（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕bmycacr基因的原核表达和亚细胞定位研究.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密口 。 学位论文作者签名：参1 骛 日期：沙lo 年弓月剀日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名： 日期：加fo 年月纠日 浙江理工大学硕士学位论文 本研究由 国家9 7 3 计划课题 ( n o 2 0 0 5c b1210 0 6 ) 、 国家8 6 3 计划课题 ( n o 2 0 0 7 a a 0 217 0 3 、 n o 2 0 0 7 a a l0 0 5 0 4 ) 和浙江省自然科学基金 ( n o y 30 8 018 3 ) 提供资助 浙江理工大学硕士学位论文 洳锂罩殳治 z h e j i a n g s c i - t e c hu n i v e r s i t y 硕士学位论文 论文题目： 塞蚕垦丝z 丝鲤基国的 厦弦麦鲨塑垩缉擅枣僮瑟究 作者姓名：割亟 指导教师：毯耀浏 教授 学科专业： 生物化堂皇盆王生物堂 递交日期：2 q q 2 ：1 2 浙江理工大学硕士学位论文 at h e s i ss u b m i t t e dt oz h e j i a n gs c i - t e c h u n i v e r s i t yf o rd e g r e eo fm a s t e ro fs c i e n c e m n l 一1 1 一 一一一一 1l t l e ：! = q 竖塾! = y q t l ce x p r e s s i o na n ds u b c e l l u a rl o c a l i z a t i o no f b m 艺c a c rg e n ef r o ms i l k w o r mp u p a e ( b o m b v x m o r i ) c a n d i d a t e sn a m e ： l - - t i t j r l i - n - - 9 1 _ _ _ _ 一 s u b m i s s i o nd a t e ： 坠金：2 q q 2 单位代码! q 圣圣墨 研究生学号堡丝q 2 立! q 2 垒 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 y c a c r 蛋白含有一个保守的y c a c r e l a t e d 结构域，属于异分支酸酶超家族，据推测其。 功能可能与异分枝酸酶类似，但是具体底物和生物学功能尚不清楚。 从本实验室构建的家蚕蛹c d n a 文库中检索到一个e s t 序列，该序列编码一个含有 y c a c r e l a t e d 保守结构域的蛋白的一个片断，进而得到该c d n a 的全长序列。该序列被命名 为b m y c a c r ，g e n b a n k 登录号为g u 2 9 2 7 9 4 。预测该基因编码的蛋白分子量为2 2 8 3 8k d 。 我们将其完整o r f 序列克隆到原核表达载体p e t - 2 8 a ( + ) q b ，构建的重组质粒经p c r 及双 酶切鉴定成功后，转化到ec o l ir o s e t t a ( d e 3 ) q b ，经i p t g 诱导成功表达了融合蛋白 h i s b m y c a c r 。超声破碎后发现该蛋白以可溶的形式存在于上清中，经亲和层析纯化后， 得到较纯的融合蛋白h i s b m y c a c r 。将纯化后的h i s b m y c a c r 为抗原免疫新西兰大白兔 后制各该蛋白的多克隆抗体，经e l i s a 检测，抗体效价可达1 ：6 4 0 0 以上。我们还采用荧 光定量p c r 和w e s t e r nb l o t 的方法，对b m y c a c r 在家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个发育 时期以及五龄幼虫各组织中的转录水平和表达情况进行分析，结果显示：在各发育时期中， b m y c a c r 基因在卵时期的转录水平和表达量最高，而在蛾时期的转录水平和表达量最低， 在家蚕五龄幼虫各组织中，b m y c a c r 基因的转录水平由高到低依次为睾丸、气管、脂肪体、 卵巢、表皮、肠、血、马氏管、丝腺、头部；在五龄幼虫的各组织中，该蛋白在睾丸、马! 氏管、气管、卵巢、表皮、肠和脂肪体中均有表达，而在头部、血和丝腺中未检测到阳性 信号。亚细胞定位结果表明，b m y c a c r 蛋白在家蚕b m n 细胞的细胞核和细胞质中均有分 布，但在靠近质膜区域检测到较强的荧光信号。为以后研究该蛋白的功能特性奠定了基础。 关键词家蚕；b m y c a c r ；荧光定量p c r ；亚细胞定位 浙江理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t y c a c rp r o t e i nc o n t a i n sac o n s e r v e dy c a c r e l a t e dd o m a i n , b e l o n g i n gt oi s o c h o r i m a t a s e s u p e r f a m i l y i ti sp r e d i c t e dt h a tt h ef u n c t i o no fy c a c r e l a t e dp r o t e i ni ss i m i l a rt oi s o c h o r i m a t a s e ， b u tt h es p e c i f i cs u b s t r a t ea n db i o l o g i c a lf u n c t i o ni su n c l e a r a u n i q u en e wb o m b y xm o r ie d n aw a si d e n t i f i e df r o mt h ee d n al i b r a r yc o n s t r u c t e db yo u r l a b o r a t o r ya f t e rb l a s tb a s e do nn c b id a t a b a s e t h eg e n ew a sn a m e db m y c a c r ( b o m b y xm o r i b m y c a c r ) a n d t h ea c c e s s i o nn u m b e ro fb m y c a c ri sg u 2 9 2 7 9 4 i te n c o d e sf l p r o t e i nc o n t a i n i n g ac o n s e r v e dy c a c r e l a t e dd o m a i n t h ep r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h ti sa p p r o x i m a t e l y2 2 8 3 8k d w ec l o n e dt h eo r fo ft h i s g e n ei n t ot h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 2 8 a ( + ) a n d e x p r e s s e di ti ne c o l ir o s e t t a ( d e 3 ) a f t e ri n d u c e dw i t hi p t c 弓t h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a s s u c c e s s f u l l ye x p r e s s e d a f t e rb e i n gp u r i f i e dw i t hm a g n e th i s t mn i p a r t i c l e s ，t h ef u s i o np r o t e i n w a su s e dt oi m m u n i z eam a l en e wz e a l a n dr a b b i t t h e n ，p o l y c l o n a la n t i b o d yw a sh a r v e s t e d ；t h e t i t e ro ft h ep o l y c l o n a l a n t i b o d yr e a c h e d 1 ：6 4 0 0m e a s u r e db ye l i s a w eu s e dt e a l t i m e f l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep c ra n dw e s t e r nb l o tt oc o m p a r et h et r a n s c r i p t i o n a la n de x p r e s s i o n l e v e lo fb m y c a c rm r n ai nd i f f e r e mt i s s u e so ft h ef i f t hi n s t a rl a r v aa n dd i f f e r e n ts t a g e so f s i l k w o r m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et r a n s c r i p t i o n a la n de x p r e s s i o nl e v e lo f b m y c a c rg e n ei n f o u rs t a g e so fs i l k w o r mw a sh i g h e s ti nt h ee g g ，a n dl o w e s ti nt h em o t h i nf i f t hi n s t a rl a r v a , t h e t r a n s c r i p t i o n a ll e v e lo fb m y c a c rg e n ew a sf o u n di nd i f f e r e n tl a r v a st i s s u e sf o l l o w i n gf r o mh i g h t ol o w ：t e s t i s ，t r a c h e a , f a tb o d y ，o v a r y ，e p i d e r m i s ，g u t ，b l o o d ，m a l p i g h i a nt u b u l e ，s i l kg l a n d sa n d h e a d w e s t e r nb l o ta n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h eb m y c a c rw a se x p r e s s e di nf a tb o d y ，t r a c h e a , e p i d e r m i s ，g u t ，o v a r ya n dm a l p i g h i a nt u b u l e ，b u tn o td e t e c t e di nh e a d ，b l o o da n ds i l kg l a n d s i m m u n o c y t o c h e m i s t r yi nb m nc e l l ss h o w e dt h a tb m y c a c re x i s t e di nt h en u c l e u sa n d c y t o p l a s m ，a n dm o s tp r e s e n t e di nt h er e g i o nn e a rt h ec e l lm e m b r a n e i tl a i dag o o df o u n d a t i o n f o rf u r t h e rs t u d i e so nt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no f b m y c a c rg e n e k e yw o r d s ：b o m b y xm o r i ；b m y c a c r ；r e a l - t i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep c r ；s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n i l 浙江理工大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t 1 1 缩略语1 第一章文献综述2 弓l 言2 1 异分支酸酶( 1 s o c h o r i s m a t a s e ) 超家族2 1 1 烟酰胺酶家族2 1 2 烟酰胺酶相关的氨基水解酶家族2 1 3 氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶家族2 1 4 异分支酸酶家族3 1 5y c a c 相关基因产物家族3 2y c a c 及其相关蛋白3 2 1y c a c ! 蠹f ! j ：； 2 2y c a c r 蛋f 刍4 2 3y c a c r 蛋白的进化树6 3 展望7 第二章实验设计方案一8 l 实验目的和意义8 2 研究内容：8 3 实验流程图8 第三章生物信息学分析1 0 1 生物信息学分析工具1 0 2 分析流程及结果l o 2 1b m y c a c r 基因的基本信息：1 0 2 2b m y c a c r 蛋白疏水性分析1 l 2 3b m y c a c r 蛋白信号肽预测1 2 2 4b m y c a c r 蛋白跨膜区分析1 2 2 5b m y c a c r 蛋白定位预测一1 3 2 6b m y c a c r 蛋白功能位点的预测13 2 7b m y c a c r 蛋白二级结构的预测14 2 8b m y c a c r 蛋白高级结构的预测14 3 讨论1 5 第四章家蚕b m y c a c r 基因的原核表达1 7 l 材料与试剂l7 1 1 材料17 1 2 订购试剂。l7 1 3 主要试剂的配制1 7 2 方法2 0 2 1p c r 扩增目的片段2 0 2 2 凝胶| 口】收、纯化p c r 产物。2 l 2 3 目的片段与p e t 2 8 a ( + ) 载体双酶切与回收2 2 2 4 连接反应2 2 2 5c a c l 2 法制备ec o l it g1 感受态细胞2 2 l i l 浙江理工大 2 6 连接产物的转化 2 7 重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) - b m y c a c r 的筛选与鉴定2 3 2 7 1 挑斑与质粒抽提2 3 2 7 2p c r 鉴定2 3 2 7 3 双酶切鉴定2 4 2 8b m y c a c r 基因的表达。2 4 2 8 1c a c l 2 法制备ec o r o s e t t a 感受态细胞2 4 2 8 2 重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) - b m y c a c r 的筛选与鉴定2 4 2 8 3h i s 融合蛋白在大肠杆菌中的表达2 4 2 8 4 蛋白凝胶电泳检测。2 5 3 结果2 6 3 1p c r 扩增目的基因2 6 3 2 重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) - b m y c a c r 的鉴定2 7 3 3h i s 融合蛋白的表达2 7 4 讨论：1 8 第五章融合蛋白的纯化及抗体制备2 9 1 材料与试剂2 9 1 1 材料2 9 1 2 订购试剂2 9 1 3 主要试剂的配置2 9 2 方法3l 2 1 融合蛋白的纯化一3 l 2 1 1 融合蛋白的大量表达与样品制备一3 l 2 1 2n i n t a 柱纯化融合蛋白。31 2 1 3b r a d f o r d 法检测蛋白浓度3 2 2 2 多克隆抗体的制备3 2 2 2 1 抗原的制备3 2 2 2 2 免疫新西兰兔3 2 2 2 3 多克隆抗血清的制备3 2 2 3 间接e l l s a 法测定抗体效价3 3 2 4 抗体特异性检测3 4 3 结果3 5 3 1 融合蛋白的纯化3 5 3 2 质谱分析3 5 3 3 间接e l l s a 法测定抗体效价：3 6 3 4w e s t e r nb l o t 检测抗体的特异性3 6 4 讨论3 7 第六章b m y c a c r 蛋白的表达分析3 9 l 材料与试剂3 9 1 1 材料3 9 1 2 试齐u 3 9 1 3 主要试剂的配制：3 9 2 方法4 0 2 1 总r n a 的提取4 0 2 2d n a 酶消化4 0 i v 浙江理工大学硕 2 3c d n a 第一链的合成 2 4 荧光定量p c r 。 2 4 1 荧光定量p c r 引物的设计 2 4 2 荧光定量p c r 反应体系： 2 4 3 荧光定量p c r 数据分析 2 5 家蚕五龄幼虫不同组织总蛋白的提取 2 6w e s t e r nb l o t 检测b m y c a c r 蛋白的分布4 3 3 结果4 4 3 1 家蚕发育过程中b m y c a c rm r n a 转录水平分析4 4 3 2 家蚕五龄幼虫各组织中b m y c a c rm r n a 转录水平分析4 5 3 3 家蚕不同发育时期b m y c a c r 蛋白表达量的比较4 7 3 4 家蚕五龄幼虫各组织中b m y c a c r 蛋白表达量的比较4 7 4 讨论4 8 第七章亚细胞定位。5 0 1 材料与试剂5 0 1 1 材料5 0 1 2 试剂5 0 1 3 试剂配制5 0 2 方法5 0 3 结果5l 4 讨论5 2 l 墙论! ；：； 参考文献5 4 致谢! ；7 v 浙江理工大学硕士学位论文 a p b s a a m m o n i u mp e r s u l f a t e a l b u m i n ，b o v i n e ，f r a c t i o nv 缩略语 b m y c a c r b o m b y xm o r iy c a cr e l a t e dp r o t e i n d a p i 2 ( 4 一a m i d i n o p h e n y l ) - 6 一i n d o l e c a r b a m i d i n e d i h y d r o c h l o r i d e e d l l a e l l s a e s t f c a f i a h r p i p t g k a n c m n c b i o r f p c r p m s f e t h y l e n ed i a m e m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 过硫酸铵 牛血清白蛋白 家蚕y c a c r 蛋白 4 , 6 联脒2 苯基吲哚 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附实验 e x p r e s s e ds e q u e n c et a g 表达序列标签 f r e u n d sc o m p l e t ea d j u v a n t f r e u n d si n c o m p l e t ea d j u v a n t 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 辣根过氧化物酶 i s o p r o p y l t h i o - p d g a l a c t o s i d e k a n a m y c i n c h l o r a m p h e n i c o l 异丙基硫代p - d - 半乳糖苷 卡那霉素 氯霉素 n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n美国国立生物技术信息中心 o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e 开放阅读框 聚合酶链式反应 苯甲基磺酰氟 s d s - p a g es o d i u md o d e c y ls u l f a l t ep o l ya c r y l a m i d e 十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺 g e le l e c t r o p h o r e s i s t f at r i f l o u r o a c e t i ca c i d 凝胶电泳 三氟乙酸 浙江理工大学硕士学位论文 第一章文献综述 引言 b m y c a c r 是在家蚕中发现的一个y c a c r 蛋白，含有一个y c a c r e l a t e d 保守结构域，目 前对y c a c r 蛋白的研究很少，推测其和y c a c 蛋白一样是假定的酰胺水解酶，具有代谢酶 功能，但功能未知【1 1 。 异分支酸酶超家族包括五个亚家族【2 】：烟酰胺酶( n i c o t i n a m i d a s e ) ，烟酰胺酶相关的 氨基水解酶( n i c o t i n a m i d a s e r e l a t e da m i d o h y r d r o l a s e s ) ，氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶 ( n - c a r b a m o y l s a r c o s i n ea m i d o h 3 r d r o l a s e ( c s h a s e ) ) ，异分支酸酶( i s o c h o r i s m a t a s e ) 和细菌 中发现的未知功能的大肠杆菌y c a c 相关基因产物家族。目前，烟酰胺酶相关的氨基水解 酶和y c a c 相关蛋白的功能仍然未知，但是预测它们可能具有未知底物的水解酶活性【1 1 。 1 异分支酸酶( i s o c h o r i s m a t a s e ) 超家族 异分支酸酶超家族包括五个亚家族，尽管这些亚族在氨基酸序列上相似性很低，但是 在高级结构上有较高的相似性，都含有非常保守的活性氨基酸残基。 1 1 烟酰胺酶家族 ： 烟酰胺酶又被称为吡嗪酰胺酶( p y r a z i n a m i d a s e ) ，在原核生物体内广泛表达【3 _ 4 1 ，能够 将烟酰胺分解为烟酸和氨，也可以合成n a d ；同时该酶能够将肺结核药物吡嗪酰胺转变成 活性的吡嗪酸5 ，6 1 ，目前对吡嗪酰胺酶的研究较多，据推测c y s l 3 8 是它的活性氨基酸残基 1 7 一。 1 2 烟酰胺酶相关的氨基水解酶家族 该家族的酶具有其他氨基水解酶催化活性的氨基酸残基，但是其具体的生物功能还不 清楚川。 1 3 氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶家族 该家族是这个超家族中第一个被广泛研究的亚家族，该家族的主要成员在活性位点都 有一个保守的半胱氨酸残基，因此这类家族最开始时被称为半胱氨酸水解酶( c y s t e i n e h y d r o l a s e ) 超家族，但是这个保守的半胱氨酸残基并不是在所有的异分支酸酶超家族中保 2 浙江理工大学硕士学位论文 守 9 1 。氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶的功能是将微生物体内的氨甲酰肌氨酸水解生成肌氨酸， 二氧化碳和氨，并最终降解为甘氨酸【1 0 1 。1 9 9 6 年，z a j c 等通过x 射线技术得到了c s h a s e 蛋白与抑制剂相结合的晶体结构，并推出了该酶的活性催化位点，c y s l 7 7 是它的活性氨基 酸残基，在活性位点附近1 7 2 位a l a 和1 7 3 位t h r 形成一个顺式肽键，可能是与其他蛋白 相互结合的位点【1 2 】。 1 4 异分支酸酶家族 异分支酸酶能够水解催化异分支酸生成2 ，3 二羟苯酸盐和丙酮酸盐，该亚家族还包括 很多未知功能的蛋白质【1 3 】。从绿脓假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 中分离出来的p h z d 就属于一种异分支酸酶类，该酶参与吩嗪的生物合成过程【1 4 。6 】，吩嗪类化合物是重要的毒 性因子，在细胞内可作为电子载体1 7 1 。从大肠杆菌中分离得到的e n t b 1 8 2 0 】也是异分支酸酶 的一种，是肠菌素生物合成过程的第二个步骤的关键酶类【2 l 】。 1 5y c a c 相关基因产物家族 y c a c 蛋白最先发现于大肠杆菌中，是从大肠杆菌d m s o 还原酶( d i m e t h y l s u l f o x i d e r e d u c t a s e ) 的基因组( d m s a b c ) 及其周围区域测序时发现的开放阅读框2 2 1 。据推测该家 族的蛋白与其他氨基水解酶一样具有催化活性的氨基酸残基，但是其具体的生物功能还不 清楚。 ： 虽然，异分支酸酶超家族的亚家族之间亚基形成的一级氨基酸序列相似性不高，可是 他们的三级结构却非常相似，并且活性位点的主要特征极为保守【2 。该超家族的成员主要 有两个共同的特征【1 】：一是异分支酸酶超家族的几个亚家族成员都具有发挥生理功能所必 需的活性氨基酸残基d 1 9 ，k ( r ) 8 4 和c 1 1 8 ( 1 y a c ，按大肠杆菌y c a c 中标号) ，二是 该超家族成员的高级结构的活性位点区均含有一个罕见的非脯氨酸的顺式肽键结构 ( n o n p r o l i n ec s p e p t i d eb o n d ) ，可能是用于底物结合的部位。 2y c a c 及其相关蛋白 2 1y c a c 蛋白 1 9 8 8 年，b i l o u s 等从大肠杆菌中发现了y c a c 蛋白( y c a cp r o t e i n ) ，生物信息学比对 未发现有同源序列。19 9 8 年，c o l o v o s 等通过x 射线衍射技术得到了大肠杆菌y c a c 蛋白 的晶体结构2 3 1 ，结果显示：大肠杆菌的y c a c 蛋白是一个同源八聚体的复合物，四个亚基 先形成同源的四聚体，然后两个四聚体上下堆积形成对称的八聚体，两层的四聚体结构形 浙江理工大学硕士学 成了一个圆柱形的桶状，中间形成一个很大的空穴 生理状态下是以八聚体形式存在口4 1 。 图1 1 大肠杆菌y c a c 蛋白的晶体结构吲 f i g 1 1c r y s t a ls t r u c t u r eo fy c a cf r o me 2 3 】 ( a ) y c a c 蛋白的八聚体的球体结构显示图( 顶面观) ( b ) y c a c 蛋白的八聚体的条带结构显 示图( 顶面观) ，星号表示临近两个单体亚单位之间的活性位点 以y c a c 蛋白的单体为探针搜索p d b 结构数据库发现虽然y c a c 与氨甲酰肌氨酸酰胺 水解酶的序列相似性很低，但这两个蛋白的高级结构的中间部分折叠模式非常保守， c s h a s e 的假定的活性位点为c y s l7 7 与y c a c 蛋白的c y s l l 8 残基在空间上具有对应的关系； c s h a s e 的顺式肽键位于1 7 2 ( a l a ) 和1 7 3 ( t h r ) 位氨基酸残基之间，这与y c a c 蛋白的 1 1 3 ( v a l ) 和1 1 4 ( v a l ) 位氨基酸残基之间形成的顺式肽键空间结构相似1 2 5 。同时发现 y c a c 与烟酰胺酶和异分支酸酶的空间结构在1 0 0 1 4 0 位氨基酸残基处的同源性较高，尤其 是保守的c y s l1 8 r 2 6 2 7 】。推测y c a c 蛋白也许能够行使类似异分支酸酶和烟酰胺酶的功能。 所以现在普遍认为y c a c 蛋白是假定的同源八聚体的氨基水解酶，属于异分支酸酶超家族， 催化类似异分支酸酶的反应，但是具体底物和生物学功能尚不清楚。 2 2 y e a c r 蛋白 y c a c r 蛋白含有一个y c a cr e l a t e d 保守结构域，l i a n g 等用文昌鱼y c a c r 蛋白作为探针， 搜索g e n b a n k 数据库寻找同源序列发现从高等生物( 人和动物等) 到细菌体内都存在着假 定的y c a c r 序列。用各种物种的假定y c a c r 序列与大肠杆菌y c a c 蛋白之间进行多序列比 对，发现y c a c r 蛋白与y c a c 蛋白都含有保守的可能的酶活性催化三联体( c a t a l y t i ct r i a d ) ： d 1 9 、r ( k ) 8 4 和c 1 1 8 和保守的非脯氨酸的顺式肽键【1 】( 图1 2 ) 。 4 浙江理工大 图1 2b m y c a c r 蛋白与其他物种y e a c r 蛋白之间进行多序列比对1 】 f i g 1 2a l i g n m e n to f t h ea m i n oa c i ds e q u e n c e so fb m c a c r w i t ho t h e ry c a c r p r o t e i n sf r o md i f f e r e n t s p e c i e s 1 】 大肠杆菌y c a c 蛋白的二级结构标注于序列顶部，箭头表示卷曲，圆柱表示a 螺旋，v 表示活性位点氨 基酸残基，表示形成保守顺式肽键位点的两个氨基酸残基。 上面的物种包括有：人( h o m os a p i e n s ，h s ，a a h 0 8 3 6 7 ) ；猴子( m a c a c am u l a t t a ，m m ， x p 一0 0 10 8 8 0 5 7 ) ；狗( c a n i sf a m i l i a r i s ，c f , x p 一8 5 0 7 61 ) ；大鼠( r a t t u sn o r v e g i c u s ，甩 x p 一0 0 10 5 9 3 4 4 ) ；爪蟾( x e n o p u sl a e v i s ，x 1 ，q 5 p q 71 ) ；文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ，b b ， a a t 3 9 4 2 0 ) ；海胆( s t r o n g y l o c e n t r o t u sp u r p u r a t u s ，s p ，x p 一7 9 5 0 6 4 ) ；果蝇( d r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ，d m ，n p 一6 5 18 6 9 ) ；家蚕( b o m b y xm o r i ，b m ，n p 一0 0 10 4 0 5 4 1 ) ；线虫 ( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ，c e ，n p 一5 0 2 315 ) ；大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ，e c ，1y a c ) ；菌 ( p s e u d o m o n a s p u t i d ak t 2 4 4 0 ，p p ，n p 一7 4 5 9 3 6 ) ；绿脓假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ， p a , n p2 5 2 5 3 5 ) ；奥奈达希瓦氏菌( s h e w a n e l l ao n e i d e n s i s ，s o ，n p7 1 6 3 9 3 ) 。 从上图可以看出b m y c a c r 与大肠杆菌的y c a c 蛋白和其他假定的y c a c r 序列都存在与 气 帖帅昨胁壮印卟哳嘶睫弛即铀陌 j窖昨嘶壮印卟哳嘶睡n叩铀 峙帅肝觚壮邛帖嘶嘶恤|：即铀n 肚帅昨胁n印陆嘶嘶驰n叩铀h s 口口s h r pdlk二一 口田囡图母一u母h口二二 圊麓陛震 s s s s 5 5 7 日9 u 、9 b o 9 b 8 b 8 8 b o 3 2 8 1 1 3 2 器器等盆嚣嚣凳 ；器器甚；嚣嚣 卜h#*嚣嚣嚣# 浙江理工大学硕士学位论文 推测的y c a c 蛋白可能的保守的催化活性位点相同的氨基酸残基，即酶催化活性的 ( d 、k 、c ) ，并且在i 和e ( 黑点表示) 两个氨基酸残基之间能够形成保守的非脯 顺式肽键。 2 3y c a c r 蛋白的进化树 l i a n g 等【1 】构建了异分支酸酶超家族的五个亚家族的代表性序列与y c a c r 蛋白的 化树( 如图1 3 ) 。 图1 3 不同物种中y c a c r 及异分支酸酶超家族其它成员蛋白质的系统进化树1 1 1 f i g 1 3u n r o o t e dp h y l o g e n e t i ct r e ec o n s t r u c t e du s i n gb b y c a c rp r o t e i n s ，p u t a t i v ey c a c rp r o t e i n sa n d r e p r e s e n t a t i v e5s u b f a m i l i e sp r o t e i n so f t h ei s o c h o r i s m a t a s es u p e r f a m i l y 1 】 n r 代表烟酰胺酶家族；n a m a s e 代表烟酰胺酶相关的氨基水解酶家族；c s h a s