（药理学专业论文）5氟尿嘧啶联合白藜芦醇的抗肿瘤作用研究.pdf

目录 u liii iii i iiii il uliil 19 014 4 1 中文摘要1 英文摘要8 英文缩写1 7 研究论文5 氟尿嘧啶联合白藜芦醇的体内外抗肿瘤作用研究 引言1 8 第一部分5 氟尿嘧啶联合白藜芦醇对肿瘤细胞a 4 31 、t e 1 的生长抑制 和细胞毒作用 前言2 0日舌2 0 材料与方法2 l 结果2 6 附图2 9 附表3 4 讨论3 8 小结4 0 参考文献4 0 第二部分5 氟尿嘧啶联合白藜芦醇对肿瘤细胞a 4 31 、t e 1 周期和增殖 的影响 前言4 4日u 舌4 4 材料与方法4 5 结果5 0 附图5 2 讨论5 6 小结5 7 参考文献5 8 第三部分5 氟尿嘧啶联合白藜芦醇对肿瘤细胞a 4 3 1 、t e 1 凋亡的影响 前言6 0翮舌6 u 材料与方法6 1 结果6 5 附图6 8 附表8 1 讨论8 2 小结8 6 参考文献8 6 第四部分5 氟尿嘧啶联合白藜芦醇对小鼠两阶段皮肤癌模型的抗肿瘤 作用 前言一9 0 材料与方法一9 0 结果一9 4 附图一9 5 讨论一9 8 小结一9 9 参考文献一9 9 结论- 1 0 0 综述白藜芦醇在癌症预防方面的临床前研究1 0 1 致谢1 1 9 个人简历1 2 0 中文摘要 5 氟尿嘧啶联合白藜芦醇的抗肿瘤作用研究 摘要 在发展中国家，癌症是仅次于心脏疾病的死亡率最高的疾病，随着生 存环境的恶化，人口增长与老龄化，环境污染以及与癌症有关的生活方式 的改变( 如吸烟、运动减少以及更多地采取西化饮食结构) ，癌症的发生 率逐年增加。目前恶性肿瘤的治疗方法包括手术、放疗、化疗和免疫治疗 等手段，以化学治疗为主的综合治疗在其中占有十分重要的地位。化学治 疗指的是使用化学药物杀灭肿瘤细胞，理想的化疗药物应该是通过抑制细 胞生长或细胞毒作用，只针对肿瘤细胞特异性杀伤而不影响正常细胞。但 事实上，i 临床常用的化疗药物其肿瘤抑制作用大多与剂量相关，在杀伤肿 瘤细胞的同时具有细胞毒作用的无选择性，从而对宿主全身会产生毒副作 用，成为化疗实施的障碍，从而在很大程度上影响肿瘤治疗的效果。因此， 除了寻找高效低毒的新化疗药物以外，还可以通过与其他化合物或药物联 合产生相加或协同作用以提高化疗效果。如能改变肿瘤细胞的周期进程， 使大量肿瘤细胞暂时性蓄积在某一时相，同时应用细胞周期特异性药物杀 伤处于此药物敏感时相的肿瘤细胞将能明显提高治疗效果，同时也可降低 化疗药物剂量从而减轻不良反应，这样的研究将具有重要意义。 5 氟尿嘧啶( 5 f l u o r o u r a c i l ，5 - f u ) 是常见的化疗药物，常用于实体 瘤的治疗，可以通过将细胞周期阻滞于g ，s 期并干扰细胞基本生物合成 过程诱导肿瘤细胞的凋亡从而起到抑制肿瘤生长的作用。5 f u 还可以作 为胸苷酸合成酶( t s ) 的抑制剂掺入d n a 和r n a 结构中使肿瘤细胞无 法正常合成d n a ，影响其正常功能。鉴于5 f u 的作用机理，它在治疗过 程中也会影响正常细胞的功能而产生毒副作用，另外，目前比较常见的 5 f u 使用中产生的抗药性也成了阻碍其发挥疗效的障碍。现在已有很多 二线药物如紫杉醇、丝裂霉素、四氢叶酸、喃氟啶等开始与5 f u 联合使 用，其目的是在保持其抗肿瘤作用最大化的同时减少5 f u 的毒副作用。 除了这些药物以外，一些天然植物素也能达到对5 f u 增效减毒的效果。 白藜芦醇( r e s v e r a t r o l ，r e s ) 是一种广泛存在于自然界中的植物抗 毒素，是植物对抗外界环境压力如气候变化，暴露于更多的臭氧环境中， 中文摘要 重金属刺激以及病原微生物感染等情况时所产生的。大量研究结果 藜芦醇可以对抗多种疾病甚至癌症。研究发现白藜芦醇对肿瘤的起 进和发展三个阶段均有抑制作用，可作为天然的肿瘤化学预防剂。 瘤作用可能与其影响细胞生长、抗炎、诱导细胞凋亡和抗侵袭能力 白藜芦醇可以影响体内多种基因表达，其中包括肿瘤抑制因子p 5 3 细胞周期调节蛋 刍c y c l i n 家族以及多种凋亡调节因子。诸多的体内 证实白藜芦醇可以作为抗肿瘤药物或与其他化疗药物联合使用治 有抗药性的癌症。 肤癌尤其是非黑色素性皮癌 n m s c ) 是世界上发病数量最多的人 ，近年来的发病率日益升高，据估计每年新增病例超过一百万。如 年发病率使其越发受到公众的关注。食管癌的死亡率很高，在世界 瘤死亡率中占据第六位，而我国正是是食管癌的高发地区。鉴于这 瘤的高发性，本实验中选取食管鳞状细胞癌株t e 1 、人表皮癌a 4 3 1 细胞株作为研究对象来考察5 f u 与白藜芦醇联合在细胞生长、细胞周期和 凋亡方面的作用，并对可能与联合作用有关的凋亡通路进行了研究。实验 共分为四部分： 第一部分5 氟尿嘧啶联合白藜芦醇对肿瘤细胞a 4 3 1 ，t e 1 生长的抑制 和细胞毒作用 目的：研究5 f u 联合白藜芦醇对肿瘤细胞a 4 3 1 、t e 1 生长的抑制 作用和致坏死能力 方法：本部分实验中采用m t t 法、生长曲线实验、平板克隆实验对 5 f u 和白藜芦醇的联合用药进行评价，联合用药的效果采用c h o u t a l a l a y 法进行定量评价分析。细胞毒作用采用l d h 溢出实验进行评价。 结果：( 1 ) m 兀实验显示5 f u 有抑制肿瘤细胞的生长的能力，而且这种 作用呈时间与浓度依赖性。而白藜芦醇在较高浓度( 不低于1 0 p m o u l ) 才 能够产生抑制作用。二者联合使用时在很大的浓度范围内都可以产生协同 作用( 白藜芦醇不低于1 0 l a x n o l l ) 。联合用药可以大大降低5 f u 或白藜芦 醇对a 4 31 的中效浓度( 5 f u 的i c 5 0 从单独使用时的3 2 2 8 9g m 降至 7 1 9 9 i _ t m ；白藜芦醇的i c 5 0 从1 7 4 5 8p m 降至3 7 5 6 i t m ) 。对t e 1 联合用 药可以分别将5 f u 的i c 5 0 从4 8 0 8 3l a m 降至1 5 1 8 7 t m ，而白藜芦醇的 i c 5 0 可从2 4 8 6 4p m 降至6 9 4 2 t m 。该结果显示5 一f u 和白藜芦醇联合使用 应进行 评价，当两药联合使用对肿瘤的的抑制效应达到5 0 时，a 4 3 1 细胞的 联合指数c i 为0 4 3 8 ，而对t e 1 的联合指数c i 为o 5 9 5 。二者联合在高 于o 2 的效应范围内c i 值均不高于1 ，说明在一个很大的效应范围内 ( 0 2 0 9 5 ) 5 f u 联合白藜芦醇都能产生协同作用。( 2 ) 生长曲线实验结 果显示，当5 一f u 和白藜芦醇单独使用时都能对肿瘤细胞的生长起到抑制 作用，当二者联合使用时对肿瘤细胞的生长曲线抑制更为明显，与对照组 和各单药组相比均存在显著性差异。( 3 ) 平板克隆实验结果显示1 4 天后 a 4 3 1 和t e 1 各自有1 7 6 0 和2 6 7 5 的克隆形成率，白藜芦醇单独 使用可以使两种细胞的克隆形成率分别降至a 4 3 l5 4 2 ，t e 11 0 1 3 。 而5 f u 单独使用的克隆形成率分别为a 4 311 0 7 ，t e 12 2 3 。两种 细胞的联合用药组则几乎没有克隆形成，各组间在统计学上表现为极显著 性差异。( 4 ) l d h 活性实验显示了5 f u 和白藜芦醇单独使用所导致的 a 4 3 1 和t e 1 细胞坏死分别出现在4 8 h 和7 2 h 后，而联合给药组在2 4 h 即出现l d h 的溢出，说明联合用药对肿瘤细胞的抑制作用可能与坏死有 一定关系，而且其程度均高于各单独用药组。 结论：( 1 ) 5 f u 和白藜芦醇都可以对细胞产生时间依赖和浓度依赖性 抑制，联合用药组在大部分效应范围内都表现为协同作用。( 2 ) 5 f u 和白 藜芦醇联合或单独使用都会对a 4 3 1 和t e 1 的生长曲线产生抑制作用，联 合用药与单独用药相比存在显著性差异。( 3 ) 细胞坏死在5 f u 单独作用 4 8 h 后参与n 5 f u 对肿瘤细胞的抑制作用中来，而直到7 2 h 白藜芦醇才会 引起肿瘤细胞的坏死，二者联用则从2 4 h 臣p 有细胞坏死现象的存在，并呈 现时间依赖性。 第二部分5 - f u 联合白藜芦醇对肿瘤细胞a 4 3 1 、t e 1 周期和增殖的影响 目的：研究了5 f u 联合白藜芦醇对a 4 3 1 、t e 1 细胞周期和周期增殖 相关蛋白的影响。 方法：采用流式细胞术对a 4 3 1 和t e 1 的细胞周期进行分析。 w e s t e r nb l o t 检测周期相关蛋白和增殖相关蛋白的表达。 结果：( 1 ) 白藜芦醇单独作用2 4 7 2 h 均会引起a 4 3 1 和t e 1 细胞的s 期数量增多与相应的g 1 期细胞数量减少，这种结果导致了a 4 3 1 和t e 1 中文摘要 细胞的s 期阻滞现象，与对照组相比，5 0 州白藜芦醇对a 4 3 1 作用2 4 h 导致a 4 3 l 细胞的s 期比例从2 9 2 _ 4 ：1 4 上升到6 5 3 4 - 2 5 俾 o 0 1 ) 。7 0 州白藜芦醇对t e 。1 作用2 4 h 导致t e 1 细胞的s 期比例从2 6 2 - 4 ：3 2 增 长到8 9 3 4 - 3 7 俨 o 0 1 ) 。5 f u 单独用药组和联合给药组都会引起a 4 3 1 和t e 1 的g l 期细胞的少量增加，但是这种增加在2 4 h 时与对照组相比 没有统计学意义，4 8 h 后才与对照组相比出现显著性差异，而且5 f u 组 和联合用药组之间在不同时间点都没有显著性差异。( 2 ) w e s t e r nb l o t 对 周期蛋白的分析证实了流式的结果，白藜芦醇导致的s 期阻滞使c y c l i n d l 和p c n a 蛋白的表达量出现减少。 结论：( 1 ) 5 f u 单独给药或与白藜芦醇联合使用会使a 4 3l 和t e 1 的 细胞周期产生g o g 1 期阻滞，白藜芦醇单独用药会对a 4 31 和t e 1 的细胞 周期产生s 期阻滞，鉴于5 f u 的抗肿瘤作用机制是与s 期特异性杀伤有 关，我们推测可能是白藜芦醇对细胞周期的影响( 将肿瘤细胞大量阻滞于 s 期) 使得a 4 3 1 和t e 1 细胞对5 f u 的敏感性增加，从而出现了协同作 用。( 2 ) 对肿瘤细胞增殖的抑制可能是其抗癌作用的机制之一，c y c l i n d l 和p c n a 蛋白表达的下降也证实了这个假设。 第三部分5 - 氟尿嘧啶联合白藜芦醇对a 4 3 1 、t e 1 细胞凋亡的影响 目的：研究5 f u 联合白藜芦醇对a 4 3 1 和t e 1 细胞凋亡的影响及相 关机制。 方法：采用了普通光镜，d a p i 染色和d n a 片段化凝胶电泳分析等 方法对药物诱导a 4 3 l 和t e 1 凋亡的现象进行了观察。使用a n n e x i nv - p i 流式分析术对细胞的早期凋亡进行分析。测定细胞内c a 2 + 变化，w e s t e r n b l o t 检测凋亡相关蛋白，对5 f u 与白藜芦醇联合给药的凋亡机制进行研 究。 结果：( 1 ) 采用普通光镜和d a p i 染色法观察了给药后的a 4 31 t 车i t e 1 ， 观察至u a 4 3 1 和t e 1 细胞都出现了膜不对称性和细胞间连接的消失，以及 细胞皱缩等现象。d a p i 染色可以看到诸如核固缩，染色质凝集等现象， 并可观测到凋亡小体。与单独给药组相比，联合药物组可以观察到a 4 3 l 和t e 1 细胞更多的形态学变化。5 - f u 和白藜芦醇作用4 8 h 后，光镜下可以 观察到更多凋亡小体和典型的形态学变化。( 2 ) 给药后产生凋亡的情况也 可以通过检测d 】姐梯状条带的变化来进行比较，d n a 梯状条带的数量可 中文摘要 f u 作用4 8 h 后，d n a 断裂不明显，只有似 用4 8 h 后，可以清晰地辨别出d n a 的梯状 条带( d 1 妊l a d d e r ) ，在联合药物组作用4 8 h 后，d n a 有序片段化更加明 显，条带增多。( 3 ) 采用a n n e x i nv - f i t c 和p i ( p r o p i d i u mi o d i d e ) 双染的 方法，用流式细胞仪检测给药后a 4 3 1 和t e 1 细胞的早期凋亡现象。与对 照组相比，5 - f u 和白藜芦醇单独给药组都出现了早期凋亡细胞比例的明显 增加( 尸 o 0 5 ) 。对照组a 4 31 细胞出现了少于6 的自发早期凋亡；而5 f u ( 7 0l a m o l l ) 或白藜芦醇( 5 0r t r n o l l ) 各自处理2 4h 后分别诱发了a 4 31 细胞 1 9 和9 3 的早期凋亡。二者同时给药时，出现了凋亡率的大幅增加，约 达至1 3 4 2 的早期凋亡率( 与单药组相比p 0 0 1 ) 。t e 1 对照组细胞出现了 低于5 的自发凋亡，5 f u ( 1 5 0p m o l l ) 或白藜芦醇( 7 0 “r n o l l ) 单独作用 2 4 h 可分别将t e 1 的早期凋亡率提升到1 1 和7 5 二者联合给药后t e 1 的早期凋亡率增加到2 4 2 ，与单独给药组相比有极显著性差异 僻o 0 1 ) 。( 4 ) 钙离子在细胞内处于信号转导通路的上游，其变化与凋亡 的发生有关，5 - f u 或白藜芦醇单独用均可使细胞中钙离子的量增加，与 单独给药相比，两药联用使细胞中的钙离子强度与有大量增加，与单独给 药组呈极显著性差异( 氏0 0 1 ) 。为了研究药物联合使用的机制是否与凋亡 相关蛋白的改变有关，我们用w e s t e r nb l o t 检测了凋亡相关蛋白b e l 一2 、b a x 、 c a s p a s e 3 和p a r p 等的表达。结果显示无论是5 f u 或白藜芦醇都可以诱发 凋亡抑制蛋t 兰t b c l 2 表达水平的明显下降，联合药物组的b e l 2 减少更为明 显。而凋亡促进蛋白b a x 和p 5 3 的表达水平却随着给药出现大量增加。另 外，联合用药组的凋亡促进蛋白与凋亡抑制蛋白的比值( b a x b c l 2 ) 与 单独给药组相比大大增加。药物作用4 8 h 后细胞中e a s p a s e 3 和p a r p 蛋白酶 原的表达量减少，相应活化的c a s p a s e 3 和p a r p 片段的表达上调，与单独 给药组相比，联合用药组表现出了更为明显的下降和上调( 尸 o 0 1 ) 。以 上结果提示5 - f u 和白藜芦醇联合用药产生协同作用可能与上调凋亡促进 蛋i 刍b a x 和p 5 3 的表达，下调凋亡抑制蛋白b c l 2 的表达有关。 结论：( 1 ) 5 f u 和r e s 都可以诱导肿瘤细胞a 4 3 1 、t e 1 发生不同程 度的凋亡。( 2 ) 5 f u 和r e s 联合使用对肿瘤细胞a 4 31 、t e 1 的凋亡有协 同作用。( 3 ) 5 f u 和r e s 联合使用对肿瘤细胞a 4 31 、t e 1 凋亡作用机制 可能是通过上调促凋亡基因p 5 3 ， b a x ，下调b c l 2 基因表达激活线粒 中文摘要 体通路，从而活化c a s p a s e 3 发生级联反应进而活化底物p a r p 而诱导了 细胞凋亡的发生。 第四部分5 氟尿嘧啶联合白藜芦醇对小鼠两阶段皮肤癌模型的抗肿瘤作 用 目的：研究了5 f u 联合白藜芦醇对小鼠两阶段皮肤癌模型的抗肿瘤 作用 方法：小鼠皮肤乳头状瘤模型采用经典的d m b a t p a 两阶段促癌法 进行诱发。w e s t e r n b l o t 检测小鼠皮肤肿瘤中p 5 3 、b a x 和b c l 2 的表达水 平。免疫组织化学检测鼠皮中活化c a s p a s e 3 的表达。 结果：( 1 ) 给药后皮肤中p 5 3 、b a x 的表达水平上升，b c l 2 的表达水平 下降，联合给药组组织中促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白的比值( b a x b c l 2 ) 明 显增加。( 2 ) 5 f u 或白藜芦醇单独给药后均可引起小鼠表皮细胞中 e a s p a s e 3 的活化，联合给药组的活化程度与单独给药组相比有明显的增 加。 结论：( 1 ) 与单药相比，5 f u 和r e s 联合给药可以对小鼠表皮癌产生 良好的治疗效果，并减轻5 f u 对皮肤的强烈刺激。( 2 ) 5 f u 和r e s 联合给 药可以通过调节p 5 3 、b a x 和b e l 2 基因的表达以及上调b a x b c l 2 的比 例诱导小鼠表皮肿瘤产生凋亡。( 3 ) 5 f u 和r e s 联合给药还可以使小鼠表 皮细胞中的凋亡执行因子c a s p a s e 3 大量活化，从而诱导细胞产生凋亡。 结论 通过我们的实验研究可以得出以下结论：1 、5 f u 和r e s 联合给药对人 表皮癌a 4 3 1 和人食管鳞癌t e 1 的生长抑制有协同作用，而且呈现时间和 浓度依赖性，与5 f u 和r e s 单独用药相比，可以更好的抑带1 a 4 3 1 和t e 1 细 胞的生长曲线和克隆形成，并在一定程度上通过增j j 口a 4 3 1 和t e 1 的坏死 程度起到肿瘤抑制作用。2 、r e s 可以影响a 4 3 l 和t e 1 细胞的细胞周期， 将大量细胞阻滞在对5 f u 敏感的s 期，同时降低p c n a 的表达使细胞增殖 减少，而5 f u 和r e s 联合给药也可将部分细胞阻滞在d n a 合成前期从而减 少肿瘤细胞的增殖。二者抗肿瘤的协同作用可能是上述原因综合作用的结 果。3 、5 f u 和r e s 联合给药与单独给药相比能更大程度的影响与凋亡有关 中文摘要 的生物转导因子c e + 的胞内表达和凋亡相关蛋白的表达( 上调p 5 3 、 b a x b c l 2l i , 例，活化c a s p a s e 3 ，切割其特定底物p a r p ) ，产生更强程度的 凋亡。具体表现为c a 2 + 荧光强度大幅度增加，凋亡小体的增多，d n a 有序 片段化条带增多，膜磷脂外翻程度增加等。4 、5 f u 和r e s 联合给药在两阶 段诱发的皮肤癌整体动物模型上也表现出了协同作用，可以对小鼠皮肤癌 进行有效的治疗，并影响小鼠皮肤凋亡相关蛋白的表达( 上调p 5 3 、 b a x b c l 2l l 例，增加胞浆内活化c a s p a s e 3 比例) 。 关键词：5 氟尿嘧啶；白藜芦醇；t e 1 ；a 4 31 ；协同效应；凋亡； c h o u - t a l a l a y 联合指数法；两阶段致癌 a b s t r a c t c a n c e r , n e x to n l yt oh e a r td i s e a s e ，i st h es e c o n dl e a d i n gc a u s eo fd e a m i i l d e v e l o p i n gc o u n t r i e s t h eb u r d e no fc a n c e ri s i n c r e a s i n gi ne c o i l o i i l i c a u v d e v e l o p m gc o u n t r i e sa sar e s u l to fe n v i r o n m e n tp o l l u t i o n ，p o p u l a t i o na 西n g a n dg r o w t ha sw e l la s ，i n c r e a s i n g l y ，a na d o p t i o no f c a n c e r - a s s o c i a t e dl i f e s 圾l e c h o i c e si n c l u d i n g s m o k i n g ，p h y s i c a li n a c t i v i t y ，a n d w e s t e r n i z e d ，d i e t s u a n c e rc a nb et r e a t e d b ys u r g e r y , c h e m o t h e r a p y , r a d i a t i o n t h e r a p y , i m m u n o t h e r a p y , m o n o c l o n a l a n t i b o d yt h e r a p y o ro t h e r m e m o d s c h 锄o m 盱a p yp l a y sam a i nr o l ei nt h ea n t i t u m o rt h e r a p y c h e m o t h e r a p yi s t h et r e a t m e n to fc a n c e rw i t hd r u g st h a tc a n d e s t r o yc a n c e rc e l l s i d e a l l y ， c h e m o t h e r a p e u t i ca g e n t ss h o u l dt a r g e tc a n c e rc e l l s s p e c i f i c a l l yw i t h o u t a f f e c t i n gn o r m a lc e l l s ，b yi n d u c i n gc y t o s t a t i co rc y t o t o x i ce f l e c t s i nf a c t t 1 1 e l a c ko fs p e c i f i c i t y , i n t r i n s i c o r a c q u k e dd r u gr e s i s t a n c e ，e s p e c i a l l vt h e i n d u c t i o no fs i d ee f f e c t sd u et oh i g hd o s a g ea f f e c t st h et h e r a p e u t i ce f f e c to f m a n yc h e m o t h e r a p e u t i c s i na d d i t i o nt of i n d i n gm o r ee f f e c t i v es u b s 加c e so f l o wt o x l c l t y , t h e s ep r o b l e m s c a l la l s ob eo v e r c o m e b yc o m b i n i n go 廿l e r c o m p o u n d so rd r u g sw i t hal o w e rd o s et r e a t m e n ta g e n t st og e ta l la d d i t i v e0 r s y n e r g i s t i ct h e r a p e u t i ce f f e c t u s i n gt h ec e l lc y c l e s p e c i f i ca g e n tt oi m e m r e t h ec e l lc y c l ea n db l o c kt h ec a n c e rc e l l sa tac e r t a i np e r i o d ，w i l li n l p r o v e 舭 s e n s i t i v i t yo fc a n c e rc e l l st o c h e m o t h e m p e u t i c s m e a n w h l i e ， i tc a na l s o d e c r e a s es i d ee f f e c tb y r e d u c i n gt h ed o s eo fc h e m o t h e r a p e u t i c s a m o n g t h ec h e m o t h e r a p y d r u g s ，f l u o r o u r a c i l ( 5 - f u ) i sw i d e l yu s e di nt h e t r e a t m e n to far a n g eo fs o l i dt u m o r sa sw e l la sf o r c u t a n e o u sd i s e a s e s i t 、) i r 0 咀岱 b yb l o c k i n gt h ec a n c e rc e l l sa tg d sp h a s ea n di n d u c e sa p o p t o s i so fc 觚c e r c e l l sb yi n h i b i t i n ge s s e n t i a lb i o s y n t h e t i cp r o c e s s e s ，o r b yb e i n gi n c o r p o 眈d i n t or n aa n dd n a a sat h y m i d y l a t es y n t h a s ei n h i b i t o rt o i 1 1 n u e n c em e i r n o 肌2 l ii i m c t i o n i nt h e p r o c e s s ，5 - f ua l s od e s t r o y sn o r m a lc e l l s ，c a u s i n g o ft r e a t m e n t ff a i l u r ef o r c a n c e rt h e r a p i e s t or e d u c et h ea d v e r s ee f f e c t sa n dm a x i m i z et h ea n t i - t u m o r e f f e c t so f5 - f u ，e f f o r t sh a v eb e e nm a d ei nc o m b i n a t i o no f5 一f uw i t hs e v e r a l s e c o n d l i n ea g e n t s ，s u c ha sp a c l i t a x e l ，m i t o m y c i n ，l e u c o v o r i n ，t e g a f u r , a n ds o o n i na d d i t i o n ，s o m en a t u r a lp h y t o c h e m i c a l sh a v ea l s os h o w ni n c r e a s e d e f f e c t sa n dd e c r e a s i n gc y t o t o x i c i t yi nc o m b i n a t i o nw i t h5 - f u r e s v e r a t r o l ( r e s ) i sap h y t o a l e x i np r o d u c e db yt h ee n z y m es t i l b e n e s y n t h a s ei nr e s p o n s et oe n v i r o n m e n t a ls t r e s ss u c ha sv i c i s s i t u d e si nc l i m a t e ， e x p o s u r et oo z o n e ，s u n l i g h ta n dh e a v ym e t a l s ，a n di n f e c t i o nb yp a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s n u m e r o u ss t u d i e ss h o wt h a tr e s v e r a t r o lh a st h ea b i l i t yi n p r o t e c t i n ga g a i n s tm a n yd i s e a s e si n c l u d i n gc a n c e r r e s v e r a t r o lc a np o t e n t i a l l y i n t e r f e r ew i t ha l lt h r e em a jo rs t a g e so fc a r c i n o g e n e s i s ( i n i t i a t i o n ，p r o m o t i o n a n dp r o g r e s s i o n ) t h ea n t i - t u m o r p r o p e r t i e s o fr e s v e r a t r o lh a v e b e e n a s s o c i a t e dw i t hi t sa n t i o x i d a n ta c t i v i t ya n da b i l i t yt oa f f e c tc e l l g r o w t h , i n f l a m m a t i o n ，a p o p t o s i s ，a n g i o g e n e s i s ，a n di n v a s i o n i th a st h ea b i l i t yt oa f f e c t m a n yg e n ee x p r e s s i o nv i am a n yp a t h w a y s ，t h e s ei n c l u d et u m o rs u p p r e s s o r s p 5 3a n dr b ，c e l lc y c l er e g u l a t o r sc y c l i n sa n dm a n ya p o p t o t i ca n ds u r v i v a l r e g u l a t o r s t h e s e i nv i t r oa n di nv i v os t u d i e sp r o v i d ear a t i o n a lb a s i si n s u p p o r t o fu s i n gr e s v e r a t r o li nh u m a nc a n c e r c h e m o p r e v e n t i o n ，i n a c o m b i n a t o r i a la p p r o a c hw i t ho t h e rc h e m o t h e r a p e u t i cd r u g sf o rt h eh i g h l y e f f i c i e n tt r e a t m e n to fd r u gr e f r a c t o r yt u m o rc e l l s s k i nc a n c e r , e s p e c i a l l yt h en o n m e l a n o m as k i nc a n c e r s ( n m s c ) ，i st h e m o s tc o m m o nf o r mo fh u m a nc a n c e r i ti se s t i m a t e dt h a to v e r1m i l l i o nn e w c a s e so c c u ra n n u a l l y t h ea n n u a lr a t e so fa l lf o r m so fs k i nc a n c e ra r e i n c r e a s i n g e a c hy e a r , r e p r e s e n t i n gag r o w i n gp u b l i c c o n c e m e s o p h a g e a l c a n c e ri st h es i x t hl e a d i n gc a u s eo fc a n c e rm o r t a l i t y c h i n ai sa m o n gt h ea r e a s o fh i g hi n c i d e n c eo fe s o p h a g e a lc a n c e r g i v e nt h eh i g hi n c i d e n c eo ft h et w o c a n c e r s ，w ec h o s eh u m a ne p i d e r m a lc a n c e rc e l ll i n e sa 4 31a n de s o p h a g e a l s q u a m o u sc e l lc a n c e rt e 一1t od e t e r m i n et h ei n d i v i d u a la n dc o m b i n e de f f e c t s o fr e s v e r a t r o la n d5 一f uo nc e l lg r o w t h ，c e l lc y c l e ，a n da p o p t o s i s w ea l s o 9 w a sa n a l y z e db yt h em e t h o do fc h o ua n dt a l a l a y , w h i c hi saq u a n t i t a t i v e m e a s u r eo ft h ed e g r e eo fd r u gi n t e r a c t i o nb e t w e e nt w oa g e n t s c y t o t o x i c i t y i n d u c e db y5 - f uc o m b i n e dw i t hr e so na 4 3la n dt e 1w a sm e a s u r e db y l d h r e l e a s i n ga s s a y r e s u l t s ：( 1 ) m t ta s s a ys h o w e dt h a t5 f ud e c r e a s e dc e l lv i a b i l i 饵i na c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t a n d t i m e d e p e n d e n tm a n n e r r e sa t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s ( n ol e s st h a nio l x r n o l l ) a l s os h o w e da ni n h i b i t i o no nc e l l v i a b i l i t y i n a c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t a n d t i m e d e p e n d e n t m a n n e r c o m b i n a t i o no f5 f uw i t hr e sw a sm o r ee f f e c t i v et h a ne i t h e ra l o n ea tm o s t c o n c e n t r a t i o n s d e c r e a s e dt h em e d i a ni n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ( i c 5 0 ) t oa 4 31 c e l l sf r o m3 2 2 8 9p mt o7 1 9 9 t m ( 5 - f u ) a n d17 4 5 8p m t o3 7 5 6 t m ( r e s ) ， r e s p e c t i v e l y a n dd e c r e a s e di c 5 0t ot e lc e l l sf r o m4 8 0 8 3l a mt o151 8 7 “m ( 5 - f u ) a n d2 4 8 6 4 肛mt o6 9 4 2 - t m ( r e s ) ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t si n d i c a t e da s y n e r g i s t i ca n t i - t u m o re f f e c to fc o m b i n i n g5 - f ua n dr e s 硼1 ei n h i b i t o r ye f f e c t o fc o m b i n a t i o no ft h et w od r u g sw a sa s s e s s e db yt l l em t t a s s a y a f t e rt r e a t e d w i t h5 - f uw i t ho rw i t h o u tr e sf o r4 8h ，t h ei n h i b i t i o nr a t e sw e r ea n a l y z e db y t h em e t h o do fc h o ua n dt a l a l a y 砀ec iv a l u ew a sd e t e r m i n e da te f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n ( e c ) o f5 一f up l u sr e st h a tc a u s e dm i n i m a li n h i b i t i o n ( 1o ， e c l 0 ) a n dm a x i m a li n h i b i t i o n ( 9 5 ，e c 9 5 ) 5 一f ua n dr e sa c t e ds y n e r g i s t i c a l l y w h e nb o t ha g e n t si n h i b i t e dc e l lv i a b i l i t yb y5 0 i na 4 3 1 ( c i o 4 38 ) a n d t e l ( c i = 0 5 9 5 ) t h ec iv a l u e sw e r e 1w h e