（水生生物学专业论文）深圳市售贝类麻痹性贝毒毒素成分特征及监测和管理方案设计.pdfVIP

里一ill。gdl4lll1i2ll p a r a l y t i cs h e l l f i s ht o x i np r o f i l e si n s h e ll f i s hm a r k e to fs h e n z h e na n dt h e m o ni t o r i n gp r o g r a m 1一，一 x i em e n g s p e c i a l t y ： c o l l e g e ： s u p e r v i s o r ： s u b m it t e dd a t e ： h y d r o b i o l o g y c o l l e g eo fl i f es c i e n c e p r o f e s s o rj i a n gt i a n 。ji u m a y3 1 ，2 0 1 0 f 摘要 摘要 深圳市售贝类麻痹性贝毒毒素成分特征及 监测和管理方案设计 专业名称： 申请者姓名： 导师姓名： 水生生物学 谢猛 江天久 本文于2 0 0 7 年1 1 月至2 0 0 8 年1 0 月在深圳罗湖水产批发市场每月两次采集 市售主要贝类，经小鼠检测麻痹性贝类毒素( p a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，p s p ) 为阳性的样品，采用高效液相色谱一柱后衍生荧光检测技术( h p l c - f d ) 进行p s p 成分分析，旨在弄清深圳水产批发市场贝类的p s p 毒素成分特征，探索不同产 地、不同季节、不同贝类品种间p s p 毒素的分布规律。主要研究结果如下： 一、贝类p s p 毒素成分的地域性差异 通过对产自福建、汕尾、南澳和湛江海域的华贵栉孔扇贝所含p s p 的h p l c 分析发现，p s p 各组分及总量的地理分布呈由北向南上升的趋势。各地区样品所 含p s p 的成分较基本一致，均检测出g t x 4 - 1 、g t x 3 - 2 、c 1 2 、d c g t x 3 - 2 和 g t x 5 ( b 1 ) 9 种成分，未检出n e o 、s t x 和d e s t x ，主要成分为g t x 4 - 1 、g t x 3 2 和 b 1 ，特别是g t x 3 2 占总毒素的4 5 以上，p s p 各组分的比例在地域上无明显差 异。 二、贝类p s p 毒素成分的季节性差异 通过对2 0 0 7 年1 1 月至2 0 0 8 年l o 月产自大连的虾夷扇贝所含p s p 的h p l c 分析发现，p s p 含量的高峰期出现在冬春两季，最高毒素含量达2 4 3 5 4 n m o l g ； p s p 毒素成分基本相同，共检出1 1 种毒素成分，有g t x 4 一l 、g t x 3 2 、c 1 - 2 、 d c g t x 3 2 和g t x 5 ( b 1 ) 9 种成分，少量样品检出了的s t x 和d c s t x ，未检出n e o ， 主要成分为c 卜2 、g t x 4 - 1 、g t x 3 2 和b 1 ；p s p 各成分的比例随着时间变化呈现 出一定的差异，冬春两季样品中c 1 - 2 毒素占有较高，其他季节则相反；除了冬 季样品外，其他季节g t x 4 - 1 一般都低于g t x 3 - 2 比例。 摘要 三、贝类p s p 毒素成分的种间差异 在受检的1 6 种贝样中，只有虾夷扇贝、华贵栉孔扇贝和栉江珧3 种贝类对 小白鼠p s p 检测呈阳性，但h p l c 法分析结果显示，栉江珧并不含p s p 毒素； 虾夷扇贝和华贵栉孔扇贝2 种贝类种类中普遍含有p s p 毒素，表明扇贝比其他 种贝类更容易累积p s p 毒素。 通过对深圳市售贝类毒素进行为期一年的调查，并借鉴国外贝毒监测系统 方案的成功经验，本文总结了各种监测方案的优缺点，确定了深圳市售贝类的 监测贝种、采样方法、采样频率、检测方法和毒素警戒值等，制定出针对性和 操作性强的监测和管理方案，以期为相关部门完善和强化贝类监督和管理工作 提供科学依据和理论参考，以保证我国贝类产品的食用安全。 关键词：麻痹性贝类毒素高效液相色谱贝毒监测系统监测方案 n a b s t r a c t p a r a l y tics h e l l fis ht o xinp r o fil e sins h e l l fis hm a r k e to f s h e n z h e na n dt h em o nit o rin gp r o g r a m a b s t r a c t m a j o r ：h y d r o b i o l o g y n a m e ：x i em e n g s u p e r v i s o r ：t i a n j i u - j i a n g i no r d e rt ou n d e r s t a n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fd i f f e r e n tc o m p o n e n t so fp a r a l y t i c s h e l l f i s hp o i s o n i n g ( p s p ) t o x i n sa n dt h ed i s t r i b u t i o no fp s p s p a t i a l l y ，t e m p o r a l l ya n d i n t e r - v a r i e t a l l y ，s h e l l f i s hs a m p l e sw e r ec o l l e c t e dt w i c e am o n t hf r o ms e a f o o d w h o l e s a l em a r k e to fl u o h ui ns h e n z h e nc i t yd u r i n gn o v e m b e r2 0 0 7t oo c t o b e r2 0 0 8 t h i sp a p e rf o c u s e so ns a m p l e sw e r ee s t a b l i s h e dt ob ep o s i t i v ef o rm o u s eb i o a s s a y m e t h o d ，b ya n a l y z i n gt h ep s pc o m p o n e n t sb yh p l c - f dt e c h n i q u e ，t h er e s u l t sa l e s u g g e s t e da sf o l l o w s ： 1 s p a t i a ld i f f e r e n t i a t i o no fd i f f e r e n tc o m p o n e n t so fp s pt o x i n s p s pc o n t e n t si nt h es h e l l f i s hs a m p l e so fc h l a m y sn o b i l i sf r o mf 哂i a n ，s h a n w e i ， n a n a oa n dz h a n j i a n gs h o w e das p a t i a l l yi n c r e a s i n gt e n d e n c yf r o mn o r t ht os o u t h a l o n gt h ec o a s to f c h i n a n i n ep s pc o m p o n e m s ，i n c l u d i n gg t x 4 - 1 、g t x 3 2 、c 1 2 、 d c g t x 3 2a n dg t x 5 ( b 1 ) ，w e r ep r e s e n t ，w h i l en e o 、s t xa n d d c s t xw e r ea b s e n ti n a l lt h es a m p l e s ，w h i c hd e m o n s t r a t e dq u i t eas i m i l a r i t y 2 s e a s o n a lv a r i a t i o no fp s pc o m p o n e n t si nt h es h e l l f i s hs a m p l e s i no r d e rt ou n d e r s t a n dt h es e a s o n a lv a r i a t i o n so fp s p ，s h e l l f i s hs a m p l e so f p a t i n o p e c t e ny e s s o e n s i sf r o md a l i a nw e r ea n a l y z e d t h ep e a l ( c o n c e n t r a t i o nm a i n l y o c c u r r e di nw i n t e ra n ds p r i n g ，谢t i lt h em a x i m u mo f2 4 3 5 4 n m o l g e l e v e np s p c o m p o n e n t sw e r ed e t e c t e di n c l u d i n gg t x 4 1 ，g t x 3 - 2 ，c 1 2 ，d c g t x 3 2 ，g t x 5 ( b 1 ) ， s t xa n dd c s t x ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft h et w ol a t t e rw e r eq u i t el o w o b v i o u s l y s e a s o n a lv a r i a t i o n so fp s pc o n t e n t si nt h es h e l l f i s hs a m p l e sw e r eo b s e r v e d c1 - 2 c o n t e n t si nt h es a m p l e si nw i n t e ra n ds p r i n gw e r eh i g h e rt h a nt h o s ei ns u m m e ra n d a u t u m n t h ep e r c e n t a g eo fg t x 4 1i nt o t a lp s pt o x i n sw a sl o w e rt h a nt h a to f 1 1 1 a b s t r a c t g t x 3 2i na l ls e a s o n se x c e p tf o rw i n t e r 3 d i f f e r e n c e so fp s pc o m p o n e n t sb e t w e e ns h e l l f i s hs p e c i e s o n l y3o u to f16s h e l l f i s hs p e c i e s ，i n c l u d i n gc h l a m y sf e r r e n p a t i n o p e c t e n y e s s o e n s 西a n dc h l a m y sn o b i l i s ，w e r ed e t e r m i n e dp o s i t i v ef o rm o u s eb i o a s s a ym e t h o d h o w e v e r ，f u r t h e rh p l ca n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a tp s pt o x i n sw e r em e r e l yp r e s e n t i nt h el a t t e rt w os p e c i e s ，w h i c hs h o w e dt h a tt h e s et w os p e c i e sm i g h th a v eas t r o n g e r c a p a b i l i t yt h a no t h e rs p e c i e si na c c u m u l a t i n gp s p t o x i n s b a s e do nt h ey e a r - r o u n di n v e s t i g a t i o no fp s pi nt h es h e l l f i s hf r o mt h em a r k e t a n de x p e r i e n c eo fb i o t o x i nm o n i t o r i n gs y s t e ma b r o a d ，t h i sp a p e rp r o p o s e dap s p m o n i t o r i n gp r o g r a mf o rt h e s e a f o o do ns a l ei nt h em a r k e to fs h e n z h e n , w h i c h i n c l u d e s m o n i t o r i n g s h e l l f i s h s p e c i e s ，s a m p l i n gm e t h o d s ，f r e q u e n c ym e t h o d ， d e t e c t i o nm e t h o da n dt h r e s h o l do fp s pt o x i n s k e yw o r d s ：p a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n gh p l cb i o t o x i nm o n i t o r i n gs y s t e m b i o t o x i nm o n i t o r i n gp r o g r a m i v 目录 目录 摘要：i a b s t r a c t i i i 目录v 第一章引言1 1 1 麻痹性贝类毒素2 1 1 1 麻痹性贝毒的分布与来源2 1 1 2 麻痹性贝毒的结构与性质5 1 1 3 麻痹性贝毒的毒性与毒理效应7 1 1 4 麻痹性贝毒的检测方法8 1 1 4 1活体检测法1 0 1 1 4 2 离体检测法1 0 1 1 4 3 化学检测法1 2 1 1 5 深圳市售麻痹性贝毒污染状况与p s p 成分分析意义1 3 1 2 贝类监测系统研究概况1 4 1 3 本论文的创新1 6 第二章深圳市售麻痹性贝毒的成分特征分析1 7 2 1实验材料与方法l7 2 1 1实验材料17 2 1 1 1实验仪器17 2 1 1 2化学试剂18 2 1 2 实验方法1 9 2 1 1 1材料处理1 9 2 1 1 2 检测方法1 9 2 2 检测结果2 0 2 2 1深圳市售贝类p s p 的成分特征2 0 2 。2 2 深圳市售贝类p s p 及其成分的地域性差异2 0 2 2 3 深圳市售贝类p s p 及其成分的季节性差异2 2 2 2 4 深圳市售贝类p s p 及其成分的种间差异3 0 2 2 5p s p 小白鼠生物检测法与高压液相色谱检测法检测结果比较3 0 2 3 分析讨论31 2 3 1 深圳市售贝类p s p 及其成分的地域性差异3l v 目录 2 3 2 深圳市售贝类p s p 及其成分的季节性差异3 4 2 3 3 深圳市售贝类p s p 及其成分的种间差异3 6 2 3 4 小结一3 7 第三章深圳市售贝类监控管理方案的设计。3 9 3 1贝毒监测系统的目的及组织结构和职能3 9 3 2 监测方法的确定4 0 3 3 监测区域的确定4 1 3 4 监测季节的确定4 2 3 5 监测贝种的确定4 2 3 6贝毒检测的分析方法和控制标准4 3 3 7 贝毒监测系统的体制建设4 4 3 7 1建立健全完善的认证和执法监管体系4 4 3 7 2 完善贝类水产品市场准入制度4 4 3 7 3 加强应急监测体制的建设和产品召回制度4 4 参考文献4 6 致谢5 2 攻读硕士学位期间发表或待发表的论文5 8 v l 第一章引言 第一章引言 麻痹性贝毒( p a r a l y t i cs h e l l f is hp o is o n i n g ，p s p ) 是一类赤潮 生物毒素的总称，根据毒素所导致的中毒症状及携毒的媒介，赤潮生 物毒素通常分为五类：麻痹性贝类毒素( p a r a l y tics h e l lf is h p o is o n in g ，p s p ) 、腹泻性贝类毒素( d i a r r h e tics h e l lf is h p o i s o n in g ，d s p ) 、记忆缺失性贝类毒素( a m n e s tics h e l lf is h p o is o n in g ，a s p ) 、神经性贝类毒素( n e u r o t o x i cs h e l lf is hp o i s o n in g ， n s p ) 和西加鱼毒( c i g u a t e r af is hp o is o nin g ，c f p ) 。赤潮生物毒 素最初是在藻体内发现的，因此又称为藻毒素。在目前已知的约4 0 0 0 种海洋浮游微藻中，约有3 0 0 种有害赤潮藻种，其中有毒藻种有7 0 余种( s o u r n ia ，1 9 9 5 ) 。由于在早期的中毒事件中人们都是食用了带毒 的贝类或鱼类而中毒，所以将这些藻毒素称为贝毒或鱼毒，如麻痹性 贝毒、西加鱼毒等。人类误食含有藻毒素的海产品后会出现一系列急 性和慢性中毒症状，严重的甚至会导致死亡。近年来，工农业的迅猛 发展，大量工业废水和生活污水排入海洋，加上大规模海产养殖产业 的发展导致近海、港湾富营养化程度日趋严重，为藻类形成赤潮提供 了丰富的物质基础，因此赤潮生物毒素的危害有不断增多的趋势。 深圳水产批发市场是我国的水产品南方重要水产品聚散地之一， 其产品主要来自中国沿海、东南亚及大洋洲等地，承担着深港和珠三 角等地区的水产品供应。深圳的罗湖水产品批发市场是深圳大型的海 鲜批发市场，其高档海鲜经营规模占深圳市场批发总量8 0 9 0 ，其 市售的贝类除一部分来自深圳近岸贝类的养殖区，大部分来自广东的 南澳、湛江及广西、福建、江苏和辽宁等省的近岸养殖区，产品来源 复杂。而深圳的重点养殖区，大亚湾、大鹏湾海域，是广东省麻痹性 贝毒中毒事件的多发地区，已有多起中毒死亡事件发生( 林燕棠， 19 9 4 ) 。香港每年发生的贝类中毒事件达10 多起，每年的4 月和9 1 0 月间，经常有贝类中毒事件见诸报端，肇事贝类疑为产自深圳海域的 贝类。雷芳的硕士论文深圳市售贝类麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类 华南师范大学硕十学位论文 毒素污染状况研究在为期近2 年的调查基础上，首次较全面地论述了 深圳市售麻痹性贝类毒素和腹泻性贝类毒素分布状况，主要染毒贝类， 季节变化等规律，但其对贝毒素的检测方法是根据美国分析化学家协 会( a o a c ) 推荐的小白鼠生物法，未能确切地阐明毒素的性质及主要毒 素的成分特征，因而难以说明各海域贝毒素间的内在关系及贝毒素与 有毒藻间的联系。本论文在该文的基础上，试图运用高效液相色谱一 荧光检测的技术，对含有麻痹性贝类毒素的贝类进行检测，较全面地 分析了我国染毒贝类的主要成分特征及时空和种间差异，为弄清贝类 毒素的来源，制定适合我国贝毒污染现状的监测和管理方案提供科学 依据 为了提高我国贝类产品质量安全水平，保障人们水产品消费的健 康安全，建立贝毒素的监测和管理体系是预防和减少贝类赤潮生物毒 素危害的唯一有效方法。我国是贝类养殖和贝类出口大国，在国民经 济中占有重要的地位。自9 0 年代初期，一些国家纷纷建立了贝毒监测 体系，并制定了严格的卫生标准( a n d e r s o n ，2 0 0 1 ) ，欧盟、日本等 国对我国的贝类产品实施严格检验，这些都严重阻碍了我国贝类产品 的出口创汇( 郭斌，2 0 0 5 ) 。因此建立完善的贝毒监测和管理体系已 成为我国当前社会经济发展的迫切需要。本论文在p s p 成分分析的基 础上，吸收国内其他学者的研究成果，借鉴国外贝毒监测系统方案的 成功经验，设计了一套符合本国国情的贝类毒素的监测和管理方案， 以保证我国贝类产品正常出口和人民群众食用安全。 1 1麻痹性贝类毒素 1 1 1 麻痹性贝毒的分布与来源 麻痹性贝毒是目前世界分布最广、发生中毒事件频率最高的一种 海洋生物毒素( h a l l e g r a e f f ，1 9 9 3 ) ，各沿海国家几乎都有麻痹性中毒事 件发生的记录。早在十八世纪，北美就有p s p 毒素中毒事件的记载。 进入19 7 0 s 以后，p s p 中毒事件无论在数量上还是在分布区域上都有明 显增加，l9 7 0 年以前北美和欧洲有记录的人类中毒事件约有l6 0 0 次， 而l9 7 0 年到l9 8 4 年就发生了9 0 0 次。原先仅在美国、欧洲北部和日本等 2 第一章引言 地发生，而现在则扩展到亚太、欧洲南部、南美洲以及澳大利亚等地 区。p s p 的全球分布如图1 1 所示( h a r m f u la l g a e ，2 0 0 6 ) 。我国四大海 域中贝类p s p 污染状况非常严重。调查发现，麻痹性贝类毒素在我国 各大海域均普遍存在( a n d e r s o n ，l9 9 5 ；关春江，19 9 9 ：林燕棠，2 0 0 1 ) 。 图1 1p s p 的全球分布图 f g1 i g l o b a ld i s t r i b u t i o no fp a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g 最初认为p s p 毒素来自贝类，19 2 7 年金门贻贝中毒事件发生后， s o m m e r 认为p s p 毒素是由链状膝沟藻( g o n y a u l a x c a t e n e l l a ) 产生，此 后又在多种甲藻中发现p s p 毒素。已发现能产生p s p 的微藻主要为甲藻 中的亚历山大藻属( a l e x a n d r i u m ) 、膝沟藻属( g o n y a u l a x ) 、裸甲藻属 ( g y m n o d i n i u m ) 、旋沟藻属( p y r o d i n i u m ) 和生活在淡水区的蓝藻属 ( b l u e g r e e na l g a ) ，此外，细菌、红藻中的一些种类也可产生p s p 毒素( 于 仁成，l9 9 8 ) 。 藻类产生的毒素并不直接毒害人类，而是通过贝类等摄食有毒藻， 毒素在其体内累积，当人们误食这些染毒的海产品时就会造成中毒。 能在体内积累p s p 的可食性贝类主要有：贻贝类：m y t i l u s ，m o d i o l u s ： 蛤类：s a x i d o m u s ，p r o t o t h a c a ，s p i s u l a ，m y a ，a r c t i c a ，h u m i l a r i a ， m e r c e n a r i a ，m e s o d e s m a ，t r e s u sa n de n s i s ；牡蛎：c r a s s o s t r e a ，o s t r e a ； 扇贝类：p l a c o p e c t e n ，p e c e n ，s p o n d y l u sa n dh i n n i t e s ：海扇类：c a r d i u m ， 华南师范大学硕士学位论文 c l i n o c a r d i u m ( 刘智勇等，2 0 0 6 ) 。尽管双壳类软体动物是最重要的p s p 的携带者，其他的水生动物如食肉和腐食为主的腹足纲动物，杂食性 的甲壳类及鱼类都可能成为携带者。不同种类的贝类对毒素的代谢速 率不同。贻贝相对于其他双壳贝类如扇贝、巨蛎和沙海螂等往往具有 中毒早、毒素吸收率高、毒性累积水平高等特点，因此在p s p 监测中 常被作为指示物种。而另有研究发现，在海湾扇贝中p s p 毒素( 4 0u g s t x e g p lo o g ) 可在体内驻留很长时间，从几个月甚至到几年( b r i c e l j ， 19 9 8 ) 。贝类对p s p 不同成分的吸收、代谢和排除的速率也存在很大的 差异，贝类毒素成分分析为贝类毒素的积累机制提供一条很好的途径。 表1 1 常见的p s p 毒素产毒藻种类 t a b l ei ic o m m o ns p e c i e sp r o d u c i n gp s pt o x i n s 属名种名参考文献 亚历山大藻属 a c a t e n e l l a ，a t a m a r e n s e ，a a c a t e n e l l ， ( a l e x a n d r i u m )a c o h o r t i c u l a ，彳f u n a y e n s e ， 彳f r a t e r c u l u s ，彳m i n u t u m 膝沟藻属 g c o h o r t i c u l a ，g m o n i l a t a ( g o n y a u l a x ) 裸甲藻属 ( g y m n o d i n i u m ) 多甲藻属 ( p y r o d i n i u m ) 蓝绿藻 g c a t e n a t u m p b a h a m e n s ev a r c o m p r e s s u m 4 p h a n i z o m e n o nf l o s a q u a e ， ( b l u e - g r e e na t g 口) a n a b a e n ac i r c i n a l i s ，l y n g b y 口w o l l e i ， c y l i n d r o s p e r m o p s i sr a c i b o r s k i i 莫拉氏菌属细菌 m o r a x e l l as p ( m o r a x e l l a ) 红藻( j a n i a ) j a n i as p 4 s t e i d i n g e r ，l9 9 3 k o d a m a ，1 9 8 8 刘智勇，2 0 0 6 于仁成，1 9 9 8 素1 4 ( g o n y a u t o x i n l 一4 ，g t x l 4 ) ；n 一磺酰氨甲酰基类毒素( n s u l f o c a r b a m o y lt o x i n s ) ，包括g t x 5 ，6 ( b 1 ，2 ) ，c l 一4 ；脱氨甲酰 基类毒素( d e c a r b a m o y lt o x i n s ) ，包括d e c a r b a m o y ls a x i t o x i n ( d c s t x ) ， d e c a r b a m o y ln e o s a x i t o x i n ( d c n e o s t x ) ，d e c a r b a m o y lg o n y a u t o x i n s1 4 ( d c g t x l 一4 ) ；脱氧脱氨甲酰基类毒( d e o x y d e c a r b a m o y lt o x i n s ) ，包 括d e o x y d e c a r b a m o y ls a x i t o x i n ( d o s t x ) ，d e o x y d e c a r b a m o y l g o n y a u t o x i n 2 ，3 ( d o g t x 2 ，3 ) 。此外，还在一种螃蟹z o s i m u sa e n e u s 中检出了石房蛤毒素和新石房蛤毒素的n 一羟基衍生物( n h y d r o x y c a r b a m o y ld e r i v a t i v e s ) h y s t x 和h y n e o s t x ( n e g r i ， 2 0 0 3 ； l y n d o n ，2 0 0 4 ) 。大量数据表明，氨基甲酸酯类毒素s t x 、n e o s t x 和 g t x l 4 在p s p 中最为常见，特别是s t x ，占总p s p 的8 5 以上。 图1 2麻痹性贝类毒素的结构 n h 2 4 - f i g1 2 t h es t r u c t u r eo fp s pt o x i n s 5 华南师范大学硕士学位论文 表1 2p s p 毒素种类和名称 t a b l ei 2t h et y p e sa n dn a m e so fp s pt o x i n s p s p 毒素易溶于水，可以部分溶解于甲醇和乙醇，但不溶于非极 性的有机溶剂如乙醛、石油醚。它是一种生物碱，容易从酸性溶液中 萃取。在紫外线范围内不被吸收，p k a 值在8 12 到1 115 间，旋光度约 为+ 1 3 0 。石房蛤毒素s t x ) 的分子式是c l o h l7 n 7 0 4 ，分子量为2 9 9 ，呈 碱性，易于用酸性溶液提取。p s p 在一般条件下比较稳定，但是其中 的一些基团也会发生变化，如c1 1 位羟基磺酸盐基团的空间异构化。 有毒藻中大量存在的d 异构体可以转变成更加稳定的c t 异构体。贝组织 中也会发生这种异构化，稳定后a ，p 异构体的比例趋于a ：p = 3 ：l ，这 一比例可以被用来判断贝类染毒时间的长短。n 一磺酰氨甲酰基类毒 素在加热、酸性条件下会脱掉磺酰基，生成相应的氨基甲酸酯类毒素， 而在稳定的条件下则生成相应的脱氨甲酰基类毒素( 后者常发生在贝 类组织中) 。在贝类体内，1 n 位原子上的羟基可以在还原剂的作用下 脱去氧原子，生成对应的毒素，同时1 1 位c 原子上的o s 0 3 也可能被消 除：cl2 位的酮二元醇的s t x 衍生物在p h 较高时易于氧化，结果导致 c 4 cl2 键破裂，剩下的两个环重新定向成一个面，呈芳香构型，形成 的嘌呤衍生物具荧光特性。这类转变是毒素进行化学测定和分析的关 键。 6 第一章引言 1 1 3麻痹性贝毒的毒性与毒理效应 p s p 毒素是一类神经肌肉麻痹剂，其毒性极强，相当于眼镜蛇的 8 0 倍，中毒范围从6 0 0 5 0 0 0 m u ( m u ，鼠单位，一个鼠单位表示使1 只 重2 0 9 的小白鼠在15 m i n 内被杀死所需的腹腔注射的剂量) ，致( 人) 死亡 量为3 0 0 0 - 3 0 0 0 0 m u ，麻痹性贝类毒素各成分的毒性如表1 3 所示。 表1 3 麻痹性贝类毒素各成分的毒性( p e r e i r a ，2 0 0 0 ) t a b l e1 3 t o x i c i t yo fd i f f e r e n tp s pc o m p o n e n t s 7 华南师范大学硕士学位论文 p s p 毒素属于肌类毒素，其活性部位的肌基，与可兴奋细胞膜上 的电压门控n a + 通道位点l 的氨基酸残基高亲和，通过选择性阻断n a + 内流，阻碍动作电位的形成而起抑制作用。因此一旦被人食用，就会 造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用( m o n s ，1 9 9 8 ) 。由于神经钠通 道、脑钠通道、心钠通道、骨骼肌钠通道等各种钠通道存在差别，p s p 毒素的肌基与钠通道氨基酸残基的结合也有所不同，但都是与更靠近 钠通道外口的氨基酸残基结合。在成年兔骨骼肌钠通道，s t x 通过肌 基与通道上的a s p 4 0 0 和g 1 u 7 5 5 高亲和。而n e o s t x 比s t x 多了一个羟 基，此羟基能够与a s p 4 0 0 和t y r 4 0 1 作用，与t y r 4 0 l 可能形成氢键，因 此比s t x 有更高的亲和力。通过对龙虾巨轴突、枪乌贼巨轴突和青蛙 郎飞氏结的研究，发现p s p 毒素能够抑制去极化刺激产生的膜瞬时钠 传导。p s p 毒素各衍生物对膜的作用机理相似，均以剂量一依赖型方 式阻断钠离子内流，而对静息膜电位或钾通道无作用。 p s p 易被胃肠道吸收，难被人的消化酶所破坏，会很快释放并呈 现毒性作用。人体中毒症状为：食用染毒量较高的水产品一般3 0 分钟 后，唇、舌头、脸有刺痛和灼烧的感觉，但有时会在5 分钟之后即有这 种感觉，此症状渐渐扩展到脖子、手臂、手指、腿和脚趾，产生麻木 感，以至行动困难，同时可能伴随着恶心、腹泻、头疼、头晕等症状。 如果引起呼吸系统的麻痹，则可在12 d , 时内导致死亡。在摄入量不是 很大的情况下，中毒病人一般2 4 d , 时后逐渐恢复，4 8 d , 时后可完全康 复，大多数中毒者在病发期间能够保持清醒。现代医学对麻痹性贝类 毒素引起的中毒尚没有特效的解毒方法，只能采用相关治疗方法缓解 病人的症状，主要是依靠病人自身的解毒、排毒机能来分解、清除毒 物，因此中毒后果常常比较严重( b a s i o w ，19 8 5 ) 。 1 1 4麻痹性贝毒的检测方法 建- 0 | p s p 毒素的监控体系是预防和减少p s p 中毒的有效方法，目前 在世界范围内，建立起了多种p s p 检测分析方法。各种检测方法有其 优缺点，检出限或灵敏度各不相同，可根据实际工作需要选用( 见表 1 4 ) 。 8 第一章引言 表1 4 常用的p s p 分析方法 t a b l e1 4 c o m p a r i s o no fd i f f e r e n tm e t h o d sc o m m o n l ya p p l i e dt op s pa n a l y s i s 9 华南师范大学硕士学位论文 1 1 4 1活体检测法 p s p 毒素的生物监测主要采用小鼠生物检测法( m b a ) 。m b a 作 为检测和定量p s p 毒素的标准方法已有六十多年的历史( s o m m e ra n d m e y e r ，1 9 3 7 ；m c f a r r e n 等，1 9 5 8 ：h e l r i c h ，1 9 9 0 ) 。1 9 3 7 年s o m m e r 和m e y e r 首次描述了小鼠腹腔注射毒素后毒素浓度和死亡时间之间的 对数关系。此方法后经m e d c o f 和s c h a n t z 修改完善后于19 5 8 年被分析化 学家协会( a s s o c i a t i o no fo m c i a la n a l y t i c a lc h e m i s t s ，a o a c ) 确定为标 准方法( o f f i c i a lp r o c e d u r e ) 延用至今，并在世界范围内被广泛接受。在 已建立毒素监测体系的国家里，大约有8l 的国家采用小鼠法监测p s p 由于小鼠法直接测定污染物的毒性，比较适合海产品食用安全性的检 测，尤其是对于未知的毒素和污染物，是难以替代的直观测定方法。 尽管该方法在检测样品毒性方面相当有效，但也有较多的不足，如该 法不能确定样品中毒毒素的组成和含量，且该法是利用对小白鼠腹腔 注射毒物测定其死亡时间以确定毒性大小，因此灵敏度低，其检出限 约l6 0 n g s t x m l 或4 0 p g s t x e q 10 0 9 贝肉，此外，该法在标准程序中不 同小鼠的品系、批次、损伤程度和大小等方面对检测的灵敏度和重复 性有很大的影响，并浪费较多的毒素和需使用活体动物等等( s o m m e r ， 19 8 4 ) 。这些缺点使得人们希望能有另外一些操作简便、可比性强、 费用较低的生物监测手段来取代小鼠法。 对p s p 的活体检测方法除了m b a 方法之外，还有家蝇生物分析法 ( m c e l h i n c y ，19 9 8 ；s h o p t a u g h ，19 7 8 ) ( h o u s e f l yb i a s s a y ) 和蝗虫生物 分析法( c a r l s o n ，1 9 8 4 ) ( l o c u s tb i o a s s yl b a ) 。这两种方法虽然减少了 成本、提高了灵敏度，但与m b a 相比提高了操作技术上的难度，因此 限制了该方法的应用。 1 1 4 2 离体检测法 免疫化学检测技术：免疫分析技术是另外一种很好的检测p s p 毒 素的手段，分为血球凝聚、放射免疫分析( r i a ) 和酶联免疫分析 ( e l i s a ) 。其中e l i s a 是最常用的一种。其基本原理在于应用毒素诱发 免疫反应产生抗体，利用抗体对抗原的特异性识别来对毒素进行监测。 但由于缺乏与之相关的毒素标准品和稳定的免疫抗原而限制了该技术 1 0 第一章引言 的发展，所使用的抗体是解决检测藻毒或贝毒的瓶颈。用于检测p s p 的免疫化学技术主要以单克隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d y ，m a b ) 为基 础。p s p 本身为小分子物质，不具有免疫原性，因此需要连接到大分 子载体上，使其成为完全抗原，再用来免疫动物。国外学者对抗p s p m a b 制备及p s p 定量测定方法进行了尝试，取得了满意的结果。目前 国外的一些化学试剂公司( 如r b i o p h a r m 的r d a s c r e e n r ； s a x i t o x i nt e s t e r ) 已有商品化的成套试剂盒出售，我国已有使用 购进的国外试剂盒分析检测p s p 的文献报道( 张纹，2 0 0 5 ；于兵，2 0 0 5 ； 罗辉武，2 0 0 6 ) 并认为e l i s a 法简便、快速、灵敏是筛选贝类毒素和 藻类毒素的首选技术，但进口的试剂盒价格昂贵。 细胞毒性检测法：它是利用毒素对细胞的毒性作用来检测毒素存 在与否的一种技术。细胞毒性监测始于8 0 年代末，其原理是利用p s p 毒素可以作用于小鼠神经节瘤细胞n a + 通道位点l ，阻断n a + 内流。当 在培养的细胞中加入n a + 通道活化剂黎芦定或n a + k + 一a t p 酶抑制剂 乌本昔，细胞会由于n a + 内流过多而造成肿胀，甚至死亡，但如果在 以上过程中同时加入具n a + 通道阻断作用的p s p 毒素，n a + 内流会因拮 抗作用而受到限制，使得细胞成活，由此可以确定毒素的存在，并作 出定量估计( j e l l e t ，1 9 9 5 ：m a n g e r ，1 9 9 5 ) 。细胞毒性监测技术是很有 前景的一项技术，这种方法己经可以通过仪器分析，已有商业化的产 品出售。 神经受体分析法：又称为固相受体结合法或生物分子分析法。这 种方法是将取自大鼠大脑细胞膜上的钠通道受体固定在微滴度板表 面，通过待测样品和3 h 标记的标准s t x 与受体的竞争性结合来测定样 品中p s p 的毒性。这种方法经过完善之后，可以实现对毒素的大量、 快速监测。与小鼠法得到的结果比较，发现这种方法具有较高的重现 性和灵敏度，是一种很有前途的生物监测技术。但神经受体监测不能 对毒素种类进行区分，而且要求的仪器设备和消耗的费用都相对较高， 因而难以得到普遍应用。但作为一种对藻毒素快速、灵敏的监测技术， 这一方法仍然具有相当大的应用潜力。 华南师范大学硕士学位论文 1 1 4 3化学检测法 尽管针对p s p 毒素已经建立了多种生物监测技术，但这些技术只