（分析化学专业论文）核酸分子探针结合信号放大技术用于核酸的检测.pdf

s i g n a la m p l i f i c a t i o nf o rn u c l e i c a c i d s a n a l y s i sb a s e d o n m o l e c u l a rp r o b e s b y b a oy a n y a n b s ( h u n a nu n i v e r s i t y ) 2 0 0 9 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no f t h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e l n a n a l y t i c a lc h e m i s t r y i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o ry a n gx i a o h a i p r o f e s s o rw a n gk e m i n m a y ，2 0 1 1 咖0 23mm，0哪9 川-舢y 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律后果由本人承担。 作者签名：匆侈陋柜日期：年夕月弓f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编 本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密r - i ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密匐 ( 请在以上相应方框内打“、”) 作者签名：钝= | 否襁 导师签名：训q 娩 叠畸，弦 日期：2 。f 年j - 月；f 日 日期：c i lo t1 年，月夕j 日 r ， 核酸分子探针结合信号放大技术用于核酸的检测 摘要 核酸的检测涉及到疾病诊断、基因筛查、环境检测等诸多领域，与人类健康、 社会安定息息相关。传统的核酸检测方法灵敏度低、操作复杂、耗时费力。实现 核酸的灵敏、精确、便捷、经济的检测已成为各个领域愈加迫切的要求。近年来 发展起来的利用各种工具酶、纳米颗粒等手段的核酸信号放大检测技术为此提供 了新的契机。本论文将脱氧核酶与切刻内切酶相结合发展了3 种信号放大方法用 于核酸的检测，包括： 一、基于脱氧核酶电化学信号放大检测d n a 设计新型核酸探针，建立了一种以脱氧核酶催化反应作为信号放大手段，以 电化学计时电流法为检测手段的d n a 检测新方法。这种结合了脱氧核酶的核酸探 针无需经过电活性物质标记，与靶d n a 杂交后释放出脱氧核酶，催化底物反应实 现信号放大检测。该方法操作简便，无需复杂仪器、快速，特异性好，检测下限 达n o 6n m o l l 。 二、基于脱氧核酶和链置换聚合酶反应比色法信号放大检测m i r n a 结合脱氧核酶与切刻酶介导的聚合酶链置换反应，发展了一种m i r n a 检测 的新方法。当靶m i r n a 存在时，与嵌合探针杂交，并通过r n a s e h 作用，引发切 刻反应链置换聚合酶反应循环进行，不断产生脱氧核酶序列。这些序列具有类似 于过氧化物酶的活性，可以催化底物发生颜色的变化，产生可检测信号。该方法 不需变温、分离等复杂的操作步骤，方法简便，快捷，特异性较好，检测下限达 到2f m o l l 。 三、基于分子信标和链置换聚合酶反应荧光信号放大检测m i r n a 设计了一条d n a 与r n a 嵌段的探针，作为靶m i r n a 的识别探针和链置换 聚合反应的模板，利用r n a s e h 和切刻内切酶介导的链置换聚合酶反应，发展了 一种等温循环放大的m i r n a 荧光检测新方法。该方法避免了常规核酸扩增检测 方法易产生假阳性反应或容易导致污染的问题，不需分离等复杂的操作步骤，在 等温下反应，方法快捷，特异性好，对靶m i r n a 检测下限为o 5f m o l l 。 关键词：核酸探针；信号放大；脱氧核酶；链置换聚合酶；d n a ；m i r n a ； i i a b s t r a c t d e t e c t i o no fn u c l e i ca c i d s ，i n v o l v i n gi nd i s e a s ed i a g n o s i s ，g e n e t i cs c r e e n i n g ， e n v i r o n m e n t a lt e s t i n ga n do t h e rf i e l d s ，i sc l o s e l yr e l a t e dt oh u m a nh e a l t ha n ds o c i a l s t a b i l i t y t r a d i t i o n a ln u c l e i ca c i dd e t e c t i o nm e t h o d sa r el i m i t e dd u e t ol o ws e n s i t i v i t y , c o m p l i c a t e do p e r a t i o n ，t i m e c o n s u m i n g t h e r e f o r e ，t h ed e v e l o p m e n to fn e w n u c l e i c a c i dd e t e c t i o nm e t h o d sa t t r a c t se x t e n s i v ea t t e n t i o n t oa c h i e v es e n s i t i v e ，a c c u r a t e ， c o n v e n i e n ta n de c o n o m i c a ld e t e c t i o nh a sb e c o m ei n c r e a s i n g l yu r g e n td e m a n d i n gi n v a r i o u sf i e l d s i nr e c e n ty e a r s ，t h ed e v e l o p m e n to fs i g n a la m p l i f i c a t i o nd e t e c t i o n t e c h n o l o g i e sb a s e do nv a r i o u se n z y m e sa n dn a n o p a r t i c l e s ，o f f e r e dan e wo p p o r t u n i t y t oa c h i e v es i m p l e ，f a s t ，a n dh i g h l ys e n s i t i v ed e t e c t i o no fn u c l e i ca c i d s i nt h i st h e s i s ， t oa d d r e s st h e s ei m p o r t a n ts c i e n t i f i ci s s u e s ，as e r i e so fs i g n a la m p l i f y i n gd e t e c t i o n m e t h o d sb a s e do nd e o x y r i b o z y m ea n d t h ee n z y m e m e d i a t e dp o l y m e r a s ec h a i n r e p l a c e m e n tf o rn u c l e i ca c i d ，t h ev e r yi m p o r t a n tc o m p o n e n to fl i f e ，w e r ed e v e l o p e d ， c o m b i n i n gn u c l e i ca c i dm o l e c u l a rp r o b e sa n dt h es e q u e n c es p e c i f i cr e c o g n i t i o na n d a m p l i f i c a t i o n o fn u c l e i ca c i de n z y m e s ，w i t he l e c t r o c h e m i c a l ，c o l o r i m e t r i e ，a n d f l u o r e s c e n c ea sd e t e c t i o nm e a n s t h em a i nc o n t e n tw a ss u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 s i g n a l a m p l i f i e de l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n f o rd n ab a s e do np e r o x i d a s e l i k e d n a z y m e an o v e l 。e l e c t r o c h e m i c a ld n ad e t e c t i o na s s a yw a sd e v e l o p e db a s e do n ah a i r p i n s t r u c t u r ep r o b ew i t hc h r o n o a m p e r o m e t r i ca sd e t e c t i o nt e c h n i q u e u p o nh y b r i d i z a t i o n w i t ht h et a r g e t ，t h eh a i r p i ns t r u c t u r ew a so p e n e d ，a n dt h eg 。q u a d r u p l e x 。b a s e d d n a z y m ew a sg e n e r a t e d ，t r i g g e r i n gt h ee l e c t r o c h e m i c a lo x i d i z a t i o no fh y d r o q u i n o n e b yh 2 0 2 ，a n dr e a l i z i n gq u a n t i t a t i v em e a s u r ef o rt a r g e td n a t h i sm e t h o dd o e s n t n e e dd i r e c tc o n j u g a t i o no fr e d o x a c t i v ee l e m e n t ，e a s yt om a n i p u l a t e ，f a s t ，a n ds p e c i f i c f o rt a r g e td n a ，w i t had e t e c t i o nl i m i to f0 6n m o l l 2 s i g n a la m p l i f i e dc o l o r i m e t r i cd e t e c t i o n f o rm i r n ab a s e do np e r o x i d a s e l i k e d n a z y m ea n ds t r a n d - d i s p l a c e m e n tp o l y m e r a s e r e a c t i o n c o m b i n i n gp e r o x i d a s e 1 i k ed n a z y m ea n ds t r a n d d i s p l a c e m e n tp o l y m e r a s er e a c t i o n ， an e wm i r n aa s s a yw a sd e v e l o p e d i n t h e p r e s e n c e o f t a r g e tm i r n a ， s t r a n d d i s p l a c e m e n tp o l y m e r a s er e a c t i o n w a st r i g g e r e dw i t ht a r g e tm i r n aa st h e p r i m e r a n dt h ed n a r n ac h i m e r i c a lp r o b ea st e m p l a t e ，p r o d u c i n gn u m e r o u s p e r o x i d a s e 1 i k ed n a z y m es e q u e n c e s a n dt h e nc a t a l y z i n gt h eo x i d a t i o nr e a c t i o n w h i c hi nt u r nl e a d e dd e t e c t i v ec o l o rc h a n g e s t h i sa s s a yi ss i m p l e ，c o n v e n i e n c e ， 1 i i 核酸分子探针结合信号放大技术用于核酸的检测 s e l e c t i v e ，w i t hn on e e df o rs e p a r a t i o no rc o m p l e xm a n i p u l a t i o n t h ed e t e c t i o nl i m i t f o rm i r n ai sa sl o wa s2f m o l l 3 s i g n a la m p l i f i e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nf o rm i r n ab a s e do nm o l e c u l a rb e a c o n s a n ds t r a n d - d i s p l a c e m e n tp o l y m e r a s er e a c t i o n w i t ht h e a i do fr n a s e ha n dn i c k i n g e n z y m em e d i a t e dc i r c u l a rs t r a n d - d i s p l a c e m e n t p o l y m e r a s er e a c t i o n ，an e wi s o t h e r m a lc i r c u l a ra m p l i f i c a t i o nm i r n ad e t e c t i o na s s a yw a s d e v e l o p e dw i t had n a - r n ac h i m e r i c a lp r o b ea s t h ep r o b ef o rt a r g e t m i r n aa n dt h e t e m p l a t eo fs t r a n d - d i s p l a c e m e n tp o l y m e r a s er e a c t i o n t h i sa s s a ya v o i d e dt h ef a l s ep o s i t i v e s i g n a la n dp o l l u t i o nr e s u l t i n gf r o mr e g u l a rn u c l e i ca c i da m p l i f i c a t i o n f u r t h e r m o r e ，i tc a r lb e e x p e c t e dt op r o v i d eas i m p l e ，f a s t ，s p e c i f i cd e t e c t i o nm e t h o df o rm i r n a w i t had e t e c t i o nl i m i t o fo 5f m o l l k e yw o r d s ：n u c l e i ca c i dp r o b e ；d n a z y m e ；s t r a n d d i s p l a c e m e n tp o l y m e r a s e ；d n a ； m i r n a i v 摘要i i a b s t r a e t i i i 第1 章绪论1 1 1 核酸检测的意义1 1 2 核酸检测的主要方法1 1 2 1 基于直接核酸杂交的检测方法1 1 2 2 基于核酸体外扩增技术的核酸检测方法3 1 3 核酸信号放大检测技术及其在核酸分析检测中的应用一6 1 3 1 基于切刻酶介导的链置换聚合酶反应信号放大检测一6 1 3 2 基于引物入侵技术的信号放大检测一9 1 3 3 基于脱氧核酶( d n a z y m e ) 催化的信号放大检测1 0 1 3 4 基于滚换扩增( r c a ) 篚j 信号放大检测1 2 1 4 本文拟开展的工作1 4 第2 章基于脱氧核酶电化学信号放大检测d n a 1 6 2 1 前言16 2 2 实验部分1 6 2 2 1 试剂和仪器1 6 2 2 2 实验方法1 8 2 3 结果与讨论1 8 2 3 1 检测原理1 8 2 3 2 发夹形探针序列的筛选1 9 2 3 3g 四聚体复合物形成的电化学表征2 0 2 3 4 可行性考察2 l 2 3 5 实验条件的优化2 2 2 3 6d n a 的定量检测2 4 2 3 7 方法特异性考察2 4 2 3 8 电极的再生2 5 2 4 小结2 5 v 核酸分子探针结合信号放大技术用于核酸的检测 第3 章基于脱氧核酶和链置换聚合酶反应比色法信号放大检测m i r n a 2 6 3 1 前言2 6 3 2 实验部分2 6 3 2 1 试剂和仪器2 6 3 2 2 实验方法2 7 3 3 结果与讨论2 8 3 3 1 检测原理2 8 3 3 2 方法的可行性考察2 9 3 3 3d n a r n a 嵌合探针浓度的优化3 0 3 3 4m i r n a 的定量检测3 1 3 3 4 方法特异性考察3 2 3 4 小结3 2 第4 章基于分子信标和链置换聚合酶反应荧光信号放大检测m i r n a 3 3 4 1 前言3 3 4 2 实验部分3 3 4 2 1 试剂和仪器3 3 4 2 2 实验方法3 4 4 3 结果与讨论j 3 5 4 3 1 检测原理3 5 4 3 2 分子信标的设计和性能考察3 6 4 3 3 方法可行性考察3 8 4 3 3 嵌合探针的浓度优化3 8 4 3 4m i r n a 的定量检测3 9 3 3 5 方法特异性考察4 0 4 4 小结4 l 结论4 2 参考文献4 3 附录攻读硕士学位期间所发表的学术论文及专利5 5 致谢5 6 v i i _ _ 。一 硕士学位论文 本文所用英文缩略词表 缩略词名称缩略词名称 a b t s 2 ，2 州嗪? 苯基噻唑磺 b p碱基对 p碱基对 酸6 ) 1 c 。n a互补脱氧核糖核酸d a b c y l 4 - ( 4 鬻基偶 d m s o二甲基亚枫d n a脱氧核糖核酸 d n t p三磷酸脱氧核糖核苷d t t二硫苏糖醇 e d t a乙二胺四乙酸f a m荧光素 k f k 1 e n 。w 大尊段? n a 聚合酶 l n a锁核酸k f l n a锁核酸 ( e x o 。) m i r n a微小核糖核酸m b分子信标 n a s b a核酸依赖扩增技术n t核苷 m r n a信使r n ap b s磷酸缓冲液 p c r聚合酶链式反应r c a滚环扩增 r i s c 基因沉默复合物 r n a 核糖核酸 r n a s eh核糖核酸酶hr r n a核糖体r n a s b r信背比trna转运r n a s e l e x指数富集配体系统进化技术t r i s三羟甲基氨基甲烷 【一 硕士学位论文 1 1 核酸检测的意义 第1 章绪论 核酸分子携带有遗传信息，是生物物种延续、进化的决定因素。核酸主要包 括脱氧核糖核酸( d e o x y f i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 和核糖核酸( r i b o n u c l e i ea c i d ，r n a ) 两大类。d n a 是生物遗传信息的载体，主要集中在细胞核内，在生物的生长、发 育、繁殖、遗传和变异等生命活动中占有极其重要的地位，并与生物的生长，发 育以及癌变等活动相关【l 】。r n a 主要分布在细胞质中，包括有转移核糖核酸 ( t r n a ) 、信使核糖核酸( m r n a ) 、核糖体核糖核酸( r r n a ) 、小核r n a ( s n r n a ) 、 干扰r n a ( s i r n a ) 和微小r n a ( m i r n a ) 等。其中m i r n a 是近年来发现的一类 长度在1 9 2 4 个核苷酸( n t ) 左右的内源性非编码小分子单链r n a 分子，能通过与 靶基因m r n a 特异性的碱基互补配对，引起靶基因m r n a 的降解或者抑制其翻 译，广泛地负调控靶基因的表达，参与细胞的增殖、凋亡、分化、代谢以及个体 发育和病毒感染等过程。另外，有部分特殊m i r n a 表达可以起到癌基因和抑癌基 因的作用【2 3 】。因此对m i r n a 的定量检测能够对研究其生物学功能提供重要信息， 同时为揭示癌症、神经紊乱、心脏疾病的发生机理提供重要依据【4 8 】。 1 2 核酸检测的主要方法 近年来，发展更为完善的核酸检测方法引起了人们的广泛关注。实现核酸的 灵敏、精确、便捷、经济的检测已成为各个领域愈加迫切的要求。目前，核酸的 检测的方法从原理上主要可以分为基于杂交的检测方法和基于核酸体外扩增技术 的检测方法。 1 2 1 基于直接核酸杂交的检测方法 核酸杂交技术是基于核酸碱基互补杂交的特异性而建立的。它是目前大多数 核酸检测技术的基础。通过核酸探针的设计，核酸杂交技术可以实现均相和固相 的d n a 及r n a 定性和定量的检测。目前基于直接核酸杂交的主要方法有： s o u t h e r n 印迹杂交【9 1 、n o r t h e r n 印迹杂交【1 0 】和原位杂交等。 s o u t h e r n 印迹杂交是进行基因组d n a 特定序列定位的通用方法，主要包括两 个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支 持物( 硝酸纤维素膜或尼龙膜) 上，即印迹( b l o t t i n g ) ；二是固定于膜上的核酸 同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程【9 j 。利用 s o u t h e r n 印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及 核酸分子探针结合信号放大技术用于核酸的检测 定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析( r f l p ) 等【1 2 1 ”。该技 术的操作比较烦琐、费时。 n o r t h e r n 印记杂交是将r n a 从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的一种 r n a 检测方法【1 0 1 。此方法是经典的r n a 检测方法，但是此方法灵敏度不高限制 了其广泛应用。锁核酸( l o c k e dn u c l e i ca c i d ，l n a ) 的引入以其高亲和力和热稳 定性极大的提高了n o r t h e r n 印记杂交的灵敏度【l6 1 。但是，由于n o r t h e r n 杂交技术 是基于固相杂交的方法，杂交速度慢。因此，有研究者发展了一种基于液相杂交 的核糖核酸酶保护法( r n a s ep r o t e c t i o na s s a y ，r p a ) 来检测r n a 【1 7 1 。该方法比常 规的n o r t h e r nb l o t t i n g 法更加简便、灵敏、样品量少。 虽然n o r t h e r nb l o t t i n g 和s o u t h e r nb l o t t i n g 是目前常用的核酸检测技术，但是 由于其操作步骤繁琐不适用于高通量分析。微阵列芯片技术( m i c r o a r r a y ) 解决 了这个问题，实现了核酸的高通量分析【1 8 2 1 1 。如c a s t o l d i 等【2 1 】通过杂芯片上固定 多个与待测m i r n a 互补的探针，与经标记的靶m i r n a 杂交后检测信号，实现了 m i r n a 的高通量检测。然而该方法却存在着探针与待测分子间交叉反应引起的准 确度低和杂交效率不高导致的检测灵敏度低的缺点。而基于此发展的微球杂交的 流式细胞检测方法( b e a d b a s e dh y b r i d i z a t i o nt e c h n o l o g y ) 克服了此不足【2 引。由于 微球处于液相悬浮状态类似于液相探针，提高了杂交的效率。但是，由于流式细 胞仪操作复杂、成本高，而且微球需特殊材料制作以实现编码功能限制了其应用。 本小组张何等【2 3 】发展了一种新型基于碱性磷酸酶介导的等位基因特异性引 物延伸方法的一维微流控突变检测芯片。该方法利用了d n a 聚合酶对3 匹配末 端的延伸速度比3 不匹配末端的延伸速度快的特性，在反应体系中加入能降解 d n t p 的酶，3 不匹配末端开始延伸时溶液中的d n t p 已被降解，不产生延伸信 号。因此该方法具有很好的突变识别特异性，可以将匹配二聚体从任意组合的单 碱基不匹配二聚体中识别出来；该方法在微流控通道内的应用同样体现出高的突 变识别灵敏度，可以识别0 1p m 合成的靶核酸序列并区分单碱基差异，用绝对值 表示可以识别1 0 。1 9t o o l 的靶序列；以m d r l 相关的c 3 4 3 5 t 及g 2 6 7 7 t 两个s n p 为例，该方法也能同时检测多s n p 位点，并产生正确的识别信号。 另外，江龙等【2 引。在金表面组装一层1 ，6 一己二硫醇，然后在己二硫醇上吸附 上一层金纳米粒子，粒子上组装一层经由巯基修饰的d n a ，然后将其置于靶寡核 苷酸片段上，通过频率的变化来检测耙基因的多少。采用该方法，其灵敏度可达 到1 0f m o l l 本小组黄晋等【2 5 】发展了基于芘分子二聚体和核酸杂交链式反应的荧光信号 放大技术。设计了两端标记芘分子的一对分子信标h 1 奉和h 2 * ，在目标核酸分子 存在下，触发h 1 幸和h 2 * 分子间的杂交而发生链式反应，形成超级三明治结构。 芘分子形成二聚体产生4 8 5n m 的较强荧光，二聚体和单体的荧光比信号有效消 2 硕卜学位论文 除信号波动的影响，发展了对目标d n a 的高灵敏检测方法技术平台( 图1 1 ) 。 并进一步基于芘分子二聚体较长的荧光寿命特性，采用荧光时间分辨方法实现了 实际细胞样品中的核酸分子检测。该方法恒温且不需要酶催化，无须分离可适时 监测，具有灵敏度高，选择性好，操作简单等优势，并且基于芘分子二聚体较长 的荧光寿命特性有效消除了背景等干扰，为d n a 的高灵敏检测提供了新的信号 放大技术。 m 嚣导 罾静 t h i *t h i * h 2 * c 、 讼i 国爻 裂 一砭 强e 图1 1 基于芘分子二聚体和核酸杂交链式反应的荧光信号放大检测【2 5 】 1 2 2 基于核酸体外扩增技术的检测方法 由于核酸杂交方法检测灵敏度的限制，近年来基于核酸体外扩增技术的核酸 检测方法发展起来。这种方法可以在短时间内将靶分子扩增数百万倍，提高了核 酸检测的灵敏度，是目前分子生物学研究、临床诊断中的重要研究手段。下面对 几种基于核酸体外扩增技术的核酸检测方法进行简单介绍。 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 是一种可以在短时间内扩 增大量靶d n a 片段的分子生物学技术【2 6 1 。1 9 8 5 年，c e t u s 公司的m u l l i s 等发明 了此技术。典型的p c r 由高温变性模板、引物与模板退火、引物沿模板延伸三步 反应组成，经多次循环反应，使目的d n a 得以迅速扩增。经2 0 3 0 次循环，靶 序列的数量可以达到数百万，使检测的灵敏度可以达到痕量水平。p c r 技术以其 直接、迅速、高灵敏的特点成为最常用的分子生物学技术之一。其应用范围包括 有基因扩增、基因克隆、基因改造、疾病分析、遗传鉴定以及许多非生物学领域 【2 6 3 4 1 。 核酸分子探针结合信号放大技术用于核酸的检测 随着科学技术手段的不断进步，基于p c r 技术的又发展出一系列p c r 的衍 生技术，如逆转录p c r 技术阮3 6 1 、原位p c r 技术3 7 ，3 8 1 、免疫p c r 技术【3 9 ，4 0 1 、 不对称p c r 技术【4 1 1 、实时定量p c r 技术【4 2 4 5 】等，使其应用范围扩大到生物医学、 临床诊断、法医鉴定等诸多领域。 以定量p c r 技术为例，对于m i r n a 检测的方法主要有三种。第一种方法是 在常规引物延伸技术( p e ) 的基础上建立的引物延伸p c r 法( p e q p c r ) ( 图1 2 ) m 6 。 先通过一个加尾的m i r n a 特异性引物( g s p ) 将m i r n a 反转录成加尾的e d n a ，然 后利用一个l n a 修饰的m i r n a 特异性反向引物( r p ) 和一个与加尾序列一致的通 用引物( u p ) 进行p c r 扩增。 r e v e r s et r a n s c r i p t i o n 5 m i c r o r n a 3 - i i i i i i 3 品弋5 ， s y b rg r e e nq p c r 图1 2 引物延伸定量p c r 法检测m i r n a 示意图【4 6 】 第二种方法是先用p o l y ( a ) 聚合酶( p a p ) 处理总r n a1 4 。，在m i r n a 的3 端加 上一段p o l y ( a ) 尾巴，然后用5 端含有接头序列的p o l y ( t ) 弓i 物进行反转录，使 第一链e d n a 加上一段接头，为p c r 扩增提供反向通用引物序列，再利用一条与 m i r n a 序列特异的正向引物即可实现p c r 扩增。 第三种方法是利用茎一环状引物反转录m i r n a ，称为s t e m 1 0 0 pr t - q p c r 检测 法( 图1 3 ) 【4 引，茎环状反转录引物中含有一段与m i r n a 互补的特异性序列，及一段 较长的共有序列，与靶m i r n a 退火反转录后，得到一个较长的反转录扩增子 ( e d n a ) ，共有序列提供了一个通用引物结合位点，然后通过一个与m i r n a 序列特 异的引物和一个通用引物进行p c r 扩增。此方法方法的特异性较高，可精确区分 同一家族中序列高度同源的m i r n a ，能检测只有一个碱基差别的不同m i r n a 的表 4 硕七学位论文 达水平；该法的灵敏度也很高，样品消耗量少，能检测出低丰度靶m i r n a ，定量线 性范围宽。 n 1 r m e v e r s ，e t a q m a np r o b e 。 图1 3s t e m 1 0 0 pr t - q p c r 法检测m i r n a 示意图【4 8 1 d n a 链置换扩增技术是由w a l k e r 小组【4 9 】首次提出的一种新型的d n a 体外 等温扩增技术。该技术使用了一种耐热的无外切酶活性d n a 聚合酶，在缺口处 利用d n t p s 进行聚合，同时具有链置换活性，是一种依赖限制性内切酶和d n a 聚 合酶的恒温扩增d n a 的新型方法。该方法灵敏度高，无需变温，是一种快速获 得d n a 单链的方法。但是，这种方法靶序列准备复杂，因而限制了其广泛应用。 核酸依赖扩增技术( n u c l e i ca c i ds e q u e n c e b a s e da m p l i f i c a t i o n n a s b a ) 是一种 基于等温扩增酶促反应技术的由一对引物指导连续均一的合成特异性的核苷酸序 列的方法【5 叭。n a s b a 由于操作简便、无需特殊仪器、等温复制、可靠性高等特 点可以应用于检测特定的r n a ，同时也可以扩增双链d n a 5 0 0 2 1 。 本小组文建辉等【5 3 1 发展了一种基于端粒酶的核酸信号放大技术( 图1 4 ) 。利 用端粒酶可通过自身r n a 模板不断将t t a g g g 重复序列添加至端粒酶引物末端 的特性，在液相中合成生物素标记的荧光探针，通过生物素亲和素生物素交联 将荧光探针与生物素标记的一抗结合，实现对目标抗原的高灵敏检测。该方法对 p 5 3 蛋白的检测下限可达1 0p m ，比一维微珠阵列内双抗体夹心免疫分析法灵敏 度提高了近2 个数量级，最低可检测到8 5 个c n e 2 细胞“l 样品中的p 5 3 蛋白。 与免疫p c r 和免疫r c a 技术相比，本方法简单、快速，可进行高通量平行分析。 该方法在一维蛋白质芯片中的应用提高了该蛋白分析平台的灵敏度，对实现基于 核酸分子探针结合信口放大技术用于核酸的枪测 该平台的低丰度多蛋白检测具有重要意义。 ) 链霉机生物曩、- 一l j 生物素标记号i 钫目标蛋白净气1 荧光标记多克隆抗体 皇鼠簟克隆机体爿 生物鬃标记多克隆机体 + f k i 口悖h1 2 标记的幽：r p 图1 4 基于一维微流控微珠阵列芯片的端粒酶信号放大的蛋白质检测原理图【5 3 l 1 3 核酸信号放大检测技术及其在核酸分析检测中的应用 随着生命科学的发展，核酸的检测面临着新的挑战。在生物分析及生物学研 究中常常碰到待检测核酸片段较短，或核酸同源性强等问题，应用常规的核酸杂 交和核酸扩增难以实现高灵敏检测。核酸信号放大检测技术是近年来发展起来的 一类新型高灵敏核酸检测技术。目前核酸信号放大检测已成为生物分析中的一个 非常重要的方面。基于酶、脱氧核酶、纳米颗粒等电化学、光学、压电等信号放 大方法被广泛应用于生物分析检测领域中 5 4 - 7 8 。下面就核酸信号放大检测技术及 其在生物分析检测中的应用进行简单介绍。 1 3 1 基于切刻酶介导的链置换聚合酶反应信号放大检测 切刻酶( n i c k i n ge n z y m e ) 为一种特殊的限制性内切酶，只在酶切位点上水解 双链d n a 中的一条链，对d n a 链进行切刻而不是切断。这一切刻作用产生的3 端羟基端可以作为其它反应如d n a 链置换扩增反应的起点。研究者们利用切刻 酶的这个性质并结合d n a 聚合酶发展了一系列对核酸的简便、快速和灵敏的等 温信号放大检测方法【5 5 6 2 1 。 w i l l n e r 研究小组基于切刻内切酶和链置换聚合酶发展了“d n a 机器用于 核酸信号放大检测【5 5 6 们。检测原理如图1 5 所示【5 5 1 ：结合切刻酶只水解双链d n a 酶切位点中的一条链和链置换聚合酶的链置换活性，设计了一条具有切刻酶位点 的探针。当引物与探针杂交后引发聚合反应，切刻酶在生成的双链的酶切位点处 6 硕f ：学位论文 发生切刻反应，产生3 端羟基从而再次引发链置换聚合反应，产生新的酶切位点， 循环往复，实现了对d n a 的信号放大检测。其检测限可以达到0 1p m o l l 。 图1 5 基于d n a 机器对d n a 信号放大检测原理【5 5 】 在此基础上，t r a u 等6 将切刻内切酶位点设计在在分子信标的茎部，发展了 一种荧光信号放大检测d n a 的方法。如图1 6 所示，当靶d n a 与分子信标杂交 哪 、，i s 咯n a l 仃a n 曩d 删朝 ( i h l o n - l i n c a r _ m p l a r a u o ( a ) o - 9 乒r c ，k 6 一 一一稿蛄a c g 6 c g 毛，图1 6 基于d n a 机器对d n a 指数信号放大检测原理1 6 1 l 7 核酸分了探针结合信号放大技术用于核酸的检测 后，荧光基团和淬灭基团分开而产生荧光信号。同时，打开的分子信标臂部与一 段短的引物杂交引发聚合酶反应，将靶d n a 置换下来。被置换下来的d n a 又与 另外一个分子信标杂交，引发新一轮链置换聚合酶反应。而聚合酶反应产生的双 链d n a 在切刻内切酶作用下发生水解反应，引发新的聚合酶反应，又产生新的 酶切位点，从而循环发生酶切一链置换聚合酶反应一酶切反应，实现了对d n a 的 高灵敏检测，其检测限可以达到1 7 6f m o l l 。 另外，c h e n g 等【6 2 】利用m i r n a 的3 端为羟基可作为d n a 复制引物的特点， 并结合切刻内切酶和d n a 链置换聚合酶，建立了一种超灵敏的荧光信号放大 a ) m 。p o l y m e m s en i c k i n g 舶驰 , , m i r n a k 嚏瑚：，l 啪 a 俐a o u ln g u l 0 i 兀i y - 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