（微生物学专业论文）pcr技术检测肉及肉制品中金黄色葡萄球菌研究.pdfVIP

摘要金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一，国内外由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒屡屡发生。引起食物中毒的食品多为动物性食品、乳及乳制品等。目前，国内检测食品中金黄色葡萄球菌仍采用传统的方法，其操作繁琐，检测时间较长，通常需要3 - 5 天才能完成，且灵敏度较低。本研究建立了一套快速检测肉及肉品中金黄色葡萄球菌的p c r 方法，以缩短食品中金黄色葡萄球菌的检测时问，消除p c r 反应抑制因予，提高检测方法的灵敏性。本研究以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基n ( n u c ) 为靶基因，选择特异性引物，进彳亍p c r 扩增，检测肉及肉制品中的金黄色葡萄球菌。对p c r 反应体系中镁离子浓度、模板量及退火温度和循环数进行优化，以确定适宜p c r 反应体系和p c r 扩增程序，其适宜反应体系为：5 p l1 0 p c r b u f f e r ，4 p i , d n t p s 混合物，1 9 l 2 0 9 m o t l 正向引物，l ”l 2 0 p m o l l 反向引物，最适镁离子浓度为1 5 m m o l l ，o ，2 5 1 a l ( 5 u g l ) t a q ，水3 8 7 5 9 l ，总反应体系5 0 9 l ；其适宜p c r 扩增程序为：p c r 反应采用冷启动，9 4 预变性4 m i n ，再按9 4 。c1m i n - - 5 8 * c o 5 m i n 7 2 1 5r a i n 进行3 5 个循环，最后7 2 延伸3 5m i n 。p c r 反应产物在2 的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果。对p c r 扩增产物进行了d n a 测序，p c r扩增产物d n a 序列与文献报道的靶基因序列的同源性达9 9 6 ，从而证实p c r扩增产物确为目的扩增产物。本研究共检测了5 4 株菌，以验证引物的特异性，结果表明：3 3 株金黄色葡萄球菌中3 3 株均为阳性结果；2 1 株其它菌株均为阴性结果。因此该引物特异性强，可用于p c r 检测金黄色葡萄球菌。采用f t a 滤膜制备模板进行p c r 扩增，其方法的灵敏度为2 c f u 2 0t al 反应体系。对f t a 滤膜用于肉中金黄色葡萄球菌p c r 直接检测( 无需增菌) 模板制备的具体方法进行了研究。结果表明：使用f t a 滤膜制备模板时，f t a 滤膜吸附样品，干澡后采用1 0 s d s 煮沸该滤膜，可消除结合在f t a 滤膜上的p c r 抑制因子，采用该方法制备的模板可有效的扩增出目的基因。采用f t a 滤膜制备模板。利用p c r 技术直接检测( 无需增菌) 人工污染的肉及肉制品中的金黄色葡萄球菌，以确定检出限。结果表明：猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉及熟肉制品匀浆液的检出限均为1 0 1 e f u g 。可在6 h 内完成对肉中金黄色葡萄球菌的检测，比目前普遍采用的先增菌再进行p c r 检测的方法缩短了1 2 2 4 h 。比较了p c r 检测肉及肉制品中金黄色葡萄球菌的7 种d n a 模板制备方法，结果表明：f t a 滤膜法可高效从样品中提取金黄色葡萄球菌d n a ，可有效的消除p c r 反应的抑制因子，灵敏度高、操作简便、耗时短，该方法明显优于其他方法。实际检测了7 2 份样品，同时与g b4 7 8 9 1 0 9 4 方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌的方法做了比较，结果表明：g b4 7 8 9 1 0 9 4 方法检出率为7 0 8 ，检出时间为5 d ，p c r 方法的检出率为7 3 6 ，敏感性为1 0 0 ，特异性为9 0 5 ，符合率为9 7 2 ，检出时间为6 h ，p e t r f i l mr s a 方法的检出率为6 1 1 ，敏感性为9 8 ，特异性为1 0 0 ，符合率为9 8 6 ，检出时间为1 8 h ，b a i r d p a r k e rr p f方法的检出率为6 9 4 ，敏感性为8 6 3 ，特异性为1 0 0 ，符合率为9 0 3 ，检出时问为1 8 h 。因此，f t a 滤膜用于p c r 检测肉中金黄色葡萄球菌检出率高，敏感性高，耗时短。研制出了新的f t a 滤膜缓冲液，其效果明显优于f t a 专用缓冲液，成本降低9 3 3 ，大大降低了检测成本。使用f t a 滤膜法制备模板d n a ，可高效的提取样品中的d n a ，有效的消除p c r 反应抑制因子，操作简便，为p c r 快速检测食品中的致病菌构建了一个技术平台。关键词：p c r ；检测：f t a 滤膜；金黄色葡萄球菌；肉及肉制品s t u d yo np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na s s a yf o rd e t e c t i o no f s t a p h ) i o c o c c u sa u r e u si nm e a tp r o d u c t sa u t h o r ：l i uj m g w us t | p e r v i s o r ：p r o f e s s o r 2 盎a n g w e tm a j o r ：m i c r o b i o l o g y( i n s t i t u t eo f f o o ds c i e n c ea n dt e c h n o l o g y , a g j c u l t u r a lu n i v e r s i t yo f h e b e i )a b s t r a c ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u si saw i d e s p r e a db a c t e r i a lp a t h o g e nt h a tc a ni n f e c ta n i m i n a l sa n dh u m a nb e i n g s i te x i s t si nm o s tf o o d s ，s u c ha sm e a t ，f e r m e n t e dm e a t 。m i l k ，d a i r yp r o d u c t sa n dv e g e t a b l e s t h ef o o d sm o s tp r o n et oc o n t a m i n a t i o nb ys t a p 妙l o c o c c b f sa u r e u sa r em e a ta n dm e a tp r o d u c t s m o r e o v e r , s o m es t r a i n so fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa r ec a p a b l eo fp r o d u c i n gh i g h l yh e a t s t a b l et o x i n s ，t h u sp r e s e n t i n gaw i d e s p r e a dd a n g e rt os o c i e t y i nr e c e n ty e a r s ，t h e r eh a v eb e e ni n c r e a s i n gr e p o r t so fs t a p 砂，l o c o c c u sa u r e u sr e l a t e df o o dp o i s o n i n g s t a p h y ，i o c o c c u sa u r e u sp o i s o n i n ga c c o u n t sf o r3 3 o fa l lb a c t e r i a lf o o dp o i s o n i n gi nu n i t e ds t a t e s ，4 5 i nc a n a d aa n dm o r et h a n5 0 i ns o m ee u r o p ec o u n t r i e s i n c r e a s i n gr a t e so fi n f e c t i o nw a r r a n tag r e a t e re m p h a s i so nt h ed e v e l o p m e n to fd e t e c t i o nm e t h o d st h a ta r ef a s t e r , m o r es p e c i f i ca n dh i g h l ys e n s i t i v e c u r r e n ts t a n d a r dd e t e c t i o nm e t h o d sr e q u i r el e n g t h yc u l t u r ee n r i c h m e n ts t e p st oi n c r e a s et a r g e tb a c t e r i a ln u m b e r sb e f o r ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o nc a l lb ep e r f o r m e d t h e s ec o n v e n t i o n a lf o o dm i c r o b i o l o g i c a lt e c h n i q u e so f t e nr e q u i r es e v e r a ld a y st od e t e c tb a c t e r i a lp a t h o g e n sp r e s e n ti nf o o da tl o wl e v e l s m o l e c u l a rb i o l o g y - b a s e dt e c h n i q u e ss u c ha sp c rm a yo f f e rd i s t i n c ta d v a n t a g e si nt e r n so fs e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y h o w e v e r , ac r i t i c a lf a c t o ri nt h eu s eo fp c ri st h ea b i l i t yt op r o v i d eaq u a l i t yn u c l e i ca c i dt e m p l a t e f r e eo fa n yi n h i b i t o r ys u b s t a n c e s t h eu s eo fp c ri nt h ed e t e c t i o no fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u si nm e a th a sb e e nh a m p e r e db ym a n yf a c t o r s ，i n c l u d i n gt h ep r e s e n c eo ff a t ，p r o t e i na n di r o n t h u st h ek e yt od e t e c t i o na p p e a r st ob et h ee x t r a c t i o no fp u r ed n at e m p l a t e i np r e s e n ts t u d y , m g c l 2c o n c e n t r a t i o n ，a n n e a l i n gt e m p e r a t u r ea n dp c rc i r c l e sa r eo p t i m i z e dt od e t e r m i n et h eo p t i m a lp c r t h er e a c t i o nm i x t u r ec o n s i s t e do f5g lo f10 x p c ra m p l i f i c a t i o nb u f f e r ( 2 0 0m mt r i s h c l p h8 3 】，5 0 0m mk c l ，15m mm g c l 2 ，o 1 w t v o l 】g e l a t i n ，o5 t w e e n2 0 ) ，4g lo f d n t p s ( 1 m me a c hi ns o l u t i o n ) ，1l a lo fe a c hp r i m e r ( 2 0 州s t o c ks o l u t i o n ) ，o 2 5i - t lo ft a q ( 5l - “lo fs t o c ks o l u t i o n ) ，a n d3 8 7 5i t lo fd o u b l e d i s t i l l e dw a t e r t h er e a c t i o nw a sr u nu n d e rt h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：c o o ls t a r t ；d n ap r e d e n a t u r a t i o na t9 4 。cf o r4m i n ；d n ad e n a t u r a t i o na t9 49 cf o rlm i n ，p r i m e ra n n e a l i n ga t5 8 。cf o r0 5m i n ，a n dd n ae x t e n s i o na t7 2 。cf o r1 5m i nf o r3 5c y c l e s ；t h el a s te x t e n s i o nw a sp e r f o r m e da t7 2 f o r3 5m i n t h ep c rp r o d u c t sw e r ee x a m i n e db ye l e c t r o p h o r e s i sw i t h2 a g a r o s eg e l s y n t h e t i co l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r so f21a n d2 4b a s e s ，r e s p e c t i v e l y ，、, v e r eu s e di nt h ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nt oa m p l i f yas e q u e n c eo ft h en u cg e n e ，w h i c he n c o d e st h et h e r m o s t a b l en u e l e a s eo fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ad n af r a g m e n to f2 7 9b pw a sa m p l i f e d p c rp r o d u c t sw e r ec o n f i r m e db yd n as e q u e n c i n g t h e r ew e r e5 4b a c t e r i a ls t r a i n st ob ed e t e c t e di n c l u d i n g3 3 a u r e u ss t r a i n sa n d21o t h e rb a c t e r i a ls t r a i n se x c e p tf o rsa u r e u ss t r a i n si no r d e rt od e t e r m i n es p e c i f i c i t yo f a m p l i f i c a t i o no f p r i m e r sn er e s u l t so f3 3s t r a i n so fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u sw e r ep o s i t i v ea n dt h o s eo f2 】o t h e rs t r a i n sw e r en e g a t i v e t h ed e t e c t i o nl i m i to f p c r - b a s e da s s a y sw i t hf t af i l t e r sa st e m p l a t e sw a s2 0c f up e rp c rr e a c t i o n ，i ti sw e l lk n o w ni h a tc e l lw a l lo fsa u r e u sa r ev e r yt h i c k s oi tc a l ln o tb ee a s i l yl y s e d ，b u ti nt h i ss t u d ys a u r e u sw e r ee a s i l yl y s e db yf t af i l t e r ,i n h i b i t o r st h a tm a ya f f e c tp c ri nh e r e s u c ha sc u l t u r em e d i u m c e l ld e b r i sw e r er e m o v e db yw a s h i n gw i t hf t ap u r i f i c a t i o nb u f f e r i nt h ep r e s e n ts t u d y , w ed e v e l o p e dap r o t o c o lt h a tu s e sf t af i l t e rt or e s o l v et h ep r o b l e m sa s s o c i a t e dw i t hd n at e m p l a t ep r e p a r a t i o nt h em e t h o d so fe x t r a c t i n gd n af r o ms t a p h y l o c o c c u sa u r e u si nm e a tw i t hf t af i l t e rw e r es t u d i e di nh e r e a c c o r d i n gt ot h er e s u l to fa g a r o s e e l e c t r o p h o r e s i s ，a l le f f i c i e n td e a lp r o c e d u r ew a sc o n f i r m e df o re x t r a c t i o no fs t a p h ) l o c o c c u sa u r e u sd n af r o mm e a tw i t hf t af i l t e r t h es a m p l ew a sp p l i e dt ot h ef t af i l t e ra n da l l o w e dt od r y ：a tt h i sp o i n t t h ec e l l u l a rm a t e r i a ll y s e sa n dt h en u c l e i ca c i db e c o m ee n t a n g l e di nt h ep a p e r , ab o i l i n gp r o c e d u r ew i t h10 s d sw e r et a k e na n dw a s h e ds e v e r a lt i m e st or e m o v ec o n t a m i n a n t sa n dd n ab i n d i n g s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sd n aw a sd i r e c t l ye x t r a c t e df r o mm e a tw i t h o u te n r i c h m e n t t h ee x t r a c t e dd n aw a ss u i t a b l ef o rp c rd e t e c t i o n a na s s a yu s i n gp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np c r ) w a sd e v e l o p e df o rt h ed e t e c t i o no fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u si nm e a t b a s e do nf l o t a t i o na n ds o l v e n te x t r a c t i o nt e c h n o l o g y , f t af i l t e rw a su s e dt oe x t r a c tsa u r e u sd n af r o ma r t i f i c i a l l yc o n t a m i n a t e dm e a t p r i m e r st a r g e t i n gt h et h e r m o s t a b l en u c l e a s eg e n e ，衍u e ) w e r eu s e dt oa m p l i f ya2 7 9b pd n af r a g m e n tw h i c hw a sc o n f i r m e db yd n as e q u e n c i n g 1 1 1 ed e t e c t i o n1 i m i to fp c rw a s 2 0c f u g 1m e a to fsa u g e u s t h i sn o y e 】f t a p c ra s s a ya l l o w sf o rd e t e c t i o no f s t a p h y l o c o c c u sa u r e u si nm e a ti nl e s st h a n6 h ，w h i c hi s1 2 2 4hl e s st h a nt h a to fc o n v e n t i o n a ip c r 、v i t he n r i c h m e n tm e t h o d t h ee f f e c to fs e v e nm e t h o d so fe x t r a c t i n gd n af r o ms t a p h y l o c o c c u sa u r e u si nm e a tw e r ec o m p a r e d a ne 蕊c i e n te x t r a c t i o np r o c e d u r ew a sc o n f i m l e df o re x t r a c t i o no f s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sd n af r o mm e a tw i t h o u te n r i c h m e n t 。s t a p 缸j i o c o c c u sa u r e u sd n aw a sd i r e c t l ye x t r a c t e du s i n gf t af i l t e r t h ee x t r a c t e dd n aw a ss u i t a b l ef o rp c rd e t e c t i o n t h es e n s i t i v i t yo ft h ep c ra r e2 0 c f u go fp o r k ，b e e f , m u t t o n ，c h i c k e na n ds a u s a g e s e v e n t y t w os a m p l e sw e r ea n a l y z e da n dt h ed e t e c t i o nr a t eu s i n gt h es t a n d a r dc u l t i v a t i o nm e t h o dw a s7 0 8 、d e t e c t i o nt i m ew a s5 d t h ed e t e c t i o nr a t eo fp c ra m p l i f i c a t i o nu s i n gf i l t e r sw a s7 3 6 d e t e c t i o nt i m ew a s6 h t h ed e t e c t i o nr a t eo fb a i r d p a r k e rr p fm e t h o dw a s6 9 4 。d e t e c t i o nt i m ew a s18 h 7 n l ed e t e c t i o nr a t eo fp e t r f i l mr s am e t h o dw a s6 1 1 ，d e t e c t i o nt i m ew a s1 8 h t h u sp c ra m p l i f i c a t i o nu s i n gf l t e r sp r o v i d e saf a s t e ra n dm o r es e n s i t i v em e t h o do fsa u r e u sd e t e c t i o nt h a nt h es t a n d a r dc u l t i v a t i o nm e t h o d a ne f f i c i e n tb u f f e rt h a tw a su s e dt ow a s h i n gf t af i l t e rw a si n v e n t e d i ti sb e t t e ra n dc h e a p e rt h a nt h es p e c i f i cf t af i l t e rb u f f e rt h a ti sp u r c h a s e di nw h a t m a nc o m p a n yi tp r o v i d e sau n i v e r s a lp r o c e s sf o rp r e p a r i n gd n at e m p l a t ek e yw o r d s ：p c r ；d e t e c t i o n ；f t af i l t e r ；m e a tp r o d u c t s ；s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得鎏韭壅些盘鲎或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位捌乍者签名：纠等，式签字吼汹6 年6 月f 目学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑i 垦塞些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑垦壅些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名叫嚣_ 武签字日期：州6 年6 月7 曰学位论文作者毕业后去向工作单位：通讯地址：导师签名：讴陷j签字目期：川年i 月日电话；邮编：p c r 技术检测肉及肉制品中金黄色葡萄球菌研究1 1 立题背景和意义1 引言食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题。随着食品牛产的工业化和新技术、原材料、新产品的采用，造成食品污染的因素日趋复杂化；高速发展的_ 农业带来的环境污染问题，也波及到食物并引发一系列的严重的食品污染事故。全球各地连续发生一系列食源性疾病爆发事件：英国的疯牛病；日本出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：i t 7 和雪印i ：奶的葡萄球菌肠毒素中毒事件；法国的李斯特氏菌中毒；比利时的二恶英污染；全球范围的禽流感等均引起世界范围的震惊”。近年来，山金黄色葡萄球菌引起的食物中毒越来越多，据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的细菌性食物中毒居第一位，占整个细菌性食物中毒的3 3 。加拿人则高达4 5 ，由此而造成的经济损失也相当惨重”】。目前世界各国都把金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法定检测项目。由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的中毒暴发事件，近年来首推2 0 0 0 年日本“雪印奶粉”事件，造成1 4 0 0 0 多人受感染；每年由于金黄色葡萄球菌食物中毒的爆发给印度人民和政府带来极为沉重的经济负担；美国多食用禽畜肉、乳制品和糕点类，金黄色葡萄球菌食物中毒最多，其中美国食品药品管理局( f d a ) 的“b a db u gb o o k ”中报道的典型事件是在美国德克萨斯州发生的由于金黄色葡萄球菌污染鸡块色拉引起的食物中毒，该起食物中毒导致】6 所小学的5 8 2 4 名学生中有1 3 6 4 名患病。我国每年由于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也很多，如”“：2 0 0 5 年4 月，宁波市某校学生在学校小卖部就餐，发生一起食物中毒，造成4 名学生发生食物中毒，经证实为一起产a 型肠毒素金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。2 0 0 1 年7 月2 8 日，旭升乡双山村村民王某从明水商业街买回生牛肉，加工后出售。本村1 0余名建筑民工从王某处买回熟牛肉未再加工处理。聚餐后先后出现巾毒症状。经鉴定为金黄色葡萄球菌中毒。2 0 0 3 年5 月8 日，临朐县某村家庭聚会发生细菌性食物中毒，经调查确认是食用被金黄色葡萄球菌污染的五香脱骨扒鸡引起。2 0 0 5 年2 月6 日春节前夕，广东省清远市某快餐店引发一起食物中毒，造成6 2 人食物中毒，所有食物中毒人员都是一闻电信城的售货员，经流行病学调查、临床表现及实验室检验，证实该起食物中毒是由蜡样芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌引起。2 0 0 3 年7 月4 日，湖南省武网市龙溪镇塘田村发生一起食物中毒，经流行病学调查，临床诊断和实验室检验结果表明食物中毒的原因为金黄色葡萄球菌引起。中毒原因主要是迸食了被金黄色葡萄球菌污染的卤猪脚食品，且在食用前未进行加热处理。2 0 0 5 年1 月1 1 日，长阳土家族自治县永和坪小学1 1 名学生发牛食物中毒，经调查核实为食用被金黄色葡萄球菌污染的炒猪血、芹菜炒肉所致。2 0 0 4 年8 月1 4 目，定陶县冉固镇某村村民孙某因请人帮工在家进行午餐共7 人参加，6 人河北农业大学硕士学位论文发生食物中毒。初步认定为食用道口烧鸡引起的食物中毒。2 0 0 4 年石家庄市某大学发生一起食物中毒。经流行病学调查、临床诊断和病原学鉴定，证实为一起由金黄色葡萄球菌和变形杆菌引起的食物中毒。2 0 0 3 年卜海市发生一起由于食用被金黄色葡萄球菌污染的盒饭导致食物中毒事件。2 0 0 2 年天台县某村发生一起因食用丧宴而引起的金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒，造成七十多人中毒。2 0 0 4 年6 月2 2 日，在南昌发生一起由于食用被金黄色葡萄球菌污染的卤制品 1 发的群体性食物中毒事件，造成1 5 9 人中毒。2 0 0 4 年6 月，贵州省贵阳市的三联乳业公司由于一次不规范操作，生产，一批被金黄色葡萄球菌 j 染的奶粉，导致5 3 名幼儿园的孩子中毒。国际食品微生物规格委员会( i n t e r n a t i o n a lc o m m i s s i o no nm i c r o b i o l o g i c a ls p e c i f i c a t i o n sf o rf o o d s ，i c m s f ) 以对金黄色葡萄球菌的危害度进行评估，将其列为r p 度直接局部传播性病原茼。日本的仓出浩通过金围食物中毒统计资料中的病死率、发病率和平均一起的发病数对金黄色葡萄球菌的危害度进行评估，其结果与i c m s f 建议的危害度系数相一致。鉴于金黄色葡萄球苗本身的危害性及其引起食物中毒事件的严重程度，建立从食品中快速检测金黄色葡萄球菌的方法是非常必要的。传统的检测金黄色葡萄球菌的方法为生化检测法，这种方法操作繁琐，检测时间较长，通常需要3 - 5d 才能完成，且检测灵敏度较低。国外已建立从食品中检测金黄色葡萄球菌的聚合酶链式反应( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ，p c r ) 方法，但国内很少有人将此方法应用的食品检测中来。我国对金黄色葡萄球菌目前采用的方法是以国家标准g b 4 7 8 9 1 0 8 4 及检验检疫系统行业标准s n 0 1 7 2 9 2 作为依据。整个检测过程获得最终结果须时5d 左右，既费时又费力，并造成货物积，也影响货物的及时出运，并使货主的仓储成本提高，造成较火的经济损失。我国是一个食品生产和消费大国，随着市场经济的快速发展和生活水平的提高，特别是加入w t o 后，消费者对食品安全更加关注，食品安全与食品贸易的关系更为密切，提高我国食品安全水平的要求越来越迫切。为确保食品安全与食品贸易，需要大力加强食品检验的力度，传统的检验方法已不适应时代发展的要求，迫切需要建立快速、灵敏的金黄色葡萄球菌的检验方法。因此，本研究主要针对金黄色葡萄球菌的致病性，选择特异引物，建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌的p c r 方法，以期缩短金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的检测时间，提高检测方法的灵敏性，为金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病的快速诊断提供技术支持。1 2 金黄色葡萄球菌简介1 ，2 1 金黄色葡萄球菌生物学特征形态与染色：典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径o 8l a i n 左右显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。革兰氏染色阳性。培养特性：金黄色葡萄球菌营养要求不高在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度3 7 。c ，最适生长p h7 4 。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1 2m m 。血平板2p c r 技术检测肉及肉制品中金黄色葡萄球荫研究菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在1 0 一1 5 n a c l 肉汤中生长【1 3 】生化特性：金黄色葡萄球菌可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，v p 反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。1 2 2 金黄色葡萄球菌的致病- 眭金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染”“。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：溶血毒素：外毒素，分、p 、n6 四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死：杀自细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞：血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用，葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性冒肠炎的蛋白质性肠毒素，共有a 、b 、c ( c i 、c 2 、c 3 、d 、e 、g 、h 、l 、j 、k 、l 、m 、n 】4 个血清型”“。暴发性食物中毒中最常见的血清型为a 和d 型，b 和c 型次之，其中a 型的毒力最强”“。据报道含有1 0 61 0 8c f u g ( m l ) 的金黄色葡萄球菌可以产生导致食物中毒症状有效量的肠毒素。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如肉与肉制品、牛奶和奶制品、蛋等，在温度条件适宜时，经8 1 0h 即可产生相当数量的肠毒素。肠毒素可耐受1 0 0 c 煮沸3 0m i n 而不被破坏。并能抵抗胃肠道中蛋白酶的水解作用。因此，破坏食物中存在的金黄色葡萄球菌需在l o o 加热食物2h 。肠毒素刺激肠上皮细胞，通过环磷腺苷和环磷鸟苷分泌途径，及两个独立于环式核苷酸的途径钠、水分泌，产生腹泻。同时有研究表明，金黄色葡萄球菌对小肠粘膜细胞无直接的破坏作用，而以完整的分子经消化道吸收入血。到达中枢神经系统后刺激呕吐中枢而导致以呕吐为主要症状的食物中毒。此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。1 2 3 金黄色葡萄球菌的流行病学1 6 】金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，5 0 以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：( 1 ) 季节分布，多见于春夏季：( 2 ) 中毒食品种类多，主要以各类熟肉制品、乳及乳制品、蛋及蛋制品，其次为含有乳制品河北农业大学硕士学位论文的冷冻食品，个别的淀粉类食品引起的中毒事件也有报道。( 3 ) 食物中金黄色葡萄球菌来源及肠毒素形成条件：金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，人和动物的鼻腔、咽喉、消化道带菌率均较高。健康人带菌率为2 0 3 0 ，上呼吸道感染患者鼻腔带菌率8 3 ，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。一般而言，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒：熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化膝时，对肉体其他部位的污染。影响肠毒素形成的条件有以下几点：( i ) 食物受污染的程度：食物受金黄色葡萄球菌污染的程度越严重，繁殖越快，越易形成毒素。( 2 ) 食物存放的温度：在3 7o c 内，温度越高，产毒时间越短。( 3 ) 食物存放的环境：通风不良氧分压低易形成肠毒素，如污染金黄色葡萄球菌的剩饭在通风不良的条件f 存放，极易形成毒素。( 4 ) 食物种类及性状：含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，或含油脂较多的食物，肠毒素易生成。如带金黄色葡萄球菌的生肉馅在3 7 下经1 8 - 1 9h 产生肠毒素，而在肉馅中加入馒头碎屑或淀粉时，在同样的温度下只需8h 就能产生毒素。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，荚国疾病预防控制中心( c d c ) 报告存美国南金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的3 3 ，加拿大则更多占4 5 ，某些欧洲国家如匈牙利、芬兰等占5 0 以上。我国每年发牛的此类中毒事件也非常多。1 2 4 金黄色葡萄球菌污染的控制61 2 4 1 防止金黄色葡萄球菌污染食品主要从以下几方面注意：( 1 ) 防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染( 如疥疮、手指化脓等) 、上呼吸道感染( 如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等) 的人员要暂时停止其工作或调换岗位。( 2 ) 防止金黄色葡萄球蔷对奶及其制品的污染：如牛奶厂耍定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶：奶挤出后，要迅速冷至1 0 c 以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。( 3 ) 患局部化脓感染的禽、畜尸体应按病畜、病禽肉处理，将病变部位除去后，按条件可食肉经高温处理后以熟制品出售。1 242 防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒索形成：在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过6 h ，并且食用前要彻底加热。4p c r 技术检测肉及肉制品中金黄色葡萄球菌研究l t 3 食品中病原菌检测方法研究现状目前食品中病原菌的检测方法主要有以下几种1 3 1 常规的检测方法主要是采用分离培养及生理生化试验检测。1 3 2 快速的检测方法132 ，1 免疫学方法免疫学方法主要有免疫扩散法、反向间接凝血试验( r p h a ) 、反向被动乳胶凝集试验( r p l a ) 、放射免疫法( r i a ) 、酶联免疫吸附法( e l i s a ) 及免疫印迹法( i m m u u n o b l o t t i n g ) 等。13 2 2p c r 方法p c r 技术由于具有特异性强、灵敏度高、快速准确、自动化程度高等特点，所以在医学、生命科学、农业科学、环境科学、考古学等许多领域得到了广泛的应用。近年来随着人民生活水平的提高，对食品的安全性耍求越来越高，特别是由于致病生物引起的食物中毒，引起了人们越来越多的注意，传统的检测方法检测食品中致病菌的步骤繁琐费时，需经富集培养、分离培养、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定以及必要的动物试验等过程，并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测。而应用p c r 技术，只需数小时，就可用电泳法检测出o ，lm gd n a 中仅含数个拷贝的模板序列；用p c r 扩增细菌中保守的r d n a 片段，还可对那些人工无法培养的微生物进行检测。食品中常见致病菌种类及其p c r 检测的靶基因见表1 ”7 。1 。5河北农业大学硕上学位论文表1 常见致病菌种类及其p c r 检测的靶基因t a b l e1t h ep a t h o g e n sa n dt a r g e tf o rp c rd e t e c t i o n尽管p c r 方法方便、准确、快速、灵敏度高，但在食品检测中仍然存在一些问题：( 1 ) 山于在有些食品中所含的菌量低，直接检有时不容易见出，可能会造成漏检，有时需要前增菌，这就相应的增加了检测需要的时间。( 2 ) 食品成分复杂，有很多因素抑制p c r 反应，如果不能有效的排除各因素的干扰，可能会出现假阴性。常见食品中所需检的致病菌种类以及其抑制因子和消除办法见表2 ：表2 常见食品中所需检的致病菌种类以及其抑制因子和消除办法拉“2 3 1t a