（分析化学专业论文）几个生物分子体系的压电电化学及荧光光谱法研究.pdf

中文摘要 压电石英晶体传感器可获取电极表面低至纳克级( 单分子层或亚单层 修饰) 的质量变化等信息，与电化学技术联用后的压电电化学技术也可同 时获取研究体系电化学信息。荧光光谱法具有灵敏度高、选择性好、用量 少、方法简便、信息多样等优点。本学位论文采用压电电化学和荧光光谱 法，研究几个生物分子体系，主要内容如下： 1 简要综述了压电电化学和荧光光谱法及其在生化领域的应用。 2 将8 b 铅笔粉以“涂写”方式修饰在电化学石英晶体微天平( e q c m ) 的金电极上，发现对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d h ) 的电氧化有催化 作用。以e q c m 定量研究了其催化活性。饱和修饰8 b 铅笔粉的金电极 对n a d h 分析具有灵敏度高、检测电位低( o 4vv ss c e ) 、检测限低 ( 0 0 8p m o ll 。1 ) 和线性范围宽( o 2 7 1 0g m o ll _ ) 等优点。研究了n a d h 在裸金和铅笔修饰金电极上的荧光光谱电化学行为，结果满意。 3 以电化学石英晶体阻抗分析( e q c i a ) 技术实时监测了芦丁( i 汀) 在碳 纳米管( c n t s ) 修饰的金电极上的吸附过程，以及固定在电极上的r t 和溶液中血红蛋白( h b ) 的结合过程，同步获得了r t 吸附过程和h b 结合过程中包括频率等的多种石英晶体阻抗参数。计算了吸附在c n t s 上的r t 和h b 的平均结合摩尔比和结合常数。我们还用荧光猝灭法研究 了溶液态r t 和h b 的结合作用，结果表明溶液态r t 和h b 的结合作用 与吸附态一致。 。 4 以e q c t a 技术实时监测了葡萄糖氧化酶( g o d ) 和十二烷基苯磺酸钠 ( s d b s ) 混合物在s d b s c n t s 修饰的金电极上的吸附过程。定量考察 了s d b s 和c n t s 对g o d 活性的影响。发现g o d 在裸金电极上的吸附 量很少且吸附态g o d 基本无电活性；若将g o d 和s d b s 混合后再吸附 在s d b s c n t s 修饰电极上，其吸附量和电活性都有明显增强，但吸附 态g o d 的酶比活性( e s a ) 显著下降。 关键词：石英晶体阻抗分析、电化学、电化学石英晶体微天平、荧光光谱 法、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、8 b 铅笔粉修饰、芦丁、血红蛋白、 碳纳米管、葡萄糖氧化酶、十二烷基苯磺酸钠 n a b s t r a c t p i e z o e l e c t r i c q u a r t zc r y s t a l ( p q c ) s e n s o rc a nd e t e c td y n a m i c a l l ya l l e l e c t r o d e m a s sc h a n g ed o w nt ot h en a n o g r a ml e v e l ( g e n e r a l l ye q u i v a l e n tt o m o n o l a y e r o r s u b m o n o l a y e rm o d i f i c a t i o n ) a n d i t sc o m b i n a t i o nw i t h e l e c t r o c h e m i s t r y ，p i e z o e l e c t r i ce l e c t r o c h e m i s t r y ，i sc a p a b l eo fp r o v i d i n g m u l t i p l e ns i t ui n f o r m a t i o no ft h ei n v e s t i g a t e ds y s t e m t h ef l u o r e s c e n c e s p e c t r a lm e t h o dh a sm a n ya d v a n t a g e ss u c ha sh i g hs e n s i t i v i t y , g o o ds p e c i f i c i t y ， s m a l l 。q u a n t i t ys a m p l ea n ds i m p l em a n i p u l a t i o n i nt h i st h e s i s ，p i e z o e l e c t r i c e l e c t r o c h e m i s t r ya n df l u o r e s c e n c es p e c t r a lw e r eu s e dt os t u d ys e v e r a lb i o l o g i c a l m o l e c u l a r s y s t e m s ，a n dt h em a i nc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ep r i n c i p l e sa n da p p l i c a t i o n so ft h ep i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a ls e n s o ra n d f l u o r e s c e n c es p e c t r a lm e t h o df o rb i o c h e m i c a ls t u d i e sa r eb r i e f l yr e v i e w e d 2 w er e p o r tf o rt h ef i r s tt i m et h ee f f e c t i v e c a t a l y t i ce l e c t r o o x i d a t i o no f n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e ( n a d h ) o nt h ep e n c i l8 b s c r a w l e dg o l d e l e c t r o d eo fa ne l e c t r o c h e m i c a lq u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ( e q c m ) t h e e q c ma l l o w e du st oq u a n t i t a t i v e l ye v a l u a t et h ec a t a l y t i c a c t i v i t yo ft h e p e n c i l - s c r a w l e da ue l e c t r o d e s e n s i t i v ea m p e r o m e t r i cd e t e c t i o no fn a d h w a sa c h i e v e da tt h eg o l de l e c t r o d ew i t hs a t u r a t e dp e n c i lm o d i f i c a t i o n ，w i t h l o wd e t e c t i o np o t e n t i a l ( 0 4vv e r s u ss c e ) ，l o wd e t e c t i o nl i m i t ( 0 0 8p m o l l “) a n dw i d el i n e a rr a n g e ( o 2 7 1 0p m o ll 。) t h ef l u o r o e l e c t r o c h e m i c a l m e a s u r e m e n t so fn a d ha tb a r ea n dp e n c i l m o d i f i e dg o l de l e c t r o d e sw e r e a l s oc o n d u c t e dw i t h s a t i s f a c t o r yr e s u l t s 3 e l e c t r o c h e m i c a lq u a r t zc r y s t a li m p e d a n c ea n a l y s i s ( e q c i a ) t e c h n i q u ew a s u t i l i z e dt om o n i t o r ns t ut h ea d s o r p t i o no f r u t i n ( r t ) o n t oac n t s m o d i f i e d g o l de l e c t r o d ea n ds t u d yt h eb i n d i n gp r o c e s so fs o l u t i o nh e m o g l o b i n ( h b ) t o r ti m m o b i l i z e do nt h ee l e c t r o d e t i m ec o u r s e so ft h ee q c ip a r a m e t e r s i i l i n c l u d i n gc r y s t a lr e s o n a n tf r e q u e n c yw e r es i m u l t a n e o u s l yo b t a i n e dd u r i n g t h er ta d s o r p t i o na n df i b r tb i n d i n g t h ea v e r a g eb i n d i n gm o l a rr a t i oo f a d s o r b e dr tt oh ba n dt h ea s s o c i a t i o nc o n s t a n tf o rt h eb i n d i n gw e r e e s t i m a t e d c o m p a r a b l er e s u l t sw e r eo b t a i n e df r o mf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g m e a s u r e m e n t si nm i x e ds o l u t i o n sc o n t a i n i n gr to ff i x e dc o n c e n t r a t i o na n d h bo fv a r y i n gc o n c e n t r a t i o n s ，d e m o n s t r a t i n gt h a tt h ei n t e r r a c i a lr th e r e b e h a v e d e q u i v a l e n t l yi nt h er t - h bb i n d i n ga c t i v i t ya st h es o l u t i o no n e 4 t h ee q c t at e c h n i q u ew a su t i l i z e dt om o n i t o r ns t ut h ea d s o r p t i o no ft h e m i x t u r eo fg l u c o s e o x i d a s e ( g o d ) a n ds o d i u md o d e c y l eb e n z e n es u l f o n a t e ( s d b s ) o n t oas d b s c n t sm o d i f i e dg o l de l e c t r o d e ，a n dt h ee n z y m a t i c a c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e dg o d a saf u n c t i o no fi t sd i r e c te l e c t r o c h e m i s t r y w a sq u a n t i t a t i v e l ye x a m i n e d c o m p a r e dw i t ht h eb a r eg o l de l e c t r o d ea t w h i c hal i t t l eg o dw a sa d s o r b e da n dt h ed i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yo ft h e a d s o r b e dg o dw a sn e g l i g i b l e ，t h ee l e c t r o a c t i v i t yo fa d s o r b e dg o dw e r e g r e a t l y e n h a n c e dw h e nt h eg o dw a sm i x e dw i t ht h es d b sa n dt h e n a d s o r b e do n t ot h es d b s c n t sm o d i f i e da ue l e c t r o d e 。h o w e v e r , t h ee n z y m e s p e c i f i ca c t i v i t y ( e s a ) o f t h ea d s o r b e dg o d w a sl a r g e l yd e c r e a s e d k e y w o r d s ： q u m zc r y s t a li m p e d a n c ea n a l y s i s ，e l e c t r o c h e m i s t r y , e l e c t r o c h e m i c a lq u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ，f l u o r e s c e n c es p e c t r a l m e t h o d ，n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e ，m o d i f i c a t i o no f8 b p e n c i lp a r t i c l e s ，r u t i n ，h e m o g l o b i n ，c a r b o nn a n o t u b e s ，g l u c o s e o x i d a s e ，s o d i u md o d e e y l eb e n z e n es u l f o n a t e 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：万、挥弘刁年1 月f 日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密日。 作者签名： 导师签名： 请在以上相应方框内打“ ”) 日期：廊l 月r 日 日期：撕刁年b 月f 日 7 0 凡个生物分子体系的压电电化学及荧光光谱法研究 第一章绪论 高灵敏度、高通量、实时、在线、多参数以及现场或原位分析已 成为现代分析化学发展的重要方向。电化学石英晶体微天平 ( e l e c t r o c h e m i c a lq u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ，e q c m ) 基于压电石 英晶体( p i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l ，p q c ) 的压电现象，可在电化学 研究现场动态监测电极表面低至钠克级( 原子及分子单层或亚单层) 的质量及溶液粘、密度改变等信息【l 卅。电化学石英晶体阻抗分析 ( e l e c t r o c h e m i c a lq u a r t zc r y s t a li m p e d a n c ea n a l y s i s ，e q c i a ) 是一种 多参数e q c m 技术，具有实时同步提供多维压电信息的能力，故已成 为当今分析化学领域性能优良且应用广泛的广谱传感器。压电石英晶 体传感器与其他分析方法联用可以提供更加丰富的信息，已成为当今 分析化学领域特别是生物传感研究领域的重要工具。本章中简要综述 了电化学压电石英晶体传感器的理论及在生化领域的应用，并提出了 本论文的基本构思。 1 1 压电石英晶体传感器 1 1 1 压电石英晶体传感原理 1 8 8 0 年，比尔和约克居里兄弟首先发现石英等一些晶体的压电 效应【5 】，即压电晶体在机械压力作用下发生形变，极化状态发生变化， 致使其某些相对应的表面上产生电荷，表面电荷密度与应力成正比。 随后，他们又发现了“逆压电效应”，即向压电晶体施加外电场时，晶 体介质内产生形变，形变大小与电场强度成正比。压电石英晶体传感 器主要利用“逆压电效应”。p q c 在气相中振荡时，其性能与表面涂层 的质量、物态、性质、分布、体声波由晶体向涂层的传播及声阻抗等 因素有关。此外，与压电晶体自身振荡状态有关的一些因素( 如温度、 晶体谐振器参数) 也可影响其传感响应。1 9 5 9 年德国物理学家 s a u e r b r e y 提出的厚度剪切压电石英晶体频移蛳与晶体表面均匀刚性 l 硕士学位论文 薄膜的质量之间存在线性关系，并以此为依据首先提出将压电晶体用 作灵敏的微天平。 蛳一2 趣2 耐口c 日q ) ”2 - - - 2 ，2 6 4 x l o 乞如2 】, n a( 1 一1 ) 上式称为s a u e r b r e y 方程1 6 】，式中血为晶体基频( h z ) ，蛳为晶体频 移( h z ) 。a 为电极表面积( c m 2 ) ，珐和鳓分别为石英晶体的密度( 2 6 4 8 gc l t i 刁) 和晶体剪切模量( 2 9 4 7 1 0 gc m 1 $ - 2 ) ，a m 为刚性薄膜质 量变化( g ) ，负号表示质量增加导致频率下降。 ， 。 压电晶体在液相中振荡能量损耗很大，容易停振。因此在早期很 长一段时间，压电石英晶体传感器的应用仅限于气相领域。2 0 世纪 8 0 年代初，k o n a s h 和n o m u r a 等实现了压电石英晶体单面触液的稳 定振荡f 7 一。随后，本实验室的y a o 等人也第一次实现了p q c 在水溶 液和4 0 多种有机物液体中双面触液的稳定震荡，找到了保证p q c 在 液相中稳定振荡的关键因素i 州甜。研究表明，影响压电石英晶体在液 相中振荡频率的因素很多，除了有灵敏的质量效应以外，还存在有更 多的非质量效应，如负载膜的粘弹性以及本体溶液的粘度、密度、电 导率和介电常数等【l 】。对于刚性、均匀分布的薄膜质量负载，方程( 1 - 1 ) 在液相中依然成立。而对于p q c 在液相中谐振的纯粘密度效应， k a n a z a w a l l 3 1 和m a r t i n 等【1 4 1 发现，满足以下方程： 蛳= 【甜a ( 1 r p q 硒) m 】【仇2 秕) i 2 忱lr l 1 ) m 】 ( 1 2 ) 式中下标l 和2 表示在两个不同状态下的液体的密度和粘度。单面触 液的压电石英晶体净液体负载效应可以用下面的方程表征【1 5 1 ： 2 码。硒名衄a r i l = 2 a f a l ，。= _ 4 鸠。筑出矗k * - 4 码。a 缸 ( 1 - 3 ) 这里兀- ，2 l 和血分别是电导曲线半峰宽和共振频率 ( f o = l l 2 7 c ( l 1 c 1 ) m 】) ，而尺i l 和l l l 是由于溶液的粘度和密度变化引起 的，赢是空气中p q c 电极的共振频率，k ( 2 ，9 5 7 x 1 0 mnn l 。) 是压 电石英弹性常数。根据这个方程，9m h z 盼p q c 电极的f o r 。的特 征值约为一1 0h z f 2 。显然，对于所研究的体系，f o r l l 的绝对值越大， 粘度效应越弱，质量效应越大。 1 1 2 压电石英晶体传感技术 2 几个生物分子体系的压电电化学及荧光光谱法研究 研究液相p q c 谐振的方法有两种：主动法和被动、法【1 l 。 主动法又称振荡器法，该法中p q c 作为振荡电路的一部分置于 正弦波交流振荡回路中，用作电路振荡的正反馈，p q c 在由其自身 控制的频率上持续、稳定振荡，该频率可由频率计测量。这种方法常 用1 几振荡电群。6 1 ，其优点是仪器简单、可自行设计制作振荡电路、 操作方便、测定简单快速，迄今为止r , q c 的绝大多数应用仍然在使 用振荡器压电传感技术。其缺点是所提供的信息量少、只利用了谐振 频率、起振行为受振荡电路类型和电气元件参数的影响以及操作条件 较难控制。将电化学技术与主动法结合称为电化学石英晶体微天平 ( e q c m ) 。e q c m 始于1 9 8 6 年m e t r o y m 等【1 7 1 对金属p b 在金电极上 欠电位沉积( u p d ) 的研究。e q c m 通常采用单面触液的a t - 切石英 晶体作为工作电极，该工作电极与参比电极和对电极构成三电极系 统。e q c m 技术通过监测晶体频移以确定v q c 电化学反应过程中龟 极表面的质量负载变化。 被动法也称阻抗分析法，指将p q c 作为外部元件接在电学测量 仪器( 网络阻抗分析仪) 的测量端，该仪器输出的正弦波电压以扫 频方式加在v q c 两电极上，以测量p q c 谐振区间的阻抗或导纳等电 学参量。每次扫频过程中，当频率接近p q c 固有的谐振频率铂) 时， p q c 产生谐振，出现特有的阻抗和导纳谱。根据压电石英晶体谐振 机电耦合模型，通常用b u t t e r w o r t h v a nd y k e ( b v d ) 等效电路来分 析p q c 谐振行为。当频率扫描至。无很远时，p q c 具有类似于电容的 电学行为，对应于b v d 等效电路中的静态电容。压电石英晶体阻抗 法用来测定加在晶体上的电压和流过晶体的电流的比值即阻抗，该值 与能量的损耗有关。阻抗，网络技术可给出全面表征压电传感器响应 的多参数，主要包括：( 1 ) 石英晶体等效电路( b v d ) 元件参数，包 括动态电阻( 胄1 ) 、动态电感( 1 ) 、动态电容( c 1 ) 和静态电容( c o ) 。 每一个参数都有其明确的物理意义，r ，揭示耗散到环境中的能量损 失；l - 与谐振惯性正相关；c i 与晶体弹性相关；c 0 对应于远离晶体 谐振区的一个频率下测得的电容值。( 2 ) 各种频率，如石英晶体的各 3 硕士学位论文 种频率包括谐振、反谐、最大，j 、阻抗频率和串并联谐振频率。将电 化学技术与被动法结合称为电化学石英晶体阻抗分析( e q c i a ) 技术， 该技术能全面给出表征电化学过程中压电传感器响应的多参数，更全 面地表征石英晶体谐振行为。n o e l 和t o p a r t 【l s 】对该技术进行了很好 的研究，他们用h p 4 1 9 4 a 阻抗分析仪对金属和高聚物沉积过程进行 了现场石英晶体阻抗测定，能以约9s 的时间间隔在电化学实验中实 时获取石英晶体谐振导纳数据。 1 1 3 压电石英晶体传感技术的应用 压电石英晶体不但对晶体表面的质量负载具有很高的灵敏度，也 能反映电极表面的物理性质的改变，因而应用领域十分广泛。在化学 领域，该方法已成功用于金属的沉积溶出和防护【1 ”9 - 2 0 1 、无机和有机 分子在电极上的吸附和解吸过程【2 l ，2 2 1 、化学修饰电极和化学修饰膜的 制备等的研究 2 3 2 4 】。压电石英晶体在生物领域的应用主要有如下几方 面： 1 1 3 1 蛋白质吸附过程及吸附态蛋白质分子与生物小分子结合过程 研究 蛋白质在固体表面的吸附以及吸附态蛋白质和生物小分子的结 合研究已经成为生命科学研究中的一个非常活跃的领域。由于蛋白质 结构的复杂性以及吸附和结合过程中蛋白质在固体表面的结构变化， 所以在线检测这种吸附和结合过程、获取过程中的变化信息成为蛋白 质研究的重要内容。本实验室在该领域做了大量的工作。h e l 2 5 j 等将 压电石英晶体微天平和电化学阻抗技术联用，研究了抗人体免疫球蛋 白g ( h i g g ) 在裸金、聚邻苯二胺、正十二硫醇修饰电极表面的吸附， 并研究其与抗人i g g 抗体的作用；x j e l 2 6 2 7 等采用压电石英晶体阻抗 和电化学阻抗联用技术测定了人血清白蛋白( h s a ) 在不同修饰电极 上的吸附，并发现蛋白质的吸附受电极表面的疏水性、电位、溶液 p h 值的影响；z h a n g p 8 1 等研究了蛋白质在不同离子掺杂的聚苯胺修饰 电极表面的吸附动力学；l i u 掣2 9 3 0 1 用电化学石英晶体阻抗技术分别 4 几个生物分子体系的压电电化学及荧光光谱法研究 研究了牛血清白蛋白和胶原蛋白在疏水可控的十二烷基苯磺酸钠掺 杂的聚吡咯膜表面的吸附过程，以及吸附在纳米金表面的牛血清白蛋 白和单宁酸的结合过程，测定了相关动力学参数。 1 1 3 2 生物传感器制作过程监测和生物物质的定量测定 利用压电石英晶体能实时、定量监测电极修饰过程的特点，本实 验室用电化学石英晶体阻抗分析技术定量监测了酶传感器电极修饰 的整个过程，对每个电极修饰步骤进行了定量优化。另外，基于该技 术本实验室还提出了一种新的计算微量修饰酶的比活性的方法1 3 1 3 3 l 。 1 1 3 3 细胞生长过程监测和动力学研究 微生物细胞的测定在食品检验、临床医学和环境监测等许多领域 都具有重要的地位。传统的微生物测定方法有细胞记数法、比浊法、 干重法和菌丝长度测定法等。但这些方法都不能获得微生物或细胞生 长过程中的现场动态信息。e b e r s o l e l 3 4 】等最先利用压电生物传感器实 时检测细胞代谢、代谢率和分裂率，并对细胞生长遇抑剂及营养情况 进行实时检测。w u l 3 5 1 等用压电石英晶体阻抗技术( p q c i ) 基于洳 淀粉酶对水溶性淀粉的酶促反应，对枯草杆菌生长进行了研究，推导 出了枯草杆菌生长的p q c i 响应模型，得到了生长过程中的实时生长 曲线和该细菌有关的生长常数，探讨了初始细菌数对这些常数的影 响，实时监测了细菌生长过程中产生的洳淀粉酶的活力。 g u i l l o u - b u f f e l l o t 3 6 1 等监测了生物活性聚合物对纤维原细胞的黏附过 程，表征细胞在黏附到p q c 表面过程中与修饰其表面的聚合物的作 用。k h r a i c h e t 3 7 1 等在线监测了神经母细胞瘤在电极上的黏附。z h a n g 3 訇1 等研究在溶菌酶存在的情况下微球菌的溶解过程，认为溶菌过程的压 电石英晶体响应的改变主要是由溶菌过程中溶液的粘度和密度变化 引起的。 1 1 3 4 基因传感 利用核酸分子间的特异性互补配对规律，研究特定核苷酸序列 ( 基因片段) 实现快速分析的新方法d n a 生物传感器，已经成为 当今生物传感器中的研究热点。d n a 传感器是在换能器上固定一条 5 硕士学位论文 单链的d n a ，通过d n a 分子杂交，对另一条含互补碱基序列的d n a 进行识别，结合成双链d n a 分子，通过声、电、光等不同信号的转 换，来实现对目的基因的检测。压电基因传感器是利用压电石英晶体 振荡频率变化对晶体表面质量负载的高度敏感性与核酸互补杂交的 特异性相结合的一类质量效应型压电石英晶体传感器，是把电子学、 声学及分子生物学等学科结合在一起的新型基因检测技术，其理论基 础是石英晶体谐振器表面的质量改变与频率变化的负相关关系。该技 术不需要任何标记，且仪器简单，操作方便。 f a w c e t t 3 9 j 等首先将压电石英晶体用于d n a 检测，他们利用压电 石英晶体表面固定寡核苷酸与靶核苷酸杂交后引起的晶体振荡频率 显著变化来测定靶核苷酸的量。t 0 w e 巧【如】等用光和压电传感器分别对 6 5o c 下p h6 7 的磷酸缓冲溶液中ec o l id n a 基因片段的杂交进行 研究，两种方法测碍相同的杂交速率。其它许多文献也报道了用压电 d n a 传感器测定d n a 杂交动力学的研究f 4 1 4 2 l 。 1 2 荧光光谱法 荧光光谱法作为一种重要的现代仪器分析方法，从2 0 世纪以来 得到了长足的发展，理论日益丰富，技术日益成熟和多样化。它具有 灵敏度高、选择性好、用量少、方法简便、信息多样等优点，因而被 广泛应用于化学、医学、药学、生物学、考古学、矿物学、环境科学 等领域。 1 2 1 荧光光谱法基本概念 早在1 6 世纪，人们就发现荧光的存在。当时人们从植物抽提液 和矿物中观察到荧光的发射。1 8 5 2 年，s t o k e s 4 3 i 阐明了荧光发射的机 理，他认为荧光不是由于光的漫散射所引起的，而是由于物质吸收了 光能后重新发出不同波长的光线。 图1 1 是分子能级示意图。g 表示基态，s 表示第一电子单线激 发态，s 表示第二电子单线激发态，t 表示第一电子三线激发态。 基态和激发态都有几个不同的振动能级，图中用v = o ，1 ，2 ，3 表示。 6 几个生物分子体系的压电电化学及荧光光谱法研究 3 j i v l 跃无 吸 i 迁辐 光 射 j i叫 j l j lt l 迁辐 荧 射 光 1 f r f s t g f i g 1 - 1 t h es k e t c hm a po f e n e r g yt r a n s f e rf o ra b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c es p e c t l l l 当光量子打到分子上时，电子从基态跃迁到能量比较高的单线电子激 发态s 或s 等。跃迁后，能量较高的激发态分子，通过内转换过程 把部分能量转移给周围分子( 如溶剂分子) ，自己回到最低电子激发 态的最低振动能级。此时分子再通过发射出相应的光量子来释放能 量，回到基态的各个不同振动能级时，就发射出荧光。 。 1 2 2 荧光分析方法 荧光分析的手段虽然很多，但从分析方法上来说，大致可以分为 直接测定与间接测定两大类。直接测定是利用物质自身发射的荧光， 即所谓“内源荧光”来进行测定的，故其分析受到一定限制；间接测 定是利用某些试剂( 如荧光染料) ，使其与荧光较弱、或不显荧光的 物质共价或非共价结合，以形成发荧光的结合物等再进行测定，这种 方法又叫“外源荧光”法或“荧光探针”技术。荧光探针的使用为一 些原来不能用荧光分析的物质打开了方便之门。除上述两种方法外， 近些年发展很快的荧光猝灭法也经常应用于一些物质的定量或定性 分析。 1 2 3 荧光光谱法的应用 7 硕士学位论文 荧光光谱法应用很广泛，很多无机物 4 4 , 4 5 和有机物4 7 1 都可用荧 光光谱法进行定性和定量分析。在生化分析领域，荧光光谱法已成功 用于维生素4 。1 、药物h 9 1 、氨基酸岱o l 、蛋白质、核酸【5 2 1 等各种生物 分子的检测。近来，随着和其它技术联用的发展，荧光光谱法更进一 步拓宽了它在各领域的应用，成为科研和日常生活中一种非常重要的 分析方法。 1 3 本文构思 压电石英晶体( p q c ) 传感器虽已成为分析化学、电化学、材料 科学、生物医学等学科领域有力的研究工具，但大多数的研究仍集中 于压电石英晶体振荡器方法即压电石英晶体微天平( q c m ) 法。该 方法大体上只记录p q c 振荡频率的改变值，不能得到反映体系物理 化学性质变化的多维压电信息，对于较为复杂的研究体系，该方法有 一定的局限性。与之相比，电化学石英晶体阻抗分析( e q c i a ) 技术 通过快速测量石英晶体电声阻抗而获取更全面的晶体谐振信息，从而 可同步动态研究电化学反应或过程的多种理化参数和材料学性质，如 电极表面低至纳克级的质量变化、溶液粘密度、修饰膜粘弹性等。有 鉴于此，在本研究室已有的研究工作基础上，本文用电化学石英晶体 微天平( e q c m ) 研究了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d h ) 在铅笔粉 修饰金电极上的电化学性质；用e q c i a 研究了芦丁( r t ) 及葡萄糖 氧化酶( g o d ) 在碳纳米管( c n t s ) 修饰金电极表面的吸附过程和 电化学性质，测算了吸附动力学参数，定量测量了吸附态r t 的电活 性、吸附态g o d 的电活性及酶活性，考察了吸附态r t 和血红蛋白 的结合过程以及c n t s 和表面活性剂十二烷基苯磺酸钠( s d b s ) 对 吸附态g o d 的电活性和酶活性的影响。 8 几个生物分子体系的压电电化学及荧光光谱法研究 第二章e q c m 和荧光光谱电化学研究n a d h 在8 b 铅笔粉 修饰金电极上的催化氧化 2 1 引言 迄今被研究过的脱氢酶已有几百种，其中很大一部分均通过烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸( 磷酸盐) 的氧化态( n a d ( p ) + ) 和还原态 ( n a d ( p ) h ) 之间的转化作为耦合的氧化还原反应发挥其生理作用 【5 3 1 。因此，n a d h 的电化学性质吸引了广泛的关注。2 5 时中性水 溶液中n a d + n a d h 电对的条件电位约为o 5 6vv ss c e 5 4 1 ，但常见 裸金属电极上n a d h 的直接电化学氧化需要高达1 0v 的过电位 1 5 5 - 5 8 ，所以实现n a d h 的低电位高灵敏检测一直以来是科研工作者 的研究热点。修饰电极是减小过电位的常见方法之一，许多醌类和吩 嗪类衍生物用作电化学氧化n a d h 的催化剂已见报道【54 纷册，包括 硝基苯酸衍生物6 ，氧化还原染料5 3 7 3 , 7 舶，无机盐 5 7 , 6 3 】，导电聚合物 1 6 3 - 6 9 ，碳纳米管1 5 5 , 弛7 2 l ，以及导电聚合纳米管删等。但由于电极修饰 过程复杂，因此研究简单有效的修饰方法以实现n a d h 的催化氧化 是一项很有意义的工作。 铅笔电极已成功运用于一些生物分子的电化学传感，如葡萄糖 【鲫、d n a 8 、f a c t o rv e 蜊等，和一些无机金属的检测8 3 1 ，以及一些绝 缘和导电微粒的表征1 8 4 。此类电极具有价格便宜和表面易更新的优 点。但将铅笔粉修饰在金属电极上作为低检测电位高灵敏度的电化学 传感层，据我们所知，还未曾报道过。如果实验中采用石英晶体微天 平 6 b 4 b 2 b h b ) ，故本章我们选用8 b 铅笔。 n a d h 为s i g m a 公司产品，2 0o c 冷冻储藏。n a d h 样品溶液用 磷酸盐缓冲溶液( p b s ，p h6 7 ) 配制，未使用时保存在- 4o c 的冰箱 里。k 2 c r 2 0 7 - h 2 s 0 4 洗液配制方法如下：将1ogk 2 c r 2 0 7 溶解在3 0m l h 2 0 和1 7 0m l 浓h 2 s 0 4 中( 该洗液有毒，高氧化性，使用时要特别 小心，废液要经过处理才能倒掉以免造成环境污染) 。所有试剂都是 分析纯或优级纯，所有溶液均用二次蒸馏水配制。所有实验都在室温 ( 2 0 - 4 - 2o c ) 下进行。 2 2 2 电极修饰过程 e q c m 金电极首先用lt o o ll 1h n o ，清洗1 0s ，然后用二次蒸馏 水冲洗。处理后的电极放在0 2 0m o ll 。1h c l 0 4 中电位循环扫描( 0 - 1 5 v ，5 0 m vs 以) 直到出现基本重复的循环伏安图【9 2 】。然后用二次蒸馏 水彻底冲洗电极，用洗耳球吹干后在5m m o ll dk 3 f e ( c n ) 6 + 0 2 5m o l l n a 2 s 0 4 溶液中进行循环伏安实验( - 0 1 - 4 ) 5v 区间) ，直到得到基 本可逆的循环伏安图( 峰峰电位差小于8 0m v ) 。然后用洗耳球把电 极表面吹干，将细# 3 0 0 金相砂纸抛光过的铅笔芯在电极表面涂写。 之后，为了彻底清除电极表面的疏松铅笔粉，同时为了获得最高催化 活性，依次用水、乙醇和k 2 c r 2 0 7 一h = s 0 4 洗液清洗电极各三次，每次 清洗前电极表面须吹干。 2 2 3 实验过程 在做荧光光谱电化学实验时。为了同步记录电化学和荧光响应， w e 、r e 和a e 都放在荧光比色皿中，然后把该比色皿插在f - 4 5 0 0 1 1 硕士学位论文 荧光分光光度计的样品池内。之后，把待测液注入该比色皿内浸没所 有电极的表面。 恒电位检测n a d h 的实验过程如下：取一定量的p b s 溶液，恒 电位搅拌状态下加入一定体积的n a d h 样品溶液，记录其约1 0 0s 后的稳态氧化电流，根据该电流值对n a d h 浓度进行定量分析。 2 3 结果与讨论 2 3 1n a d h 在裸金、铅笔修饰金以及普通8 b 铅笔电极上的催化氧化 我们首先研究了修饰的铅笔粉量对n a d h 催化氧化的影响。实验 过程中将铅笔粉涂写在电极表面，之后依次用水、乙醇和 k 2 c r 2 0 7 h 2 s 0 4 洗液清洗，洗耳球吹干，然后记录电极干频，最后把 修饰电极依次放在p b s 空白溶液和1 0m m o ll 1n a d h 溶液中，在 0 5 1 0v 区间进行循环伏安实验，结果如图2 1 所示。电极表面修 - 0 - 0 20 00 20 4o 专0 81 - o e ，v s s c e 蝇，i f i g 2 - 1 c y c l i cv o l t a m m o g r a m so ft h ee q c ma ue l e c t r o d ew i t hv a r i e dp e n c i l m o d i f i c a t i o ni np h6 7p h o s p h a t eb u f f e rw i t h ( b ) a n dw i t h o t r t ( b ) 1 0m m o ll 1 n a d ha sw e l la sp e a l 【c u r r e n td e n s i t y “，a f t e rb a c k g r o u n ds u b t r a c t i o n ) a n dp e a k p o t e n t i a l ( 睇) a sf u n c t i o n so f t h e “d r y f r e q u e n c ys h i f t ( 蛳) a n dt h em 黜l o a d i n g o f p e n c i l ( a m ) t h eb i ga r r o w si n d i c a t et h ec h a n g eo f 酶f r o mo 0 0 , 1 0 6 , - 1 3 6 , 5 0 9 ，8 7 8 ，1 0 5t o 1 0 9k h zr e s p e c t i v e l y s c a nr a t e ：5 0m v s - 1 1 2 几个生物分子体系的压电电化学及荧光光谱法研究 饰的铅笔粉质量根据公式2 1 计算。从图2 i 我们可得出如下一些结 论：( 1 ) 在裸金电极表面n a d h 在约0 6v 开始氧化，峰电位在约 0 8v 处：( 2 ) 随着修饰的铅笔粉不断增多，n a d h 的氧化峰电位( 昂) 逐渐负移，当铅笔粉修饰量达饱和后，e 负移至o 4 5v ，和裸金电极 相比负移了约0 3 5v 。我们发现当修饰的铅笔粉约为i lk h z 时( 相 当于6 0p gc m - 2 ) ，经如前述方法处理后电极表面不能修饰更多的铅笔 粉，我们称之为“饱和修饰”；( 3 ) 和裸金电极相比，修饰电极的峰 电流密度瓴) 有明显增强，饱和修饰时n a d h 在0 1 0 v 间的氧化 电量( q ) 是裸金电极上的两倍( 分别为9 5 8 和4 8 2m cc m - 2 ) ，这说 明修饰的铅笔粉对n a d h 的催化效率很高。 f i g 2 - 2 s e mi m a g e so f t h eb a r e ( a ) a n dp e n c i l 。m o d i f i e d ( b ) g o l de l e c t r o d k ；s 图2 2 的s e m 图说明，经我们前述方法处理后电极表面修饰了很 多亚微米级的铅笔粉。我们认为，电极经这种亚微米级铅笔粉修饰后 其表面积明显增大，因此n a d h 在该修饰电极上的氧化电流密度比 普通8 b 铅笔电极大，如图2 3 所示。此外，铅笔的这种涂