（微生物学专业论文）pcr技术检测婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌的研究.pdf

摘要 食品安全突发事件频率高是近年来食品安全问题的一个显著特点，坂畸肠杆菌是 自1 9 6 1 年发现以来一直受全世界的关注的一种食源性致病菌，能在婴幼儿中引起脓 血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎特别是对新生儿或免疫力较低的婴儿，常会导致严 重的后遗症甚至死亡。 本文对婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌的p c r 检测方法进行了研究。 本试验以坂崎肠杆菌2 3 sr d n a 的保守序列，通过n c b i 对比，根据其特异区片断 设计引物。实验过程中对p c r 反应体系中镁离子浓度、模板量及退火温度和循环数 等p c r 影响要素进行优化，确定了适宜的p c r 反应体系和扩增程序，其反应体系为： 2 5 u l1 0 p c rb u f f e r ( 1 0m m o l lt f i s h c l 【p h8 3 1 ，5 0m m o l lk c l ，0 1 w t v o l 】 g e l m i n , 0 5 t w e e n 2 0 ) ，3 0 u l 2 5r n m o l l m + ，2 0 u l d n t p s 混合物，0 5 u l l o u m 正向 引物，0 5 u l l o u m 反向引物，0 2 5 u l ( 5 uu l 4 ) t a q 酶，模板为f t a 膜，水1 6 2 5 u l ， 总反应体系2 5 u l ；p c r 扩增程序为：p c r 反应采用冷启动，9 4 预变性5r a i n ，9 4 变性1r a i n ，5 5 ，6 。c 退火4 5s ，7 2 延伸1m i n ，3 4 个循环，7 2 终延伸1 0m i n , 反应产物在2 的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果。对p c r 扩增产物 克隆到p m d 1 8 t 质粒上进行了d n a 测序，p c r 扩增产物d n a 序列与靶基因序列的 同源性达1 0 0 ，从而证实p c r 扩增产物确为目的扩增产物。采用p c r 方法共检测 了5 株坂崎肠杆菌标准株和1 株野生株及1 9 株其它革兰氏阳性菌和阴性菌，结果表 明6 株坂崎肠杆菌为阳性结果，其它菌株均为阴性结果，因此本研究选择的引物特异 性强且p c r 方法的灵敏度为1 0 4 。 一 采用了七种坂崎肠杆菌基因组d n a 提取方法，通过的比较，找出了一种最简便、 最有力的提取方法。对该七种基因组d n a 方法的检出限、操作过程和增菌时间等多 方面进行了比较，确定最低检出限，依据每种方法检出限的不同，再次对婴儿配方奶 粉进行污染，找出了每种方法的检测时间底线，避免了以往过夜培养造成的不必要的 时间浪费。结果显示出利用f 1 a 滤膜裂解坂崎肠杆菌细胞提取菌体d n a 优于其它六 种方法d n a 提取方法，整个实验过程只需8h 就能完成，比传统增菌时间缩短了1 2 2 2 h 。 ， 目前，坂崎肠杆菌的检测还未有国标方法，本实验与传统的f d ab a m 方法、 d f i 方法、o k 方法进行对比，并通过与v i t e k 自动生化鉴定系统为鉴定结果进行阳 性对照，本试验共检验了3 5 份样品其试验结果为：p c r 方法检出率为1 4 3 ，敏感 性为8 0 o ，特异性为9 6 7 ，符合率为9 4 3 ，f t a 膜方法检出时间为8h ，试剂 盒法、普通热裂解法检出时间为l l 1 2h ，溶剂热裂解法、溶菌酶解法、普通试剂法、 蛋白酶k 法检出时间为1 2 1 3h ；f d a b a m 方法检出率为1 1 4 ，敏感性为8 0 o ， 特异性为1 0 0 ，符合率为9 7 1 ，检出时间为7d ；d f i 方法检出率为1 1 ，4 ，敏感 性为8 0 ，特异性为1 0 0 ，符合率为9 7 1 ，检出时间为5d ；o k 方法检出率为1 7 1 ， 敏感性为8 0 o ，特异性为1 0 0 ，符合率为9 1 - 4 ，检出时阊为5d 。四种方法的敏 感性相同，p c r 方法的特异性略低于b a m 方法和d f i 方法，但高于o k 方法，p c r 方法的符合率稍低于b a m 方法和d f i 方法但高于o k 方法，比较之p c r 方法检测 时间比其他三种方法大大缩短。总之，利用f t a 滤膜，采用p c r 技术可只需增茵2h 检测到婴儿配方奶粉中的坂崎肠杆菌，灵敏度高，检测婴儿配方奶粉中的坂崎肠杆菌 的检出限1 s c f u 1 0 0 9 。 关键词：p c r ；婴儿配方奶粉；检测：坂崎肠杆菌 s t u d yo np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na s s a yf o rd e t e c t i o no f e n t e r o b a c t e rs a k a k i ii np o w d e ri n f a n tf o r m u l am i l k a u t h o r ：h o hj u n - r u m a j o r ：m i c r o b i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rz h a n gw e i a b s t r a c t f o o ds a f e t ye m e r g e n c i e sa r eh i g hf r e q u e n c yi nr e c e n ty e a r s e n t e r o b a c t e rs a k a z a k i i h a sa t t r a c t e dw o r l d w i d ea t t e n t i o ns i n c e1 9 6 1 ，e n t e r o b a c t e rs a k a z a k i ii saf o o d b o r n eb a c - t e r i a , w h i c hc a l lc a u s es e p s i si ni n f a n t s ，n e c r o t i z i n g ，e n t e r o c o l i t i s ，o rm e n i n g i t i s ，e s p e c i a l l y f o rn e o n a t eo ri m m u n o b a b i e s ，a n dl e a dt oa p p a r e n ts e v e r es y m p t o m se v e nd e a d t l l i sp a p e rs u m m a r i z e dt h ep c rd e t e c t i o nm e t h o d so f e s a k a z a k i ii np o w d e ri n f a n t f o r m u l am i l k i nt h i ss t u d y , t o o ku s eo fe s a k a z a k i io fs p e c i a ls e q u e n c e so fc o n s e r v a t i v e2 3 sr d n a a c c o r d i n gt ot h er e s u l to fb l a s t t od e s i g na s p e c i a lp r i m e r s i nt h ep c rp r o c e s s d n a c o n c e n t r a t i o n , m 矿c o n c e n t r a t i o n , t e m p l a t ev o l u m e ，a n n e a l i n gt e m p e r a t u r ea n dp c r c i r c l e sa r eo p t i m i z e dt od e t e r m i n et h eo p t i m a lp c r 1 1 l er e a c t i o nm i x t u r ec o n s i s t e do f 2 5 u l ：2 5 u l1 0 x p c rb u f f e r ( 1 0m m o l lt r i s - h c l b h8 3 】，5 0m m o l lk c l ，o 1 w t v 0 1 g e l a t i n 0 5 t w e e n 2 0 ) ，2 5m m o l l m 3 o u l 2 o u l m i x t u r eo f d n t p s ，0 5 u l o f l 0u m f o r w a r dp r i m e r , 0 5 u lo f1 0u mr e v e r s ep r i m e r , o 2 5 u l ( s uu l l ) t a qe n z y m e ，兀：ac a r d sa s t h et e m p l a t e d d h 2 01 6 2 5 u l 1 1 ”r e a c t i o nw a sr u nu n d e rt h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：c o o l s t a r t ；d n ap r e d e n a t u r a t i o na t 9 4 f o r5m i n , d n ad e n a t u r a t i o na t9 4 f o r1 r a i n , p r i m e ra n n e a l i n ga t5 5 6 c ，a n dd n ae x t e n t i o na t7 2 cf o rlr a i n ，r u n3 4c y c l e s ；t h e f i n a le x t e n t i o nw a sp e r f o r m e da t7 2 f o r1 0m i n n l ep c rp r o d u c t sw e r ee x a m i n e db y 2 a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s p c rp r o d u c tw a sc l o n e di n t ot h ep m d 一1 8 tp l a s m i dt o s e q u e n c i n g t h er e s u l to fs e q u e n c i n gc o m p a r e dw i t ht a r g e tg e n es e q u e n c es h o w e dt h e h o m o l o g yg o tt o1 0 0 s op c ra m p l i f i e dp r o d u c t sw e r ec e r t i f i e d f i v es t a n d a r ds t r a i n s ， o n ew i l ds t r a i no fe s a k a z a 衙fa n d1 9s t r a i n so fg r a m p o s i t i v eb a c t e r i aa n do t h e rn e g a t i v e b a c t e r i ai nt h i ss t u d yw e r ed e t e c t e db yp c r , t h er e s u l t ss h o w e ds i xs t r a i n sb e l o n g i n gt o p o s i t i v er e s u l t sa f t e rp r i m e r se x t e n d i n g ，t h er e s u l t sw e r en e g a t i v ef o ro t h e rs t r a i n s ，i nt h i s s t u d yr e s u l tp r o v e dt h a tt h ep r i m e r su s e di np c r w a ss p e c i f i ct od e t e c t i o ne s a k a z a k i ii n i n f a n tf o r m u l ap o w d e r , m e a n w h i l e 。t h es e n s i t i v i t yg o tt o1 0 叫 w i t hp c rd e t e c t i o np r o c e s sw a sd e s i g n e db ys e v e nd i f f e r e n tt y p e so fg e n o m i cd n a e x t r a c t i o nm e t h o d s ，b yt h ec o m p a r i n gt h e i rs e n s i t i v i t y , w o r kp r o c e s sa n dd e t e c t i o nl i m i t s f o u n do u to n em o s ts i m p l ea n de f f e c t i v em e t h o do fd n ae x t r a c t i o n s e v e no fg e n o m i c d n ae x t r a c t i o nm e t h o d sg o td i f f e r e n td e t e c t i o nl i m i t e a c hm e t h o db a s e do nt l l ed i f f e r e n t d e t e c t i o nl i m i tp o l l u t e da g a i ni n f a n tf o r m u l ap o w d e rt of i n dd e t e c t i o ne n r i c h m e n tt i m eo f e a c hm e t h o d ，t h er e s u l ts h o w e dt h e s em e t h o d ss a v em u c ht i m ea n da v o i dc u l t u r eo fo v e r r d g h t w h i c hi st i m ew a s t i n g n er e s u l t so fd n ae x t r a c t i o nm e t h o d ss h o wt h a tt h eu s eo f f t af i l t e rt op y r o l y s i s - e s a k a z a k i ie e l lm e m b r a n et or e l e a s ed n am e t h o di sb e t t e rt h a nt h e o t h e rs i xd n ae x t r a c t i o nm e t h o d s 。t h ew h o l ee x p e r i m e n t a lp r o c e d u r ec a l lb ec o m p l e t e d o n l y8h o u r s ，s h o r t e r1 2 - 2 2ht h a nt h et r a d i t i o n a lb i o c h e m i s t r yd e t e c t i o n c u r r e n t l y , c o u n t r ys t a n d a r dm e t h o da b o u tt h ed e t e c t i o no f e s a k a z a k i fh a sn o tf o r m e d t h et y p i c a lt r a d i t i o n a lm e t h o df d ab a me x p e r i m e n t ，d f im e t h o d ，o km e t h o da n d t i t e k m m a d ec o m p a r i s o n s t h et e s tr e s u l t so f3 5s a m p l e sw e r ea sf o l l o w s ：t h es e n s i t i v i t y o fp c ri s8 0 o a n dt h es p e c i f i c i t yo fp c ri s9 6 7 t h ec o i n c i d e n c er a t e so fp c ri s 9 4 3 ，d e t e c t i o nt i m eo fd n am a d eb yf t ac a r d sm e t h o di s8l l d n ae x t r a c t i o nk i ta n d c o m m o np y r o l y s i sm e t h o dt a k e s11 1 2h ，r e a g e n tp y r o l y s i s ，b a c t e r i o l y a s e ，c o m m o n r e a g e n ta n dp r o t e i n a s ekm e t h o da b o u tt a k e1 2 1 3h ：f d ab a mm e t h o di sw i t ht h e d e t e c t i o ns e n s i t i v i t yo f8 0 0 a n dt h es p e c i f i c i t yo f1 0 0 ，t h ec o i n c i d e n c er a t e so f9 7 1 t h ed e t e c t i o nt i m eo f5 7d a y s ；t h es e n s i t i v i t yo fd f im e t h o di s8 0 t h es p e c i f i c i t yo f d f ii s1 0 0 ，t h ec o i n c i d e n c er a t e so fd f ii s9 7 1 ，t h ed e t e c t i o nt i m en e e d4 5d ：t h e s e n s i t i v i t yo fo km e t h o di s8 0 o t h es p e c i f i c i t yo fo k i s9 3 3 t h ec o i n c i d e n c er a t e so f 0 ki s9 1 4 t h ed e t e c t i o nt i m en e e d4 5d t h er e s u l ts h o w st h a tt h es e n s i t i v i t yo ff o u r m e t h o d sa r et h es a n l e t h es p e c i f i c i t yo fp c ri sl e s st 1 1 a nt h et w om e t h o d so fb a ma n d d f i ，w h i c ha l lh j l g h e rt h em e t h o do f0 kt h ec o i n c i d e n c er a t e so fp c ri ss l i g h t l yl o w e r t h a no t h e rb a ma n dd f im e t h o db u ts t i l lh i g h e rt h a no km e t h o d i na 1 1 t h ed e t e c t i o nt i m e o f p c rm e t h o di ss i g n i f i c a n t l ys h o r t e rt h a nt h eo t h e rt h r e em e t h o d s ，i na l l ：t a k eu s eo f f t a f i l t e rc a nd e t e c te s a k a z a k i if r o mi f pi n8h s e n s i t i v i t yg e tt o1 5 c f u 1 0 0gi nt h e2h e n r i c h m e n tt i m e k e y w o r d s ：p c r ；i n f a n tf o r m u l ap o w d e r ；d e t e c t i o n ；e n t e r o b a c t e rs a k a z a k i i 本文所用缩略词及中英文对照 缩略词英文全称中文全称 a m u g4 m e t h y l u m b e l l i f e r y l - a - d d u c o s i d e b a m b a c t e r i o l o g i c a la n a l y t i c a lm a n u a l b h ib f e a s th e a r ti n f u s i o nb r o t h b i c g 5 一b r o m o 一4 c h l o r o 3 一i n d o l y l a - d 对u c o s i d e b p wb u f f e r e dp t o n ew a t e r d f i d m g g a n - f o r s y t h e - l v e r s e n e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d e ee n t e r o b a c t e r i a e e a ee n r i c h m e n tb r o t h e l i s ae n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y e m b e o s i n m e t h y l e n eb l u ea g a r f d au s f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o nc e n t e r f q - p c rr e a lt i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep c r f v r af l i n d e r st e c h n o l o g ya s s o c i a t e s i c m s ft h ei n t e r n a t i o n a lc o m m i s s i o nf o r m i c r o b i o l o g i c a ls p e c i f i c a t i o n sf o rf o o d s i d f i n t e r n a t i o n a ld a i r yf e d e r a t i o n i f pi n f a n tf o r m u l ap o w d e rm i l k i p t g i s o p r o p y l8 - d 1 - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e l b l u r i a b e r t a r l j m l s t l a u r y ls u l f a t et r y p t o s eb r o t h - v a n c o m y c i n n 口nm o s tp r o b a b l en u m b e r n an u 仃i e ma g a r n e cn e o n a t a ln e c r o t i z i n ge n t e r o e o l i t i s o k o k - k a n g p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r p m r o u n dp e rm i n u t e 1 a et r i s b o r a t ea c i d ，e d t ab u f f e r t a q t h e r m u sa q u a t i c u sd n a p o l y m e r a s e t et r i sb a s e 馒：叽a b u f f e r i r i s t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e t s a t 聊t i c 筋es o y a g a r uu n i t v r b g av i o l e tr e db i l eg l u c o s ea g a r x a - g i e a 5 - b r o m o - 4 c h l o m 3 - i n d o l y l a - d - g l u c o s i d es u b s t r a t e 4 一甲基伞形酮一a d 一葡萄稽苷 细菌分析手册 脑心浸液 5 一溴一4 一氯- 3 一吲哚一a d 一葡萄醛酸 缓冲蛋白胨水 三位科学家的名字 乙二胺四乙酸 肠道菌增菌肉汤 酶联免疫吸附试验 伊红美蓝琼脂 美国食品药品监督管理局 实时荧光定量p c r 弗林德斯技术联合 国际食品微生物标准化委员会 国际乳品联盟 婴儿配方奶粉 异丙基一1 3 - d 硫代半乳糖苷 营养肉汤 。 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 最大可能数 营养琼脂 新生几坏死性小肠结肠炎 两位科学家的名字 聚合酶链式反应 转每分钟 t r i s 醋酸e d t a 缓冲液 栖热水生菌d n a 聚合酶 商s e d t a 缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 胰蛋白胨大豆琼脂 单位 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂 以b i c g 为底物的培养基 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑j 垦盎些盘鲎或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：互覆垒为p 签字日期：哼年厂月，扩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑i 垦a 基些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑i 垦壅些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：彳灰弓龟舌p导师签名 签字日期：刁年月，字日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 签字日期：垆彰年月7 日 电话： 邮编： 陆中 骗怂 、y九u p c r 技术检测婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌的研究 1 1 立题的背景和意义 1 引言 食品安全问题一直是人们关注的焦点，婴儿配方奶粉是新生儿重要的营养平衡和 补充食品，其安全性直接关系新生儿的健康。坂崎肠杆菌作为一种条件致病菌成为一 个新的健康问题和公众关注焦点，坂崎肠杆菌的来源和污染途径尚不为人类所知，但 种种证据表明新生儿的感染与婴儿配方奶粉的污染有关。u r m e n y i 和f r a n k l i n 于1 9 6 1 年“3 首次报道了由该菌引起的两例脑膜炎事件，随后在全球范围内相继出现了由坂崎 肠杆菌引起的脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎的报道州。2 0 0 2 年，国际食品微 生物标准化委员会( i c m s f ) _ 1 把坂崎肠杆菌列为“严重危害特定人群，危害生命或 慢性实质性后遗症或长期影响”的一种致病菌。从大多数病例看，坂崎肠杆菌其主要 危害对象是身体状况较差的婴儿，虽然有抗生素的治疗，但总体死亡率在有些病例中 却高达8 0 以上i s 。 据报道即使低浓度的污染也可在奶粉的冲调、放置过程中大量繁殖而成为感染的 危险因素。以下三种主要途径可以导致婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌的污染：通过生 产婴儿配方奶粉的原料；在巴氏杀菌后，由配方奶粉污染或其它添加剂干粉带入； 婴儿食用前被污染。据f a o w h o ( 联合国粮农组织世界卫生组织) 专家组的报 告，目前缺乏发展中国家婴儿配方奶粉的污染资料，缺乏因食用已污染的婴儿配方奶 粉导致的疾病状况资料，但不能排除发展中国家没有坂崎肠杆菌感染的事件【1 6 j 。 当前国外使用的坂崎肠杆菌检测方法仍是常规培养法，由于其检测周期长( 5 7 天) 、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。f a o w h o 在 2 0 0 4 年【9 l 召开了两次国际相关会议，倡导采用国际通用的分子生物学方法来检测坂崎 肠杆菌，以弥补传统方法的局限性。随着分子技术的日益发展，p c r 技术用于食品 检测领域也日趋成熟。 1 2 坂崎肠杆菌简介 1 2 1 坂崎肠杆菌生物学特征 形态与染色：典型的坂崎肠杆菌为革兰阴性短杆状，氧化酶阴性。 培养特性：分离的坂崎肠杆菌在t s a 平板上为淡黄色菌落。v r b g a 平板上， 呈大小2 3m m 、紫红色、凸起、边缘褶皱，极富弹性；麦糠凯琼脂平板上大小2 3m m 、扁平、淡黄色；e m b 平板上，形成大小3 4 姗、隆起、淡粉色的粘液状 菌落，而且随传代次数增多粘液状更加明显，传第三代时变成粘液状的蔓延菌落； t s i 上，a 、产气；t s a 平板上产黄色色素。 生化特性：见表1 。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 急性毒性试验结果：腹腔注射坂崎肠杆菌标准菌株和分离菌株菌悬液的小鼠， 注射6h 均出现精神萎靡，呆卧少动，体位异常，反应迟钝，运动失调，呼吸缓慢， 眼睑半闭等症状。8h 后，中毒症状加深，出现抽搐、麻痹、迟钝，眼孔扩大，张 口呼吸等临床症状，2 4h 后全部死亡( 每组小鼠为3 只) 。解剖死亡小鼠，发现下 列体征：肠肿胀，有气泡，肠壁变薄，糜烂，肠系膜血管、腹腔血管变粗、充血， 胃、肝、脾等未见明显异常症状。 1 2 2 坂崎肠杆菌的致病性 到目前，还未知坂崎肠杆菌的致病机理或蛋白毒力因子【1 0 l ，体外试验用中国仓 鼠卵巢( c h o ) 滤液、v e r o 、y - 1 细胞作为细菌培养物，结果显示细胞裂解且v e r o 、 y - 1 细胞更易受坂崎肠杆菌侵害。分别给小鼠静脉注射和口服发现每鼠静脉注射达 到1 0 8 c f u 可致死，口服两株菌可致死( 一株来自临床，另一株由食品分离出来) 。 p a g o t t o 于2 0 0 3 年进行动物试验证实所有低于1 0 7 c f u 剂量都会有剂量反应线性关 系【1 1 1 1 1 。f a 0 w h o 对坂崎肠杆菌危险评估分析中指出一株菌就能引发感染1 9 j 。来自 荷兰的成人感染报道低于1 0 4 c f u 剂量就可能存在线性关系。n a z a r w e c - w h i t e 1 j 和 f a r b 一1 3 】认为1 0 0 0 个坂崎肠杆菌细胞1 0 0g 为感染限量标准比较合理。h a v e l a a r 和 z w i e t e r i n g 1 4 】认为含有低量坂崎肠杆菌的奶粉溶液在3 7 ，大约只要2h 就能使超 过1 1 0 0 0 的婴儿患病。作为革兰氏阴性杆菌，肠杆菌拥有外毒素致病因子，所以坂 崎肠杆菌被认为是条件性致病菌，口服低致死量和静脉注射高致死量可解释为毒力 因子需经胃或者肠壁吸收可易致死，而静脉注射错过了胃和或小肠这些器官i l o l 。 坂崎肠杆菌感染最终的死亡率为6 0 ；随着采用第三代头孢菌素类抗生素，坂 崎肠杆菌感染的死亡率降低【1 1 l ，采用头孢素类抗生素和第二代氨基糖类抗生素结合 使用，效果显著。使用第三代抗生素后死亡率为1 4 ，但是婴儿感染( 小于1 2 月) 的死亡率仍为3 3 ，早产儿或低重儿( 小于2 5 0 0g ) 的死亡率为4 5 ，所有的病人 康复后存在智力和身体发育迟缓的症状，有些病人还存在突发性心脏病、大脑瘫痪 等后遗症；由坂崎肠杆菌引起的坏死性小肠结肠炎死亡率为1 0 5 5 “j 。坂崎肠 杆菌能在很宽的温度范围内生长( 6 4 7 ) l “，在l o ，1 8 ，2 1 ，3 7 温度时 的代时分别是1 3 6 h ，2 9 h ，1 3 h ，0 5 h 。可见坂崎肠杆菌相对于其他的肠杆菌科细 菌生长范围更广，并且迟滞时间和时代更短。因此冲调好的奶粉中如果含有少量的 坂崎肠杆菌( 1c l v ，m l ) 在较短时间就能增殖到1 07 c f u m l “1 ，从而威胁健康。 2 p c r 技术检测婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌的研究 表1 坂崎肠杆菌生化特性 t a b l e1c h e m i c a ls l c l a l i t yo f e n t e r o b a c t e r s a k a z a k l i 洼t 。+ ”表示反应结果阳性。一。表示反应结果阴性 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 2 3 坂崎肠杆菌的流行病学 坂崎肠杆菌的发病率虽然不高，但导致的疾病死亡率很高，从1 9 6 1 年至2 0 0 5 年，在7 3 例坂崎肠杆菌感染婴儿的报道中，有1 9 例死亡【1 5 l 。食用奶粉引起坂崎肠 杆菌感染主要是导致婴儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症。婴儿脑膜炎发病率 为0 2 5 1 1 1 0 0 0 ，而由坂崎肠杆菌引起的脑膜炎占总发病量约为4 ，是新生儿最常 见的肠胃道疾病，肠杆菌科细菌引起的坏死性小肠结肠炎占总发病量的2 9 【1 “，而 由坂崎肠杆菌引起的坏死性小肠结肠炎占总发病的比例随着近年坂崎肠杆菌分离 技术的发展变得越来越大【1 7 1 。l a i 1 8 l 回顾1 9 9 4 1 9 9 9 年的微生物学数据，发现3 6 的菌血症与肠杆菌科细菌有关，由于坂崎肠杆菌只在1 9 9 6 年进行了统计，因此坂 崎肠杆菌只占菌血症的0 4 。可见，相对于发达国家人群的食源性疾病发病率在 3 0 左右，食用奶粉引起的坂崎肠杆菌感染发生的比例不高，美国食源疾病实时监 测网络( f o o d n e t ) 2 0 0 2 年调查了坂崎肠杆菌在婴儿( 小于1 2 月) 中的发病率为 1 1 0 0 0 0 0 1 2 1 。我国还缺乏相应的数据调查。 坂崎肠杆菌引起的所有年龄层人发病，f a o w h o 公布了坂崎肠杆菌对不同年 龄人群的影响，婴儿( 小于1 2 月) 属于对坂崎肠杆菌的高危人群，其中新生儿为 最危险人群，尤其是早产儿和低重儿或免疫力低下新生儿。坂崎肠杆菌引起的脑膜 炎中5 5 为低重新生儿( 小于2 5 0 0 9 ) ，5 0 小于1 周，几乎7 5 小于1 月【l z j 。 f b o d n e t l l 2 1 2 0 0 2 年调查在低体重婴儿中的发病率为8 7 1 0 0 0 0 0 。儿童和成年人很少 感染坂崎肠杆菌，并且感染都与食品无关，病人通常患有严重的免疫力低下疾病。 1 2 4 坂崎肠杆菌污染的控制 为控制坂崎肠杆菌的危险性，专家建议1 1 9 1 ：( 1 ) 制定婴幼儿配方奶粉中坂崎肠杆 菌微生物标准，建立有效控制措施，将其危险性降低到最低。( 2 ) 制定加工、使用和 操作婴幼儿配方食品的规则，研究降低坂崎肠杆菌污染水平的方法，在生产环境和 配方奶粉中降低坂崎肠杆菌的浓度和流行的危险性；为高危人群生产较大比例的商 业无菌配方替代产品。( 3 ) 制定有效的环境监测计划，将肠杆菌科而不是大肠杆菌作 为工业生产线的卫生指标菌。( 4 ) 建立实验室监测网络，对坂崎肠杆菌的来源、传播 途径等进行调查研究；加强相关学科的基础研究，包括生态学、分类学、菌株毒力 等。( 5 ) 用商业无菌液体或开水冲调配方食品，喂养婴幼儿后剩余的调配食品应放置 冰箱保存，并在食用前再加热。我国应根据实际情况制定相应管理办法，加强对坂 崎肠杆菌的检测技术及控制技术研究，迸一步完善婴幼儿配方食品标准，以保证我 国广大婴幼儿群体的健康与安全。 1 2 5 近年来由坂崎肠杆菌引起的中毒事件 1 9 6 1 2 0 0 5 年 ：o - 2 2 报道了7 3 起婴儿坂崎肠杆菌感染事件，其中2 5 起发生于新 生儿感染，表2 是1 9 5 8 2 0 0 2 年已发生的新生儿和婴儿感染病例。 4 p c r 技术检测婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌的研究 表2 新生儿和婴儿中坂崎肠杆菌的感染 t a b k 2 i n f c c t l o n o f e n t e r o b a c t e r s a k a z a 舡i i n 【p fa n d i n f a n t ；洼：i f m = i n f a a t f o f a l a l a p o w d e r ( 萎儿配方奶粉) # w 论文中未见详细报道；西天驰周r 口县，产岁 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 3 坂崎肠杆菌检测方法研究现状 目前还没有坂崎肠杆菌的国家标准检测方法，已报到的坂崎肠杆菌检测方法分 为三类，一类是传统的分离鉴定方法：一类是普通p c r 方法和实时荧光p c r 方法； 一类是探针方法。 1 3 1 传统分离鉴定方法 ( 1 ) b a m 培养法 美国f d a ( 2 0 0 2 ) 1 哪推荐的方法需要7d 时间，以最大可能数法( m p n ) 为基础， 需要一共3 3 3 9 样品( 3 1 0 0 9 ，3 x1 0 9 , 3 x 1g ) ，具体实验流程如图1 所示： 1 0 0 91 0 91 9 裟霎雾薹嚣臻监夜 取混合液1 0i l l ，分别接入到9 0m l 无菌e e 肉汤稀释液中。3 6 孵育过夜。 直接涂布法( v r b g a ) 直接划线法( v r b g a ) 挑取可疑菌落，划线接种至t s a 琼脂平板 工 2 5 培养4 8 7 2 h 上 按a p l 2 0 e 进行生化鉴定 j r 查m n p 条 圈1f d a 方法 f i g 1f d a m e t h o d ( 2 ) d f i 方法 d f i 方法【2 3 】是在f d a 方法的基础上改进了显色培养基x a - g l c a ，比v r b g a 更加提高了检测的特异性。流程见图2 ： 6 p c r 技术检测婴儿配方奶粉中坂崎肠杆菌的研究 与2 2 5 m l b p w 卜1 圈 与 ii o 稀释 、i 剁苗果1 0l一 取1 0 m l 接种到9 0 m l e e 肉汤中3 7 0 獬 li 在d f i 琼脂平板上划线分离 搬蓝去酩冈拂取蓝绿色菌落i 2 2 1l ( 3 ) o k 方法 o k 方法【2 l 】采用了产荧光因子4 - 甲基伞形酮一a - d 一葡萄糖苷作为坂崎肠杆菌 a - d r 葡萄糖苷酶产生的指示剂，3 号胆盐是肠杆菌的选择性培养基成份，柠檬酸铁 和硫代硫酸钠是肠杆菌科h 2 s 产生的指示剂，这种培养基的荧光指示是一种有选择 性的肠杆菌科鉴别培养基。具体方法步骤同d f i 方法。 ( 4 ) i d f 方法 2 0 0 6 年2 月i s o 和国际乳晶联盟( i n t e r n a t i o n a ld a i r yf e d e r a t i o n ，i d f ) 联合公 布了“乳和乳制品中坂崎肠杆菌的检测方法”，该方法分别选择m l s t - v m 和e s i a 作为坂崎肠杆菌选择性增菌肉汤和选择性分离培养基替代美国f d a 方法中的e e 肉 汤和v r b g a ，选择性培养温度均为4 4 0 ，整个实验需5 6d 2 2 1 。 ( 5 ) 传统检测方法的比较 坂崎肠杆菌的显色培养基主要包括以下几种： 胰化蛋白胨大豆琼脂( t s a ) 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂( v r b g a ) d f i 显色培养基琼脂( x a g i c a ) 山梨醇麦康凯琼脂( s m a c ) 四甲基伞形酮培养 基( n a + a 删g ) 坂崎肠杆菌分离琼脂( e s i a ) 。 将参考菌株的e e 肉汤培养物划线接种子t s a ，园g a ，x a g l c a ，n a + a m u g ， s m a c 和e s i a 培养基平板，t s a 平板2 5 0 培养7 2 h ，其余平板3 7 培养1 8 2 4 h ， 观察菌落形态。结果显示见表3 ： 围圈 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 衰3 选择性培养基试验结果 t a b l e 3 t h ec o m p a r er e s u l t o fs e l e c t i o n c u l t l i r c m e d i u m 注：of d a ( 2 0 0 2 年推荐) 1 0 b d m 龉柚棚y 血e 1 v 。砌功培养基【2 3 j 选择荧光蠢5 凛4 氯3 吲噤m 葡萄塘苷作为区别 试剂 山梨醇麦靡凯琼脂【2 4 i 山泉醇不被分解菌藩透明；