（果树学专业论文）苹果细胞质苹果酸脱氢酶mdcymdh基因的功能鉴定.pdf

l 一 q 关于学位论文原创性和使用授权的；掣缈溯 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得 的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体， - ， 卜均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学 校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论 文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文 收录到中国学位论文全文数据库，并向社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：垫 导师签 日 名：垃 叫 一 d e p c d n a d n t p e b e c o l i e d t a g h i p t g k a e k a n k d a l l b m g m l n m l t o o l m o p s d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e t l l i d i u mb r o m i d e e s c h e r i c h i ac o l f e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d g r a m m e h o u r i s o p r o p y l t h i o d - d - g a l a c t o s i d e k a l i u ma c e t a t e k a n a m y c i n k i l o d a l t o n l i t e r l u r i a - b e r t a n im e d i u m m i l l i g r a m m i n u t e m i l l i l i t e r m o l e m o r p h o l i n o p r o p a n es u l f o n i ca c i d 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷酸 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 克 小时 异丙基p d 硫代半乳糖苷 醋酸钾 卡那霉素 千道尔顿 升 l b 培养基 毫克 分钟 毫升 摩尔 吗啉代丙烷磺酸 i i 摘要1 a b s t r a c t ：i 前言5 1 1 苹果果实中有机酸组成5 1 2 苹果酸相关代谢途径5 1 3 苹果果实中苹果酸积累7 1 3 1 苹果酸的合成8 1 3 2 苹果酸的消耗1 0 1 3 2 1 苹果酸酶1 0 1 3 2 2t c a 循环1 3 1 3 2 3 葡糖异生途径1 3 1 3 2 4 非磷酸化呼吸作用1 4 1 3 2 5 乙醇和乳酸发酵1 4 1 3 3 苹果酸的运输1 5 1 3 3 1 液泡膜h + a t p a s e 的结构和功能。1 5 1 3 - 3 2 液泡膜h + p p a s e 的结构和功能18 1 3 3 - 3 液泡膜苹果酸转运蛋白结构和功能1 9 1 4 有机酸在植物抗逆方面的作用2 1 1 5 研究目的和意义2 2 2 材料与方法2 4 2 1 试验材料。2 4 2 1 1 植物材料。2 4 2 1 2 菌株及载体2 4 2 1 3 酶与试剂盒2 4 2 1 4 主要试剂2 4 2 1 5 仪器与设备2 4 2 1 6p c r 引物合成与测序2 5 2 2 试验方法2 5 2 2 1 植物基因组d n a 的提取及纯化2 5 2 2 1 1 小量c t a b 法提取植物基因组d n a 2 5 2 2 1 2 植物基因组d n a 的纯化2 5 2 2 1 3 基因组d n a 含量与纯度检测2 6 2 2 2 植物总r n a 的提取及含量和纯度检测2 6 2 。2 2 1c t a b 法提取苹果果实总r n a 2 6 2 2 2 2t r i z o l 试剂盒提总r n a 2 7 2 2 2 3 总r n a 含量与纯度检测2 7 2 2 3 反转录c d n a 第一链的合成2 7 2 2 4m d e y m d s 基因全长序列的扩增2 8 2 2 5 目的片段的回收2 9 2 2 6 连接反应2 9 2 2 7 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化3 0 i i i 2 2 7 1 大肠杆菌感受态细胞的制备3 0 2 2 7 2 大肠杆菌感受态细胞的转化。3 0 2 2 8 碱法小量质粒d n a 的提取3 l 2 2 9 质粒d n a 的酶切鉴定3l 2 2 1 0d n a 序列测定3 2 2 2 1 1 根癌农杆菌g v 3 1 0 1 感受态细胞的制备与转化3 2 2 2 1 1 1 农杆菌感受态细胞的制备3 2 2 2 1 1 2 电转法转化农杆菌3 3 2 2 1 2m d c y m d h 基因表达载体的构建j 3 3 2 2 1 2 1m d c y m d h 基因正义表达载体的构建3 3 2 2 1 2 2m d c y m d h 基因反义义表达载体的构建。3 3 2 2 1 2 3m d c y m d h - g f p 融合蛋白表达载体的构建：3 4 2 2 1 2 4 p m d c y m d h ：g u s 表达载体的构建表达载体的构建3 4 2 2 1 2 5b i f c 表达载体的构建表达载体的构建3 4 2 2 1 3 王林愈伤组织的培养和转化3 5 2 2 1 3 1 培养基制3 5 2 2 1 3 2 王林愈伤培养基配方3 6 2 2 1 3 3 王林愈伤组织的侵染转化3 6 2 2 1 3 4 王林愈伤组织的转基因检测及m d c y m d h 基因的表达分析3 7 2 2 1 4 烟草的栽培、转化及转基因植株鉴定3 7 2 2 1 4 1 烟草幼苗的萌发与移栽3 7 2 2 1 4 2 农杆菌介导的烟草转化3 7 2 2 1 4 3 转基因烟草的生物学鉴定分析3 8 2 2 1 5 番茄的培养、转化和鉴定3 8 2 2 1 5 1 番茄培养基配方3 8 2 2 1 5 2 番茄的培养与转化3 9 2 2 1 5 3 转基因番茄的生物学鉴定分析4 0 2 2 1 6g u s 染色分析4 0 2 2 1 7m d c y m d h 亚细胞定位。4 l 2 2 1 8 实时定量r t - p c r 。4 1 2 2 1 9 高效液相色谱( h p l c ) 测定有机酸含量、可溶性糖含量。4 2 2 2 1 9 1 有机酸( 草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸) 含量分析4 2 2 2 19 2 可溶性糖( 葡萄糖、果糖和蔗糖) 含量分析4 2 2 2 2 0 苹果酸代谢相关酶的提取与活性测定4 2 2 2 2 0 1 酶液提取4 2 2 2 2 0 2h + - a t p a s e 活性测定4 3 2 2 2 0 3 苹果酸酶活性测定4 3 2 2 2 0 4m d h 还原活性测定4 3 2 2 2 1 转基因材料生理生化测定。4 4 2 2 2 1 1 王林愈伤组织中相对含水量的测定4 4 2 2 2 1 2 王林愈伤组织中自由水量的测定4 4 2 2 2 1 3 王林愈伤组织中束缚水量的测定4 4 i v 2 2 2 1 4k _ 、n a + 离子含量测定一4 5 2 2 2 1 5 溶质势测定4 5 2 2 2 1 6a t p 含量测定方法4 5 2 2 2 1 7 转基因植物光合速率与呼吸速率的测定4 6 2 2 2 1 8 转基因植株叶片的光合速率测定4 6 2 2 2 1 9 转基因植株叶片的呼吸速率测定4 6 2 2 2 1 1 0 酶液提取一4 6 2 2 2 1 1ls o d 活性测定。4 7 2 2 2i 1 2c a t 活性测定4 7 2 2 2 1 1 3 丙二醛含量测定4 7 2 2 2 1 1 40 2 含量测定。4 7 2 2 2 1 1 5h 2 0 2 含量测定一4 8 2 2 2 1 1 6 相对电导率测定一4 8 3 结果与分析4 9 3 1 苹果果实中d n a 和r n a 提取。4 9 3 2 苹果m d c y m d h 基因全长c d n a 序列的分离4 9 3 3 苹果m d c y m d h 蛋白亚细胞定位5 0 3 4 苹果m d c y m d h 基因的表达分析5 2 3 5 苹果m d c y m d h 基因启动子的克隆与g u s 染色5 2 3 6m d c y m d h 基因对非生物胁迫的响应分析5 4 3 7 高酸、低酸基因型果实发育过程中苹果酸含量5 4 3 8 高酸、低酸基因型果实发育过程中m d h 活性5 5 3 9 高酸、低酸基因型果实发育过程中m d c y m d h 基因的相对转录水平5 5 3 1 0 转基因王林愈伤组织5 6 3 1 0 1 纳， h 基因植物过量表达载体和反义表达载体的构建5 6 3 1 0 2 王林愈伤组织的转化与筛选：5 6 3 1 0 3 转基因王林愈伤组织中m d c y m d h 的表达水平和m d h 活性检测5 6 3 1 0 4m d c y m d h 转基因对王林愈伤组织m d c y m e 转录和m e 活性的影响5 7 3 1 0 5m d c y m d h 转基因对王林愈伤组织苹果酸含量的影响5 8 3 1 0 6 不同生长状态的苹果悬浮细胞和组培苗中m d c y m d h 基因的表达分析5 8 3 1 0 7 苹果种子层积过程中m d c y m d h 基因的表达5 9 3 1 0 8m d c y m d h 转基因对苹果愈伤组织生长势的影响5 9 3 1 0 9m d c y m d h 过量表达对苹果愈伤组织 纠玎趔卅转录和v h a 活性的影响6 0 3 1 0 1 0m d c y m d h 过量表达对苹果愈伤组织无机离子和相对含水量的影响6 l 3 1 0 。1 1m d c y m d h 过量表达对苹果愈伤组织m & n m d h 和m d m s d h 转录水平的影响6 l 3 1 0 1 2m d c y m d h 过量表达对苹果愈伤组织柠檬酸含量的影响6 2 3 1 0 1 3m d c y m d h 转基因对王林愈伤组织呼吸速率和a t p 含量的影响。6 2 3 1 0 1 4 低温和n a c l 胁迫对转基因王林愈伤组织生长的影响6 3 3 1 0 1 5 低温和n a c i 胁迫条件下m d c y m d h 过量表达和反义抑制对王林愈伤组织中m d c y m d h 影响 6 4 3 1 0 1 6 低温和n a c i 胁迫条件下拖初，i l 日过置表达和反义抑制对王林愈伤组织中m d c y m e 的影响 6 5 v 3 1 0 1 7 低温和n a c i 胁迫条件下m d c y m d h 过量表达和反义抑制对王林愈伤组织中m d v h a - 4 的影 口l 句6 5 3 1 0 1 8 低温和n a c ! 胁迫条件下m d c y m d h 过量表达和反义抑制对王林愈伤组织中m d v h p 影响6 6 3 1 0 1 9 低温和n a c l 胁迫条件下m d c y m d h 过量表达和反义抑制对王林愈伤组织中m d m m d h 的影 响6 7 3 1 0 2 0 低温和n a c i 胁迫条件下m d c y m d h 量表达和反义抑制对王林愈伤组织中m d m s d h 的影响 6 7 3 1 0 2 1 低温和n a c i 胁迫条件下m d c y m d h 过量表达和反义抑制对王林愈伤组织中s o d 活性和0 2 产生速率的影响6 8 3 1 0 2 2 低温和n a c i 胁迫条件下m d c y m d h 过量表达和反义抑制对王林愈伤组织中c a t 活性和h 2 0 2 含量的影响6 9 3 1 0 2 3 低温和n a c l 胁迫条件下m d c y m d h 过量表达和反义抑制对王林愈伤组织相对电导率和m d a 含量的影响7 0 3 1 l 转基因番茄7 0 3 1 1 1 番茄转化与筛选7 0 3 1 1 2m d c y m d h 基因过量表达对番茄m d h 活性的影响。7 0 3 1 1 3m d c y m d h 基因过量表达对番茄果实中苹果酸含量的影响。7 l 3 1 1 4 m d c y m d h 过量表达对番茄生长势的影响7 2 3 1 1 5m d c y m d h 过量表达对番茄果实中柠檬酸含量的影响7 2 3 1 1 6 m d c y m d h 过量表达对番茄叶片呼吸速率和光合速率的影响7 3 3 1 1 7 m d c y m d h 过量表达对转基因番茄a t p 含量的影响7 3 3 1 1 8m d c y m d h 基因过量表达对番茄耐低温胁迫的影响7 4 3 1 1 9 低温处理对转基因番茄s o d 活性和0 2 。还原性的影响7 4 3 1 1 1 0 低温处理对转基因番茄c a t 活性和h 2 0 2 含量的影响。7 5 3 11 1 1 低温处理对转基因番茄相对电导率和m d a 含量的影晌7 5 3 1 2m d c y m d h 过量表达基因对苹果愈伤组织可溶性糖含量的影响7 6 3 1 3m d c y m d h 基因过量表达对番茄果实可溶性糖含量的影响7 6 3 1 4m d c y m d h 过量表达对m d p e p c k 、m d f b p 和m d t r x - h 三个基因表达水平的影响7 6 3 1 5m d c y m d h 与m d p e p c k 和a t f b p 蛋白互作分析7 7 3 1 6m d c y m d h 与a t t r x - h l 蛋白互作分析7 8 4 讨论。8 0 4 1m d c y m d h 定位在细胞质膜和细胞质中8 0 4 2m d e y m d h 参与调控苹果果实中苹果酸积累8 0 4 3m d c y m d h 基因可以调控苹果有机酸的积累8 l 4 4m d c y m d h 基因有助于细胞和植物生长8 3 4 5 过量表达m d c y m d h 基因提高转基因植物抗性8 5 5 结论8 8 参考文献8 9 附录10 6 j s 【谢1 0 9 攻读学位期间完成的学术论文1 1 0 v i 山东农业大学博士学位论文 摘要 有机酸种类和含量是影响果实风味品质和加工品质的重要因素之一，在苹果果实中 苹果酸占有机酸总量的8 0 以上，是主要的有机酸。此外，苹果酸参与多个代谢途径， 在植物逆境胁迫适应方面发挥重要作用。为了研究苹果果实中酸度形成的分子机制以及 苹果酸在果树逆境胁迫适应方面所发挥的作用，我们将m d c y m d h 基因转化王林愈伤组 织和番茄，鉴定m d c y m d h 基因在苹果酸积累、植物生长和抗逆性中的功能。主要结果 如下： 1 m d c y m d h 定位在细胞质和质膜上 在转化空载体p b i n 的洋葱表皮细胞中，g f p 绿色荧光均匀分布在整个细胞中：而 表达m d c y m d h g f p 融合蛋白的洋葱表皮细胞中，只有质膜和细胞质中才能够检测到 绿色荧光信号。以上实验结果表明，m d c y m d h 蛋白不仅定位在细胞质中，还定位在质 膜上。 2 m d c y m d h 基因的表达分析 时空表达结果显示，m d c y m d h 基因在苹果茎、叶、花和果实中均有表达，并且在 胁迫条件下表达下调；p m d c y m d h ：g u s 转化烟草结果也表明，m d c y m d h 启动子驱动 的g u s 基因在烟草根、茎、叶等器官中呈组成型表达。另外，在苹果细胞悬浮系、组 培苗、层积种子等细胞核器官中的表达分析表明，m d c y m d h 基因的表达水平同植物的 代谢活性和生长速度正相关性。 3 m d c y m d h 基因过量表达可以促进王林愈伤组织和番茄果实的苹果酸积累 过量表达m d c y m d h 基因的王林愈伤组织中苹果酸含量达到0 3 0 8m g g f w ，而对 照和反义m d c y m d h 转基因愈伤组织中检测不到苹果酸；过量表达m d c y m d h 基因的番 茄果实中苹果酸含量也显著高于对照：同时，各转基因材料中的糖含量等也明显提高。 以上结果表明m d c y m d h 基因的过量表达可以促进王林愈伤组织和番茄果实中得苹果酸 积累及其相关的糖异生等。 4 m d c y m d h 基因的过量表达促进转基因王林愈伤组织和番茄的生长 过量表达m d c y m d h 基因的愈伤组织生长状态和相对生长量明显好于对照，同时， m d c y m d h基因番茄的株高和根茎直径也高于野生型对照。以上结果表明，m d c y m d h 基因的过量表达促进转基因苹果愈伤组织和番茄的生长。 5 m d c y m d h 基因的过量表达可以提高转基因苹果愈伤组织和番茄的抗逆性 苹果细胞质苹果酸脱氢酶( m d c y m d h ) 基因的功能鉴定 胁迫条件下，m d c y m d h 转基因苹果愈伤组织和番茄的抗性明显好于对照，同时， 转基因材料中的过氧化物清除酶活性提高，活性氧含量降低，反映膜完整性的m d a 和 相对电导率也都明显降低，表明m d c y m d h 基因的过量表达提高了转基因材料的抗逆性。 6 m d c y m d h 与糖异生和氧化还原相关蛋白相互作用 双分子荧光互补分析结果显示，m d c y m d h 分别与m d p e p c k 、a t f b p 和a t t r x h l 相互作用，其中m d p e p c k 和a t f b p 是葡糖异生途径的关键酶，a t t r x h l 是拟南芥硫 酸循环；双分子荧 山东农业大学博士学位论文 a b s t r a c t t h et y p ea n dc o n t e n to fo r g a m ca c i d sc o n t r i b u t et ot h eo v e r a l lo r g a n o l e p t i c a n d p r o c e s s i n gq u a l i t yo ff r u i t s m a l a t ei st h ep r e d o m i n a n ta c i da c c o u n t i n gf o rm o r et h a n8 0 o f t o t a lo r g a n i ca c i d si na p p l ef r u i t s i ti si n v o l v e di nv a r i o u sm e t a b o l i cp a t h w a y sa n dp l a y sa l l i m p o r t a n tr o l ei np l a n tr e s p o n s e sa g a i n s ts t r e s s e s t oi n v e s t i g a t e t h em e c h a n i s mb yw h i c h m a l i ca c i da c c u m u l a t e si na p p l ef r u i t sa n df u n c t i o n si nr e s p o n s e st os t r e s s e s ，t h ef u n c t i o n so f m d c y m d hw a si d e n t i f i e di n c e l l a n dp l a n tg r o w t ha sw e l la ss t r e s st o l e r a n c eb yg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o ni n t o “o r i n ”a p p l ec a l l u sa n dt o m a t o t h er e s u l t sa r es h o w na sf o l l o w s 1 m d c y m d hp r o t e i ni sl o c a l i z e di np l a s m am e m b r a n ea n dc y t o p l a s m 3 5 s ：m d c y m d h - g f p a n d3 5 s ：g f pv e c t o r sw e r et r a n s i e n t l ye x p r e s s e di no n i o n e p i d e r m i sc e l l s g f pw a sd e t e c t e di nt h ew h o l ec e l l ，w h i l et h ef u s i o np r o t e i nm d c y m d h g f p o n l yi nc y t o p l a s ma n dp l a s m am e m b r a n e 2 e x p r e s s i o na n a l y s i so fm d c y m d h t e m p o r a la n ds p a t i a le x p r e s s i o na n a l y s i ss h o w e d t h a tm d c y m d h u b i q u i t o u s l ye x p r e s s e d i ns t e m ，l e a f , f l o w e ra n df r u i t s i na p p l e i t se x p r e s s e dw a sd o w n r e g u l a t e db ys t r e s s e s a f t e r t r a n s f o r m e dw i t hp m d c y m d h ：g u s , t r a n s g e n i ct o b a c c oc o n s t i t u t i v e l ya c c u m u l a t e dg u s ， s u g g e s t i n g t h a tm d c y m d hc o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e s i na l lo r g a n st e s t e d i na d d i t i o n ， e x p r e s s i o na n a l s y i sa l s oe x h i b i t e dt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e l o fm d c y m d h g e n ep o s i t i v e l y c o r r e l a t i v ew i t hm e t a b o l i ca c t i v i t ya n dg r o w t hv i g o ri nc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e s ，s h o o tt i s s u e c u l t u r e sa n ds t r a t i f i e ds e e d s 3 m d c y m d ho v e r e x p r e s s i o nf a v o r a b l yc o n t r i b u t e st om a l a t ea c c u m u l a t i o ni na p p l ec a l l u s a n dt o m a t o t h em a l a t ec o n t e n tw a sh i g hu pt o0 3 0 8m g g - 1f wi na p p l ec a l l u so v e r e x p r e s s i n g m d c y m d hg e n e ，w h i l ei ti su n d e t e c t a b l ei nt h en o n - t r a n s g e n i cc o n t r 0 1 s i m i l a r l y , t r a n s g e n i c t o m a t oe c t o p i c a u ye x p r e s s i n gm d c y m d hg e n eo v e r l ya c c u m u l a t e dm a l a t ei nl e a v e sa n df r u i t s m e a n w h i l e ，a l lt r a n s g e n i cm a t e r i a l sp r o d u c e dm o r es u g a r st h a nt h ec o n t r 0 1 t h o s er e s u l t s i n d i c a t et h a tm d c y m d hg e n ei si n v o l v e di nm a l a t em e t a b o l i s mi na p p l e 4 m d c y m d ho v e r e x p r e s s i o np r o m o t e dt h eg r o w t ho fa p p l ec a l l u sa n dt o m a t o t h et r a n s g e n i ca p p l ec a l l u s e so v e r e x p r e s s i n gm d c y m d hg e n ee x h i b i t e dm u c hm o r e 苹果细胞质苹果酸脱氢酶( m d c y m d h ) 基因的功能鉴定 g r o w t hi n c r e m e n tt h a nt h ec o n t r o lu n d e rn o r m a lc o n d i t i o n s l i k ea p p l ec a l l u s ，t h et r a n s g e n i e t o m a t os e e d l i n g sa l s os h o w e dm o r ev i g o r o u sg r o w t ha si n d i c a t e da sg r e a t e rs e e d l i n gh e i g h t a n ds t e md i a m e t e rt h a nt h ec o n t r 0 1 5 m d c y m d ho v e r e x p r e s s i o nc o n f e r ss a l ta n dc o l dt o l e r a n c ei na p p l ec a l l u sa n dt o m a t o t r a n s g e n i ca p p l ec a l l u sa n dt o m a t op l a n t ss h o w e dm o r ev i g o r o u sg r o w t ht h a nt h ec o n t r o l u n d e rs t r e s s e s m e a n w h i l e ，t r a n s g e n i cm a t e r i a l sg e n e r a t e di n c r e a s e da c t i v i t yo fa n t i o x i d a n t e n z y m e sa n dd e c r e a s e dr o sc o n t e n t a sar e s u l t ，m d ac o n t e n ta n dr e l a t i v ee l e c t r o n i c c o n d u c t i v i t yd e c r e a s e di nt r a n s g e n i cm a t e r i a l su n d e rs t r e s s e s t h o s er e s u l t si n d i c a t et h a t m d c y m d ho v e r e x p r e s s i o nc o n f e r ss t r e s st o l e r a n c ei nt r a n s g e n i ca p p l ec a l l u sa n dt o m a t o 6 m d c y m d hi n t e r a c t sw i t l lp r o t e i n sr e l a t e dt og l u c o n e o g e n e s i sa n dr e d o x b i f ca s s a y ss h o w e dt h a tm d c y m d h p h y s i c a l l yi n t e r a c t e d 诵t l lm d p e p c k ，a t f b pa n d a t t r x - h lp r o t e i n s ，r e s p e c t i v e l y ，i n nv i v op l a n tc e l l s ，p o s s i b l yu n d e r l y i n gt h e i m p a c t so f m d c y m d h o ng l u c o n e o g e n e s i sa n dr e d o xc h a n g e s k e yw o r d s ：a p p l e ；m a l a t e ；m d c y m d h ；t c ac y c l e ；g r o w t hv i g o r ；s t r e s st o l e r a n c e 4 山东农业大学博士学位论文 刖吾 苹果酸( m a l a t e ) 是苹果( m a l u sd o m e s t i c ab ) 果实中主要的有机酸，它是影响果 实风味品质和加工品质的重要因素之一( 姚玉新，2 0 0 6 ；b e r u t e r ；2 0 0 4 ；s w e e t m a ne ta 1 ， 2 0 0 9 ) 。目前，已经从多个物种上克隆了苹果酸代谢关键酶基因并进行了相关研究( m i l l e r e ta 1 ，1 9 9 8 ；p i n e se ta 1 ，1 9 9 7 ；h l i u s l e re ta 1 ，2 0 0 1 ；d i n ga n dm a ，2 0 0 4 ；m a r t i n o i ae ta 1 ，2 0 0 7 ； m f i l l e re ta 1 ，2 0 0 8 ；y a oe ta 1 ，2 0 0 9 ) ，但苹果果实中苹果酸积累的分子机制还不是很清楚， 需要进一步深入研究。 此外，“野生苹果抗性强、适应性广，其果实酸度高、涩度大”；“盐碱地栽培的苹 果普遍偏酸”：“在同一纬度上苹果果实酸度随着海拔升高、温度降低而变酸”这些已作 为一种普遍现象为人所知，暗示了有机酸积累和环境适应性可能存在某种关联。 1 1 苹果果实中有机酸组成 苹果属于苹果酸型果实，苹果酸是苹果果实中主要的有机酸( 陈发兴，2 0 0 5 ；h u l m e 逮 a n dr h o d e s ，1 9 7 1 ；b e r u t e r ；2 0 0 4 ) 。在成熟果实