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三角褐指瀑和微拟球藻e p a 合成的去饱和酶研究 三角褐指藻和微拟球藻e p a 合成的去饱和酶研究 摘要 众所周知，( 0 3 系的超长链多不饱和脂肪酸( v e r yl o n g - c h a i np o l y u n s a t u r a t e df a t t y a c i d s ，v l c p u f a s ) 特别是e p a ( e i c o s a p e n t a e n o i ca c i d ，2 0 ：5 n 3 ) 和d h a ( d o c o s a p e n t a e n o i c a c i d ，2 2 ：6 1 1 3 ) 对人类健康非常重要。日常摄入一定量的v l c p u f a s 能够补充人体自身合 成的不足，对某些疾病起到明显的预防和治疗作用。v l c p u f a s 的主要来源是深海鱼 浊，但是由于市场需求的迅速增长和海洋可捕捞鱼类资源的日益减少，该途径已经远 远不能满足需要，寻找更为持续、稳定的v l c h j f a s 来源已经成为当务之急。海洋微 藻是海洋食物链的初级生产者，许多种类能够从头合成v l c p u f a s 且含量较高。海藻 以其脂肪酸组成稳定，不含胆固醇，没有难闻的鱼腥味和重金属元素污染等优点正逐 渐成为鱼油的良好替代资源，具有巨大的开发潜力。近年来，对海洋微藻v l c p u f a s 合成及存储相关酶基因的研究进展很快，己在多个藻种中克隆得到了参与e p a 、d h a 合成的去饱和酶和延伸酶基因。将该类基因在植物特别是油料作物中表达，使之作为 “绿色细胞工厂”生产v l c p u f a s 的研究已成为植物代谢工程研究领域的热点之一。 国外多个小组进行了转基因植物合成v l c p u f a s 的探索并取得了突破性的成果。国内 目前还没有这方面的报道。及时开展相关研究，获得具有自主知识产权的酶基因，不 仅有助于阐明微藻脂肪酸合成及存储途径，阐明脂肪酸随环境因子变化而变化的机理， 也可为经济微藻的优化培养与遗传改良提供一定的分子基础，为转基因植物合成 v l c p u f a s 的研究提供基因来源，因此具有重要的理论意义和广阔的应用前景。 本实验选择了两种海洋真核微藻一三角褐指藻( p h a e o d a c ( y l u mt r i c o r n u t u m ) 和微拟 球藻( n a n n o c h l o r o p s i so c u l a t a ) 进行e p a 合成途径中去饱和酶的研究。这两种藻均富含 e p a ，含量可达总脂肪酸的3 0 以上，说明在这两种藻中存在高效合成e p a 的酶系， 有望克隆得到具有较高底物特异性和酶活性的去饱和酶基因。此外，这两种藻均能够 进行大规模培养，本身就可作为e p a 的来源。二者在脂肪酸合成上也存在些差异， 如三角褐指藻的e p a 合成途径比较复杂，推测存在4 条通路，而微拟球藻的相对简单， 只有经典的n 6 、n 3 途径；除e p a 外，三角褐指藻还含有少量d h a ，而微拟球藻不含 d h a 。弄清楚存在这些差异的原因有助于对这两个藻种进行比较研究。目前对这两种 藻的研究程度也不尽相同，对三角褐指藻的研究较为深入，已有4 个去饱和酶基因被 三角褐指藻和微拟球藻e p a 台成的去饱和酶研究 克隆鉴定，该藻的基因组测序及注释工作也即将完成；对微拟球藻的研究较少，分子 信息相当缺乏，还没有去饱和酶的研究报道。通过分析已有资料，本实验在进行这两 种藻的去饱和酶基因克隆时采取了不同的研究方法。 已知三角褐指藻的4 条e p a 合成途径均需要5 脂肪酸去饱和酶的作用，可见5 位去饱和是e p a 生成的关键步骤。先前已有研究者克隆得到一个5 去饱和酶基因 0 t d 5 ) ，表达后发现能将1 3 3 的e t a ( 2 0 ：4 a 8 ，1 1 ，1 4 ，1 7 ) 转化为e p a ( 2 0 ：5 5 ，8 ，1 l ，1 4 ，1 7 ) ， 而在藻细胞中这一转化效率几乎为1 0 0 。为什么会出现这种差异呢? 推测藻细胞中至 少还存在一个5 去饱和酶。通过应用简并p c r 、反向p c r 及r a c e 等方法，在三角 褐指藻中成功克隆得到一个类5 去饱和酶基因序列( p r 0 5 - 2 ) 。全基因序列共1 5 6 1 b p ， 在第3 0 3 4 3 2 位碱基之间有一个内含子，转录后的m r n a 翻译区有1 4 3 i n t ，可翻译 为4 7 6 个氨基酸残基。分析显示翻译后的蛋白序列具有“前端”去饱和酶的明显特征， 如n 端细胞色素6 5 结构域；3 个极为保守的组氨酸簇( 分别为h d a n h 、h w t h h 、 q v e h h ) ，第3 个组氨酸簇的第1 个h 被q 替代。此外，具有4 个明显的跨膜旺螺旋 区，分别位于1 3 2 1 4 8 、1 5 3 1 7 2 、2 5 6 2 7 4 和3 3 4 3 5 2 位氨基酸残基之间。将该 序列在n c b ib l a s t 中做p r o t e i n p r o t e i nb l a s t ，结果与三角褐指藻的第1 个5 去饱 和酶f e t d 5 ) 及海链藻的5 去饱和酶( d e s o ) 同源性最高( i d e n t i t y 分别5 1 和4 7 ) 。关 于该酶的功能鉴定工作正在进行中。 微拟球藻脂肪酸合成方面的资料较少，到目前为止还没有从该藻中克隆得到去饱 和酶基因的报道，而且该藻的其它分子信息也相当缺乏。鉴于微拟球藻重要的生态及 经济价值，获取更多的基因信息从而对其进行深入研究是必需的。生成表达序列标签 ( e s y s ) 是得到表达基因信息的有效途径，本实验选择了e p a 含量较高的指数生长末期的 藻细胞，构建了微拟球藻的c d n a 文库并进行了大量的z s t n 序，以期在分子水平上对 该藻有更为全面的了解，并试图从中获得e p a 合成相关的去饱和酶基因。试验共获得 5 3 1 5 条e s t 序列，长度1 0 0 。7 1 6b p ，非冗余序列( n o n r e d u n d a n ts e q u e n c e s r q r s s ) 1 9 6 0 条， 其中仅有3 2 ，5 的n r s s 与n l 库中的蛋白序列具有相似性( e l e 0 4 ) ，2 5 的n r s s 能够得 到k o g 注释并根据其可能的细胞功能被归于2 4 个功能组。大多数n r s s 与已知的蛋白没 有明显相似性，说明该藻可能具有许多非常独特的基因。虽然指数末期的藻细胞e p a 含量很高，但是在所测的e s t s 中未能分析得到去饱和酶的相似序列。令人惊讶的是改 用简并引物扩增3 去饱和酶基因片段也未能得到任何条带，这一结果进步证明了该 藻遗传信息的特殊性，表明该藻的去饱和酶基因似乎也较为独特。 u 三角褐指藻和微拟球藻e p a 台成的去饱和酶研究 此外，本实验应用实时定量p c r 初步研究了p t d 5 和p t d 5 2 基因在三角褐指藻不 同生长期的表达变化。发现两个基因的表达趋势是相同的，均在指数生长期表达水平 最高，而在指数末期表达量显著下降，在静止初期最低，进入静止期后略有升高。两 个基因在指数生长期的表达量是其静止初期的2 0 倍。对不同生长期的三角褐指藻进行 脂肪酸分析，发现e p a 含量在整个生长期内均很丰富，一直是总脂肪酸中所占比例最 高的；而4 个时期相比较则指数生长期的藻细胞e p a 含量最低( 占总脂肪酸的2 9 猢， 指数末期明显升高( 占总脂肪酸的3 5 ) ，而后保持稳定直至静止期。这个现象非常有趣， 即去饱和酶基因表达量最高时e p a 含量最低，而当基因表达水平降低后e p a 含量反而 有所升高。这也诲反映了从基因表达到产物合成的时滞，但是具体原因还需要迸一步 探索。该试验结果可为微拟球藻及其它微藻的研究提供参考。如果微拟球藻去饱和酶 的基因表达与三角褐指藻类似，在构建e d n a 文库时就可以考虑选取指数期的藻细胞。 综上所述，本研究克隆了三角褐指藻的一个类5 脂肪酸去饱和酶基因，序列分析 表明其极有可能是该藻的第2 个5 去饱和酶，如果能够确定其功能，那么这是在三角褐 指藻中具有两个5 去饱和酶的首次报道，对阐明该藻复杂的e p a 合成途径具有重要参 考价值，也为基因的表达调控及应用研究提供了分子基础。此外，本研究首次构建了 微拟球藻的e d n a 文库并进行了大量的e s t 钡i j 序，在分子水平上探讨了微拟球藻的表达 信息特征，为今后开展包括e p a 合成在内的多项研究奠定了基础。 关键词：e p a 合成；e s t 脂肪酸去饱和酶：微拟球藻；三角褐指藻 三角褐指藻和微拟球藻e p a 合成的去饱和酶研究 r e s e a r c ho nf a t t ya c i dd e s a t u r a s e si ne p a b i o s y n t h e s i so f p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u ma n dn a n n o c h l o r o p s i so c u l a t a a b s t r a c t i ti sw e l lk n o w nt h a tv e r yl o n g c h a i np o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ( v l c p u f a s ) h a v ea n u m b e ro fi m p o r t a n tn u t r i t i o n a la n dp h a r m a c e u t i c a lv a l u e s d i e t a r ys u p p l e m e n t a t i o no f v l c p u f a sh a sb e e nf o u n ds i g n i f i c a n t l ya l l e v i a t et h es y m p t o m so f m a n yd i s e a s e s c u r r a n f l y , t h ep r i n c i p a ls o u r c eo fv l c p u f a si sd e e p s e nf i s h h o w e v e r , i ti sc o n s i d e r e di n s u f f i c i e n t a n de n d a n g e r e dd u et oa ne x p a n d i n gm a r k e ta n de n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n t o e x p l o i t s u s t a i n a b l ea n dc o n t i n u a b l es o u r c e si su r g e n tn e e d m 撕n em i c r o a l g a eh a v eb e e nr e c e n t l y s h o w nt ob eg o o da l t e r n a t i v es o u r c e sf o rt l l e i ra b i l i t yt os y n t h e s i sa n da c c u m u l a t eg r e a t a m o u n t so fv l c p u f a s m o r ea n dm o r eg e n e se n c o d i n ge n z y m e si n v o l v e di nv l c p u f a s b i o s y n t h e s i s o fm i c r o a l g a e ，e g d e s a t u r a s e sa n de l o n g a s e s ，h a v eb e e ni d e n t i f i e d c o e x p r e s s i o no fs u c hg e n e si n o i lc r o p st op r o d u c ev l c p u f a sb e c o m e so n eo ft h e h o t s p o t si nt h ef i e l d o fp l a n tm e t a b o l i ce n g i n e e r i n g s e v e r a lf o r e i g ng r o u p ss t u d i e d v l c p u f a sb i o s y n t h e s i si nt r a n s g e n i cp l a n t sa n db r e a k t h r o u g hh a sb e e ni l a d e t h e r ei sn o d o m e s t i cr e l a t e dr e p o r t sa n di ti sn e c e s s a r yt od os o m er e s e a r c hw o r ki nt i m e i ti su s e f u lt o d e m o n s t r a t et h em e c h a n i s mo fm a n i p u l a t i o no fv l c p u t a sp r o d u c t i o ni nm i c r o a l g a ea n d o f f e rm o l e c u l a rb a s i sf o rt h ef o l l o w i n gt r a n s g e n i cr e s e a r c h ， i nt h i ss t u d y , t w om a r i n em i c r o a l g a e ，p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u ma n dn a n n o c h l o r o p s i s o c u l a t aw e r ec h o s e nf o rs t u d yo f t h e i rd e s a t u r a s e s b o t ho f t h e ma r er i c hi ne p aa n dw i d e l y u s e di nm a r i c u l t u r e t h e r ea r es o m ed i f f e r e n c e si nt h e i rf a t t ya c i ds y n t h e s i s e p a b i o s y n t h e t i cp a t h w a yo fp t r i c o r n u t u mi sm o r ec o m p l e xt h a nn o c u l a t a ，t h e r ei sal i t t l e d h ai n 尸t r i e o r n u t u m b u tn od h ai n o c u l a t a s e v e r a ld e s a t u r a s eg e n e sh a v eb e e n c l o n e df r o mpt r i c o r n u t u m h o w e v e r , l i t t l eh a sb e e nk n o w na b o u tf a t t ya c i db i o s y n t h e s i so f o c u l a t aa tt h em o l e c u l a rl e v e lu n t i ln o w t h e r e f o r e d i f f e r e n tm e t h o d sw e r eu s e dt oc l o n e d e s a t u r a s eg e n e sf r o mt h e s et w om i c r o a l g a e a c c o r d i n gt ot h ep r e v i o u sr e p o r t s ，t h ea 5d e s a t u r a t i o nc a t a l y z e db yt h ea 5d e s a t u r a s ei s t h e k e y p r o c e s s i n e p a b i o s y n t h e s i s t h ec o n v e r s i o no f 2 0 ：4 n 3 t o e p a i sa l m o s t1 0 0 i n p i v 三角褐指藻和微拟球藻e p a 合成的去饱和酶研究 t r i c o r n u t u m t h o u 曲aa 5d e s a t u r a s ef r o m ，t r i c o r n u t u m ( p t d 5 ) h a sb e e ni d e n t i f i e d ，i t s e e m st h a ti t sc a p a c i t yo fc o n v e r t i n g2 0 ：4 n 3t oe p ai sn o ta sh i 曲a sa n t i c i p a t o r y s om a y b e t h e r ei sas e c o n da 5d e s a t u r a s ei npt r i c o r n u t u m t oo b t a i nt h i sg e n e ，d e g e n e r a t ep c r ， i n v e r s ep c ra n dr a c ew e r ep e r f o r m e d a sar e s u l t ，aa 5d e s a t u r a s e l i k es e q u e n c ew a s o b t a i n e d ( p t d 5 2 ) t h et o t a ls e q u e n c ei s1 5 6 1 b pw i t ha ni n t r o ni n3 0 3 - 4 3 2 b p t h eo r f i s 1 4 3i n te n c o d i n g4 7 6a n l l n oa c i d s 髓ed e d u c e dp r o t e i ns e q u e n c ec o n t a i n st h et y p i c a l c h a r a c t e r so f f r o n t - e n d d e s a t u r a s e ss u c h 嬲t h en - t e m a i n a lc y tb 5d o m a i na n dt h r e e c o n s e r v e dh i s t i d i n ec l u s t e r s 谢t 1 1a l lht oqs u b s t i t u t i o ni nt h et h i r dc l u s t e r i na d d i t i o n , h y d r o p h o b i cp l o th a d i n d i c a t e dt h ep r e s e n c eo f d i s t i n c tf o u rp o t e n t i a lt r a n s m e m b r a n eh e l i c e s t h ep r o t e i ns e q u e n c es h a r e st h eh i g h e ri d e n t i t i e sw i t hp t d 5a n dt h ea 5d e s a t u r a s eo f t h a l a s s i o s i r ap s e u d o n a n a ( d e s o ) ( 5 1 a n d4 7 ，r e s p e c t i v e l y ) t h ei d e n t i f i c a t i o no ft h i s g e n ei si np r o c e s s i n g t h o u g ht h e r ea r es o m em o r p h o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a la n db i o p h y s i c a ls t u d i e so f n o c u l a t a ， l i t t l eh a sb e e nk n o w na tt h em o l e c u l a rl e v e lu n t i ln o w c o n s i d e r i n gt h i sa l g ah a sg r e a t e c o l o g i c a la n dc o m m e r c i a lv a l u e ，m o r ee f f o r t ss h o u l db em a d et oo b t a i ni n f o r m a t i o no fi t s g e n o m e ，w h i c hm i g h th e l pu sb e t t e ru n d e r s t a n di t sv a i j o u sb i o l o g i c a lp r o c e s s e si n c l u d i n g f a t t ya c i db i o s y t h e s i s t og e n e r a t ee x p r e s s e ds e q u e n c et a g sf e s t s ) i sa l le f f i c i e n tw a yt o o b t a i ni n f o r m a t i o no ne x p r e s s e dg e n e s s oae d n al i b r a r yw a sc o n s t r u c t e du s i n g 踅o c u l a t a c e l l sg r o w na tl a t ee x p o n e n t i a lg r o w t hp h a s e m o r et h a n5 ，0 0 0c l o n e sw e r es e q u e n c e da n d 5 3 1 5e s tr e a d sw a so b t a i n e d at o t a lo f1 9 6 0n o n - r e d u n d a n ts e q u e n c e s ( n r s s ) w e r e g e n e r a t e d o n l y3 2 5 o fn r s ss h o w e ds i g n i f i c a n ts i m i l a r i t y ( e 2 5 ) ，但a a 和e p a 含量极低，仅有1 o 和0 8 ( 表3 ) 。由于d g l a 和e t a 的含量也非 1 7 三角褐指藻和微拟球藻e p a 合成的去饱和酶醑究 常少( 分别为1 2 和0 9 ) ，所以推断c 1 8 6 延伸一步为整个合成通路的瓶颈。试验结 果显示a 6 延伸酶基因转录活跃且酶活很高，但是该酶的适宜底物g l a c o a 、s d a c o a 在发育种子的c o a 库中含量很少，因此作者推测是a 6 延伸酶的底物适用性限制了c 1 8 的延伸效率。如前所述，植物中去饱和酶的底物为p c 中的脂肪酸，而延伸酶的底物为 酰基c o a 中的脂肪酸，如果6 去饱和产物不能有效的从p c 转入酰基c o a 库，就不能被 延伸酶催化延伸。影响脂肪酸进入酰基c o a 库的可能原因主要有两点：一是负责脂肪 酸在p c 和酰基c o a 库之间转移的酰基转移酶( l p c a t ) 不能有效识别并转移非植物自身 的脂肪酸；二是由于s d a 可经不依赖于酰基一c o a 的途径直接整合入三酰甘油，而且植 物中催化该反应的酶( 如p d a t ) 活性很高，所以影响了s d a 至i j 酰基c o a 库的转移( 图3 8 ) 。 ( 3 ) 经典通路的构建和d h a 的生成 实现了c 2 0 v l c p u f a s 在转基因植物种子中的合成后，研究者又将目标转向高等 植物d h a 合成通路的构建，k i n n e y 等( 2 0 0 4 ) 专利的形式报道了在转基因大_ 豆( g l y c i n e m a x ) 种子和体细胞胚中合成e p a 和d h a 的方法。在大豆种予中表达了5 个外源基因( 表 3 ) ，结果种子中e p a 含量达到了总脂肪酸的1 9 6 ，明显高于a b b a d i 等( 2 0 0 4 ) 在亚麻 种子中得到的结果，推测1 5 和1 7 去饱和酶的转入增加了n 6 族脂肪酸向1 1 3 族脂肪 酸的转化。在体细胞胚中表达了除a 1 5 去饱和酶以外的上述其它4 个酶，另又增加了 盐生巴夫藻( p a v l o v as a l i n a ) 的5 延伸酶和真菌s c h i z o c h y t r i u ma g g r e g a t u m 的4 去饱和 酶，结果生成了6 1 的e p a 和3 1 的d h a ，这是目前转基因植物中d h a 产量最高 的报道( 表3 ) 。 r o b e r t 等( 2 0 0 5 ) 在拟南芥种子中构建了类似的合成途径，将斑马鱼的a 6 a 5 双功能 去饱和酶、线虫的6 延伸酶、盐生巴夫藻的5 延伸酶和4 去饱和酶基因分两步转 入拟南芥，最终生成了2 5 的e p a 和o 5 的d r t a ( 表3 ) 。斑马鱼的a 6 a 5 去饱和酶 是典型的动物来源的去饱和酶，以酰基c o a 中的脂肪酸为底物，其产物可直接被a 6 延伸酶利用，从而大大提高了延伸效率，使8 6 的g l a 和6 7 的s d a 被延伸。但是 v l c p u f a s 的产量仍然很低，分析表明a 6 去饱和反应成为了整个合成途径的限速步 骤，这可能是由于动物来源的去饱和酶在植物中酶活不高造成的。 近期，又有研究者通过5 步转基因操作在芥菜( b r a s s i c aj u n c e a ) 种子中成功构建了 e p a 、d h a 合成通路( w u e ta 1 ，2 0 0 5 ) ( 表3 ) 。e p a 的最高产量可达1 5 ，明显高于a b b a d i 等( 2 0 0 4 ) 在亚麻中得到的结果。d h a 和产量仍然较少，最高为1 5 ( 表3 1 。试验显示 e p a 的a 5 延伸一步效率很低，只有4 ，这可能与转基因亚麻a 6 延伸效率低的原因 三角褐指藻和微拟球藻e p a 合成的去饱和酶研究 类似，即脂肪酸去饱和后不能有效的由p c 进入a c y l c o a 库从而被延伸酶利用。此外， 作者还提出另一种可能的原因，即外源转入的延伸酶如果与植物内源性延伸复合体的 其它3 个组分不能很好的协作，也会降低延伸反应效率。至于本试验转入的l p c a t 在 d h a 合成中是否起到了促进作用还不清楚，但是理论上它能够帮助v l c p u i 舢在酰基 ，c o a 库和p c 间进行转移。 表3 不同转基因植物中v l c p u f a s 的生成 t a b 3v l c p u f a si nd i f f e r e n ti r a n s g e n i cp l a n t s h o s tp 2 赫t h e t 暂o l o g o u s 吼鲫嚣a a ( 嗡e e 氏惭d 王a ( 哟 r c f e r e a a e c a r a b i d o p s i sl e a v 髂i g 9 e l o + e g a 8 d e 针m 血5 d 铝 6 63 00 0 q ic ta 1 ，2 0 0 4 l i n s e e ds e e d s p t a 6 d e s + p p a 6 e l o + p t a 5 d e s 1 00 80 0 a b b a d ic t a l ，2 0 0 4 s o y t m ns e e d s s d a 6 d e s + m a a 6 e l o + m a a s d e s2 21 9 60 0 k e n n e yc ta 1 。2 0 0 4 a n da t a l 5 d e s + s d a l 7 酶 s o y b e a ns o l l l a t i c s d a 6 d e s + m a a 6 e 1 0 + m a a 5 d e s e m b r y o sp a v a s e l o + s a a 4 d e s + s d a l 7 d a r a b i d o p s i ss e e d s d r 6 ，a 5 d e s + c e 矗6 e l o + m a a 5 d 它 s b r s w a 血r c e t lp i a 6 d e s + t c a 5 d e s + p p a 6 e l o s e e d s p i a 6 d e s + t c a s d e s + p p a 6 e l o + c o a l 2 d b p i a 6 d e s + t c a s d e s + p p a 6 e i o - t - c o a l 2 d e s + t e a 6 e l o p i a 6 d e s + t c 浊5 d e s + p p a 6 e l o + c o a f 2 d 鹊+ t c a 6 e 1 0 + p i n 3 d c s p i a 6 d e s + t c a s d e s + p p a 6 e l o - t - c o a l 2 d e s + t c 6 e i o + p i n e 3 d e s a n dt c a 4 d e s + t c a t + o n u 坫e i o 5 26 1 1 22 j 7 3o 8 1 2 o1 3 1 3 71 4 5 48 1 4 08 1 k e n n e yc ia 1 。2 0 0 4 r o b e r t n a l ，2 0 0 5 w ue l ：a l ，2 0 0 5 a b b r e v i a t i o n s ：v l c p u f a s , v e r y l o n g - c h a i n p o l y u n s a l u r m e d 伽砂i a s ；a m n e h i d o n i ca c i d ；e r a , e i c o s a p e n t a e n o i ca c i d ；d h a , d o e o s a h e x a e n o i ca c i d ；慨d e s a t u r a s 8 ；e i o , c l o n g a s e a a r a b i d o p s i $ t h a l i a n a ；c e , c a e n o r h a b d i t 西e l e g a n a ；c o , c a l e n d u l a o f f i c i n a l i s ；d r , d a n i o r e r i o ；地e u g l e n a g r a c i l i s ；l 舀l s o c h r y s i s g a l b a n a ；m a m o r t i e r e l l a a l p i n a ；o r e , o n e h o r h y m h u a m y l a s s ；p a y , p a v l o v as p 4p i p y t h i u m i r r e g u l a r e ；p h p h y t h o p h t o r a i n f e s t a m ；p p , p h y s c o m i t r e l l a p a t e n s ；p s , p a v l o v a s a l i n a ； p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u m ；s “s c h i z o c h y t r i u ma g g r e g a t u m ；s o , s a p r o l e g n i ad i c l i n a ；t o , t h r a m t o c h y t r u ms p 3 5 2 增强转基因植物合成和积累v l c p u f a s 的策略 ( 1 ) 选择适宜的目标植物 不同种类的植物脂肪酸代谢途径不完全相同，相关酶的作用能力也存在差异，因此 在不同植物中构建相同的脂肪酸合成通路，其合成效率也会有所差另1 ( s i n g he ta 1 ， 1 9 ” 啦 三角褐指藻和微拟球藻e p a 合成的去饱和酶研究 2 0 0 5 ) 。上述研究表明，尽管都是构建经典的合成途径，大豆和芥菜似乎比亚麻和烟草 更容易生成v l c p u f a s ( 表3 ) ，这可能与不同植物的内源性l p c a t 活性不同有关，但 还需要进一步的实验证明。 ( 2 ) 选择适宜的去饱和酶、延伸酶基因 目前发现的去饱和酶和延伸酶大多对脂肪酸底物的链长、双键数量和位置不具有严 格的专一性，除了目标产物外，还会生成某些副产物。考虑到这些脂肪酸对转基因植 物和人体的影响所知甚少，它们的出现不利于转基因植物的商业化应用，因此需要继 续筛选具有高底物特异性的去饱和酶和延伸酶。已知许多海洋微藻能够从头合成并积 累大量的v l c p i 爪a s ，它们有望成为相关基因的良好来源。 ( 3 ) 选择目标植物种子特异的启动子 转基因植物合成v l c p u f a s 后，必须将其转运到t a g 中才有利于存储、提取和被 人体利用。种子是t a g 大量存储的部位，转基因植物合成v l c p i 砸a s 的关键之一是 能否在其种子中实现v l c p u f a s 的合成及存储，这首先就需要选择种子特异的强启动 子以实现外源基因在发育种子中的大量表达( s i n g he ta 1 。2 0 0 5 ) 。此外，t a g 合成存在 多条途径，深入研究t a g 合成相关的酶进而提高t a g 的合成效率对开发有商业价值 的转基因植物也具有重要意义。 ( 4 ) 解决脂肪酸在磷脂库和酰基c o a 库间的转运瓶颈 上述研究表明，去饱； 产物不能有效的从p c 转入酰基一c o a 库是妨碍其进一步延 伸的瓶颈，也是v l c p u f a s 合成的主要限制因素，这可能是由于植物内源性的l p c a t 不能有效识别并转运v l c p u f a s 造成的( n a p i e re ta 1 ，2 0 0 6 ) 。解决这一问题主要有两条 途径：一是研究海洋微藻等能够自身合成e p a 、d h a 的生物中该类脂肪酸在p c 和酰 基c o a 库间的交换机制，寻找高效转移v l c p u f a s 的l p c a t ；二是转入以酰基c o a 为底物的去饱和酶，减少脂肪酸在p c 和酰基c o a 库间的转移，提高延伸效率。已知 动物的去饱和酶为酰基c o a 去饱和酶，但是将动物来源的基因转入植物可能会引起消 费者的反感，从而影响其商业化应用( t r u s k a 毗a 1 ，2 0 0 6 ) 。虽然在某些高等植物中也发 现了酰基c o a 去饱和酶( m o r e a ue ta 1 ，1 9 8 1 ；c a h o o ne ta 1 ，2 0 0 0 ；m a r i l l i ae ta 1 ，2 0 0 2 ) ，但 是它们只能催化饱和脂肪酸链的第1 个去饱和反应，不能在u f a s 中继续引入双键 ( s p e r l i n ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 。最近，个来自海洋微藻o s t r e o c o c c u st a u r i 的酰基一c o a a 6 去饱 和酶被鉴定，将其与a 6 延伸酶和5 去饱和酶在酵母中共表达，发现a a 和e p a 的产 量是使用a 6 酰基一脂去饱和酶的2 0 倍，关于该酶能否提高转基因植物的6 延伸效率 三角褐指藻和微拟球藻e p a 合成的去饱和酶研究 还有待进一步研究( d o m e r g u ee ta 1 ，2 0 0 5 b ) 。此外，由于目前转基因植物中d h a 的生成 量很低，而a 5 延伸反应是d h a 合成最为重要的限速步骤，如果能够克隆出以 e t a ( 2 0 ：5 n 3 ) 为底物的酰基c o a a 5 去饱和酶，就有可能大大提高d h a 的合成效率。 ( 5 ) 提高外源酶与内源酶的重组及协作效率 延伸反应实际是由4 个酶组成的多酶复合体催化( l e a a r d e ta 1 ，2 0 0 4 ) ，因为催化缩 合反应的酶( t i p 延伸酶) 决定着底物特异性，所以先前所有转基因试验仅转入了以长链多 不饱和脂肪酸为底物的缩合酶，该酶与植物本身的其它3 个组分能否协调一致将直接 影响延伸反应效率，将内源缩合酶突变或沉默掉是否有利于外源缩舍酶的重组值得迸 一步探索( w ue ta 1 ，2 0 0 5 ；t r u s k ae ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 此外，由o a 合成v l c p u f a s 的所有去饱和酶和延伸酶均为e r 膜蛋白，e r 膜并 不是均一的，而是由许多负责不同生物功能的微结构域构成，在转基因植物中表达的 外源蛋白如果不能准确进入e r 膜上与脂肪酸合成相关的区域，也会导致底物在这些酶 之间传递的障碍( t r u s k ae ta 1 ，2 0 0 6 ) 。因此，研究外源酶蛋自在e r 膜上的整合部位有 利于了解这些酶的空间协作，如果能使这些酶集中位于e r 的同一功能域内，就会使底 物的流动更加顺畅，从而提高合成效率。 上述几个研究小组的研究证明在植物中转基因生产v l c p u f a s 是可行的，而且a a 和e p a 的产量可以达到相当高的水平。虽然目前在转基因植物种子中大量合成d h a 还存在一些限制因素，但是相信随着对脂肪酸合成、转运及存储途径的深入研究和各 种相关酶基因的克隆鉴定，这些问题也会被逐步解决。如果植物油中a a 、e p a 和d h a 的含量各占总脂肪酸的5 ，1 0 9 这样的油脂就能满足每人每天对v l c p u f a s 的需求 ( d o m e r g u ee ta 1 ，2 0 0 5 a ) ，转基因植物就有可能作为鱼油的良好替代资源应用于生产， 为更多的人提供廉价且高品质的食用油，从而大大增进人类健康。 4 微藻p u f a s 生物合成及相关去饱和酶的研究 微藻是食物链的初级生产者，许多种类能够产生p u f a s 且含量较高。某些海洋微 藻因为富含e p a 、d h a 在水产养殖中应用广泛，如紫球藻( p o r p h y r i d i u m c r u e n t u m ) 、微 拟球藻( n a n n o c h l o r o p s i ss p ) 、三角褐指藻t r i c o r n u t u m ) 、球等鞭金藻ug a l b a n a ) 等， 其e p a 、d h a 的含量参见表4 。微藻p u f a s 的合成途径在本章第2 部分已有较为详细 的叙述，各种藻的具体研究参见相关综述( g u s c h i n aa n dh a r w o o d ，2 0 0 6 ) 。 目前，已有多种微藻的脂肪酸去饱和酶或延伸酶基因被克隆( 表5 ) ，对系统阐明微 2 l 三角褐指藻和微专f l 球藻e p a 合成的去饱和酶研究 藻的p u f a s 合成途径、环境因子对p u f a s 合成的影响机制以及转基因生产v l c p u f a s 奠定了良好的分子基础。 表4 几种海洋微藻中e p a 、d h a 的含量( 占总脂肪酸) t a b 4c o n t e n t so f e p aa n dd h ai ns o m em a r i n em i c r o a l g a e ( i nt o t a lf a i r ya c i d s ，) 物种( s p e c i e s ) e p ad h a 参考文献( r e f ) c h a e t o c e r o s m u e j l e r i1 2 宴0 ，8z 白u k o v a a n d a 捌咖胃j 9 9 5 c y l i n d r o t h e c a f u m f o r m i s 7 ，7 2 0 31 1 1 2 6 d u n s t mc ta 1 1 9 9 4 ；t a n dj o h n s , 1 9 9 6 n i t z s c h i