呕吐毒素标准检测规程.doc

文件编号：HAMK-OI- -2015 版本号：1.0 生效日期：2015年12月30日 发放号：呕吐毒素标准操作规程1、 目的为了规范亲和柱净化样本中呕吐毒素的操作流程，特制订本操作规程。2、 范围本标准适用于粮食、饲料、食品中呕吐毒素的检测。3、 检出限和定量限项目岛津安捷伦样本检出限（g/kg）样本定量限（g/kg）样本检出限（g/kg）样本定量限（g/kg）DON12.9636.721515034、 职责部门名称部门职责质量管理部1、 负责本制度的实施。2、 负责本制度的监督执行。5、 程序5.1 原理测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过呕吐毒素免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱呕吐毒素，然后注入到分析仪器中用于检测。5.2 溶液配制5.2.1 PBS缓冲液：称取8.0g 氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL蒸馏水或去离子水溶解，用浓盐酸调节pH至7.0，再用蒸馏水或去离子水定容至1L。上述PBS缓冲液用于样品的提取、稀释，以及亲和柱的清洗。5.2.2 呕吐毒素标准工作液：先用色谱级甲醇将高标稀释到5ppm，再用水将其稀释到1ppm，此时标品的溶剂为20%甲醇，然后再用20%甲醇将标准品梯度稀释到500ppb、200ppb、100ppb、50ppb。5.3 样品前处理5.3.1 玉米、小麦、面粉、配合饲料、浓缩料、精补料等吸水性较小的样本-将样品粉碎，称取25g样品，加入5g聚乙二醇，加入125mL蒸馏水；-高速均质（10,000r/min）1min（或用摇床200r/min300r/min剧烈振荡20min）；-用快速定性滤纸过滤，收集滤液；-滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；-取2.5mL上样液过免疫亲和柱净化。稀释倍数：25.3.2 麸皮、豆皮、玉米胚芽粕、米糠等吸水性较强的样本-称取10g样品，加入100mL蒸馏水；-高速均质（10,000r/min）1min（或用摇床200r/min300r/min剧烈振荡20min）；-用快速定性滤纸过滤，收集滤液；-滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；-取5mL上样液过免疫亲和柱净化。稀释倍数：25.3.3 酒类-取脱气的酒类样品（含二氧化碳的酒类样品，使用前先搅拌或超声脱气）或不含二氧化碳的酒类样品25g，用PBS缓冲液定容至100mL；-高速均质（10,000r/min）1min（或用摇床200r/min300r/min剧烈振荡20min）；-用快速定性滤纸过滤，收集滤液；-滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；-取2mL上样液过免疫亲和柱净化。稀释倍数：25.3.4 酱油、醋、酱及酱制品-取样品25g，用PBS缓冲液定容至100mL；-高速均质（10,000r/min）1min（或用摇床200r/min300r/min剧烈振荡20min）；-用快速定性滤纸过滤，收集滤液；-滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；-取2mL上样液过免疫亲和柱净化。稀释倍数：25.4 净化-取出免疫亲和柱，将上方塞子取出斜剪断，再插回亲和(3mL的免疫亲和柱去掉上方塞子，安装上转接头，将转接头另一端与注射器固定后使用)-将柱子与气控操作架上的注射器连接固定，取适量处理后的溶液上样；-去掉亲和柱下方堵头，调节开关，使液体以12滴/秒的速度流出；-待液体排干后，方法5.3.1中的样品用蒸馏水或去离子水洗涤2次，每次10mL，其余样品首先用0.1%Tween-20水溶液洗涤10mL，再用蒸馏水或去离子水洗涤10mL，流速23滴/秒；-待液体排干后，上样1mL甲醇，流速1滴/秒，收集洗脱液并在5060加热条件下N2气吹干，然后用1mL流动相（20%甲醇）复溶； -复溶液用0.22m微孔滤器过滤后转移至样品瓶中用于HPLC分析。* 每次上样前都要将上次液体完全排干。5.5 液相测定5.5.1 液相色谱条件 C18柱：250mm（长）4.6mm（直径），填料粒径5m；流动相：20%甲醇流速：1.0 mL/min；柱温：40；进样体积：50L紫外检测器：218nm5.5.2 色谱定量分别取相同体积样液和标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积），以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，将未知样本中呕吐毒素的峰面积带入标准曲线，得到试样中呕吐毒素的浓度，标准品色谱图参考下图：附图：DON-500ppb标准品液相图谱5.6 注意事项-使用前，免疫亲和柱需回至室温（2225）。-亲和柱28储存，不得冻存。-不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。-取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量，注意提取液量要相应改变。-柱容量：2000ng，当样本中待检毒素的含量除以稀释倍数高于柱容量时，需要适当降低上样液的体积，重新检测。-pH：亲和柱的上样溶液pH需在68之间，若偏离此范围需要用盐酸或氢氧化钠调节pH。-由于样本中呕吐毒素的含量普遍较高，如果计算后样本含量大于4mg/kg时，表示已经超过亲和柱柱容量，需要适当降低上样液的体积，重新检测。-上机检测时的溶剂与流动相保持一致可以消除溶剂效应的影响。-呕吐毒素可致癌，应戴手套操作。-使用过的容器及标准品溶液最好用次氯酸钠溶液（5%V/V）浸泡过夜。6、 相关文件免疫亲和柱检验标准免疫亲和柱