（预防兽医学专业论文）金黄色葡萄球菌LukF和LukS基因的克隆和表达.pdf

摘要 金黄色葡萄球菌是一种重要的致病菌，可以引起人和动物盼多种疾病，其主要致病物质是毒 素和酶，其中杀白细胞素可使白细胞失去吞噬功能，破坏中性粒细胞和巨噬细胞。杀自细胞素是 双组分毒素，含f 和s 两种成分，二者协同作用于白细胞膜上形成孔状结构，溶解白细胞。 本课题采用p c r 的方法扩增出金黄色葡萄球菌杀白细胞素f ( 1 u k f ) 基因和s ( 1 u k s ) 基因， 分别与p m d l 8 - t 载体连接，并转化到b l 一2 1 ( d e 3 ) 大肠杆菌。经p c r 和肋m h l 、肋n 双酶切鉴 定后，获得的阳性克隆质粒命名为p m d - l u k f 和p m d 一1 u k s 。实验进一步将两个阳性克隆和 p e t 3 2 a ( + ) 表达载体用m h i 协n 双酶切，回收目的片段，并连接转化到b l 2 1 ( d e 3 ) 大肠杆菌， 构建出表达质粒p e t 1 u k f 和p e t 1 u k s 。测序结果与g e n e b a l l l ( 中公布的序列相比，l u k f 和i u k s 同源性均在9 9 以上，编码的氨基酸序列的同源性均为1 0 0 。重组菌p e t - l u k f ，d e 3 和 p e t - l u k s 舰3 经i p t g 诱导后进行s d s p a g e ，并用抗h i s t i d i n e 单抗进行w e s t e mb l o t 分析，结 果p e t 1 u l ( f ，d e 3 表达出分子量约5 3 k d a 的蛋白质，p e t - l u l ( f ，d e 3 表达出分子量约5 4 k d a 的蛋白 质，二者分子量大小和d n a s t ”分析结果也相符，表明目的蛋白成功获得表达。在此基础上，用 m a 鲫e h j s t ”蛋白纯化系统对表达的1 u k f 和l u k s 蛋白进行了纯化，为下一步研究金黄色葡萄球 菌杀白细胞素的作用机理和免疫保护作用做了前期准备工作。 关键词：金黄色葡萄球菌，杀白细胞素，f 组分，s 组分，克隆，表达，w e s t e mb 1 0 t j 】l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八一农垦大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名互前 时间 年6 其f 芦 关于论文使用授权的说明 本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八一农垦大学可以用不同方式 在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 二 ，阜， 酮： 年6 只 7 b 鄂獬：红7 豸、 帆j 力纷多月，7 日 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章前言 第一章前言 金黄色葡萄球菌( 印 y f o c c m 口m w ) 是一种最为常见的革兰氏阳性致病菌，广泛分布于自 然界，如空气、土壤、水及物品上，也经常存在于人和动物的皮肤以及外界相通的腔道中。金黄 色葡萄球菌致病性很强，所导致的疾病种类也非常多，从普通的皮肤感染到细菌性心内膜炎以及 毒素休克综合症等，危害极大。但总的说来，所引起的疾病可分为两类疾病，一类是毒素性疾病， 被金黄色葡萄球菌污染的食物或饲料引起人或动物的中毒性呕吐、肠炎及人的毒素休克综合症 等；另一类是是化脓性疾病，例如动物的创伤感染、化脓性骨髓炎以及奶牛的急性、慢性或坏疽 性乳房炎等。金黄色葡萄球菌是引起化脓性疾病的重要致病菌，并且是毒力最强的化脓菌。金黄 色葡萄球菌主要依靠产生多种毒素和酶致病，如肠毒素、溶血素、致热性外毒素、中毒性休克综 合症毒素l 、剥脱素、杀白细胞素，血浆凝固酶、葡萄球菌溶纤维蛋白酶、耐热核酸酶、透明质 酸酶等。此外，某些细胞壁结构也具有毒力因子的作用，如葡萄球菌蛋白a 、荚膜、纤连素结合 蛋白等。在这些致病因子中，研究较多的主要的还是毒素。 1 1 金黄色葡萄球菌的主要毒素 1 1 1 肠毒素( s t a 曲y l o c o c c a le n t e r o t o x 协，s e ) s e 是金黄色葡萄球菌产生的一种毒性蛋白质，已报道有a 、b 、c 、d 、e 、f 、o 、h 、i 等血 清型口捌。一般来说，具有毒力的金黄色葡萄球菌在适宜的条件下，大多数可产生各种不同类别 的肠毒素。所有s e 的氨基酸组成已经测定，分子中赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和酪氨 酸等较集中，除s e f 外，所有s e 均含有由2 个半胱氨酸残基形成的大约有2 0 个氮基酸的胱氨酸环， s e a 、s e b 和s e c l 分子羧基端有明显的相似性”i 。各型s e 均易溶于水和盐溶液，较能抵抗蛋白酶， 并且非常耐热，即使煮沸3 0 分钟也不失活，必须在2 】8 2 4 8 经3 0 分钟才能使其毒性完全消 失。由于s e 有抗蛋白酶分解作用，才使它在胃内环境中不被立即灭活，有时间通过胃粘膜发挥 其毒性效应，误食金黄色葡萄球菌污染的食品可引起呕吐和腹泻等症状1 4 j 。并且，s e 对t 细胞具 很强的有丝分裂原作用，可非特异性地激活多克隆t 细胞，无需预先致敏，且无种属特异性。s e 需结合到辅助细胞m h c 类分子上，然后共同作用于t 细胞受体，才能发挥有丝分裂原作用。 s e 通过激活t 细胞产生一系列免疫调节作用，如诱导或抑制细胞毒性t 细胞反应，刺激t 细胞释放 干扰素和i l 2 ，并表达i l 2 的受体，在体内外抑制体液和细胞免疫等p 】。 1 1 2 溶血毒素( h e m 0 1 y s i n ) 溶血毒素致病力很强，为金黄色葡萄球菌毒素中最被人们重视的毒素。溶血毒素分为、6 、 y 、5 四种，它们的本质是一条肽链所构成的小分子蛋白质，一般由1 7 2 1 种氨基酸组成，分 子量在1 2 3 9 k d a 之间，它们除了在一定条件下有溶血作用和部份致病作用外，还存在着一些杀 白细胞的活性。但它们在溶液中不稳定，易受保存条件影响而被破坏。溶血毒素具有溶血作用， 兔红细胞对溶血毒素的溶血作用最敏惑，其次为绵羊。同时a 溶血毒素可损伤动物的血小板，使 之脱颗粒，还能促使小血管平滑肌收缩，痉挛、导致毛细血管血流阻滞和局部缺血性坏死，较大 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章前言 剂量的n 溶血毒素可引起大脑生物电的迅速停止而导致死亡。金黄色葡萄球菌在多种培养基中均 产生b 溶血毒素，又称冷热溶血素，能溶解人体的红细胞，破坏血小板。y 及6 溶血毒素对多种红 细胞都有作用，但抗原性与、b 各不相同l ”。 1 1 3 致热性外毒素( p y r o g e n i ce x o t o x j n ，p e ) 致病性金黄色葡萄球菌的培养物滤液中含有一种能导致人体发热反应的物质，称之为致热性 外毒素( p e ) ，它可分为p e a 、p e b 和p e c 三种，但其中最重要的是p e c 。它是一种由1 9 种氨基酸 组成的肽链。分子量为1 8 2 2 k d a ，它具有对机体的致热性和非特异性促细胞有丝分裂活性，故 可促进损伤组织愈合。还能诱导单核细胞和巨噬细胞及t 细胞释放出i l 一1 和1 l 2 ，可能起到抑制 肿瘤细胞生长的作用。p e c 在注射后4 6 天，非特异性促进细胞有丝分裂活性最为明显。 1 1 4 中毒性休克综合症毒素( t s s t 1 ) 金黄色葡萄球菌致热外毒素c 和肠毒紊f 与中毒性休克综合症毒素在生化特性与生物活性方 面极为类似。它们都产生于血浆凝固酶阳性的菌株，总称为中毒性休克综合症毒素( t s s t 一1 ) 。 它可引起人类中毒性休克综合症，该毒素系由1 6 种氨基酸组成的小分子量蛋白质。分子量2 2 2 4 k d a 。对热不稳定，其一定浓度有非特异性促进细胞有丝分裂，特别对人t 细胞有促进分裂效应。 t s s t l 有较强的诱导细胞因子作用，如i f n 、i n f 和i l - 1 的产生，有利于对人类疾病的治疗。 1 1 5 剥脱毒素( e x f o l i a t i v et o x i n ) 金黄色葡萄球菌所产生的剥脱毒素，能导致人剥脱性皮炎及皮肤局部坏死。它是一种由18 种 氨基酸组成的蛋白质，分子量在2 3 m a 左右，具有一定的抗原性，对热相对稳定。7 0 8 0 3 0 m i n 和1 0 0 1 0 m m 还存在部分活性。其一定浓度有非特异性促进细胞有丝分裂的活性。故有促进损伤 组织生长和修复的作用。 近年来，随着对金黄色葡萄球菌毒素研究的不断深入，人们对一种存在于致病性金黄色葡萄 球菌中的毒素产生了兴趣，这种毒素能杀死所在部位的白细胞，即破坏中性粒细胞和巨噬细胞， 这种毒素为杀自细胞素。 1 2 杀白细胞素皿蛐k 眦i d i ，l u k ) 1 2 1 杀白细胞素概述 在大多数致病性金黄色葡萄球菌培养物中，存在着一种较为强烈的杀死白细胞的活性物质， 即为杀自细胞素。它能杀死被作用部位的白细胞，但能促进末稍血液中自细胞增加和粒细胞再生。 被损伤的白细胞能释放白细胞增殖因子，刺激骨髓产生粒细胞和巨噬细胞，从而来补偿因此而产 生的病理效应。杀白细胞素包括两种水溶性的蛋白质，即l u l 【f 蛋白和l u k s 蛋白。在一级和三 级结构上的y 溶血素( h 恸、杀白细胞素和p t o n v a l e n t i n e 杀白细胞素( p v l ) ，被认为形成两个 蛋白质家族，即f 蛋白质家族( l u l c f 和l u l ( f p v ) 和s 蛋白质家族( h 】9 2 ，l u k s 和l u k s p v ) ， 2 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章前言 而且蛋白质家族内部彼此之间大约有7 0 的相同性，而在两个蛋白质家族之间同源性却只有 3 0 。有趣的是，f 蛋白质家族和s 蛋白质家族中的h 培及杀白细胞素和金黄色葡萄球菌的n 溶 血素具有2 0 一3 0 的同源性，并已经被认为是溶细胞素孔的原形i g j 。杀白细胞素l u k f 和l u k s 两种蛋白协同作用，对于人类和兔的多形核白细胞及红血球具有溶解作用，p v l 对白细胞具有 高度的特异性j 。 1 2 2 杀白细胞素的发现 1 9 3 2 年，p a | 1 t o n 和v a l e m i n e 【l 描述了杀白细胞素的活性，他们从由葡萄球菌引起的慢性疖病 中分离出溶细胞素。1 9 6 0 年，w 0 0 d i n 1 第一个纯化出杀白细胞素，并把它分为两种协同作用的 蛋白，即f 蛋白( 3 2 ，0 0 0 d a ) 和s 蛋白( 3 8 ，0 0 0 d a ) 。后来，n o d a 等i j “研究认为，用其它的纯化 技术所得到的杀白细胞素f 蛋白为3 2 ，0 0 0 i ) a ，s 蛋白为3 1 ，o o o d a 。g o m p e 甜”1 从v 8 菌株中分离纯化 的f 蛋白和s 蛋白的分子量分别为3 8 ，0 0 0 d a 和3 2 ，0 0 0 d a 。j u n 等【j 1 研究发现，从金黄色葡萄球菌分 离出的f 蛋白和s 蛋白分子量分别为3 4 ，0 0 0 d a 和3 3 ，0 0 0 d a 。使用不同的纯化技术所得的分子量的大 小不同。实际上，用分子克隆和序列分析”t ”j 来检测金黄色葡萄球菌的杀自细胞素显示，h l g 溶 血素的性质非常接近杀白细胞素，它们属于相同的毒素家族l j “j 。在1 9 7 6 年，s c h 8 m a n n 【”1 研究 发现杀白细胞素作为一种毒素蛋白能够破坏吞噬细胞和淋巴细胞，但不能导致红细胞和血小板的 减少。他也指出在c a 2 + 存在的情况下，对于杀白细胞素提高质膜的通透性和促进毒素的定位具有 重要意义。然而，在分子水平上对它的作用机理还没有得到充分的理解。 后来研究发现，两种蛋白协同作用，在人类多形核白细胞上形成孔状结构。w o o d i n 等”0 j 报 道。f 蛋白先结合到白细胞膜上，然后再和s 蛋白相连。而有学者研究认为，s 蛋白必须先和f 蛋 白结合，然后两者协同作用连接到细胞膜表面，并且他们通过小颗粒分泌实验证实，认为s 蛋白 是檄活细胞膜所必须的，在s 蛋白存在的情况下，才能推动f 蛋白和细胞膜结合。n o d e 等1 2 1 ，”1 研 究发现，可以通过卵磷脂和神经节苷酯g m l 来分别获得处于非激活状态的f 组分和s 组分，但两 个组分必须同时存在时，才可以协同作用来溶解白细胞，使白细胞形态发生改变。在经过构象改 变后，s 蛋白成为细胞膜表面的一部分受体或者受体本身，因此推动结合f 蛋白到细胞膜上。而，融f 和，“船基因分别在1 9 9 1 年和1 9 9 2 年首次克隆并进行了序列分析。f 脚 x 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章前言 丙氨酸、色氨酸、天门冬氨酸及赖氢酸的含量各不相同。但肽链间均以二硫键相连，两种组分的 末端残基均为丙氨酸陋2 “。 1 2 4 杀白细胞素的结构 1 2 4 1 杀自细胞素在细胞膜上形成孔状结构 我们已经知道杀白细胞素对红血球具有溶血作用。红细胞经过f 蛋白处理1 0 分钟，在显微镜 下可以观察到红细胞肿胀、变圆，并具有清晰的边缘，然后细胞逐渐溶解。因为细胞肿胀是通过 细胞膜的渗透作用，从而推测出是通过孔来实现膜的渗透性。这个推论由以下的研究所证实：( 1 ) 杀白细胞素的溶血作用可以被直径大于2 5 坩n 的细胞外非电解质物质所阻断，暗示着毒素形成一 个大约2 5 t 1 i t l 的亲水性孔。( 2 ) 用毒素处理红血球，在电子显微镜下观测到形成一环形结构，它的 内外直径分别为3 t 1 1 1 1 和9 i l i l l 。被细胞膜包裹的毒素被s d s 溶解，然后经过s d s 聚丙烯酰胺凝胶电 泳，w e s t e mb l o t 分析，结果发现，杀白细胞素形成一个高分子复合物，分子量大约为2 0 0 k d a ， l u l ( f 和l u k s 所占的比例大约为1 ：p “j ，并且也显示l u l ( f 和l u k s 在复合物结构中是非常重要的。 最近，研究发现，l u l ( f 以连接常数k f 为2 1 1 0 4 岬和大量的连接位点r f 为2 o x l 0 4 u m ，而l u l ( s 以较小的连接常数( k h = 1 2 1 0 4 陋2 ) 并且只有较少的连接位点( r h ，1 8 1 0 4 u m 2 ) ，暗示着l u l ( f 相对于l u k s 大约形成1 8 个折叠结构。 用杀白细胞素处理人类p m n i 和兔的红细胞：( 1 ) 在溶血之前，杀白细胞素导致k + 的流失和细 胞肿胀。但当直径大于2 1 m 的亲水性的聚乙二醇存在于细胞外空间时，最终将使毒素处理的红 细胞肿胀不能发生。( 2 ) 用电子显微镜观察显示，经过杀白细胞素处理的人类多形核白细胞( p m h 1 和兔的红细胞上存在环状结构，内外直径分别为3 n m 和9 n m 。具有相同大小的环形结构在靶细胞 中被分离得到。( 3 ) 一个单独环形结构的毒素分子大小约为2 0 0 k d a ，l l l l 【s 和l u k f 所占的比例为 1 ：1 。这些结果显示，l u k s 和l u l 【f 在靶细胞上形成分子量大约为2 0 0 k d a 的低聚物，孔的直径大约 为2 m 。 1 2 4 2 杀白细胞素的两部分形成七瓣孔跨膜结构，亚单位的比例3 ：4 和4 ：3 研究发现l u k f 具有一个膜折叠插入区域，并包括一个类似h l a 结构的核心区域1 2 9 】。在l u l ( f 单体的晶状体结构基础上，o l s o n 等3 0 】研究报道，由两部分组成的七瓣孔跨膜结构的溶血素用 h 1 a 作为模型，然而p c d e l a c q 等川推测是一个六瓣孔跨膜结构。m i l e s 等豫3 3 】研究报道是一个由l u 】( f 和l u k s 组成的八瓣孔跨膜结构。这些报道的理论基础都是凝胶电泳和离子通路上对特定位点的 标记。那么到底 x 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章前言 层，这些片层包裹了p 夹心内部的b 片层结构。前茎的p 片层包括一个无序的氨基酸残基，跨在 7 链与8 链之间，具有p 折叠或者卷曲结构。前茎的疏水性氨基酸在与p 片层接触过程中具有重 要作用，其中有2 4 处范德华力，其接触面积为8 5 2a 。，而h l a 氨基酸索链通过一个相似位点与 七聚体结合，其表面积为6 7 0a 2 ，两者较为接近。前茎与氨基酸索链通过疏水氨基酸残基直接接 触，其中包括如v 1 3 ，v 1 7 ，y 1 1 7 ，f 1 1 9 。在h l a 中，占据后两个位置的残基位于与脂质双分 子层的接触面上。前茎与氨基酸索中y 1 1 7 与f 1 1 9 的并置使这两个关键性的区域的接触成为可 能。 1 2 4 4l 心构象的改变伴随着在靶细胞膜上形成跨膜孔 对比l u l ( f 和h l a 前体的三维结构，预测l u k f 构象的改变。l u k f 和h l a 前体结构的折叠更 强调了这样一个结论，尽管成熟多肽只有3 】7 的同源性，但它们的核心是相似的。b 夹心和其 边缘区域在l u k f 单体和七聚体形成一个严格的整体，这是由于在b 夹心和其边缘区域一定数目 的氨基酸残基发生了一些小的变化口”。位于核心的b 折叠的前端是疏水性的。 l u k f 和l u k s 是金黄色葡萄球菌分泌到细胞外的水溶性蛋白，在人类的红细胞表面以3 ：4 或 4 ：3 的比例形成七孔膜结构。最近s u 窟a w a r a - t o m i l a 等的报道，分别提出6 个和7 个由l u l ( f 和 l u k s 构成的亚单位拼凑出一个单孔”“。在另一篇报道中，m i l e s 等p ”基于凝胶电泳转移和在单 孔道记录的特殊位点的化学修饰结果，而不是通过直接成像，提出一个由葡萄球菌杀白细胞素 l u k f 和l l l l 【s 在脂质双分子层上形成八聚体孔状结构。通过电子显微镜观察可以观察到在溶液 中存在的l u k f 单体的晶体状结构。许多方法如超速离心方法已经被用来检测在和d n a 形成寡 聚蛋白时的单体、四聚体、八聚体，但是低聚物不能被很好的分离，并且获得单体要求的技术含 量比较高。由于许多因素的限制，电子显微镜不能观察到一个单体形成四聚体的过程。使用权威 性的s i n g l e f r e t 方法，异源七聚物毒素包括两个截然不同的部分，比同源低聚物更具有研究价 值( 如：h l a ) ，因为各自的成分可以作为各自的荧光物的受体。进一步说，一个小孔的环形结构 应该非常稳定以使表面区域的自由能减少到最小。在小孔形成阶段中，l u k f 的跨膜结构域插入到 膜中构成一个桶状的通道，并从前体孔转变形成为一个有溶血作用功能的孔，而且跨膜域插 x 黑龙江八一农垦大学坝e 学位论文第一章前言 1 2 5 3 致病效应 杀细胞素在葡萄球菌感染中有其重要的致病作用，其主要表现形式是直接杀灭大量的中性粒 细胞和巨噬细胞，这些死亡细胞的残存成分可以形成脓栓和导致中毒性炎症反应及组织坏死等病 变，其次为破坏机体的防御屏障和免疫应答过程。体外实验证明极微量的杀白细胞紊即可引起粒 细胞的形态学变化，若大剂量连续注射，可使家兔骨髓中的原粒细胞系受到损害1 3 7 】。杀白细胞 素在人体内的致病作用及过程，尚不太清楚。在严重化脓性感染中大量巨噬细胞被破坏时，对特 异性免疫的影响及其与变态反应的关系有待进一步研究。 1 2 5 4 免疫活性 杀白细胞素为大分子蛋白质，可刺激机体产生特异性抗体。早年的研究已证实，抗杀白细胞 素抗体在抗葡萄球菌免疫中有重要意义。j o h a n o v s 时等p ”的研究指出，杀白细胞素抗体效价与 金黄色葡萄球菌的易感性之间有密切关系。当妊娠期母体抗杀白细胞素抗体效价达到一定量时， 可明显降低母婴葡萄球菌感染的发生率。近年来研究证实，抗杀自细胞素抗体能阻断葡萄球菌 的再发性感染。 1 2 6 杀自细胞索与细胞膜的结合 杀白细胞素和细胞膜结合的过程非常复杂，至少能辨别出三种现象。第一，在溶液中，大多 数在细胞膜上的杀自细胞紊仍处于不激活状态，但当膜的温度达到1 0 0 时，就有一部分杀白细 胞素的两个组成部分相互作用以保持稳定性p w 。第二，吸附杀白细胞素，杀白细胞素的两个组 分相互协调作用，在一定范围内此过程不是一个激活的过程，而是一个磷酸化的过程【4 ”。第三， 通过十倍数量的细胞膜来吸附杀白细胞素，可以通过溶液离子浓度来调节聚合，这是因为在细胞 膜表面存在脂质成分j 。 d o d a 等口5 j 用从家兔中性粒细胞膜上提取的膜糖脂( 神经节苷脂和卵磷脂) 及霍乱毒素b 亚单 位等拟受体化台物所做的受体竞争实验表明，s 组分的特异性受体主要是细胞膜上的神经节苷脂 g m l ，而f 组分主要是卵磷脂，其中神经节苷脂g m 2 对s 组分与霍乱毒素b 亚单位具有相同的受体 效应。杀白细胞毒性效应必须通过对靶细胞的吸附作用，与相应的细胞受体结合后才能得以发挥。 而以s c a c c h a r d 法j 标记的杀白细胞素尤能加强对白细胞的吸附性，其中s 组分的吸附率较高。每个 白细胞可吸附5 3 0 0 个毒素分子。但若加入g m l 等拟受体化合物可明显抑制杀白细胞素的吸附作 用及杀细胞活性1 4 “。 杀白细胞素与分离的细胞膜两者相互作用的结果，揭示细胞膜的某些成分和纯化脂类可影响 杀自细胞素的活性效应。在低离子强度下，磷脂丝氨酸、二磷酸肌苷、三磷酸肌苷以及部分提纯 的单磷酸肌苷和磷脂酰胆碱均可使f 组分变成不稳定的多聚物而丧失活性，而s 组分在此过程中， 可使三磷酸肌苷的构型改变，从而启动新的生化反应。三磷酸肌苷是白细胞膜中代谢极为活跃的 一种物质，其磷酸基团的交换率极高，与许多发生予细胞膜内外的生化反应密切相关，当受到s 组分作用时，可诱发磷酸基团的静电排斥反应，导致分子的结构发生变化，使其出现与自由肌苷 之“椅”型结构所不同的构型。进一步研究表明，三磷酸肌苷可能具有杀白细胞作用的反应点，在 细胞膜上具有杀自细胞作用的反应点，并在细胞膜上具有控制k + 通道的“扳机”效应，当受白细胞 作用后，迅速引起细胞膜上的连锁反应1 42 “j 。 6 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章前言 白细胞能够吞噬异物，在机体抵御病原入侵和炎症反应过程中起着重要作用。杀白细胞素是 金黄色葡萄球菌的一种重要致病因子，可以使白细胞失去吞噬功能，破坏中性粒细胞和巨噬细胞， 进而破坏免疫系统，引起多种疾病。杀白细胞素包括f 蛋白和s 蛋白，两者协同作用于白细胞膜 表面形成孔状结构，溶解白细胞。由于杀白细胞素对白细胞的高度敏感性，有望用于白血病的治 疗；毒素组分纯化后，制备类毒素，可能适用于葡萄球菌化脓性感染的预防。但由于金黄色葡萄 球菌在培养过程中产生的杀自细胞素量比较小，且需要繁琐的纯化过程。因此，有必要进行杀白 细胞素基因的克隆和表达研究。本实验扩增和克隆了上“肝和“船基因，将其插入p e t 3 2 “+ ) 载体， 转化到大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中进行表达。为进一步研究杀自细胞素的功能机理及其杀白细胞素的 免疫原性提供参考。 黑龙西一登毕再要印毒囊俘唯翼 弟一；善鲥 季嚣需霉羹萎荔型赝糊稽丰毒导珏谍! 餮粪等_ 圣薹囊琴蓦錾箩童堇塞萋薹蓬薰礓乍璃罐嫡 ! i 嶷! 醵曲姜翠；l 誊捏虽铧* 釜l “耋台磊榉萋 毫蚕曩羹拍瓠砰 薛采巍誊曼露塞i 基 受体荫嚣 自誊一i i 弱豢蠢蛩出j 墨誊婪坛跚攀琢焉壤青黪肇蠢函鞭i ；i 。垂雾攀婪藉：i ；薹融；l ￥ 珊驰震旁鸶妻至i 噬j 港毛躬鏊耄篓公量遁1 偿清必w 瑾罨性鲤篓鋈j 塞蚕誊藿囊i ! i f | 叫葬 虬骐蓬謦蕊冀2 j ； l = l i g 醚爱克曜烈篓蠢话 j i ；i 犁，i ；j i i 嚣可 8 萼! t j j “粪叫嚣饔篓黍鋈露委蓊翼；囊谚律蠹型菩晒鐾囊赢塞擦j 驾 囊囊到罄替季焉驰? i i l 目季：名 j ：二；囊一垄蒜西瓤警警篓麓墨；萎染料购菲了e 索赛百盛基鞋 钉奏i 囊 琊薹! i | ：i i ! 妾i 州 摹萎l l ；i l l 霉；i ；蠹醴i 薹；l 要i i o 豢嘲管羹：馏等磷囊j | 口= 要型轻誊囊 耄警雅鳟“著鍪囊；! = b l g 自；l 嘎蠢角；。目目；章l ；誊# g a 蚤4 j ”囊；瓦引瓤囊蓉瑟篡 毒；蠢遣菊们耄摹囊籁篓冀囊墅目| ， k 国i 蕾g ? l l j 饕1 。l = 目港! ! 罐曩m 谢= 布有限垒荔聪锄越笼 托鬈薹镕崩雾埋目积蠢筌芋# 鑫蠹i ； l 囊薹，；? 1 妻? ；王薹订蚕霓磊纛孺琵爱镊镤暨璧孥袭錾 嚣冀蠢：妻薰量；娶缒琵嚣攀域篇漾鲤霸z 。；受豇墅荤罄弦爿墼辩警察謇基誊要妻狰塞翟l 五 b 拍薹崭嚣蟊离每垒篓啮墓薹翼；蕾誉融尚陵藿“羹簿萋囊；i 。i ；舞；i ；j 锄ji ；! ；j g s ；5 ；狷誓 靶 强盟垦强国干磊霉喙繁罐萋癸沿罄士髦粤张醛季羽誉羹垂；羹韵型壤理掸穗骆挚昼璎在鳕 牡堡：嚯掣罐骜窆墨目i 8 雇瑚橱蔼净? 硬纂尸囊誊 抚引彰酐引蠹善确泌蓼毫海尔囊篱嘈懦垫 篓器矬静。单酗? 晕p 争乳导掣参晕霪叫冀攀磊羊上挥精謇誊蠢堪 ， 球强菇西潞触? 碰萋吾i 篱薹强话二带秦蕻垂一珥萋右鞫踵娶弹魑强握塑；羁q q ；i 型；i ；莆 涌：，式蓉貅雾溢鞋辇妻需列鬻；夔鋈霪公i 纛篓鎏巷i 资磐搿翼常籍自雨；i “妻固繁醛匍 霎拍绷i 眈零萤晶焦搴妒黧蒋“引蟊1 x 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第二章材料与方法 配制量 1 l 配制方法1 量取下列溶液，置于1 l 烧杯中。 组份 冰乙酸 甲醇 d h ，0 1 0 0 m l 4 5 0 m l 2 充分混合后使用。 2 1 6 1 8 转移缓冲液 配制量 l l 配制方法1 量取下列溶液，置于1 l 烧杯中。 组分 甘氨酸 t r i s 碱 s d s 甲醇 2 9 9 5 8 9 o 3 7 9 2 0 0 m l 2 混匀，加水至总量为1 l 。 2 1 6 1 90 0 1 m o l 几p b s o p h 7 4 ) ： 配制量 1 l 配制方法1 量取下列溶液，置于l l 烧杯中。 组分 剂量 n a c l k c l n a 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 8 o g o 2 9 1 4 4 9 02 4 9 2 加去离子水定容至1 0 0 0 m l 2 1 6 - 2 0p b s t 含o 0 5 1 h e 蛐- 2 0 的p b s 2 1 6 2 11 0 丽春红s 贮存液 组分剂量 丽春红s 2 9 三氯乙酸3 0 9 磺基水杨酸3 0 2 加水至1 0 0 m l 。 2 1 6 2 21 m o l ，l 二硫苏糖醇( d t t ) 用2 0 m l 0 0 1 m o l 几乙酸钠溶液( p h5 2 ) 溶解3 0 9 9d t t ，过滤除菌后分装成1 m l 小份贮存于 2 黑龙江八一采垦大学项：l 学位论文 第二章材料与方法 ，“肝p c r 程序： 9 4 预变性】o 分钟后，再以9 4 变性5 0 秒，5 5 追火4 5 秒，7 2 延伸5 0 秒( 1 k b 的p c r 产物，分钟) 进行3 0 个循环，壤后以7 2 延伸l o 分钟，p c r 产物下4 保存。取5 血p c r 扩增 产物于1 琼脂糖凝胶中进行电泳，于紫外灯下观察和拍照。 如七s p c r 程序： 9 4 预变性1 0 分钟后，再毗9 4 变性5 0 秒，5 2 退火4 5 秒，7 2 延伸5 0 秒( 1 k b 的p c r 产物分钟) 进行3 0 个循环，最后以7 2 延伸1 0 分钟，p c r 产物于4 保存。取5 止p c r 扩增 产物于1 琼脂糖凝胶中进行电泳，于紫外灯下观察和拍照。 2 2 4 琼脂糖凝胶电泳 用1 t a e 电泳缓冲液配成所需浓度的琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解之后， 加入e b 染料( s m 酣m l ) 至终浓度为o 5 u g n 1 l ，灌胶：然后，取适量待电泳的d n a 样品与l 6 体积的电泳上样液( 0 2 5 溴酚蓝，o ，2 5 二甲苯青f f ，4 0 蔗糖) 混匀，将混合样本加到上 样槽中，以5 v ，c m 的恒压进行电泳。当溴酚蓝电泳至适当的位置后，用长波紫外线灯观察并记 录结果或凝胶成像系统拍照保存。( 本实验所用的琼脂糖凝胶未加说明均含有终浓度为0 s “咖l 的e b 染料) 。使用1 琼脂糖凝胶电泳分析p c r 产物。 2 - 2 5p c r 产物的回收与纯化 用d n a 凝胶回收试剂盒( d n ag e le x 奸a n i o nk i t ) 回收和纯化d 悄a ，其过程如下： i 在紫外灯下切取含有目的d n a 片段的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。( 尽量减小凝胶 体积，大体积的凝胶块需切成小块，以缩短步骤4 中凝胶融化的时间。) 称量凝胶重量，以】m g = 】灶换算凝胶体积。 根据凝胶浓度，按下表所提供的参数加b u 船rd e - a ： 凝胶浓度b u 疵r d e a 体积 兰1 0 1 15 盟0 3 个凝胶体积 4 个凝胶体积 5 个凝胶体积 悬浮均匀后于7 5 加热，每隔2 3 分钟混合一次，直至凝胶块完全融化为止( 约6 8 分钟) 。 凝胶块必须完全融化，以充分释放凝胶中的d n a 。 v 按b u 仃e r d e - a 体积的5 0 加入b u 腩r d e - b ，混合均匀。 将d n a - p r 印t u b e 置于2 一m lm i c r o f u g et u b e 中，将步骤v 中的混合液移入d n a - p r e pt u b e 中，2 5 0 0 g 离心1 分钟。( 如在d n a _ p r e p t u b e 中仍残留溶液，适当升高离心速度，再离心一次， 使所有溶液过滤到2 m lm i c r o m 2 et u b e 中。) v 弃滤液，将d n a p r e pt u k 置回到原2 m lm j c r o f u 窑et u k 中，加入s o o 吐b u 髓rw 1 ，2 5 0 0 。g 离心1 分钟。( 如在d n a - p r e pt u b e 中仍残留溶液，适当升高离心速度，再离心一次，使所有溶 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第二章材料与方法 液过滤到2 一m l m i c r o f u g et u b e 中。) h 弃滤液，将d n a p ”p t 曲e 置回到原2 m l m c r o f h g e t u b e 中，加入7 0 0 止已加无水乙醇的 b u 髋r w 2 ，2 5 0 0 2 离心1 分钟，以同样的方法再用7 0 0 此b u 髋r w 2 洗涤一次。 将d n a p r e p t u b e 置于1 5 m l 离心管中，1 2 ，0 0 0 g 离心1 分钟。 x 将d n a p r e pt u b e 置于另一洁净的l ，5 m l 离心管中，在s i l i c a 膜中央加入2 5 3 0 旺去离子水， 室温静置1 分钟。1 2 ，0 0 0 2 离心1 分钟洗脱d n a 。 2 2 6 克隆载体的构建 2 2 6 1 感受态细胞的制备( c a c l 2 法制备感受态细胞) ( 1 ) 取b l 2 1 ( d e 3 ) 单菌落，接种于蜘ll b 液体培养基上，3 7 振荡培养过夜； ( 2 ) 在试管中加入8 m l l b 液体培养基及8 0 此复苏的b l 2 1 ( d e 3 ) 细菌； ( 3 ) 在3 7 恒温振荡器上以1 6 0 转分钟振荡培养2 - 3 小时； ( 4 ) 取出】2 m l 菌液检测光密度值( o d 6 0 0 ) ，当o d 6 0 0 介于o 3 - o 4 之间时，将培养管置于冰浴 中2 0 分钟； ( 5 ) 取两个无菌的1 5 m l 离心管，各装入1 5 m l 菌液，4 ，o o o 转分钟离心5 分钟。重复收集菌一 体后将管倒置于滤纸上，使管内培养液流尽： ( 6 ) 每管加入1 5 m l7 5 m m o l 几c a c l 2 溶液( 4 贮存) ，轻轻吹打重悬细菌，然后冰浴2 5 分钟， 4 ，o o o 转份钟离心5 分钟，弃上清； ( 7 ) 重复步骤( 6 ) ( 8 ) 每管加入o 2 m l7 5 m m o l 几c a c l 2 溶液( 4 贮存) ，重悬细菌沉淀。 至此可获得两管共4 0 0 血的感受态细胞。 2 2 6 - 2 连接 在o 5 m l 离心管中按m s e n d n a 与p m d l 8 t 载体摩尔比约为3 ：1 依次加入下列成分：灭菌 双蒸水2 3 灿，p m d l 8 t 载体0 7 灿，目的片段d n a2 “l ，s o l 删o n ( 含l i g a s e ) 5 灶，混匀后瞬 时离心，1 6 水浴过夜，次日即可做转化。 2 2 6 - 3 转化 做连接产物的全量转化。于7 0 冰箱中取出一支1 0 0 吐的感受态细胞手心融化后立即放 入冰盒中，把连接产物全量加入到1 0 0 旺感受态细胞中，轻旋混匀，置冰上放置3 0 分钟，然后 4 2 热休克9 0 秒，注意不要摇动，立即冰浴2 分钟，加入l m l 事先3 7 水浴的l b 液体培养基 中，3 7 空气摇床振荡( 1 0 0 r p m ) 培养l 小时，瞬时离心，将上清液留约2 0 0 旺，其余倒掉，旋涡 震荡混匀菌体，将其涂布于l b a m p + 平板培养基上( 终浓度为a m ro1 m g m l ) ，3 7 温箱中培 养过夜。 2 2 6 4 重组质粒的小量翻备 挑取转化板上的白色菌落，无菌接至3 m ll b a m p + ( a m ，终浓度为o 1 m m l ) 液体培养 基中，震荡培养2 4 小时后，采用碱裂解法小量提取制各质粒。 取】5 m l 菌液于离心管中，1 2 ，o o o 转份钟离心1 分钟，尽弃上清，稍微干燥菌体沉淀后， 加入1 0 0 此溶液i ，充分震荡悬浮菌体，使所有菌体沉淀均匀散开；再加入新鲜配置的溶液l l 2 0 0 灶，缓慢颠倒混和几次后，加入溶液l i i ，混匀后放置冰上1 0 分钟，1 2 ，0 0 0 转，分钟离心1 5 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章材料与方法 分钟，转移上清于另一新的离心管中，加入等体积的酚：氯仿混匀后，1 2 ，0 0 0 转分钟1 0 分钟， 取上清，再加入等体积的氯仿再抽提一次，转移上清于另一离心管中，加入至少1 m l 冷无水乙 醇，混匀后，2 0 沉淀3 0 分钟，1 2 ，o o o 转，分钟离心1 5 分钟，小心弃掉上清，用适量的7 0 乙 醇洗涤一次，自然干燥后加入适量灭菌双蒸水溶解。取2 此质粒，】琼脂糖凝胶电泳对质粒进 行鉴定。 2 2 6 5 重组质粒的鉴定 l 重组质粒的p c r 鉴定 取重组质粒1 山，作1 0 0 。稀释后，再用1 皿作模板。在p c r 管中依次加入以下组份： 组成成分 灭菌去离子水 1 0 p c rb u & d n ”s ( 每种浓度为2 5 m m ) 上游引物( 1 0 州) 下游引物( 1 0 州) 模扳d n a 【2 0 0 n i i l ) l a 网d n a 聚合酶( 5 u ，皿) 反应总体积 p c r 程序同上。 重组质粒的酶切鉴定 依据设计在引物两端的限制性内切酶位点，用m hi 、肋切割所提取的质粒d n a ，以 便鉴定重组质粒是否正确。 酶切体系如下： 组成成分 重组质粒 1 0 m cb u 彘r 且m h i s d ，i 灭菌去离子水 总体积 6 u l 1 u l 1u j 。 1 u l l u l 1 0 u l 混匀后3 7 水浴3 小时，取出5 u l 上样，1 凝胶电泳鉴定。 2 2 6 6 重组克隆的序列测定和序列分析 按上海生工生物工程技术服务有限公司的要求，取鉴定为阳性的重组克隆1 个，无菌操作保 存为甘油保存菌( 4 0 甘油与l b 液体菌以体积比1 ：1 的比例混合) ，装至1 5 m le p 管中，封 口膜封口后，e m s 邮寄测序。所获序列用b 1 a s t 程序与g e n b a n k 中己发表的标准序列进行比较。 6 螺姒呲呲呲呲啡灿 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第二章材料与方法 2 2 7 表达载体的构建 1 ) 将p e t 3 2 a ( + ) 载体质粒热转化至b l 2 1 ( d e 。) 感受态细胞中，3 7 摇床中振荡培养过夜后，提取 质粒。 2 ) 将质粒p e t 3 2 a ( + ) 用屁槲i 和曲进行双酶切，使用d n a 纯化回收试剂盒回收载体。 3 ) 将重组克隆质粒p m d l 8 一t 一时用屁棚i 和妇进行双酶切，使用d n a 纯化回收试剂盒回收 杀白细胞素基因片段。 4 ) 使用t 4d n al i g a s e ，将插入片段金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因与载体p e t 3 2 a ( + ) 连接后， 热转化至b l 2 1 ( d e 。) 感受态细胞中，涂布平板过夜培养菌体。 5 ) 挑取白色菌落，提取质粒。 6 ) 质粒用脚i i 和曲i 进行双酶切检测，确认目的片段有无插入载体中。 7 ) p c r 鉴定重组表达质粒p e t 3 2 a ( + ) 一出。 8 ) 重组表达质粒的序列测定和序列分析 按上海生工生物工程技术服务有限公司的要求，取鉴定为阳性的重组表达质粒1 个，无菌操 作保存为甘油保存菌( 4 0 甘油与l b 液体菌以体积比1 ：1 的比例混合) ，装至l _ 5 m le p 管中，封 口膜封口后，酬s 邮寄测序。所获序列用b l a s t 程序与g e n b a n k 中己发表的标准序列进行比较。 2 2 8 重组蛋白的诱导表达和全菌s d s 。p ：a g e 2 2 8 1 表达蛋白的提取 测序结束后，对于序列正确的菌落接种于含a m p + 的液体l b 培养基中，3 7 振荡培养过夜。 第二天取1 m l 接种于1 0 0 i l l l 含a m p + 的l b 液体培养基中，以2 0 0 转，分钟振荡培养至o d 6 0 0 值 为0 6 0 - 8 之间，取样2 m l ；而后，加入l p t g 至终浓度l m m ，继续以2 0 0 转份钟振荡培养，在 3 小时取样1 m l 。1 0 ，0 0 0 转份钟( 4 ) 离心1 分钟，收集菌体沉淀，加入9 0 旺上样液，1 0 此d t t 悬浮混匀，煮沸5 分钟，1 0 ，0 0 0 转，分钟( 4 ) 离心1 分钟，上样1 0 此，进行s d s p a g e 电泳。 2 2 & 2s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 采用常规s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 检测表达产物。分离胶浓度为1 0 ，浓 缩胶浓度为5 。方法参照参考文献【4 ”进行。样品准备好之后，用微量加样器加样，每孔加样品 1 0 皿。样品在浓缩胶中采用8 v ，c m 的电压进行电泳，在分离胶中采用1 5 v c m 的电压进行电泳。 待溴酚蓝至分离胶底部约1 c m 时，停止电泳。 2 2 3 染色 取下聚丙烯酰胺凝胶，放在有考马斯亮蓝r - 2 5 0 染色液的染色池中染色4 小时，在脱色摇床 上染色过夜。放出染色液，到入脱色液，在摇床上脱色。期问，经常更换脱色液，待条带清楚时， 停止脱色，用清水冲洗、照相。 2 2 9 重组蛋白的w e s t e mb l o t 检测 1 ) s d s p a g e 电泳。 2 ) 在转移槽的阴极板上按以下顺序放置下物：浸过缓冲液的3 张滤纸、凝胶、膜、浸过缓 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第二章材料与方法 冲液的3 张滤纸，尽可能排尽气泡，盖上正极盖，电压8 5 伏4 通电2 小时，胶中的蛋白质将 转移至膜上。 3 ) 转移终了，凝胶进行蛋白质染色以确定转移效率，膜可用立春红s 显色，观察显色结果， 而后用去离子水冲洗干净。 4 ) 封闭：将n c 膜放入玻璃平皿中，根据滤膜面积以o 1 m l c m 2 量加入封闭液，排尽气泡， 然后密闭平皿，在水平摇床上缓缓摇动，室温封闭1 5 小时。 5 ) 抗体的结合：用封闭液将一抗适当稀释( 1 ：5 0 0 ) ，将已封闭的膜置抗体溶液( 溶液量根 据滤膜面积以o 1 m l ，c m 2 计算) 中，排尽气泡，密闭袋口室温缓缓摇动2 小时。 6 ) 洗去未结合的抗体：用漂洗液( p b s t ) 2 5 0m l 振摇洗3 次，每次1 0 分钟。 7 ) 二抗的结合：用封闭液将二抗1 ：8 0 0 稀释，将已封闭的膜置抗体溶液( 溶液量根据滤膜 面积以o 1 m u c m 2 计算) 中，室温缓缓摇动1 小时。 8 ) 洗去未结合的二抗：将滤膜转移至浅平皿中，用漂洗液( p b s ) 振摇洗3 次，每次1 0 分 钟。 9 ) 显色反应：膜浸入显色液中，观察颜色区带的出现，充分