（化学专业论文）基于氮杂bodipy水溶性近红外探针的合成与性质研究.pdf

浙江大学理硕七学位论文 摘要 近红外荧光探针具有灵敏度高、动态响应范围宽的优点，适合于生命体的生 理环境，可以利用仪器方便快捷检测，而且可避免对活体细胞的损伤、减小背景 干扰的优势，获得优良信号。广泛使用于生理环境中识别和检测生物体中的各种 物质( 如d n a ，蛋白质，金属离子，阴离子，质子等) 。 氮杂b o d i p y 荧光染料具有优异的光化学和光物理特性，例如激发波长较长、 良好的光稳定性、高的摩尔消光系数等优点。因此，基于氮杂b o d i p y 类染料 的荧光分子探针研究已引起人们越来越多的关注。 本论文基于氮杂b o d i p y 母体，设计合成了两种功能性染料分子，主要内容 如下： ( 1 ) 基于光诱导电子转移( p e t ) 原理，设计合成了氮杂b o d i p y 类p h 近红外 荧光分子探针t e g d m a _ a z a - b o d i p y ，考察了不同溶剂对该化合物的荧光的影 响。t e g d m a a z a b o d i p y 有非常好的水溶性，可完全溶解在1 0 0 纯水溶液 中。在中性水溶液中荧光很弱，随着酸性增强，在p h1 3 有非常敏感的荧光的 变化，荧光增强倍数大，对质子有很高的敏感度，且可排除金属离子干扰的专一 识别质子。这可用于检测体内胃酸( p h l 2 ) 酸度的变化。 t e g d m a a z a b o d i p y 具有高的光稳定性、激发波长在近红外区( 激发波长为 7 1 4 n m ，可以避开多数生物体自身荧光的干扰) 、摩尔消光系数大，在酸性环境中 可作为光动力治疗的光敏剂。 ( 2 ) 基于分子内电荷转移的原理( i c t ) ，设计合成了氮杂b o d i p y 类检测 铜离子的探针d c m a a z a - b o d i p y ，检测了不同溶剂对该化合物荧光的影响， 该化合物吸收光谱对铜离子有很高的敏感度，且可排除其它金属离子干扰的作为 铜离子专一识别探针。d c m a a z a b o d i p y 在中性的环境中对铜离子有很好的 响应，裸眼便可观察到因微量铜离子加入导致颜色由蓝色变为浅紫色。易溶于水 的d c m a a z a - b o d i p y 钾盐在生物体内铜离子的检测有潜在的应用价值。 关键词：近红外荧光探针；水溶性a z a - b o d i p y ；p h 探针；铜离子探针 浙江人学理硕上学位论文 a b s t r a c t n e a r - i n f r a r e df l u o r e s c e n c ep r o b e sh a v eh i g hs e n s i t i v i t ya n dw i d er a n g eo f d y n a m i cr e s p o n s et ot h ep h y s i o l o g i c a le n v i r o n m e n ti nb i o l o g i c a ls y s t e m s ，w h i c hc a l l b es a f e l yp e r f o r m e dw i t hs i m p l ei n s t r u m e n t sa n df a c i l i t i e s n i rd y e sa r es u i t a b l ea si n v i t r oa n di nv i v ob i o m e d i c a ld i a g n o s t i ca g e n t sd u et oe f f i c i e n tp e n e t r a t i o no fl i g h t t h r o u g ht i s s u ea n dt h el o wa u t o f l u o r e s c e n c eo fe n d o g e n o u sc h r o m o p h o r e si nt h i s s p e c t r a lr e g i o na n da v o i dd a m a g i n gt o t h ec e l l u l a rs y s t e m su n d e ro b s e r v a t i o n n e a r - i n f r a r e df l u o r e s c e n c ep r o b e sa r ew i d e l yu s e dt or e c o g n i s ea n dd e t e c tav a r i e t yo f s u b s t a n c e so fb i o l o g i c a ls y s t e m si nl i v i n gc e l l su n d e rt h ep h y s i o l o g i c a le n v i r o n m e n t ( s u c ha sd n a ，p r o t e i n s ，m e t a li o n s ，a n i o n s ，p r o t o n s ，e t c ) a z a - b o d i p yf l u o r e s c e n c ep r o b e sh a v eb e e nt h es u b j e c t so fi n t e n s ei n v e s t i g a t i o n d u et ot h e i re x c e l l e n tp h o t o c h e m i c a la n dp h o t o p h y s i c a lp r o p e r t i e s ，s u c ha sl o n g e x c i t a t i o nw a v e l e n g t h ，g o o dp h o t o s t a b i l i t y , h i g he x t i n c t i o nc o e f f i c i e n t sa n ds oo n t w ok i n d so ff u n c t i o n a ld y e sw e r ed e s i g n e da n dc o n t r u c t e db a s e do nt h e a z a - b o d i p yc o r ei nt h i st h e s i s t h et h e s i si n c l u d e st h ef o l l o w i n gc o n t e n t s ： ( 1 ) b a s e do np h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ( p e t ) p r i n c i p l e ，w ed e s i g n e da n d s y n t h e s i z e dt h en e a r - i n f r a r e dp hf l u o r e s c e n tp r o b et e g - d m a - a z a b o d i p y t h e e f f e c t so fd i f f e r e n ts o l v e n t so nt h ef l u o r e s c e n ts p e c t r aw e r ei n v e s t i g a t e d t e g d m a a z a b o d i p yh a sd i s p l a y e dv e r yg o o dw a t e rs o l u b i l i t y i tc o u l db ec o m p l e t e l y d i s s o l v e di n10 0 a q u e o u ss o l u t i o n t h ef l u o r e s c e n c ew a sw e a ki nt h en e u t r a l e n v i r o n m e n tw h e r et h ea m i n er e c e p t o rr e m a i n e dt m p r o t o n a t e d u p o np r o t o n a t i o n ，t h e f l u o r e s c e n c es p e c t r u ms h o w e das t r o n gp r o t o ni n d u c e df l u o r e s c e n c ee n h a n c e d m e n ta t p h1 - 3a n dn or e s p o n s et ot h eo t h e rc a t i o n s ( m e t a li o n s ) i tm a yb eu s e dt od e t e c t t h eg a s t r i ca c i d i t yi nv i v o ( p h1 - 2 ) t e g - d m a a z a b o d i p yp o s s e s s e sah i g h p h o t o s t a b i l i t y , l o n ge x c i t a t i o nw a v e l e n g t hi nn e a ri n f r a r e dr e g i o n ( 7 14n n l ，c a na v o i d s t r o n g i n t e r f e r e n c ed u et ob a c k g r o u n da b s o r b a n c ea n da u t o - f l u o r e s c e n c ef r o m e n d o g e n o u sc h r o m o p h o r e si ns a m p l em e d i a ) a n dh i g he x t i n c t i o nc o e f f i c i e n t ，w h i c h i i 浙江大学理硕十学位论文 d i s p l a y sp o t e n t i a la p p l i c a t i o na ss e n s i t i z e rf o rp h o t o d y n a m i ct h e r a p y ( 2 ) b a s e do nt h ep d n c i p l eo fi n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ( i c t ) ，w ed e s i g n e da n d s y n t h e s i z e dc u 2 + p r o b ed c m a a z a b o d i p y t h ee f f e c t so fd i f f e r e n ts o l v e n t so nt h e f l u o r e s c e n ts p e c t r aw e r ee x a m e d t h ec h a n g e so ft h ea b s o r p t i o ns p e c t r ao ft h i s c o m p o u n dc a u s e db yc u 2 + w i t hh i g hs e n s i t i v i t y m e t a l i o n so t h e rt h a nc u 2 + p r o d u c e dn oc h a n g ei na b s o r p t i o ns p e c t r a t h e u v - v i ss p e c t r ao fd c m a - a z a - b o d i p yh a sag o o dr e s p o n s et oc ui nt h en e u t r a le n v i r o n m e n t t h ec o l o ro ft h e p r o b es o l u t i o nc h a n g e df r o mt h eb l u ei n t ol i g h tp u r p l ew h e na d d e d t r a c ea m o u n tc u 2 + c a nb eo b s e r v e db yn a k e de y e t h ep o t a s s i u ms a l to fd c m a a z a - b o d i p yc a nb e p o t e n t i a l l ya p p l i e dt od e t e c tt h ec o p p e r ( i i ) i o ni nl i v i n gc e l l sf o ri t sw a t e rs o l u b l i l i t y k e yw o r d s ：n e a r - i n f r a r e df l u o r e s c e n e ep r o b e ；w a t e r - s o l u b l ea z a b o d i p y ；p h p r o b e ；c u 2 + p r o b e i i i 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师指导 下完成的成果，该成果属于浙江大学理学院化学系，受国家知识产权 法保护。在学期间与毕业后以任何形式公开发表论文或申请专利，均 需由导师作为通讯联系人，未经导师的书面许可，本人不得以任何方 式，以任何其它单位作全部和局部署名公布学位论文成果。本人完全 意识到本申明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：戽2 秒纱 日期：沙加年月矽日 浙江大学理硕士学位论文 独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得浙婆太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：加勿年工月谚日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝逛太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权逝江太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：厉彤忆 签字日期：h 夕年 月矿日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：知jo 彳、夸 导师签名：训j 山 、冲 签字日期：功l 口年2 月堵日 电话： 邮编： 浙江大学理硕上学位论文 前言 分子识别是广泛存在的自然现象，特别是在生命过程中，分子识别起着极其 重要的作用。所谓分子识别是指分子之间( 主体与客体或称之为受体与底物) 靠 非共价键力的选择性结合并产生某种特定功能的过程。分子荧光作为传感信号具 有以下优点：可达到单分子检测的高灵敏性、可开关、可实现人与分子的通讯、 对亚微粒具有可视的亚纳米空间分辨并且是亚毫秒时间分辨的。高灵敏度的荧光 检测不仅广泛用于生命体外生物体系分子探针研究，同时也用于活体内光学影像 探针。然而传统的荧光最大发射波长在6 0 0 n m 以下，属于紫外可见区域。人体 内的生物分子在这一地区对此区域波长有很好的吸收，例如，水和血红蛋白。此 外，在这一区域的光波很容易分散，无法穿透深入组织。另外，还有强大的自体 荧光产生在这一区域，从而导致高背景噪声，这些原因导致传统的染料不适合于 体内成像。 与之相反，在近红外( n i r ) 区( 6 5 0 9 0 0n n l ) ，生物分子有很少的吸收，近 红外还能深入组织，并且在这一区域几乎没有自体荧光。因此，能够取得许多高 信号的低背景噪声的探针。最近，很多近红外成像造影剂，如生物荧光分子探 针，已经开发并应用于血管、炎症与动脉粥样硬化等的检测等。1 虽然目前有一 些荧光探针，已用于体内成像，而且已经商业化，2 但是这些荧光探针，一般都 有高背景噪声。因此，目前，通过与生物分子作用而使得荧光强度发生变化3 的 近红外区荧光探针的合成与应用备受关注。 1荧光 1 1 荧光原理 物质的基态分子受到激发光源的照射，被激发至激发态后，在返回基态时发 射出波长与入射光相同或较长的光，称为荧光。一种物质分子能否发射出荧光不 仅取决于它本身的分子结构还和它所在的环境条件有关。 通常所指的荧光大多指紫外一可见光荧光，即用紫外可见光照射某些物质 后，发射出比吸收的紫外可见光波长相等或更长的紫外一可见光荧光，通过测定 产生的荧光强度进行分析的方法被称为分子荧光分析。 浙江大学理硕士学位论文 受i 毫! | 分子的去活化过程 辐射跃迁 荧 光 延 迟 荧 光 磷 光 无辐射跃迁 猝 灭 内 转 换 系 间 跨 越 振 动 弛 豫 s c h e m e1 分子受激发去活化后会发生分子跃迁( s c h e m e1 ) ，包括辐射跃迁和无辐射跃 迁。辐射跃迁主要包括荧光、延迟荧光、磷光；无辐射跃迁主要包括振动弛豫、 系间跨越、内转换淬灭。 1 s c h e m e 2 在基态单重态( s o ) 的分子吸收波长为九l 和如的辐射后，分别被激发到第一 激发单重态( s l ) 和第二激发单重态( s 2 + ) 的任意振动能级上，而后发生以下过程 2 浙江大学理硕上学位论文 ( s c h e m e2 ) ： 振动弛豫：在溶液中，受激的溶质分子与溶剂分子碰撞，而失去过剩的能量， 以1 0 q 3 1 0 。1s 的极快速度，降至同一电子态的最低能级上，这一过程属于无辐 射跃迁。 内转换：当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，如第一激发单 重态的较高振动能级与第二激发单重态的某一较低振动能级的位能相同，可发生 电子由高电子能级以无辐射跃迁的方式跃迁至低能级上。此过程效率高，速度快， 一般只需1 0 - 3 1 0 - 1 1s 。 荧光发射：处于激发单重态的最低振动能级的分子，也存在几种可能的去活 化过程。若以1 0 - 9 。1 0 刁s 左右的时间发射光量子回到基态的各振动能级，这一过 程就有荧光发生。 1 2 荧光标记在生物中的应用 因为荧光探针的光物理和光化学特性，具有灵敏度高、动态响应范围宽的优 点，适合于生命体的生理环境，所以被广泛地被应用于生命科学研究领域。设计 的荧光探针被引入组织和细胞后，可以富集在组织和细胞的特定成分中，在荧光 显微镜下不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对生物大分子、活细胞的结构 等进行实时观察和检测，结合荧光光谱仪获取荧光图像等。 一些荧光分子可以作为光动力学治疗中的光敏剂，4 应用于癌症光动力学治 疗。相比传统的手术、化疗的治疗方法，具有毒副作用小、靶向性高及无创等优 点，成为现代癌症治疗一种重要手段。光动力学治疗中的光敏剂可以通过静脉注 射到体内，相对正常细胞的吸收，光敏剂在肿瘤发生部位会更容易持久储留，待 健康组织中大部分光敏剂正常排出后，局部照射特定波长激光使光敏剂所在部 分，在特定波长光束照射下光敏剂生成强氧化性物质单线态氧的有机分子，杀死 肿瘤细胞被。由于光敏剂本身在没有光照射情况下，对人体是安全的，因此没有 化疗的副作用大，光动力学治疗中采用的又是低能激光，不会引起组织灼伤，同 时与传统的化疗比较，光动力学治疗的靶向性更好，不会严重伤及正常细胞。 若是用荧光标记链终止的4 种双脱氧核苷酸，在不同d n a 分子彼此分开， 后经紫外线照射，4 种被标记的双脱氧核苷酸发出不同波长的荧光，在通过分析 荧光的光谱便可以分辨出d n a 的序列。若是对抗体进行荧光标记，可以根据荧 浙江人学理硕士学位论文 光的分布和形态确定抗原的部位和性质。若是对样本细胞进行荧光标记，再用激 光束激发使之产生特定的荧光，然后将检测信号传输到计算机进行分析，可以得 到细胞相应的各种特性。 荧光技术还被应用于探测和分析d n a 及蛋白质的分子结构，尤其是比较复 杂的生物大分子。绿色荧光蛋白的多肽链中含有特殊的生色团，故无需进行任何 特殊处理，便可以在紫外线的照射下发出稳定的绿色荧光，作为生物分子或基因 探针具有很大的优越性，所以绿色荧光蛋白及相关蛋白已经成为生物化学和细胞 生物学研究的重要工具。 2 近红外荧光探针的应用 2 1 近红外荧光探针检测p h 值变化 细胞内p h 值在细胞的很多活动起关键作用，包括受体介质的信号传导，酶 的活性，5 细胞生长和凋亡，6 离子的运输，7 钙离子浓度的调节及细胞粘附8 等。在正 常生理状态下，细胞内氢离子浓度保持在微小范围内波动。正常值为4 0 n m o l l 即p h 值7 4 0 ，且只能在p h 值7 3 5 7 4 5 的范围变化。p h 值在o 1 0 0 2 0 单位在 任一方向偏移都有可能会导致心肺紊乱和神经系统的伤害( 如阿尔茨海默氏症) 。 9 更加极端的变化会有生命危险，因此氢离子在体内有着重要的作用。 2 1 1 菁染料的近红外p h 探针 9 s 0 3 - 4 o f 浙江大学理硕十学位论文 s c h e m e 3 w e i s s l e d e r 发现酸催化的水解反应可以用来设计新型的荧光探针用以检测酸 的环境。1 0 他们通过一个不稳定的酸的肽腙连接器把两个菁染料- 9 多肽连接在 一起( s c h e m e3 ) 。在生理环境p h 7 4 的时候，由于荧光淬灭，几乎没有荧光。当 p h 4 5 时，肽腙连接器被切断，菁染料从多肽链中解离下来，这使得环境中荧光 强度的增加超过3 倍。 菁染料是重要的近红外荧光标记染料，其结构如图所示， k n 觚( 如) = 6 4 5 啪( p h4 - 5 ) k 姒( 锄j = 6 6 5 n m ( p h4 - 5 ) c _ 0 2 h 瞰( a b s ) = 6 4 5n i l l ( p h 6 ) k 姒( 锄) = 6 6 5n l r l ( p h 6 ) c 0 2 s 0 3 s c h e m e4 k 缸( a b s ) = 6 4 5n n 3 ( p h4 - 5 ) k 懈( 锄j = 6 6 51 1 1 1 1 ( p h4 - 5 ) s 0 3 - c 0 2 九m 双( a b s ) = 6 5 3r l i n ( p h4 - 5 ) k 觚f 锄) = 6 6 0n i n ( p h4 - 5 ) 浙江大学理硕上学位论文 h - l c g k 砒( a b sj = 7 8 0n n l ( p h 4 ) k 瞰( 锄) = 8 0 0n n l ( p h 4 ) s c h e m e5 菁染料1 1 。1 4 9 , j p k a7 1 7 5 ( s c h e m e4 ) ，最大吸收波长约为6 4 5 哪，最大发射波 长约为6 6 5n l n 。这些荧光探针对生物体内细胞p h 的微小变化很敏感，并可裸眼 观察到变化。磺酸基有助于增加其水溶性，羧基用来与生物分子相连。菁染料的 一个衍生物h i c g1 0 4 ( s c h e m e5 ) 荧光发射波长近8 0 0n l t l ，在p h 增大时可观察到 微小的红移，p k a 为7 2 ，但是这个化合物只有一个磺酸基，故水溶性不好，也没 有同生物分子相连的基团。通常菁染料可以通过调节中间共扼碳链的长短来调节 其光谱性质，它们有很高的摩尔消光系数。但是此类染料的缺点是光稳定性差， 易在光照下氧化断裂。同时，此染料易聚积，影响其使用。 s c h e m e6 唐波等通过改善其结构设计了t p y - c y l 5 ( s c h e m e6 ) 。这是一个在近中性的生 理环境中对p h 的微小变化有很好的响应探针。在p h 值6 7 0 7 9 0 9 围内，t p y - c y 具有高的敏感度，而且其最大吸收波长和最大发射波长分别为6 4 8n n l 和7 5 0n n l ， 这就可以有效地避免生物体系本身荧光的影响。又由于其低毒性和光稳定性， t p y 。c y 被应用到h 印g 2 细胞中，发现可以实时的裸眼观察到p h 改变造成的颜色 变化，而不受背景的干扰。这也就使得此化合物可以广泛应用于生物体系中的p h 定量检测。 b o d i p y 是一个众所周知的高摩尔消光系数和高荧光量子产率的一种荧光 物质，在生物研究中的有着广泛应用。1 6 b o d i p y 这种在近红外区的特性进来被 6 浙江人学理硕上学位论文 广泛运用与于功能探针。1 7 h o p h = 6 6 p h = 8 0 h h o s c h e m e7 o s h e a d x 组通过炔烃叠氮的环和反应把半乳糖与a z a b o d i p y 连接在一起 1 8 ( s c h e m e7 ) 。在6 4 0 n m 酗j 激发波长激发下，可以观察到7 3 0 a m 发射波长的荧光 强度随p h 增加逐渐变弱。p h6 6 时化合物的的荧光强度是p h8 o 时的6 倍。在细 胞成像过程中，可以看到当调节缓冲液的p h 为8 时，化合物的荧光几乎完全淬灭， 当调节缓冲液的p h 为6 6 时，荧光恢复。因此化合物可以作为分子开关用于生物 体内p h 的检测。 ，0 n a x ( a b s ) = 6 2 0n m 久仰a xf 咖) = 6 3 6n l t l q = 4 宰1 0 4 丙酮 + h + 7 + 、n h 一， k 戕( a l a s ，= 6 3 4 n n l k n a 】【i 锄) = 6 5 2 咖 q = 0 7 5 丙酮 浙江大学理硕 二学位论文 s c h e m e8 d a u b 小组也设计了一个近红外的p h 探针1 9 ( s c h e m e8 ) ，这个探针在高的极 性环境中没有荧光，但是加入质子后变成强荧光。p k a 值被确定为2 3 2 ，在乙醇 水( 1 ：1v v ) 的。该探针不适合生物研究，因为它的低p k a 值，而且在水中 溶解度低，但其量子效率远远高于菁染料。需要改造结构，改善p k a 值并溶于 水。 2 2 近红外荧光探针检测金属离子 2 2 1 检测钙离子 作为细胞内信息传递的钙离子，有着重要的调节细胞功能的作用。它是重要 的第二信使，参与生物信号的跨膜传递，及细胞的对外刺激应答等。 h o o c ，n h o o c - h o o c 、 i 厂一c 0 0 h n l c o o h s c h e m e 9 a k k a y a 和t u r k y i l m a z g 殳计了一个方酸的钙探针2 0 ( s c h e m e9 ) 。在p h 7 2 的缓 冲液中，在加入钙离子后，荧光强度下降。而即使加入大量的镁离子，对其发 射光谱和吸收光谱没有任何影响。此探针的表观离解常数为3 4 1 0 一m ，可能 适合于生物研究。 浙江人学理硕士学位论文 s t h e m e1 0 o z m e na n da k k a y a n 样利用方酸设计了一个钙离子的探针2 1 ( s c h e m el o ) ， 最大吸收波长和最大发射波长分别为7 6 6r i m 和7 8 2n l t l ，适合于体内荧光成像。 通过光诱导电子转移机理( p e t ) 发生作用。量子产率从未加钙离子的0 0 5 跃升 到0 1 2 ，这表明有效地光诱导电子有可能在近红外区产生。表观解离常数被确定 为2 4x1 0 4 m ，这是接近休眠细胞内的钙离子浓度，所以这个探针的动态范围 是可以用于生物检测。 2 2 2 检测汞离子 汞被认为是的一种对人体和环境毒性最强离子之一，因为它的阳离子可以扩 散在空气，水和土壤中，2 2 汞积累在人体内会造成多种疾病，即使在低浓度，也 会严重影响人的消化系统、肾脏等，特别是对人的神经系统有很大伤害。2 3 尽管 其毒性很强，但是汞和汞盐被广泛应用于工业流程，汞污染高比例可以9 3 因为 人为因素。 s c h e m e1 1 李玉良及其小组成功合成出一个菁染料的近红外汞离子探针2 4 ( s c h e m e 1 1 ) ，可以通过比色或荧光方法来鉴别汞离子的存在。因为大部分荧光传感器必 须荧光检测器或紫外光检测器来检测信号。这使得通过比色法既“裸眼”检测显 浙江大学理硕十学位论文 得更直接和廉价，无需使用昂贵设备。此化合物在甲醇溶液中随着汞离子的加入， 最大吸收波长从6 9 5n l n 红移到8 1 7a m ，加入e d t a 后溶液恢复为原来的颜色， 其在甲醇中的表观解离常数为4 3 3 5 x 1 0 。4 m 。其对汞离子良好的选择性及方便的 检测有待生物研究的开发。 o s c h e m e1 2 a k k a y a j 组也开发出一个基于a z a - b o d 口y 的汞离子探针2 5 ( s c h e m e1 2 ) ，在 同比例的的汞离子溶液中，此化合物的最大吸收波长有3 5 n m 的红移，最大发射 波长有3 7n m 的红移，可以定量检测汞离子的存在。表观离解常数是5 4 x 1 0 巧m ， 量子产率在丙酮中为o 1 9 ，加入汞离子后变为o 1 7 。因为化合物本身的刚性结构 决定了对汞离子的高选择性，这也是第一个基于a z a - b o d i p y ( 约金属离子探针。 但是因为水溶性不好，生物中的应用受到限制。 2 2 3 检测锌离子 锌是人体内第二丰富的过渡金属，大量分布在人体的细胞和体液中，对人 体的生命活动有着重要的作用。2 6 - 3 荧光探针分子结合锌离子后可以为生物的研 究提供非常有用的信息。实时研究锌离子的浓度和分布现在已被广泛应用。2 7 s c h e m e1 3 k a z u k ik i y o s e j 组合成了一系列的菁染料，研究了不同的胺取代的与光化 1 0 浙江大学理硕士学位论文 学之间的关系2 8 ，发现胺的电子密度越低，最大吸收波长越长，但是最大发射波 长几乎没有变化。他们合成了d i p c y ( s c h e m e1 3 ) ，有很高的摩尔消光系数及大 的斯托克位移d i p i c o l y l e m y l e l l e d i 锄i n e ( d p e n ) 的作用类似于金属螯合剂。d i p c y 与金属离子作用时，d p e n 的电子密度降低，因此降低了荧光分子中胺的给电子 能力。 当溶液中锌离子的浓度足够大的时候，最大吸收波长有4 4n l n 的红移。由此 可见，d i p c y 是可以用于锌离子的定量检测。在p h 7 4 h e p e s 的缓冲溶液中，其 离解常数为9 8 1 0 巧m ，未加锌离子时最大吸收波长为6 2 7n l n ，最大发射波长为 7 5 8n n l ，加入锌离子后最大吸收波长为6 7 1n m ，最大发射波长为7 6 5a m 。其选择 性不是很好，且荧光量子产率比较低。 s i c h e m e1 4 这种修饰的荧光胺取代的菁染料适用于双波长测量各种生物分子和酶的活 动。唐波小组合成出d p a - c y 2 9 ( s c h e m e1 4 ) ，利用p e t 机理的检测锌离子的探针， 他们是把两个d p a 基团加在菁染料上。这是一个可以透过细胞膜的近红外荧光 探针，用两个d p a 来螯合锌离子。通过过渡金属d 1 0 或是质子与氨基的结合来抑 制p e t 达到荧光增强的目的，这也是常用到的机理。当d p a 检测到锌离子时， d p a c y 有近2 0 倍的荧光开启反应，他们把d p a c y 作为锌离子选择载体的应用 于巨噬细胞来检验是否可以作用于生物体系，发现d p a c y 是可用于细胞渗透的 并对锌离子快速响应的荧光分子。 浙江大学理硕上学位论文 t e g ， t e g i o s c h e m e1 5 大多数荧光探针的水溶性都不好，在表征的过程中需要多种溶剂，这也限制 了探针的生物应用。a k k a y a 小组利用b o d i p y 设计了一具有良好水溶性的近红 外探针3 0 ( s c h e m e1 5 ) ，可以用于光动力学和锌离子的检测。其水溶性是加入了六 个t e g 基团，检测锌离子的基团是d p a ，其最大吸收波长为6 8 0i l r n ，有高的摩 尔消光系数，在水的缓冲液中( 5 乙醇做共溶剂) 最大发射波长为7 2 6n n l 。锌 离子的加入后，荧光下溶液由几乎不可见的颜色变为亮红色，其表观解解常数 为2 x 1 0 m ，尽管汞离子和镉离子对它有响应，但在生理环境中几乎没有影响， 且对于其它阳离子没有任何响应。这种探针的合成便捷，有助用其它检测基团来 修饰。 1 2 浙江人学理硕士学位论文 s e h e m e1 6 b r a d l e yd s m i t h 同样合成了z n d p a 的近红外荧光探针3 1 ( s c h e m e1 6 ) ， 这种探针应用于人体成像，在与锌离子结合后形成的配体，可以有选择地积聚在 前列腺癌和乳腺肿瘤在两个不同的异种移植的动物模型中。在动物体内实验的激 发波长为7 5 0n l t i ，检测的发射荧光在8 3 0n l n 。体外生物分布及组织学分析表明， 探针可以标记坏死的肿瘤区域，这同体外显微镜下有选择的对死亡的细胞体外表 面阴离子标记的结果是相同的。成像探针无创的确定肿瘤细胞死亡的数量和类型 也许可以预测肿瘤的发病机理，用于人类癌细胞深层组织的成像。 2 2 4 检测铁离子 h g h 一o 叹 s c h e m e1 7 s a m u e l a c h i l e f , 、组设计用菁染料和d f o 结合在一起形成了c y p a t e d f 0 3 2 1 3 浙江人学理硕十学位论文 ( s c h e m e1 7 ) 。由于d f o 对铁离子和镓离子有很好的结合，同样c y p a t e d f o 也 通过质谱的检测获得同样的结果。其最大吸收波长和最大激发波长分别为7 8 2 i l i l l 和8 0 8n i n ，当与铁离子络合时吸收波长和荧光强度都有很大程度的降低， 而与镓离子络合时吸收波长和荧光强度无明显改变。 2 2 5 检测银离子的探针 银离子是一种重金属离子，是人体组织内的微量元素之一。微量的银对人体 没有伤害，可以用来抑制甚至杀死病毒、真菌、细菌等，具有抗菌的效用。 s c h e m e1 8 卟啉化合物已经在医学、材料科学和分析检测等领域得到广泛的应用。3 3 w a i y e u n gw o n g 小组利用伍德沃德的扩展卟啉大环化合物的方法合成探针3 4 ( s c h e m e1 8 ) 。发现扩展的卟啉大环化合物对银离子有高灵敏度和选择性。此化 合物有很大的斯托克位移，在5 1 4n l t l 的激发波长激发下，近红外区1 0 5 0n r n 产 生最大发射波长。随着银离子的加入至两倍的当量，荧光强度逐渐减弱。裸眼可 以观察颜色由淡红色变先为紫色后变为蓝色。 2 3 近红外荧光探针检测一氧化氮 1 4 浙江大学理硕上学位论文 d a c - p ( r = c h 2 c h z c h 3 x = i ) d a c - s ( r = c h 2 ( c h z ) 3 s 0 3 h ，c h 2 ( c h 2 ) 3 s 0 3 一) 臣巫亘三 d a c - p - t ( r = c h 2 c h 2 c h 3 ，x zi ) d a c - - s - t ( r = c h 2 ( c h 2 ) 3 s 0 3 h c h 2 ( c h 2 ) 3 s 0 3 - ) 臣巫回 s c h e m e1 9 一氧化氮是人体内一种重要的信标分子，是由l 精氨酸为l 一瓜氨酸在体 内通过一氧化氮合酶的作用而生成的，对体内生理和病理机制的调控有着重要的 贡献。但是因为一氧化氮在体内的浓度很低，并且化学性质不稳定，所以检测相 对来说比较困难。k a z u k ik _ i y o s e 小组合成了d a c s3 5 ( s c h e m e1 9 ) ，可以与一氧 化氮快速反应，并且近红外区域较少受到生物物质的干扰。d a c s 探针不仅可 以用于细胞，还可用于体内一氧化氮成像。其作用机理也是利用p e t ( 光诱导电 子转移) ，原来由于氮上的孤对电子使得本身的淬灭荧光，但当一氧化氮与d a c s 发生化学反应形成新的化学共价键后，形成新的化学键阻断了电子转移后又重新 恢复。 2 4 近红外探针检测蛋白酶 n h h n h 2 n 箭头指示为酶反应裂解的位置 s c h e m e2 0 一般来说，当两个荧光基团距离比较近的时候，有时会因淬灭而荧光消失。 因此可以通过酶反应或其它反应来改变两个荧光基团的距离，以便控制荧光强 度。w e i s s l e d e r 小组开发出小鼠体内模型的近红外荧光探针( s c h e m e2 0 ) 便采用上 述机制。3 6 探针被绑定到一个固相共聚物聚l 赖氨酸和甲氧基聚乙二醇琥珀酸 浙江人学理硕士学位论文 上。静脉注射后，近红外荧光探针载体累积在实体瘤，当细胞溶酶体蛋白酶裂解 高分子聚合物时便可通过近红外荧光信号检测到信号。在图像中显示，近红外荧 光信号增长了近1 2 倍，从而可以检测亚毫米大小肿瘤。w e i s s l e d e r 小组依据同 样的策略设计出一系列近红外蛋白酶探针，一些已商业化使用。3 7 2 5 检测a f td e p o s i t s y甲 c r a n a j ) - 2 s c h e m e2 1 a n n am o o r e 小组通过姜黄素的修饰设计合成了c r a n a d 2 3 8 ( s c h e m e2 1 ) ， 即通过姜黄素与硼酸反应生成二氟硼化合物，后又与n ，n 二甲基苯甲醛作用产 生。在甲醇中化合物的最大发射波长为7 6 0n l r l ，而在磷酸的缓冲液中最大发射 波长为8 0 5n l t l ，同时有一个大的斯托克位移产生。c r a n a d 2 是第一个用于体 内生理研究的二氟二酮化合物，这个探针可以用于体内a pd e p o s i t s 无创的检测。 由于c r a n a d 2 可以进入大脑并连接淀粉样蛋白斑，这将适合用于p e t 显像。 此外，由于姜黄素可以作为a d 治疗，所以c r a n a d 2 还有治疗疾病的可能。 2 6 近红外荧光探针检测p 半乳糖苷酶 大肠杆菌p 半乳糖苷酶( p - g a l ) 不仅被广泛应用于酶标记酶联免疫吸附法中， 同时在原位杂交，分枝杆菌分类，基因表达研究等方面也得到广泛的使用。3 9 各 种各样的p 。半乳糖荧光探针的已经得到开发使用，但是在体内的应用却受到各种 各样的限制。 1 6 浙江大学理硕十学位论文 n o h + l p g a i l h 2 0 j h 胁h + n n p ob h y dl y w e i s s l e d e r 小组设计了一种p 半乳糖苷酶的荧光探针4 0 ( s c h e m e2 2 ) ，通过4 羟基3 硝基苯甲醇一端连接到甘氨酸上，另一端连接在半乳糖苷上，甘氨酸上 连接2 s b p o4 1 ，2 s b p o 作为荧光团。o 糖苷键首先被酶作用后分解， 4 一羟基 三硝基苯甲醇释放，形成甘氨酸2 s b p o 。不稳定的甘氨酸2 s b p o 进一步水解 释放甘氨酸和自由的2 s b p o ，同时荧光强度增加七倍。动力学参数表明，催化 效率对p 半乳糖为底物时会更高。因为在底物荧光在近红外区域，可以用于p 半乳糖在体内的成像活动的标记。 2 7 检测样淀粉蛋白斑 ( 言职磁己4 m a r t i nh i n t e r s t e i n e r 小组设计合成了一系列的嗪染料的化合物4 2 ( s c h e m e 浙江大学理硕上学位论文 2 3 ) ，发现a o i 9 8 7 虽然发射波长为6 7 0 n n l ，但是在老鼠的血清中有很高的量子 产率。此化合物容易穿透完整的血脑屏障，并显示出与淀粉样蛋白斑块良好的结 合能力。在使用近红外荧光成像过程中，小组对尸体脑切片进行后分析发现 a o l 9 8 7 在a p p 2 3 转基因小鼠体内与淀粉样蛋白斑有相互的特定作用。定量分析 表明动物淀粉样蛋白斑聚集越多，荧光强度越强。因此a 0 1 9 8 7 可以用于动物模 型的阿尔茨海默氏疾病4 3 的检测，并可评估阿尔茨海默氏药物在蛋白斑聚集方面 的效果。 2 8 检测活性氧自由基的荧光探针 活性氧自由基是在生物的氧化代谢过程中不断产生的，超氧阴离子自由基羟 基自由基，过氧化氢等是常见的活性氧自由基。这些自由基是由非酶反应或酶反 应作用产生的，但不断被抗氧化酶被所清除，在正常生理情况下活性氧维持在极 低的浓度，处于对人体的有利无害的水平。人类几种主要疾病2 6 几乎都- 9 活性 氧有关，细胞释放的活性氧造成d n a 损伤，从而导致癌症4 7 的发生，而抗氧化剂 的干预可以阻断活性氧产生，从而抑制癌细胞生长。故活性氧的作用越来越受到 人们的重视。与其它检测方法相比，荧光法是唯一可以在不破坏生物活性的情况 下进入细胞，与活细胞内的活性氧作用生成荧光物质，实时检测细胞内活性氧。 tcp(无荧光)tcp=