u l e ( v c a m 一1 ) a n di n t e r l e u k i n 一8 ( i l - 8 ) ，p r o m o t e dn e u t r o p h i l sa p o p t o s i s k e yw o r d s ：a c u t el u n gi n j u r y ；n e u t r o p h i la p o p t o s i s ；a t o r v a s t a t i n ；c e l l a d h e s i o nm o l e c u l e ( i c a m - 1 ) ；v a s c u l a rc e l l a d h e s i o nm o l e c u l e ( v c a m 1 ) ；i n t e r l e u k i n 一8 ( i l - 8 ) ； 7 前言 急性肺损伤( a c u t el u n gi n j u r y , a l l ) 和急性呼吸窘迫综合征( a c u t e r e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e ，a r d s ) 是由多种除心源性以外的各种 肺内外致病因素导致的以血管通透性增加、透明膜形成为主要表现的 炎症综合征。是临床常见的危急重症，其发病机制复杂，死亡率非常 高，达5 0 7 0 【1 】【2 】 3 1 ，严重威胁患者的生命并影响其生存质量。目 前对a l i a r d s 的治疗包括治疗原发病、呼吸支持、糖皮质激素等相 关药物治疗，但尚无一种特殊有效的治疗手段，因此寻找新的治疗策 略已迫在眉睫。 尽管目前发病机制尚未完全阐明，但多数研究表明，损伤过程中 中性粒细胞激活与凋亡抑制，氧化应激反应，炎性反应，内皮功能破 坏，凝血纤溶系统的改变等参与a l i 发生发展。炎性反应与抗炎反应 之间平衡与失衡在发病过程起重要作用【4 】。其中中性粒细胞( p m n ) 在肺内过度聚集激活、凋亡抑制而持续活化在a l i 的发生发展中起关 键作用。研究表明5 1 1 6 7 】【8 a l i a r d s 时在粘附分子( 如i c a m 1 、 v c a m 1 等) 和炎性因子( 如i l 8 、i l 6 等) 介导下p m n 在肺毛细血 管内大量黏附、聚集，移至肺泡腔，持续活化，凋亡延迟。一方面通 过释放蛋白酶、活性氧、脂类代谢产物等炎症介质直接损伤肺组织； 另一方面通过激活核因子一kb ( n u c l e a r f a c t o r k a p p ab ，n f kb ) 诱导 白介素8 ( i l 8 ) 、肿瘤坏死因子q ( n 盯q ) 等促炎症细胞因子 和细胞间黏附分子i ( i c a m 1 ) 、血管细胞黏附分子1 ( v c a m 1 ) 等 黏附分子释放，炎性因子可进一步吸引、激活p m n ，延长p m n 的生 存期，加重炎症反应，引起瀑布效应。通过快速凋亡机制清除炎症局 部的p m n 是限制肺损伤、促进炎症消散的主要机制。研究表明【9 1 ，a l i 时渗出到肺组织的p m n 存在凋亡延迟，p m n 凋亡延迟、存活时间延 长、持续释放毒性内容物造成肺组织的损伤。如能有效拮抗p m n 聚 集活化、增加其凋亡及阻断炎症级联放大效应，从而有可能改善a l i 的预后。 他汀类药物是3 羟3 甲基戊二酰辅酶a ( h m g c o a ) 还原酶抑制 剂，其除了其明确的降低胆固醇的作用外，还发挥着许多非调脂作用， 包括抗炎、抑制炎症介质的释放、改善血管内皮功能、抗氧化、抑制 血小板聚集、抗凝、稳定动脉粥样硬化斑块、抑制系膜细胞增生和免 疫调节反应等1 0 】。他汀类药物抗炎的机制与减轻白细胞( 主要是 p m n ) 向炎症区侵润、聚集活化以及促进p m n 凋亡有关；其次是可 以调节炎性核因子kb ，从而下调炎症因子的释放，减轻局部炎症【1 1 】。 研究证实他汀类药物可上调p m n 凋亡从而使p m n 在炎症部位存活 时间缩短，减轻p m n 性肺泡炎。推测其可通过抗炎、抑制粘附分子 表达等干预或者治疗急性肺损伤。 目前对他汀类药物的研究主要集中在心血管系统，在呼吸系统疾 病中他汀类药物在慢性阻塞性肺疾病中有报道，在急性肺损伤的研究 较少。故本实验中，我们观察提前给予不同剂量阿托伐他汀钙对脂多 糖所致大鼠急性肺损伤大鼠的病理改变；外周血中性粒细胞凋亡的变 化以及肺组织i c 蝴1 m r n a 、v c a m 1 m r n a 和肺泡灌洗液i l 8 表 达及相关性；从而探讨阿托伐他汀钙在l p s 所致大鼠急性肺损伤中 的可能作用和地位。 材料与方法 l 实验材料与仪器 1 1 实验动物 清洁型s p r a g u e d a w l e y 大鼠( 体重1 9 0 2 5 0 9 ) ，泸州医学院动物 中心提供。所有的操作和实验流程均遵守实验动物管理条例。动 物在实验前均自由进食和进水。 1 2 主要实验试剂 脂多糖( 大肠杆菌0 1 2 7 ：b 8 e ，美国s i g m a 公司产品) 、阿托 伐他汀g a ( 美国辉瑞) 、大鼠白介素8 ( i l 8 ) e l i s a 试剂盒9 6 孔、 大鼠中性粒细胞分离液、大鼠淋巴细胞分离液、t a qd n a 聚合酶、 p c r 反应缓冲液( 1 0 x ) 、m g c l 2 溶液( 2 5 m m ) ：购自北京博大泰克 ( b i o d e v ) 生物基因技术有限责任公司；d n t p ：购自美国普洛麦格 ( p r o m e g a ) 公司；d n a 分子量标准( d n am a r k e r ：m a r k e ri ，显示 条带：1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 、6 0 0 b p ，购自北京t i a n g e n 公司； 琼脂糖( 电泳级) ：法国b i o w e s t 公司产品，上海y i t o 企业有限公 司分装；t u n e l 试剂盒( 罗氏) 含t d t1 0 x ( e n z y m es o l u t i o n ) 、荧光 素标记的d u t pl ( l a b e ls o l u t i o n ) x 、标记h r p 的荧光素抗体， ( c o n v e r t e r - p o d ) ；p b s 、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇( 1 0 0 、9 5 、9 0 、 8 0 、7 0 ) 、d a b 工作液、封闭液( 3 h 2 0 2i nm e t h a n 0 1 ) 、细胞通透 液( o 1 t r i t o nx - 1 0 0i no 1 s o d i u mc i t r a t e ，临用前配制) 、苏木素、 d n a s e1 ( 3 0 0 0u m 1 _ 3u m li n5 0m mt r i s h c l ，p h7 5 ，1 0m m m g c l 2 ，1m g m lb s a ) 等。 1 3 主要实验仪器 超低温高速离心机，水平摇床( 北京市六一仪器厂) ，分光光度计， 普通离心机( m i c r oc e n t a u r ) ，电子称，移液器：1 0 0 u 1 1 0 0 0 u l ，1 0 u l 一1 0 0 u l ， o 1 u 1 1 0 u 1 ( 大龙) ，p h 计，制冰机，细胞刮，酶标仪，9 6 孔板 f t c 2 0 0 0 实时荧光定量基因扩增仪，加拿大枫岭( f u n g l 、n ) 公司； m s em i c r o c e n t a u rc e n t r i f u g e 微型台式离心机，日本s a n y o 公司；水 平电泳仪，美国b i o r a d 公司；水平离心机l d 5 2 a ，北京医用离 心机厂g e ld o c1 0 0 0 凝胶成像系统，美国b i o r a d 公司；微量移液 器，法国g i l s o n 公司；m a x i m i x l i 试管震荡器，b a m s t e a d t h e r m o l y n e ( u s a ) 。光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒( 塑料饭盒与 纱布) 、塑料盖玻片、吸管、各种规格的加样器及枪头等。 2 实验方法 2 1 模型制备： 健康s d 雄性大鼠9 0 只，重量为1 9 0 2 5 0 克，随机分为空白对 照组( 1 8 只，简称n 组) 、模型组( 18 只，简称l 组) 、干预组( 分 3 个亚组：脂多糖加阿托伐他汀5 m g k g 组( 18 只，简称t 1 组) 、脂 多糖加阿托伐他汀1 0 m g k g 组( 1 8 只，简称t 2 组) 、脂多糖加阿托 伐他汀2 0 m g k g 组( 1 8 只，简称t 3 组) ) 。干预组各亚组分别于注射 脂多糖1 4 天前即开始每天胃管注入相应剂量阿托伐他汀g a ( 立普妥) 均稀释为l m l 混悬液，t 组和l 组灌入l m l 生理盐水，1 次天。t 组 和l 组按照尾静脉注射内毒素6 m g k g ( 稀释成0 5 m 1 ) 复制a l i 模型， 空白对照组尾静脉注射生理盐水0 5 m l 。各组又分为2 、4 和8 小时3 个时间点，每组分别于注射脂多糖2 、4 和8 小时处死6 只大鼠。 2 2 实验取材： 预定时间以异戊巴比妥钠麻醉大鼠，心脏采血，肝素抗凝，储存 于4 。c 冰箱备用。结扎右肺，行气管插管，用大鼠体重1 0 剂量的生 理盐水行支气管肺泡灌洗3 次，回收率达7 0 ，合并灌洗液，以2 0 0 0 g 离心1 0 分钟，留取上清液，储存于7 0 。c 冰箱备用。取大鼠右肺， 4 甲醛固定，石蜡包埋，切片，h e 染色，镜检。大鼠左肺置于e p 管放入液氮中备用。 2 3 标本检测： 2 3 1 病理学观察 对于取材的肺组织h e 染色后2 0 0 倍光镜下观察，对肺损伤的程度 采用s m i t h 评分方法对肺水肿、肺泡及间质炎症、肺泡及间质出血、 肺不张和透明膜形成分别进行0 4 分半定量分析8 】：无损伤0 分，病变 范围 2 5 为1 分，病变范围在2 5 5 0 为2 分，5 0 病变范围 7 5 为3 分，病变满视野为4 分，总分为上述各项之和。每只动物观察1 0 个高倍视野，取其平均值。由两位病理科医师分别单盲法评分后平均 得分。 2 3 2 大鼠外周血p m n 凋亡检测： 2 3 2 1 大鼠外周血中性粒细胞分离 取s d 大鼠抗凝血1m l ，与h a n k s 液l ：1 混匀后，小心加于2 m l 的比重的1 0 9 1 大鼠中性粒细胞分离液之液面上，以2 0 0 0 转分离心 ( 半径1 5 c m 水平转子) 1 5 分钟，收集界面上和细胞分离液中的细胞 ( 主要去除红细胞和血浆层) ，放入含h a n k s 液4 5m 1 的试管中， 充分混匀后，以1 5 0 0 2 0 0 0 转分离心1 0 分钟。吸去上清液，沉淀经 反复洗2 次后制成2 m l 细胞悬液小心加于2 m l 的比重的1 0 8 3 大鼠淋 巴细胞分离液之界面上，以2 0 0 0 转分离心( 半径1 5 c m 水平转子) 1 5 分钟，收集弃去界面上的大鼠淋巴细胞其余所剩细胞即为所需中 性粒细胞。沉淀经反复洗2 次，制成细胞悬液涂片，7 5 乙醇固定。 2 3 2 2t d t 介导的d u t p 缺口末端标记技术( t u n e l ) 钡, u 定中性粒细胞 凋亡 ( 1 ) 将固定好的片子用p b s 漂洗2 次 ( 2 ) 用封闭液于1 5 2 5 0 c 封闭1 0 m i n ( 3 ) p b s 漂洗2 次 ( 4 ) 用细胞通透液于( 2 8 。c ) 冰上通透2 m i n ( 5 ) p b s 漂洗2 次，晾干 ( 6 ) 制备制备t u n e l 反应混合液，处理组用5 0 0 , 1t d t + 4 5 0 0 , i 荧光 素标记的d u t p 液混匀；而阴性对照组仅加5 0 , 1 荧光素标记的d u t p 液，阳性对照组先加入1 0 0 0 , 1d n a s e1 ，反应在1 5 2 5 c ，l o m i n ，后 面步骤同处理组。 ( 7 ) 玻片干后，加5 0 0 , 1t u n e l 反应混合液( 阴性对照组仅加5 0 0 , 1 荧光素标记的d u t p 液) 于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒 中反应3 7 l h 。 ( 8 ) p b s 漂洗3 次，晾干； ( 9 ) 玻片干后加5 0 0 , 1c o n v e n e r - p o d 于标本上，加盖玻片在暗湿盒 中反应3 7 。c x 3 0 m i n 。 ( 1 0 ) p b s 漂洗3 次； ( 1 1 ) 加5 0 , - - 1 0 0 9 l d a b 底物，反应1 5 - - , 2 5 。c x l o m i r a ( 1 2 ) p b s 洗3 次； ( 1 3 ) 拍照后再用苏木素复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒 精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。 2 3 3 荧光定量p c r 法检测肺组织i c a m 1 、v c a m 1 m r n a m r n a 表 达： 2 3 3 1 肺组织总r n a 的提取 ( 1 ) 取3 0 5 0 m g 肺组织块，剪碎后加入装有l m lt r i z o l 的1 5 m le p 管中，立刻超声或匀浆破碎细胞处理。 ( 2 ) 将e p 管置于冰上片刻后，于4 0 c 条件下1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟。 取上清转移至d e p c 预处理的e p 管中。 ( 3 ) 室温放置5 分钟使样品充分裂解。 ( 4 ) 加入0 2 m l 氯仿，蜗旋混匀或猛烈晃动1 5 秒，室温放置2 3 分 钟。 ( 5 ) 于4 。c - f1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟，吸取上层水相至d e p c 预处 理的e p 管中。 。 ( 6 ) 加入0 5 m l 异丙醇，颠倒数次混匀，冰上沉淀1 0 分钟。 ( 7 ) 于4 。c - f1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃上清，管底可见胶状r n a 沉淀。 ( 8 ) 加入l m l7 5 乙醇，蜗旋或颠倒混匀。 ( 9 ) 于4 。c - f1 2 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃上清。再用离心机瞬时离心， 小心吸尽液体。 ( 1 0 ) 开盖干燥r n a 片刻，加入2 0 j _ t ld e p c 水溶解，- 8 0 。c 冻存。 ( 1 1 ) 对最后提取的总r n a 行1 琼脂糖凝胶电泳检验。如可见2 8 s 、 1 8 s 、5 s 三条亮度依次递减的清晰条带，泳道上无明显弥散痕 迹，其中2 8 s 与1 8 s 条带亮度比值约为2 ：1 ，则说明总r n a 提取完整无降解，满足后续实验要求。 2 8 s1 8 s5 s 2 3 3 3e d n a 的合成 组织中提取的总r n a ，以其中的m r n a 作为模板，采用o l i g o ( d t ) 或随机引物利用逆转录酶反转录成c d n a 。采用m b i 公司的 r e v e r ta i d t mf r i s ts t r a n de d n a s y n t h e s i sk i t ，在p c r 仪上进行扩增， 条件如下： ( 1 ) 在冰上预混下列溶液： t o t a li a 5 “1 r a n d o mh e x a m e rp r i m e r ( o 2 肛g “1 )lp l d e i o n i z e dw a t e r ，n u c l e a s ef r e e 6 1 x l ( 2 ) 瞬时离心，7 0 预处理5 m i n ，冰上冷却。 ( 3 ) 再依次加入： 5 r e a c t i o nb u f f e r 4 1 a l r i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r ( r e c o m b i n a n t ) ( 2 0 u i t 1 ) 1 肛l 1 0 m md n t pm i x 2 l r e v e r t a i d t mm m u l vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e 1 1 d ( 2 0 0 u 卜t 1 ) ( 4 ) 瞬时离心。 ( 5 ) 2 0 。c1 0 m i n ，4 2 。c6 0 m i n ，7 0 。c1 0 m i n ，置于2 00 c 冰箱保 存备用。 2 3 3 4 常规p c r 扩增 引物设计： 引物由t a k a r a 公司合成并经质量检测，如下： 开盖前瞬时离心，加入t e ( p h 8 o ) 稀释至浓度为l o i t m ，2 0 。c 储存 备用。 ( 1 ) 反应体系： 10 b u f f e r ( m 9 2 + f r e e ) 3 肛1 m g c l ，( 2 5 m m ) 一 - 1 8l a l 1 7 d n t p ( 2 5 r a m ) o 3 6 肛1 上游引物( 1 0 肛m ) 1p l 下游引物( 1 0p m ) 1p l t a q 酶( 5 u i - t 1 ) 0 3p l d d h 2 0 1 7 5 4p 1 c d n a5p 1 5 7 2 5 。c4 3 。0 s s e e c c 茎磊) 3 5 个循环延伸 1 0x b u f f e r ( m 9 2 + f r e e )3 “l m g c l 2 ( 2 5 m m ) d n t p ( 2 5 m m ) 上游引物( 1 0 “m ) 下游引物( 1 0l a m ) 染料( 1 0 肛m ) t a q 酶( 5 u p 1 ) d d h 2 0 c d n a 模板 3p l o 3 6 “l 1 l x l 1 “l 1 “l 0 3 肛1 1 5 3 4 “l 5 肛l 3 0 “l 反应体系在f t c 2 0 0 0 型荧光定量p c r 仪上进行，这种仪器较 普通的p c r 仪增加了一套复杂而紧密的荧光强度检测系统及数据分 析系统，可对p c r 反应过程中的每一循环的系统荧光强度进行实时 ( r e a l t i m e ) 检测，通过对荧光强度的分析来达到等量检测的目的。 扩增条件如下： 9 4 2 m i n 9 4 2 0 s e e ，5 5 。c 3 0 s e c ，7 2 。c4 0 s e c ，4 5c y c l e s 将p c r 仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期。4 5 循 环的扩增反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的 荧光强度增长指数( d r n ) 进行分析绘制每一反应管的扩增动力学曲 线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阂值 ( t h r e s h o l d ) 时的扩增循环数( c t 值) ，根据c t 值与标准模板初始拷 贝的对数值作图，得到该样品的标准曲线。在此反应系统中，荧光强 度的增加与模板量的增加成正比，荧光强度的变化可反应模板产物量 的变化。 2 3 3 6 待测组织中目的基因相对拷贝数的测定 将逆转录得到的c d n a 样品中各取5 1 1 ，加入和上面完全相同的 反应体系中，在同样的反应条件下行p c r 扩增。收集数据，绘制动 力学曲线，测定各样品的c t 值与标准曲线进行比较，得出待测样品 的相对拷贝数。 2 3 4 支气管肺泡灌洗液中i l 8 的e l i s a 测定 采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定( e l i s a ) 法测定i l 8 的含量。 操作步骤：1 力口样：每孔各加入标准品或待测样品1 0 0 u l ，将反应板 充分混匀后置3 7 1 2 0 分钟。2 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4 - 6 次，向滤纸上印干。3 每孔中加入第一抗体工作液1 0 0 u l 。将反应板 充分混匀后置3 7 6 0 分钟。4 洗板：同前。5 每孔加酶标抗体工作液 1 0 0 u l 。将反应板置3 7 3 0 分钟。6 洗板：同前。7 每孔加入底物工 作液1 0 0 u l ，置3 7 暗处反应1 5 分钟。8 每孔加入1 0 0 u l 终止液混匀。 9 3 0 分钟内用酶标仪在4 5 0 n m 处测吸光值。1 0 以标准品1 0 0 0 、5 0 0 、 2 5 0 、1 2 5 、6 2 、3 l 、1 5 6 、0p g m ll 为横坐标，o d 值为纵坐标，在 坐标纸上作图，画出标准曲线。1 1 根据样品o d 值在该曲线图上查出 相应i l 8 含量，得出的值除以浓缩倍数。 2 4 统计学处理 使用s p s s l 3 0 软件对数据进行处理，数据用均数 标准差表示( x s ) ，样本均数的比较采用单因素方差分析，中性 粒细胞凋亡数据与粘附分子及i l 8 的关系采用直线相关分析进行统 计描述。以a - o 0 5 为检验水准，p o 0 5 有统计学意义。 1 肺组织形态学检查结果学： 仕甲 当日木 对取材的右下肺肺组织h e 染色后2 0 0 倍光镜下观察，对照组( n 组) 小鼠肺组织的小叶结构清晰，肺泡腔干净，肺泡间质无炎性细胞浸润， 支气管黏膜上皮完整，肺泡壁无增厚。注射l p s 后可见肺组织充血明 显，肺泡腔内可见渗出和出血，肺泡间质炎性细胞浸润，肺泡壁增宽。 t 组大鼠病理改变介于对照组和l 组之间。病理改变以4 d 时最为显 著，8 小时次之，2 小时最弱。见图1 1 3 。病理学评分参照上述标准( 无 损伤0 分，病变范围 2 5 为l f f f ，病变范围在2 5 5 0 为2 分，5 0 病变范围 7 5 为3 分，病变满视野为4 分，总分为上述各项之和) 。 经评分后使用单因素方差分析进行统计学分析，结果如表1 。从结果 上看，t 组和l 组重于n 组，有显著性差异( p t 3 ，有显著性差异 ( p 0 0 5 ) 。 表1 五组大鼠肺泡炎评分结果x + s ，) 注：同一时间点与n s 组比较，1 ) 尸 0 0 5 ；同一时间点与a i l 组比较，b 、c 、 d 的p d 0 5 ；同一时间点两两比较，b 、c 、d 的p 0 0 5 ； 2 小时t 2 组图42 小时1 3 组图5 图2 为2 小时l 组肺组织病理图片，正常肺泡结构破坏，肺泡腔内见渗出和出 血，可见炎细胞浸润；图3 、4 、5 为2 小时干预组各剂量亚组肺组织，炎性浸润 较l 组减轻，且随剂量增大，病理改变减轻越明显。即病理改变t l 重于t 2 重 于t 3 。( 图2 、3 、4 、5 ：h e ，x 2 0 0 ) 4 小时l 组图64 小时t l 组图7 4 小时t 2 组图84 小时t 3 组图9 图6 为4 小时l 组肺组织病理图片，肺组织结构破坏，肺泡壁破坏，部分肺泡 间隔断裂，可见肺泡融合，肺泡膈和肺泡腔内见渗出和出血，血管周围、肺泡和 肺间质内可见大量炎细胞浸润；图7 、8 、9 为4 小时干预组各剂量亚组肺组织， 炎性浸润较l 组减轻，且随剂量增大，病理改变减轻越明显。即病理改变t 1 重 于t 2 重于1 3 。( 图6 、7 、8 、9 - h e ，x 2 帅) 8 小时l 组图1 08 小时t 2 组图1 1 8 小时亿组图1 38 小时i 3 组图1 4 图1 0 为8 小时l 组肺组织病理图片，肺组织结构破坏，肺泡腔内见渗出和出血， 可见大量炎细胞浸润；图l l 、1 2 、1 3 为8 小时干预组各剂量亚组，炎性浸润较 l 组减轻，且随剂量增大，病理改变减轻越明显。即病理改变t l 重于他重于 i 3 。( 图l l 、1 2 、1 3 、1 4 ：h e ，x 2 0 0 ) 。 2 外周血t u n e l l 法测中性粒细胞( p m n ) 凋亡结果提示： 凋亡细胞的形态特征为细胞体积缩小，染色质致密化或碎点状， 可见凋亡小体，呈现褐色亮荧光。每片计数细胞2 0 0 个，计算其凋亡 比率。凋亡细胞t 组和l 组凋亡率都低于n 组，有显著性差异 ( p o 0 5 ) ，t 组表达高于l 组，有显著性差异( p o 0 5 ) ，t 组各亚 组之间中性粒细胞凋亡率t i t 2 t 3 ，有显著性差异( p o 0 5 ) 。在 时间表达趋势上看是4 小时凋亡率最低，2 小时最高。结果见表2 。 凋亡变化以4 小时最明显，所以本组图片选4 小时组，见图1 4 1 9 。 表2 五组大鼠中性粒细胞凋亡率结果( ；士s ，n - 6 ) 细则 中性粒细胞凋亡率( ) 钮7 7 v 一 2 h 4 h 8 h n 组6 7 3 3 5 3 2 6 6 3 3 7 8 9 6 6 1 7 7 5 2 l 组3 8 8 3 - t - 2 8 6 a 2 9 6 7 4 - 5 5 0 8 3 4 0 0 4 - 4 7 3 a t l 组 t 2 组 4 9 8 3 4 - 3 1 9 曲 5 6 0 0 2 6 1 4 3 8 3 1 7 2 a b 5 0 3 34 - 4 7 6 戤 4 7 3 3 2 0 7 a b 5 3 6 7 2 9 4 t 3 组6 1 1 7 4 - 2 7 9 耐 5 6 5 0 4 - 3 0 8 甜 5 9 6 7 4 - 4 1 3 a d 了= = = _ = = ：= _ ：_ 一 一 注：同时间点与n s 组比较，1 ) p o 0 5 ；同一丽间鬲写i 瓦歪酒丽、c 、 d 的p o 0 5 ；同一时间点两两比较，b 、c 、d 的p 0 0 5 ； - ， 矗 t f - i o n 组图1 4 _ 二乞c 二兮： ? ? 了 一。o ：，： ! ：。： 图1 4 为生理盐水组大鼠外周血中性粒细胞凋亡t u n e l l 染色，褐色荧光为凋亡 细胞，蓝色为未凋亡细胞，可见中性粒细胞凋亡比例较高。图1 5 为l 组大鼠外 周血中性粒细胞凋亡，凋亡较少。( 图1 4 、1 5 ：t u n e l 染色，4 0 0 ) - - _ ，：j l j ， ：i ：气三 - - ， 7 t l 组图1 6 ， ：，? 二：乞，二了 ：， - f ：、二 三二- ，乏、，毛- _ - ，：? 。 - t 2 组图1 7t 3 组图1 8 2 5 图1 6 、1 7 、1 8 为干预组各亚组大鼠外周血中性粒细胞凋亡t u n e l l 染色，褐色 荧光为凋亡细胞，蓝色为未凋亡细胞，可见中性粒细胞凋亡比例较l 组高，较 生理盐水组少，且凋亡细胞数t i t 2 t 3 。( 图1 6 、1 7 ：t u n e l 染色，x 4 0 0 ) 3 实时荧光定量p c r 检测肺组织i c a m - - l m r n a 、v c a m - - 1 m r n a 表达水 平： 各基因实时荧光定量p c r 标准曲线i c a m - 1 、v c a m - 1 和内参基因 的斜率分别是3 3 5 、3 3 0 、3 3 0 ，相关系数分别为0 9 9 7 、0 9 9 5 、0 9 9 9 。 扩增效率相差较小，基本一致。实时荧光定量p c r 扩增目的基因 i c a m - 1 、v c a m - i m r n a 及内参基因，由l i g h t c y e l c r 荧光定量p c r 仪获取c t 值。为避免实验过程中r n a 的降解及实验操作所导致的误 差，计算时用表达恒定的内参基因的c t 值来校正i c a m - 1 、 v c 卢蝴1 i i l 】刚a 的表达变化，即c t 值，以各组对应时问点n 组平 均c t 值为相对含量，各目的基因c t 值减去n 组平均c t 值，即得 a a c t 值，用2 - c 值计算各目的基因m r n a 相对表达量。i c a m - 1 表达t 组和l 组都高于n 组，有显著性差异( p t 3 ，有 显著性差异( p 0 0 5 ) 。在时间表达趋势上看是2 小时表达最低，8 小时最高，呈递增趋势。肺组织i c a m - l m r n a 相对表达量见表3 。 v c a m - 1 表达趋势类似于i c a m - i ，见表4 。标准曲线、溶解曲线及 扩增益线见图1 9 2 7 。 表3 五组大鼠肺组织i c a m 1 m r n a 相对表达量比较( i ：k s ，确) 组别 i c a m - i m r n a 相对表达量 2 h4 hs h n 组1 0 3 o 2 51 0 2 0 2 5 1 0 2 0 2 6 注：同一时间点与n s 组比较，1 ) p 0 0 5 ；同一时间点与a 几组比较，b 、c 、 d 的p 0 0 5 ；同一时间点两两比较，b 、c 、d 的p 0 0 5 ； 表4 五组大鼠肺组织v c u 矗l m 】险认相对表达量( i 土s ，n - - 6 ) 注：同一时间点与n s 组比较，1 ) p 0 0 5 ；同一时间点与a i l 组比较，b 、c 、 d 的p 0 0 5 ；同一时间点两两比较，b 、c 、d 的p 0 0 5 ； 翔舢+ 嘲 w l 1 澎 t 弋， j l l i i 1 ：j r ， _ 厂i j k u阱 羽 啊 蛳 甬l 唧叠 + ：。叠 图1 9a c t b m r n ar e a l - t i m e p c r 标准曲线 图2 2a c ，i b m r n ar e a l - t i m e p c r 溶解曲线 静蛳l 尜 t m l 一 。 h t ：e 5 t i t l i 舶 确 c 砷r 图2 m c a m