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摘要 不同光谱能量分布的中波紫外线对皮肤的损伤及其 防护策略 摘要 专业名称： 学位申请人： 光学 刘智明 导师姓名及职称：郭周义教授 皮肤是人体的第一道防线，尽管如此，普遍存在的紫外线仍然能够穿透表皮 而对人体造成损伤，如：红斑、免疫抑制、黑素生成及癌症等。紫外线可以分为 三个波段：u v a ( 3 2 0 4 0 0 n m ) 、u v b ( 2 8 0 3 2 0 n m ) 和u v c ( 2 0 0 2 8 0 n m ) 。 其中u v b 是对皮肤的危害最大。本论文对中波紫外线对皮肤的损伤及其防护做了 一定的探索性研究。首先，在损伤方面，研究了不同光谱能量分布的u v b 对皮肤 组织及其细胞的损伤情况。其次，在u v b 防护方面，我们对红色发光二极管 ( 1 i g h t - e m i t t i gd i o d e ，l e d ) 的光保护作用做了初步的探索，并对这种光保护作 用的机制做了一定的理论探讨。 本文首先从组织水平研究了u v b 对小鼠皮肤的影响。u v b 已经广泛地应用 于皮肤病治疗当中。已有研究证明，窄谱u v b ( n a r r o w b a n du v b ，n b u v b ， 3 1 1 3 1 3 n m ) 比宽谱u v b ( b r o a d b a n du v b ，b b u v b ，2 8 0 3 2 0 n m ) 具有更好 的疗效。但是n b u v b 的安全性却一直存在着争议。实验首次将光学相干层析 成像技术( o p t i c a lc o h e r e n c et o m o g r a p h y ，o c t ) 引入评估这两种光源对皮肤的损 伤程度。o c t 是一种新颖的、高分辨率的光学成像技术，它能够对活体组织进 行实时无损的检测，不需要将组织分离下来就可以得到它的剖面图像。b a l b c 小鼠被用作实验模型。首先对小鼠背部皮肤进行u v b 红斑测试，得到b b u v b 与n b u v b 的最小红斑剂量( m i n i m a le r y t h e m ad o s e ，m e d ) ，以保证二者在同 摘要 样的生物剂量水平上比较；然后对小鼠皮肤分别施以逐渐递增的剂量( 1 m e d ， 3 m e d s 及5 d s ) 。4 8 h 后对所照射部位进行o c t 检测，3 m e d s 组小鼠连续观 察1 0 天以分析小鼠皮肤的损伤消退情况。获得的o c t 图像用i m a g ej 及o r i g i i a 转化成定量数据。四种参数：皮肤厚度、角质层厚度、进入信号的打断程度及真 皮的相关系数( 值) 被用于分析。比较结果得出，在低剂量及中等剂量( 1 m e d 及3 m e d s ) 时，b b u v b 与n b u v b 对小鼠皮肤的损伤是一致的，然而，当剂 量增大至5 m e d s 时，可以发现，n b u v b 对皮肤的损伤大大强于b b u v b 。另 外，3 m e d s 组小鼠中，n b u v b 照射组的皮肤损伤持续时间要大大长于b b u v b ( p = 0 0 0 4 ) 。综上所述，n b u v b 对皮肤组织的伤害要比b b u v b 大，因此， 在使用n b u v b 用于皮肤病光疗前一定要做好优化措施。 再次，在细胞水平上，采用h a c a t 细胞作为模型，研究了这两种光源对表 皮细胞的损伤。通过m t t 法检测细胞的存活，发现h a c a t 细胞的存活曲线符合 反“s ”型；对细胞的存活动力学分析结果显示，存活曲线符合多靶一次击中模型 ( 拟合相关系数均高于o 9 5 ) 。n b u v b 与b b u v b 相比较，h a c a t 细胞对 b b u v b 的敏感性远高于n b u v b ，这两种光源的平均致死剂量比例达到4 6 9 ：1 ( n b u v b ：b b u v b ) 。 最后，引入红色l e d 作为一种新颖的紫外线防护剂，对其光保护效应做了 初步的研究。实验用中心波长为6 2 5 n m 的l e d 以2 4j c m 2 的剂量预先处理 h a c a t 细胞，2 4 h 后再对细胞施以u v b 辐射，m t t 法检测发现，用l e d 预先 处理过的细胞的存活率明显高于未处理组( p o 9 5 ) c o m p a r i s o nb e t w e e nn b - u v ba n db b u v b ，t h eh a c a tc e l lw a sm o r es e n s i t i v et o b b - u v bt h a nt on b u v b t h en b u v b ：b b u v br a t i oo fm e a nl e t h a ld o s ew a s 4 6 9 ：1 f i n a l l y ，r e dl e d ，an o v e lp h o t o p r o t e c t i v ea g e n t ，w a si n t r o d u c e d i nu v b p r e v e n t i o n ap i l o ts t u d yw a sp r e f o r m e dt ov e r i f yt h ep h o t o p r o t e c t i o no fr e dl e d h a c a tc e l lw a sp r e t r e a t e dw i t had o s eo f2 4j c l e d ，av i s i b l es o u r c ew i t ha n e m i s s i o np e a kw a v e l e n g t ha t6 2 5r i m c e l lw a st h e ne x p o s e dw i t hu v bi r r a d i a t i o n 2 4 hl a t e r t h er e s u l t sf r o mm t ta s s a yd e m o n s t r a t e dt h a tt h es u r v i v a lo fp r e t r e a t e d g r o u pw a so b v i o u sh i g h e rt h a nt h eu v bg r o u p ( p 0 0 0 1 ) a na d a p t i v er e s p o n s ew a s h y p o t h e s i z e da st h em e c h a n i s mo f t h ep h o t o p r o t e c t i o no f r e dl e d k e yw o r d s ：n a r r o w b a n du v b ，b r o a d b a n du v b ，o p t i c a lc o h e r e n c et o m o g r a p h y ， b a l b cm i c e ，h a c a tc e l l ，f i g h t - e m i t t i gd i o d e ，a s a p t i v er e s p o n s e i v 目录 目录 摘要。i a b s t r a c t 1ii 目录v 第一章绪论1 1 1 引言1 1 2u v b 对皮肤的影响2 1 2 1 红斑反应2 1 2 2 晒黑反应3 1 2 3 免疫抑制作用3 1 2 4 光老化作用- 3 1 2 5 皮肤肿瘤4 1 3u v b 对皮肤细胞的影响。4 1 3 1u v b 对d n a 的损伤4 1 3 2u v b 诱导的基因事件5 1 3 3u v b 对细胞膜及细胞器的损伤6 1 4u v b 的防护措施6 1 4 1 物理防护7 1 4 2 防晒剂7 1 4 3 光适应性防护8 1 5 本课题的研究意义9 第二章运用光学相干层析成像技术定量分析不同光谱能量 分布的u v b 光源对小鼠皮肤的影响1 1 2 1 研究背景与目的1 1 2 2 材料与方法12 2 2 1 小鼠12 2 2 2u v b 光源12 2 2 3u v b 照射13 2 2 4o c t 系统1 3 2 2 5 小鼠皮肤组织厚度的测定15 2 2 6o c t 衰减信号的定量分析16 2 2 7 数据分析16 2 3 结果16 v 目录 2 3 1u v b 诱导的小鼠皮肤组织o c t 图像16 2 3 2 比较n b - u v b 与b b - u v b 照射后的皮肤组织厚度1 7 2 3 3 真皮衰减系数的比较2 0 2 3 4 真皮炎症的持续情况2 0 2 4 讨论2 1 2 5 结论2 2 第三章u v b 对细胞的损伤及红色发光二极管的光保护作用 2 3 3 1 研究背景与目的2 3 3 2 材料与方法。2 4 3 2 1 实验仪器2 4 3 2 2 主要试剂2 4 3 2 3 细胞来源及培养2 5 3 2 4 光源：2 5 3 2 5 不同光谱分布u v b 光源对细胞的损伤实验2 6 3 2 6l e d 照射实验2 7 3 2 7l e d 光保护实验2 7 3 2 8 统计分析2 8 3 3 实验结果2 9 3 3 1n b - u v b 及b b - u v b 辐射后h a c a t 细胞存活情况及其动力 学研究2 9 3 3 2 单次照射l e d 对h a c a t 细胞的影响3 1 3 3 3l e d 对h a c a t 细胞的光保护现象3 2 3 4 讨论3 3 第四章u v b 引发的d n a 损伤的修复及红色发光二极管光保护 机制的假设3 5 4 1u v b 引起的d n a 损伤的修复3 5 4 1 1n e r 通路j 。3 5 4 1 2n e r 识别3 6 4 2 红色l e d 光保护机制的假设3 8 4 3d n a 修复体系与红色l e d 的光适应4 1 第五章总结4 2 参考文献4 4 在读期间发表的论文5 8 参与的科研项目5 8 致谢5 9 v i 不同光谱能量分布的中波紫外线对皮肤的损伤及其防护策略 1 1 引言 第一章绪论 紫外线是太阳光中的一个重要成分，约占8 。在日常生活中，紫外线是人 体健康必不可少的物质，紫外线能够杀死或抑制皮肤表面的细菌；适量的紫外线 是维生素d 合成( 7 脱氢胆固醇转化成维生素d 3 ) 中必不可少的；此外，紫外线 还被广泛的应用于皮肤疾病的治疗当中。但是，如果过量的紫外线照射，则会对 人体产生伤害。尽管紫外线的辐射量在日光辐射总量中只占一个很小的比例，但 由于其波长较短，含有的光子能量大，因此，它所产生的生物学效应十分显著。 过多的紫外线能够对皮肤细胞质膜及其内含物( 核酸、蛋白质、细胞器等) 造成 损伤，导致其代谢功能失调、基因表达异常及细胞行为失常等；在组织层面上， 紫外线能够引起皮肤红斑、免疫抑制、黑素生成、光老化及皮肤肿瘤等。 紫外线是一种非电离辐射，波长在1 0 0 4 0 0 r i m 范围内，按照波长的长短可将 其分为三个波段：长波紫外线( u v a ，3 2 0 4 0 0 n m ) 、中波紫外线( u v b ，2 8 0 3 2 0 r i m ) 和短波紫外线( u v c ，2 0 0 2 8 0 n m ) 。短波段的u v c 对人体造成的伤害最大，但 由于大气臭氧层的存在，阻止了绝大部分的u v c 到达地表，能够到达地面的绝大 多数都是u v a 及少量的u v b 。但是随着全球日益严峻的环境污染，地球大气臭 氧层持续变薄，使得到达地表的u v 增加。u v a 占到达地面紫外线总量的绝大部 分，它对皮肤的烧伤作用仅为u v b 的1 1 0 0 0 ，因此人们在很长的一段时间内都认 为其是无害的，现在的研究发现，日光中u v a 在紫外线中所占的比重巨大( 高 出u v b5 0 0 1 0 0 0 倍) ，因此，u v a 的损伤效应是不可忽视的f l 】。u v a 波长较长， 能够穿透表皮，进入真皮组织，导致胶原纤维及弹力纤维网络结构的破坏，引起 皮肤光老化：细胞内，它能够产生自由基，导致脂质过氧化、d n a 及蛋白质的 氧化损伤。u v b 是紫外线生物活性最活跃的成分，因为d n a 生色团的最佳吸收 峰处在3 0 0 n m 处，即处于u v b 波段内1 2 1 。有报道称，紫外线照射皮肤产生的损伤 都是跟皮肤细胞内的d n a 光损伤有联系的【3 1 。 华南师范大学硕士学位论文 1 2u v b 对皮肤的影响 皮肤是人体最大的器官，它直接与外界环境接触，是紫外线辐射的主要屏障。 人和高等动物的皮肤可分成3 层：表皮、真皮及皮下组织。表皮是皮肤最外面的 一层，根据细胞的不同发展阶段和形态特点，由内向外可分为5 层：基底层 ( 该层细胞具有分裂能力，并逐渐向上推移、角化、变形，形成表皮其他 各层，最后角化脱落，基底细胞间夹杂着能够产生黑色素的黑色素细胞) 、 棘层( 由4 8 层多角形的棘细胞组成) 、颗粒层( 由2 4 层扁平梭形细胞组成， 皮肤角化过度、角化不全的发病部位) 、透明层( 由2 3 层无核扁平透明细胞 组成) 及角质层( 由数层无核角化细胞组成) 。真皮位于表皮下侧，可分为 乳头层及网状层，但二者无明显的界限。真皮组织中含有丰富的胶原纤维、 弹力纤维和网状纤维以及其他基质，这些物质赋予了真皮很好的韧性及弹 性。在网状层还分布着众多的毛细血管。真皮下面的皮下组织由疏松结缔组 织及脂肪小叶组成( 如图1 1 ) 。 图1 1 人皮肤结构 1 h 鼬 j 黔 i - - m 鞠；赡 一 f i g u r ei it h es k i ns t r u c t u r eo fh u m a n ( c i t e di n ： h t t p ：w w w h e a l t h y s k i n b e a u t y c o m s k i n s t r u c t u r e h t m l ) 1 2 1 红斑反应 红斑是机体对紫外线照射的一种反应，它在临床治疗过程中有着极为重要的 作用。红斑主要由l r ，b 引发，它是毛细血管扩张的结果。皮肤受u v b 辐射后会 导致真皮乳头层毛细血管扩张，毛细血管数量增多，血管内充满着红细胞及白细 2 不同光谱能量分布的中波紫外线对皮肤的损伤及其防护策略 胞，同时，血管壁渗透性增加，白细胞渗出，血管周围淋巴细胞及多核细胞浸润， 引发炎症，皮肤水肿；在表皮棘层形成一些着色较深的变性细胞，即”晒斑细胞一。 红斑反应可分为立即性红斑反应( u v 照射几分钟内产生) 及延迟性红斑反应( 照 射后2 6 h 产生，可持续数日) 4 1 。在皮肤病紫外线治疗中，红斑反应是确定紫外 线剂量的评判标准。在进行光疗前，通常会先确定好紫外线的最小红斑剂量 ( m i n i m a le r y t h e m ad o s e ，m e d ) ，以此作为紫外线生物剂量的单位。 1 2 2 晒黑反应 紫外线辐射后，会引起皮肤曝光部位的色素沉着。从色素形成光谱曲线中可 以看出，u v a 是主要的诱发因素【5 l 。晒黑反应可分为即时性黑化、持续性黑化及 延迟性黑化。即时性黑化是紫外照射后立即发生或照射过程中即可发生的色素沉 着，一般持续数分钟到几个小时。即时性黑化不是新的色素生成的结果，而是由 于黑素小体的再分布导致了皮肤的颜色改变，主要是黑素小体从黑素细胞的核周 通过树状突起进入表皮角质形成细胞中。足够的u v a 照射能够引起持续性黑化， 可持续数天至数周。有研究表明，持续性黑化可能是表皮基底层及其上部角质形 成细胞内的黑素前体经光化作用后转变成褐黑素的结果【6 1 。u v b 辐射可以引发皮 肤的延迟性黑化，它开始于辐射后几小时或几天，可维持数周至数月。延迟性黑 化过程中黑素细胞酪氨酸酶活性增加，黑素合成，并通过树突向邻近角质形成细 胞转移。延迟性黑化具有一定的光保护作用。 1 2 3 免疫抑制作用 紫外线中起免疫抑制作用的主要成分是u v b 。u v i 引发的免疫抑制机制主 要有两种：u v b 诱导免疫抑制的细胞分子机制及补体单核细胞巨噬细胞对u v b 免疫抑制机制【_ 7 1 。u v b 照射后，免疫细胞内的一些光敏物质( 如：d n a 、尿刊酸) 的损伤以及u v b 诱发的活性氧导致的脂质过氧化作用等能够抑制朗格汉斯细胞 的抗原提呈功能，并产生i l 1 0 等细胞因子抑制免疫反应。在补体相关的免疫抑 制机制中，u v b 照射使皮肤内补体c 3 衍生成i c 3 b ，i c 3 b 参与了诱导单核细胞巨 噬细胞及其衍生的细胞因子产生的免疫抑制和免疫耐受。 1 2 4 光老化作用 皮肤光老化是紫外线慢性照射的结果，u v a 在皮肤光老化过程中起着重要 华南师范大学硕士学位论文 的作用【8 l ，但在光老化过程中也存在着u 的协同作用f 9 】。光老化与自然老化有 着明显不同的临床症状及组织学特征，包括表皮的病理变化、真皮层基质改变、 细胞含量以及血管微循环等差异【4 】。其中，真皮胶原纤维减少，弹力纤维增生及 变性是光老化皮肤的显著特征。研究表明，紫外线诱导产生的活性氧( r o s ) 在 光老化过程中起着重要的角色，r o s 能够抑制基质金属蛋白酶( m m p s ) 抑制剂 的活性，使1 v i i v i p $ 活化，同时r o s 也诱导了m m p s 基因的表达【1 们，活化的m m p $ 能特异性降解几乎所有的细胞外基质成分。 1 2 5 皮肤肿瘤 d n a 是u v b 最主要的靶标，而d n a 损伤又是诱发皮肤癌症的基础f 3 】。紫外 辐射与人皮肤恶性黑素瘤、鳞状细胞癌( s c c ) 及基底细胞癌( b c c ) 的发生有 着密切联系【1 1 1 。s c c 主要跟长期慢性的紫外照射有关，而短期的紫外烧伤事件可 能在b c c 发生中占主要作用。黑素瘤是一种很少发生的皮肤癌症，然而，恶性黑 素瘤往往会导致皮肤癌病人的死亡。短期强烈的目光照射是黑素瘤发生的主因， 但是也不能排除慢性紫外照射的作用，特别是在恶性雀斑样黑素瘤的发生过程 中，这种长期的辐射起着重要的作用。p 5 3 n 中瘤抑制基因在皮肤肿瘤发生中起着 关键作用。超过9 0 s c c 和大约5 0 色c c 都有发现p 5 3 的突变【1 2 1 。p 5 3 基因链上的 双嘧啶位置是u v b 辐射引发突变的热点，分子流行病学研究表明有5 0 的表皮肿 瘤的p 5 3 基因链上发现有这种突变【1 3 1 。其中，c c - , t t 的突变又占了大多数【1 4 1 。 1 3u 佃对皮肤细胞的影响 皮肤细胞是组成皮肤组织的单元，u v b 造成的皮肤损伤是皮肤细胞w b 损 伤的宏观表现。 1 3 iu v b 对d n a 的损伤 环丁烷嘧啶二聚体( c y c l o b u t y lp y r i m i d i n ed i m e r ，c p d ) 和6 4 光产物( ( 6 - 4 ) p h o t o p r o d u c t ，6 - 4 p p ) 是主要的由u v b 诱导形成的d n a 光损伤形式( 图1 2 ) 1 3 】。 c p d 是由相邻的两个嘧啶碱基在c 5 和c 6 位上通过 2 + 2 1 r ；化加成反应共价连接而 成，形成的二聚体以c i s - s y n 型式为主，t r a n s s y n 型仅发生在s s d n a 上；当两相 邻嘧啶间的加成反应发生在c 4 和c 6 位时，将产生6 4 p p l 2 3 1 。c p d 的产生使得d n a 4 不同光谱能量分布的中波紫外线对皮肤的损伤及其防护策略 双螺旋结构向其大沟弯曲- j 7 0 _ 3 0 。，造成双螺旋解旋了约9 。；6 - 4 p p 贝j j 对d n a 的 结构造成了更大的损伤，使之弯曲了约4 4o 【2 1 。6 4 p p 的形成率仅仅为c p d 的 2 0 3 0 ，6 - 4 p p f l , 形成速度也只占c p d 的1 5 - 3 3 ，但是6 - 4 p p 从染色体组中的 移除速率远高- 于c p d l l5 1 。在一些情况下_ 6 - 4 p p n - - j j 髟, 成d e w a r 异构体。除t c p d 和6 4 p p ，u v b 照射还可以产生很少一部分的嘧啶单加合物如胞嘧啶氢化产物。 ， l o o j ， l j _ i t t 一目 - ；6 - 4 1 p p t h c 孓o x o - d g 图1 - 2u v b 导致的d n a 损伤 f i g u r e1 - 2u v b - i n d u c e dd n ap h o t o d a m a g e s 除 c p d 和6 4 p p 这两种直接造成的损伤外，u v b 可以光活化细胞内的光敏 剂产生活性氧对嘌呤碱基及嘧啶碱基进行氧化修饰。其中，8 羟基脱氧鸟嘌呤 ( 8 - o x o - d c o x y g u a n o s i n c ，8 - o x o d g ) 受到广泛关注( 图1 2 ) 。 1 3 2u v b 诱导的基因事件 当转录活性基因上的碱基受到损伤时，基因表达将受到影响。有研究表明， 经紫外线照射的人成纤维细胞d n a 修复能力下降，其相关的修复蛋白如 e r c c 3 、p c n a 、r p a 和x p a 的m r n a 合成水平下调【佩。 当d n a 损伤后，会引发细胞内一系列的保护反应。肿瘤抑制基因p 5 3 在细胞 应对u v b 损伤的反应中起着关键的作用。一旦发生d n a 损伤，p 5 3 虽p 被活化，促 使细胞周期停顿，并引发d n a 修复；若d n a 损伤过大，则细胞被引入凋亡程序。 p 5 3 下游基因p 2 1 w a f l 、1 4 3 3 s 、g a d d 4 5 、b 9 9 及细胞周期蛋白g 参与t p 5 3 调 控的g l 期及g 2 期的细胞周期停顿1 1 7 】，p 5 3 能够上调d d b 2 、x p c 、p c n a 、g a d d 4 5 及p 5 3 r 2 等d n a 修复基因的表达；另外，凋亡基因f a s a p 0 1 和k i l l e r d r 5 、 b a x 、b i d 、p u m a 、n o x a 、p 5 3 a i p 、p i g 3 、p e r p 和p r - g 3 等也受p 5 3 调控【1 3 】。 另外，热休克蛋白7 0 ( h s p 7 0 ) 也在细胞应对u v b 辐射的应激反应重起着 华南师范大学硕+ 学位论文 重要作用。过量表达的h s p 7 0 能够抑制角质形成细胞内因u v b 导致的促炎症细 胞因子及趋化因子的表达，促进n f r , b ( h s p 7 0 抑制剂) 抑制因子i r , b - a 的表达， 并能够抑制c p d 及8 - o x o d g 的生成，从而达到抗凋亡、抗炎症及抗d n a 损伤 的效果【1 9 1 。 1 3 3u v b 对细胞膜及细胞器的损伤 u v b 直接作用于d n a 产生c p d 和6 - 4 p p 的过程中均可产生自由基，当u v b 照射所促成的自由基生成量超过清除机制的清除极限时，发生自由基的积累，而 引起细胞或组织损伤。由紫外线诱导皮肤产生的活性氧簇主要有：氢氧根离子 ( o h ) 、超氧阴离子( 0 2 。) 、单线态氧( 1 0 ) 和过氧化氢( h 2 0 2 ) 1 2 0 1 。 活性氧自由基最明显的作用是脂质过氧化作用，导致细胞膜结构不饱和脂质 一 氧化，膜通透性及流动性降低，引发细胞膜结构的功能紊乱。 线粒体是细胞内的动力工厂。u v b 辐射会导致线粒体膜脂质过氧化、膜电位 降低、线粒体呼吸链受损及线粒体膜蛋白功能失调等。线粒体与u v b 导致的细胞 凋亡有着密切的关系【2 。u v b 诱导的h a c a t 细胞凋亡的研究认为，线粒体膜电位 的下降可能与细胞凋亡过程有关，郭坤等【2 2 】发现经u v b 照射的细胞中具有低线 粒体膜电位的细胞高达6 3 5 ，而未经照射的对照细胞中具有低线粒体膜电位的 细胞只占9 7 。其他如线粒体呼吸链破坏引起的a t p 生成减少、活性氧生成及 线粒体膜上巨型通道功能紊乱也可能同时参与了凋亡过程 2 3 , 2 4 1 。 1 4u v b 的防护措施 为应对紫外线的危害，自然界中存在着许多防御措施。大气臭氧层的存在是 地球上的生命得以生存的首要保证，它吸收了太阳光中所有u v c 及9 0 的u v b 【4 】。大气中的颗粒、分子及云层等也起到一定的紫外防御作用。对于人体本身， 人类在长期的进化过程中也演化出各种防御措施。人表皮中的黑素细胞能够生成 黑色素，黑色素能够吸收紫外线从而阻止了紫外线对其他重要分子如d n a 的损 害。一旦遗传物质d n a 受到光损伤，细胞内的d n a 修复体系会马上启动对其进 行修复，而当修复无法完成时，细胞会启动另一项凋亡程序来清除受损的细胞。 然而，现今环境污染加剧，臭氧层空洞，完全依靠自然的紫外防护已经不太可行， 因此，采取额外的紫外防护手段显得尤为必要。 6 不同光谱能量分布的中波紫外线对皮肤的损伤及其防护策略 1 4 1 物理防护 衣服、帽子及太阳镜等都是很好的u v b 防护手段。纤维织制品能够比较好的 散射u v b ，它的u v b 防护效果取决于其纤维结构、厚度、颜色及使用情况等； 帽子的防护强度取决于其原料、帽檐宽度及编织方法等；而太阳镜的防护效果决 定于镜片的性质【2 5 】。 1 4 2 防晒剂 防晒化妆品的使用已经成为人们防御紫外线的普遍手段。目前，市场上的防 晒剂可分为以下三类： 1 4 2 1 物理紫外阻挡剂 纳米二氧化钛( t i 0 2 ) 及氧化锌( z n o ) 是两种目前常用的无机紫外防护剂， 它们通过反射及散射作用而达到对紫外线的阻挡。其效果取决于纳米颗粒的大 小，t i 0 2 的最佳粒径为1 0 6 0 n m ，z n o 的最合适粒径为1 0 3 5n m l 2 6 1 。这类防晒剂 有无毒、化学稳定性和热稳定性好的特点，但是其用量大、易脱落、且防晒效果 较差，过多使用易堵塞毛孔导致皮肤疾病【2 7 1 。 1 4 2 2 化学紫外吸收剂 化学吸收剂是现在应用得最为广泛的紫外防护剂。化学吸收剂通常是一个与 羰基基团共轭的芳香族化合物。我国化妆品卫生规范( 2 0 0 2 版) 规定有2 4 种紫外线吸收剂，根据其化学结构可分为8 类：对氨基苯甲酸类、水杨酸类、肉 桂酸类、苯酮类、樟脑衍生物类、三嗪类、二苯甲酰甲烷类及苯基苯并咪唑类。 从这些化合物的紫外吸收光谱图中可以看到，绝大多数都对u v b 有着较好的吸 收，其中苯酮类、樟脑的某些衍生物、二苯甲酰甲烷类及苯基苯并咪唑类同时具 有吸收u v a 的光谱特性【2 引。化学紫外吸收剂能够较为有效地阻挡紫外线的入侵， 但是其遇光不稳定，极易引起皮肤过敏反应而且可能含有致癌物质。 1 4 2 3 天然植物防晒剂 天然植物成分应用于防晒领域已经成为一种趋势。相对于化学合成的防晒成 分，天然防晒成分具有价格低廉、性质温和及效果优良等特点，除了能够吸收紫 外线，有些还兼具有治疗皮肤疾病及美白等作用【2 9 1 。目前已经有报道的具有防晒 功能的天然产物有：黄芩、绿茶、芦荟、金银花、桂皮、陈皮、甘草、槐花、葡 萄籽、野菊花及丁香等【3 0 1 。天然产物的防晒机制因其结构的不同而异。含有共轭 7 华南师范大学硕士学位论文 双键结构的化合物如醌类、黄酮类及香豆素类对紫外有较强吸收；粘蛋白及多糖 类化合物能在皮肤表面形成膜而起到阻挡紫外线的作用；抗氧化剂类物质如超氧 化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物岐化酶、谷胱甘肽、维生素e 及p 胡萝卜素等 能够清除细胞内因紫外线而产生的自由基，而起到防止光老化的作用；一些产物 如鞣酸及矿物质类还具有保湿及收敛的作用。不过，天然产物在加工过程中还存 在着一些问题，其作用效果也还需要进一步研究。 1 4 f l 光适应性防护 近几年，已经发展出一种新的紫外防护策略诱导细胞内对紫外线的适应 性反应 3 1 - 3 3 】。这种方法是通过采用低剂量的损伤刺激物或者损伤模拟物来激发起 机体内的防护体系，被激活的防护体系能够持续一段时间，在这段时间内机体就 被赋予了对更强侵害( u v b 辐射) 的抵抗力。 1 4 3 1 有形态物质刺激剂 血红素加氧酶( h o 1 ) 是u v b 引发的免疫抑制产生过程中的一种关键酶， 通过以姜黄对人肾脏近端小管细胞进行处理，能够刺激细胞生成h o 1 ，这种酶 至少可以通过n f 诏转录通路来保护细胞免受u v b 带来的免疫抑制【3 4 1 。表没食子 儿茶精( e g c g ) 是绿茶中的一种酚类成分，它能够刺激前列腺癌细胞l n c a p 内 的p 5 3 通路【3 5 】。在活皮肤等同物( l s e s ) 的实验中发现e g c g 能够抑制k , 7 及p 3 5 m a p k 的活性，从而防止了u v b 导致的细胞凋亡【3 6 1 。通过生物修饰的方法对u v b 损伤产物或者u v b 引发的损伤途径中的某种产物进行修饰，也可以起到刺激作 用，同时又防止了用损伤刺激物引发的损伤。色素生成是细胞应对u v b 的一种保 护反应，d o r r 等【3 7 】通过合成一种促黑激素( a m s h ) 的衍生物来刺激机体生成黑 素，从而阻止了u v b 对机体带来的伤害。g o u k a s s i a n 等1 3 8 】运用c p d 的模拟物双胸 腺嘧啶( p 竹) 涂抹于无毛小鼠皮肤表面，可以增强皮肤对d n a 光损伤产物的移 除能力，并能减少u v b 导致的突变及癌变。 1 4 3 2 无形态物质刺激剂 d e c r a e n e 等人发现【1 3 1 ，预先给人角质形成细胞照射以低剂量的u v b ( 8 0 j m 2 ) 能够增强细胞对2 4 h 后更强的u v b ( 3 2 0 j i m 2 ) 的抵抗能力。进一步研究发现，该 低剂量u v b 引发了细胞内一系列依赖于p 5 3 的光保护事件。它激活p 5 3 的下游基因 p 2 1 w a f l 及p 5 3 r 2 ，这两个基因分别在p 5 3 依赖的细胞周期停顿及p 5 3 依赖的 8 不同光谱能量分布的中波紫外线对皮肤的损伤及其防护策略 d n a 修复中起着重要作用。p 2 1 w a f l 使损伤细胞停留在g l 期，p 5 3 r 2 贝l j 编码了 能将核苷酸转变为脱氧核苷酸的核苷酸还原酶，为d n a 的修复提供了原料。， m e n e z e s 等【3 8 1 对人真皮成纤维细胞预先照射以8 1 0 k j c m 2 的近红外辐射( n i r ) ， 2 4 h 后发现用n i r 预先处理过的细胞比未处理细胞有更强的u v b 抵抗力。进一步 研究【3 9 】表明，n i r 激活 p 5 3 信号通路，促进- j p 2 1 及g a d d 4 5 表达，引起细胞周 期停顿，d n a 修复得以进行。从光产物的生成情况来比较，n i r 处理过的细胞c p d 生成量明显比未处理组的少。 不仅在紫外波段及近红外波段，在可见光波段同样也发现了相似的光保护现 象。h e - n e 激光( 6 3 2 8n m ) ) 提前照射，能够增强原核及真核细胞对紫外线的 抵抗力 4 0 , 4 1 】。近期，b a r o l e t 及b o u c h e r l 4 2 】采用能发出6 6 0 n m 红光的发光二极管 ( 1 i g h t - e m i t t i gd i o d e ，l e d ) 预先照射人体皮肤，然后再施以u v b 辐射，他们发 现，在同等剂量u v b 下，提前用l e d 处理过的皮肤的红斑反应明显要小于未预先 照射l e d 的皮肤组。在体外实验f 4 3 】中，u v c 诱导的人成龈纤维细胞凋亡能够被 6 3 5 n m 波长的红色l e d 抑制，预先照射的可见光可以抑制u v c 诱导的c a s p a s e 3 、 e a s p a s e - 8 及c a s p a s e 一9 的表达。 具有物质形态的紫外防护剂由于需要直接涂抹在皮肤上，其防晒效果容易受 汗、水及其他物理、环境因素的影响，而非物质形态的光刺激剂则可以避免这些 因素。低剂量的u v b 本身会给机体带来损伤，加之人们对u v 的恐惧，因此很难 被人所接受。红外线和可见光是较为安全的光。然而，最近有文献m 】表明，红外 线的光保护作用是通过减少d n a 损伤和高调抗凋亡蛋白( f l i p l 、b c l x l ) 、 低调促凋亡蛋白( b a x ) 来实现的。高调的抗凋亡蛋白有可能会促使修复未完全 的细胞存活下来，从而导致癌症。当然，这方面的研究还未曾展开。可见光是一 种最为普通的光，然而，人们对它的光保护作用机制却知之甚少。可以合理的猜 测，p 5 3 信号通路可能会在可见光的光保护作用中起着重要的作用，因为在紫外 波段及近红外波段的光保护现象中，这一通路都有参与。 1 5 本课题的研究意义 紫外线是环境中危窖人体健康的最重要因素之一，u v b 由于其波长范围在 2 8 0 3 2 0 n m ，正好是生色团d n a 的主要吸收波长，可见，u v b 对人体健康的危害 9 华南师范大学硕十学位论文 尤为强烈。 另一方面，u v b 光源已经被广泛的应用于皮肤病的治疗中。但是，u v b 光 源在用于治疗的同时产生的副作用( 皮肤烧伤、皮肤癌症) 仍然是当前人们关心 的重点。目前，市场上的u v b 光源有两种：窄谱u v b ( 3 11 - 3 1 3 n m ) 和宽谱u v b ( 2 8 0 3 2 0r i m ) 。窄谱u v b 是近年来发展起来的一种新型u v b 光源，较之宽谱 u v b ，它有着更好的治疗效果，但是，它的安全性却一直存在着争议。本研究第 一次将光学相干层析成像技术( o c t ) 运用于评估这两种u v b 光源对皮肤的影响， 将获得的光学量化参数用于对比分析，以获得一个精确的安全性评价结果，为皮 肤病的u v b 光疗提供临床依据。 针对u v b 对人体的伤害，本研究还探讨了细胞水平上这两种u v b 光源对皮 肤细胞的损伤，并对细胞的存活曲线进行动力学分析。为u v b 的防护提供一定的 实验基础及其理论依据。 研究中还提及u v b 的光防护措施。有研究表明，预先照射一定剂量的红色 l e d ，能够增强人皮肤对u v b 的抵抗力。这种无物质形态的光保护剂较之有形的 化学防晒剂有着许多优势。然而，红色l e d 的光保护机制却还未阐明。本实验用 人永生化角质形成细胞( h a c a t ) 作为细胞模型，对红色l e d 的光保护现象作了 初步的探讨，为以后红色l e d 的光保护机制的研究提供实验基础。 l o 不同光谱能量分布的中波紫外线对皮肤的损伤及其防护策略 第二章运用光学相干层析成像技术定量分析不同光谱能量 分布的u v b 光源对小鼠皮肤的影响 2 1 研究背景与目的 u v b 光疗法已经被广泛地用于治疗各种皮肤疾病，如银屑病1 4 5 4 9 】，白癜风 5 0 - 5 3 1 ，蕈样肉芽肿病f 5 硝5 1 ，扁平苔藓【5 7 1 ，特应性皮炎【5 引，等。窄谱u v b ( n a r r o w b a n du v b ，n b u v b ，中心波长3 1 3 n m ) 是近年来发展起来的一种新型 u v b 光源，相较于普通宽谱u v b ( b r o a d b a n du v b ，b b u v b ，2 8 0 3 2 0r a n ) 光 源，它有更好的治疗效果f 5 9 - 6 2 1 。然而，作为一种u v b 光源，特别是相对于b b u v b 来说，n b u v b 的安全性一直是广受争议的。d n a 是u v b 的主要靶标，而皮肤 肿瘤也可以追溯为最初的d n a 损伤 6 3 1 。因此，在细胞水平上，d n a 的损伤程 度可以作为u v b 光源安全性的一个指标。在体外，t z u n g 和r u n g e r 脚】利用单细 胞凝胶电泳( 彗星电泳) 技术揭示出，在同等临床剂量下( n b b b u v b 为1 0 ：1 ) ， n b u v b 对淋巴母细胞及角质形成细胞d n a 的损伤与b b u v b 一致。而采用 高效液相色谱法，o r i m o 等人【6 5 】发现，n b u v b 照射过的人角质形成细胞的d n a 氧化损伤( 8 羟基脱氧鸟苷，s - o h d g ) 程度要小于同等临床剂量下( n b b b u v b 为1 0 ：1 ) b b u v b 照射所产生的d n a 氧化损伤。同样采用免疫组化手段，人们 也得到了不同的结果1 6 6 - 6 引。在组织水平上，u v b 辐射导致的红斑是u v b 损伤的 一大表征。c o v e n 等人【5 9 j 发现相较于b b u v b ，n b u v b 能够诱导更为强烈、更 为持久的红斑。而d a s 等【6 9 j 却认为这两种u v b 光源具有相同的烧伤潜能。 组织切片是皮肤病理学领域中的一种常规离体检测技术。然而，一些如因离 体检验导致的医源性创伤，因活组织检测给病人带来的痛苦，因切片制备过程所 导致假象以及在同一检测位点的不可重复性等缺点大大地限制了组织切片的进 一步应用。近年来，一些非侵入式的、高分辨的在体光学成像技术已经被引入皮 肤科学领域中，如：光学相干层析成像技术( o p t i c a lc o h e r e n c et o m o g r a p h v ，o c t ) 华南师范大学硕十学位论文 【7 们5 1 ，反射或荧光共聚焦显微成像技术 7 6 - 7 s ，等等。共聚焦成像的分辨率高， 与组织切片相当，但是，它们的成像深度比较小。另外，共聚焦复杂又昂贵的仪 器设备以及在某些情况下需要使用外源荧光物质在另一方面限制了它们在临床 上的应用。 o c t 是9 0 年代初发展起来的新型光学成像技术。它具有微米级的高分辨率， 能进行在体、无损、实时的层析成像。同组织切片相比，o c t 一方面能够避免 检测时损伤组织，一方面避免了因组织离体时所引起的失真信号；还可以利用 o c t 对不适宜作切片检查的组织进行无损成像。同共聚焦显微成像技术相比， o c t 采用近红外光作光源，成像深度较大；价格也比较低廉、便携。在皮肤病 学领域中，o c t 已经被成功地应用于基底细胞癌及光化性角化病的诊断【7 0 7 ， 以及u v 诱导的皮肤损伤的评估【7 2 , 7 3 , 7 6 , 7 9 】。 在本研究中，我们引入o c t 用于定量评估相同红斑水肿剂量下n b u v b 及b b u v b 对小鼠皮肤的影响。 2 2 材料与方法 2 2 1 小鼠 我们选择b a l b c 鼠作为实验模型。近交系b a l b c 雌性小鼠( 购于中山大 学实验动物中心) 被随机地分配于塑料笼子里喂养，每笼6 只。动物房环境控制 在温度：2 3 士2 ，相对湿度：4 0 6 0 ，照明周期：1 2 h 。鼠粮、水，随意饮食。 每隔1 周更换一次垫料。当小鼠长至8 1 0 周时，被用于实验。所有实验动物都 经过一周以上的实验室环境适应性喂养。 2 2 2u 光源 采用的u v b 光源是