（分析化学专业论文）新型纳米金胶和dna酶的传感技术对核酸和蛋白检测的应用研究.pdf

2 0 10 d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e r s c h o o lc o d e ：1 0 2 6 9 s t u d e n t sn u m b e r ：5 1 0 7 0 6 0 6 0 2 8 e a s tc h i n an o r m a l u n i v e r s i t y s t u d y o nt h ec o l o r i m e t r i ca n de l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n f o rs n p sa n dt h r o mb i np r o t e i nb a s e do na u n a n o p a r t i c l e s a n dg - q u a d r u p l e x - - b a s e dd n a z y m e s d e p a r t m e n t ： m a j o r ： r e s e a r c hf i e l d ：e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s s u p e r v i s o r ： p r o f e s s o rh ep i n g a n g , f a n gy u z h i s t u d e n t sn a m e ： s h 塾垦i i 丛塾 a p r i l ，2 010 ，s h a n g h a i 华东师范大学学位论文原创性声明 i i i i ii iii ii i ii ii ii i iiii | y 17 4 18 8 9 郑重声明：本人呈交的学位论文新型纳米金胶和d n a 酶的传感技术对核酸和蛋白 检测的应用研究，是在华东师范大学攻读硒匆博士( 请勾选) 学位期间，在导师的指 导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：也塑丕日期：沙f 口年牛月圩日 华东师范大学学位论文著作权使用声明 新型纳米金胶和d n a 酶的传感技术对核酸和蛋白检测的应用研究系本人在华东 师范大学攻读学位期间在导师指导下完成的碌孟博士( 请勾选) 学位论文，本论文的 研究成果归华东师范大学所有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使用此学位 论文，并向主管部门和相关机构如国家图书馆、中信所和“知网”送交学位论文的印刷 版和电子版；允许学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查阅、借阅；同意学校 将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题 和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) ( ) 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部”或“涉密学位论文木， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( ) 2 不保密，适用上述授权。 导师签名本人签名邋墨 加l o 年千月辫日 木“涉密”学位论文应是已经华东师范大学学位评定委员会办公室或保密委员会审定过的学位 论文( 需附获批的华东师范大学研究生申请学位论文“涉密”审批表方为有效) ，未经上 述部门审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用 上述授权) 。 沈碧墨硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 徐通敏教授华东师范大学主席 王清江教授华东师范大学委员 楚清脆副教授华东师范大学委员 论文摘要 新型纳米金胶和d n a 酶的传感技术对核酸和蛋白检测的应用 研究 论文摘要 随着人类基因组计划( h g p ) 的顺利完成和后基因组时代的到来，基因诊断已经 成为分子生物学和生物技术研究的重要领域。脱氧核糖核酸( d n a ) 是生命体内的基 因物质，具有传递遗传信息等功能，若在结构上稍有变动、差错、缺失或增多，就 可能会导致遗传性状的改变或各种疾病的出现，因此对d n a 的分析检测有助于生命 科学的研究、生命活动和信息传递规律的调节。蛋白质是一类重要的生物标志物， 它的分析检测在生物学、医学诊断等领域具有非常重要的意义。如果基因突变在外 显引起有功能意义的突变，会导致所编码的蛋白质的表达、结构和功能的发生改变， 从而影响人类的生命活动，导致基因疾病的产生。生命科学的飞速发展对基因和蛋 白的检测提出越来越高的要求，开发出更灵敏，稳定和简便的生物检测技术是目前 生命科学研究的热点所在。而新兴发展的以w a t s o n c r i c k 碱基互补配对原则为基础 的d n a 生物传感器为分子生物学研究提供了全新的基因检测技术，受到生物分析工 作者的高度重视。 分子信标的提出正是建立在d n a 碱基互补配原则的基础上，以其独特的茎环 结构，在选择性、灵敏度和特异性方面更加优于普通的直链探针，因此其在基因检 测领域的应用越来越广泛。迄今为止，经过研究者们不断地改进，分子信标的功能 更足得到了快速的发展，在p c r 实时监控、基因突变快速分析、活体细胞动态分析 及d n a 与蛋白质相互作用研究等各种领域中开辟了新的途径。 纳米技术的出现为生物传感器的发展提供了无穷想象的空间，基于纳米金胶的 比色传感技术以其方便、快速和肉眼可见的优势在d n a 生物传感器中得到了广泛 的应用。纳米金胶的良好的生物相容性、简单的合成条件、大的比表面积、低廉的 成本以及所具有的特殊的光学性质为比色技术的发展注入了强大的生命力，提高了 比色检测的灵敏度和稳定性。 随着核酸研究的深入和体外筛选技术( s e l e x ) 的建立，核酸适体技术使抗原抗 体的反应发生了新的革命性变化，在蛋白组学到来的时代以其众多的优越性弥补并 逐渐替代抗体在蛋白检测中的应用。电化学核酸适体传感器结合了电化学高灵敏度、 论文摘要 轻巧便宜、携带方便、耗能少、易微型化等优势和核酸适体对蛋白的高结合力和特 异性更是成为当今生物学医学领域的前沿性课题和方向。 g 四分体结构的d n a 酶也是基于核酸适体配体的思想通过s e l e x 技术筛选 出来的一种新型的d n a 酶。它是一类卟啉铁与其适体构成的具有g 四分体结构的 仿辣根过氧化酶的配合物，适体为一段富含g 碱基的寡聚核苷酸序列。自1 9 9 8 年， s e n 小组提出这类d n a 酶以来，它高灵敏的催化性质、易于构建、易于合成的优点， 在比色和电致发光中得到了极大的发展。 本文的创新之处就是利用了纳米金胶，d n a 酶等简单易操作，并且廉价的的各 种技术结合，建立多种检测核酸和蛋白的传感器，发展了新的基因诊断技术手段。 论文主要内容如下 。 第一章绪论 s e l e x 技术的发展促进了核酸适体的发展，这其中也包括g 四分体结构的 d n a 酶发展。本章首先介绍了d n a 生物传感器尤其是电化学核酸适体传感器、分 子信标技术及纳米金胶在比色检测中的分类和应用，着重介绍了分子信标技术， d n a 酶等的发展及应用，阐明了本论文研究的理论基础和选题依据。最后提出本论 文的目的意义及创新之处。 第二章分子信标标记的纳米金胶比色探针对寡聚核苷酸序列单碱基多态性的识别 分子信标( m b ) 是一种相比于普通直链探针更灵敏地能检测单碱基错配的茎环 结构的探针，因此广泛被应用在各种基因突变的检测上。本文介绍了一种利用分子 信标高灵敏、高特异性识别力和纳米金凝聚变色的光学特性，设计的新型的识别单 碱基多态性的比色检测方法。利用纳米金胶的自组装技术将巯基修饰的分子信标探 针固定到金胶表面制得新型纳米金胶探针( a u n p s m b ) ，当加入不同的目标序列( 完 全互补序列或单碱基错配序列) 与之杂交时，使金胶表面构象改变及引起金胶体系 熵焓的差异性：即在适当盐度条件下，导致金胶不同程度的聚集，从而实现对单碱 基错配几率和不同位点的识别。最后，将该比色传感体系应用在对p 5 3 基因的检测 上，同样能够有效区分野生型和突变型p 5 3 基因，实现对单碱基多态性的识别。实 验结果显示，利用该金胶比色方法，操作简单，成本低廉，对单碱基错配在混合目 论文摘要 标体系中的分辨率能达到至少5 。 第三章基于g 四分体结构的d n a 酶电化学核酸适体传感器信号扩增检测凝血酶 本文构建了一种结合核酸适体技术和d n a 酶的特性，以凝血酶蛋白作为研究 对象的高效、高灵敏度、特异性识别蛋白质的电化学催化检测的方法。凝血酶的核 酸适体是一段富含g 碱基的寡聚核苷酸序列，它被证实能与卟啉铁配位形成一定的 g 四分体结构，当其结合目标凝血酶时，该结构就会进一步转化成牢同的d n a 酶 超分子结构，表现出与辣根过氧化酶相似的催化特性，能对双氧水进行很强的催化 氧化，从而应用在电化学上对双氧水的催化氧化来检测凝血酶蛋白。该方法通过将 d n a 酶固定在金电极表面，结合电化学的高灵敏度，在有双氧水存在的情况下，得 到催化电流与凝血酶浓度对数值在l x l 0 1 0 l 1 0 6m o l l 范围内线性相关，检测限 可以达到6 x 1 0 - m o l l 相关系数为r = 0 9 9 4 ，对凝血酶蛋白的检测限可达到 6 l 0 0 1 m 。并且该方法对凝血酶蛋白具有很好的特异性，其它蛋白如牛血清白蛋白、 溶菌酶等均对凝血酶的检测基本无干扰。此新型的生物传感器制备简单，灵敏度和 特异性高，为凝血酶的检测提供了一种新的手段。 关键词：s n p s ，纳米金胶，分子信标，p 5 3 ，电化学催化，d n a 酶，核酸适体 m a b s t r a c t s t u d yo nt h ec o l o r i m e t r i ca n d e l e c t r o c h e m i c a lf o rs n p sa n d t h r o m b i nd e t e c t i o nb a s e do na u n a n o p a r t i c l e sa n d g q u a d r u p l e x - - b a s e dd n a z y m e s a b s t r a c t a st h eh u m a ng e n o m ep r o j e c th a su n c o v e r e dt h ef u l ls e q u e n c eo fh u m a ng e n o m e s ， t h ea n a l y s i so ft h ev a r i a t i o n sa m o n gi n d i v i d u a l g e n o m e sh a sa t t r a c t e dc o n s i d e r a b l e i n t e r e s t i naw i d er a n g eo fa r e a s i n c l u d i n gm o l e c u l a rd i a g n o s t i c s , e n v i r o n m e n t a l m o n i t o r i n g ，a n da n t i b i o t e r r o r i s m p r o t e i ni sat y p eo fi m p o r t a n tb i o m a r k e r s ，w h i c hp l a y sa k e yr o l ei nl i f es c i e n c e s ，m e d i c a ld i a g n o s t i c s m a n yd e t e c t i o nt e c h n i q u e sh a v eb e e n d e v e l o p e dr e l y i n gu p o nt a r g e th y b r i d i z a t i o nw i t hr a d i o a c t i v e ，w h i c hc r e a t ed i s p o s a l p r o b l e m s ，r e q u i r es p e c i a l l yt r a i n e dp e r s o n n e la n dh a v eas h o r t s h e l fl i f e t h e r ei s a c o n s i d e r a b l er e q u i r e m e n tf o rr a p i d ，l o w - c o s t ，a n ds e n s i t i v ed e t e c t i o no fs p e c i f i cd n aa n d p r o t e i nf o rt h ec l i n i c a ld i a g n o s i so fg e n e t i ca n dp a t h o g e n i cd i s e a s e d d n ab i o s e n s o r , a n e wc o n c e p t i o no fg e n o m ed e t e c t i o nb a s e do nw a t s o n c r i c kb a s em a t c hp r i n c i p l e ，i so f g r e a ta d v a n t a g e ss u c ha se a s yh a n d l i n g ，q u i c kd e t e c t i o n ，f a v o r a b l es e l e c t i v i t ya n dn o p o l l u t i o n n o w a d a y s ，i th a sb e c o m eo n eo ft h em o s t i m p o r t a n tm e t h o d si nd n a d e t e c t i o n o n er e c e n td e v e l o p m e n ti sm o l e c u l a rb e a c o n s ( m b s ) t h a ta r eh i g h l ys e l e c t i v ei n t h e i r r e c o g n i t i o n o fo l i g o n u c l e o t i d e s t r a d i t i o n a lm b sa led o u b l ye n d - l a b e l e d o l i g n u c l e o t i d e st h a t e x i s t i ns o l u t i o n sa ss t a b l e s t e m - l o o p s t r u c t u r e sa n du t i l i z e f l u o r e s c e n c eo far e p o r t e rd y ec o m b i n e dw i t hap r o x i m a t eq u e n c h e ra t t a c h e dt o3 e n d m b sa r en o we x t e n s i v e l ye m p l o t e di na r e a ss u c ha s g e n e t i cs c r e e n i n g ，b i o s e n s o r d e v e l o p m e n ta n dt h ed e t e c t i o no fs i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) t oa c h i e v et h ed e s i r e ds i m p l i c i t y , l o w c o s ta n ds e n s i t i v i t y , c o l o r i m e t r i cd e t e c t i o n u s i n gg o l dn a n o p a r t i c l e s ( a u n p s ) h a sb e e na t t r a c t i n gc o n s i d e r a b l ei n t e r e s t s ，b e c a u s e a u n p sa g g r e g a t i o na c c o m p a n i e db yt h es u r f a c ep l a s m o ns h i f tc a nb ec l e a r l yr e c o g n i z e d w i t ht h en a k e de y e t h ee a s eo fs y n t h e s i z i n go fa u n p sa n dt h ep o s s i b i l i t yt oc o u p l eo f a b s t r a c t d i f f e r e n tf u n c t i o n a l i t i e sm a k ea u n p sa sac o n v e n i e n tt o o lf o rt h es e n s i n go fm e t a li o n s ， p r o t e i n sa n do l i g o n u c l e o t i d e s a p t a m e r sa r es y n t h e t i cd n a r n ao l i g o n u c l e o t i d e si s o l a t e df o rt h e i ra b i l i t yt o s e l e c t i v e l yb i n dt ov a r i o u sb i o m o l e c u l e st h r o u g hs e l e x a sa l t e r n a t i v et oa n t i b o d i e s ， a p t a m e r s h a v e m a n ya d v a n t a g e si n c l u d i n gh i g h b i n d i n ga f f i n i t y , c o n v e n i e n t a u t o m a t e d s y n t h e s i s ，e a s e o fl a b e l i n g ，a n dh i g hs t a b i l i t y u pt on o w , m a n ya p t a s e n s o r s h a v eb e e nd e v e l o p e di n c l u d eo p t i c a la n de l e c t r o c h e m i c a la p t a s e n s o r s e l e c t r o c h e m i c a l a p t a s e n s o r sh a v ea t t r a c t e ds u b s t a n t i a la t t e n t i o nb e c a u s eo ft h e i rh i g hs e n s i t i v i t y , s i m p l e i n s t r u m e n t a t i o n ，l o wp r o d u c t i o nc o s t , f a s tr e s p o n s ea n dp o r t a b i l i t yi nt h ed e v e l o p m e n to f 印t a s e n s o r s s i n c et h ef i r s tr e p o r tb ys e na n dh i sc o - w o r k e r si n 1 9 9 8 ，g q u a d r u p l e x - b a s e d d n a z y m e sw h i c hh a v ea l s ob e e ni d e n t i f i e db ys e l e xh a sr e c e i v e dg r e a ta t t e n t i o n t h e f o l d e dg u a n i n e - r i c ho l i g o n u c l e o t i d e st h a ts e r v ea sa l la p t a m e rf o rh e m i nc o u l ds e l f a s s e m b l et of o r mg - q u a d r u p l e xs t r u c t u r e a f t e rb i n d i n gw i t hh e m i n ，t h e r e s u l t i n g s u p r a m o l e c u l a rc o m p l e xm i m i c sh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) a n dc a t a l y z e s t h e h 2 0 2 - m e d i a t e do x i d a t i o no f2 ，2 - a z i n o b i s ( 3 e t h y l b e n z o t h i a z o l i n e ) - 6 一s u l f o m ea c i d ( a b t s ) a n dl u m i n a l t h e s eg - q u a d r u p l e x b a s e dd n a z y m e sh a v es h o w ng r e a tp o t e n t i a la sa n o v e lk i n do fc a t a l y t i cl a b e lf o rt h ed e v e l o p m e n to fv a r i o u sb i o s e n s o r so w i n gt oi t sh i g h c a t a l y t i ca c t i v i t y , e a s ys y n t h e s i sa n dc o n s t r u c t i o n t h eg o a lo fp r e s e n ts t u d yi st od e s i g nn o v e lt e c h n i q u e sw i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n d s e l e c t i v i t y t h i sp a p e rh a sc o m b i n e s t h ee x c e l l e n tc h a r a c t e r i s t i c so fa u n p sa n d d n a z y m e st op r o v i d ea l t e r n a t i v ec a n d i d a t e sf o rd n aa n dp r o t e i nd e t e c t i o n t h e d i s s e r t a t i o ni n c l u d e st h r e ep a r t s ： c h a p t e ro n e ：i n t r o d u c t i o n a p t a m e r sa r ea r t i f i c i a lo l i g o n u c l e i ca c i d sw h i c ha r es e l e c t e dt h r o u g hs e l e xt ob i n d s p e c i f i ct a r g e tm o l e c u l e s g u a n i n e - r i c ho l i g o n u c l e o t i d e sa r eo n ek i n do ft h e s ea p t a m e r s w h i c hc a nb i n dh e m i nt of o r mg - q u a d r u p l e x b a s e dd n a z y m e s i nt h eb e g i n n i n go ft h i s v a b s t r a c t d i s s e r t a t i o n ，t h ei m p o r t a n c eo ft h ed n a a n dp r o t e i nd e t e c t i o nw a si n t r o d u c e d ，t o g e t h e r w i t ht h ed e v e l o p m e n to fd n a b i o s e n s o r s e c o n d l y , t h ec o n c e p t sa n da p p l i c a t i o n so f a u n p s b a s e dc o l o r i m e t r i cb i o s e n s i n ge v e n t s ，m o l e c u l a rb e a c o na n de l e c t r o c h e m i c a l a p t a s e n s o r sw e r ed e s c r i b e di nd e t a i lt op r o v i d et h et h e o r e t i c a lp r i n c i p l ef o rt h i sp a p e r a t l a s tt h ep u r p o s ea n di n n o v a t i o no ft h ed i s s e r t a t i o nw e r ep o i n t e do u t c h a p t e rt w o ：l a b e l - f r e em o l e c u l a rb e a c o n - f u n e t i o n a l i z e dg o l dn a n o p a r t i c l e sa s c o l o r i m e t r i cp r o b e sf o r s i n g l e - n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) d e t e c t i o n c o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a ll i n e a rd n ap r o b e ，m o l e c u l a rb e a c o ns h o w sh i g h e r s e l e c t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yd u et oi t sc o n f o r m a t i o nv a r i a t i o n sb e t w e e ns t e m 1 0 0 pa n ds t r e t c h e d s t r u c t u r ei nd e t e c t i o no fm u t a t i o n si no l i g o n u c l e o t i d e s w er e p o r t e dan e wc o i o r i m e t r i c s n p sd e t e c t i o nm e t h o db yc o m b i n i n go p t i c a lp r o p e r t i e so fg o l dn a n o p a r t i c l e sa n d m o l e c u l a rb e a c o nw i t ht h eh i g hs p e c i f i c i t ya n ds e n s i t i v i t y n et h i o l a t e dm o l e c u l a r b e a c o n sw e r ea t t a c h e dt oa u n p sv i aw e l l e s t a b l i s h e ds e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r c h e m i s t r y ap e r f e c t l ym a t c h e dt a r g e ta n dt h es i n g l e - b a s em i s m a t c h e dt a r g e tc a nb e c o m p l e t e l yd i s c r i m i n a t e db yc a u s i n gt h ec h a n g eo fe n t r o p i ca n ds t e r i cc o n f o r m a t i o na t c e r t a i nc o n c e n t r a t i o no fm g c l 2 1 1 1 ec o l o ro ft h eg o l dn a n o p a r t i c l es o l u t i o nc o n t a i n i n g p e r f e c t l ym a t c h e dt a r g e ti sb l u ea n dt h ec o l o ro ft h eg o l dn a n o p a r t i c l es o l u t i o nc o n t a i n i n g s i n g l eb a s em u t a t i o nt a r g e ti sr e d a tl a s t , w ea p p l i e dt h i sm e t h o di np 5 3g e n ed e t e c t i o n t 1 1 er e s u l t si n d i c a t e dt h a ti tw a sp o s s i b l et oa c c u r a t e l yd e t e r m i n es n p sa sl o w 部5 t h e p r o p o s e da p p r o a c hh a sag r e a tp o t e n t i a lf o rr e a l i z i n ga na c c u r a t e ，s e n s i t i v e ，r a p i da n dl o w c o s tm e t h o do fs n p sd e t e c t i o n c h a p t e rt h r e e ：g q u a d r u p l e x - b a s e dd n a z y m e sa p t a s e n s o rf o rt h ea m p l i f i e d e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no ft h r o m b i n an o v e l g - q u a d r u p l e x - - b a s e dd n a z y m e sa p t a s e n s o r f o rt h e a m p l i f i e d e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no ft h r o m b i nh a sb e e nd e s c r i b e d t h ea p t a s e n s o ru t i l i z e da v i a b s t r a c t c o m b i n a t i o no fh e r o i na n dg u a n i n e - - r i c ht h r o m b i n - b i n d i n ga p t a m e r ( t b a ) t of o r mt h e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( r t r p ) - m i m i c k i n gd n a z y m e sw i t hp e r o x i d a s ec a t a l y t i ca c t i v i t y i nt h ep r e s e n c eo ft h r o m b i n ，t h ee n z y m ea c t i v i t yc o u l db ee x t e n s i v e l yp r o m o t e d , t h e r e b y p r o v i d i n gt h ea m p l i f i e de l e c t r o c h e m i c a lr e a d o u ts i g n a l sf o rd e t e c t i n gt h r o m b i n t h i s a p t a s e n s o re x h i b i t e dh i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t yf o rt h r o m b i nd e t e r m i n a t i o n ，w h i c h e n a b l e dt h ea n a l y s i so ft h r o m b i nw i t had e t e c t i o nl i m i to f6 x10 1 1 m o nt h eb a s i so f r e s u l t s ，t h i sm e t h o dw i l ls e r v ea sav e r s a t i l et o o lf o rp r o t e i n sa n do t h e rb i o m o l e c u l e d e t e c t i o n k e yw o r d s ：s n p s ，a un a n o p a t i c l e s ，m o c u l a rb e a c o n , p 5 3 ，e l e c t r o c h e m i c a l c a t a l y s i s ，g - q u a d r u p l e x b a s e dd n a z y m e ，a p t a m e r v 目录 目录 第一章绪论l 一纳米金胶在d n a 生物传感器中的应用2 二分子信标技术的原理和应用”5 1 分子信标的结构和原理6 2 分子信标的应用”7 3 分子信标的展望“1 1 三核酸适体生物传感器及其研究进展“l l 3 1 核酸适体电化学生物传感器的原理1 2 3 2 核酸适体电化学生物传感器的展望1 6 四d n a 酶在蛋白和d n a 检测中的应用1 7 4 1g 四分体d n a 酶的结构和性质1 7 4 2d n a 酶化学发光生物传感器中的应用18 4 3d n a 酶在比色检测中的应用”i8 4 4d n a 酶的展望19 五本论文的目的和意义2 0 1 分子信标标记的纳米金胶比色探针对寡聚核苷酸序列单碱基多态性的识 另u 2 0 2 基于g 四分体结构的d n a 酶电化学核酸适体传感器信号扩增检测凝血酶 2l 参考文献21 第二章分子信标标记的纳米金胶比色探针对寡聚核苷酸序列单碱基多态性的识别 2 6 目录 一 引言2 6 二实验部分2 8 2 1 试剂与仪器2 8 2 2 实验方法”3 2 三结果与讨论”3 4 3 1 金胶表面探针密度的估计3 4 3 2a u n p s m b l 检测体系中m g c l 2 度的影响3 5 3 3a u n p s m b l 的选择性3 7 3 4a u n p s m b l 的s n p s 定量检测”3 9 3 5 对p 5 3 基因的s h i p s 的识别4 l 四 结论4 2 参考文献4 3 第三章基于g 四分体结构的d n a 酶电化学核酸适体传感器信号扩增检测凝血酶 ”j 4 4 一引言4 4 二实验部分4 6 2 1 试剂与仪器。4 6 2 2 实验过程4 7 三结果与讨论4 7 3 1 电化学交流阻抗和循环伏安对传感器的表征4 8 3 2 传感器电化学行为的研究5 0 3 3t b a h e m i n t h r o m b i n 电极的对h 2 0 2 的电催化还原5 2 3 4 凝血酶的定量检测5 3 3 5 传感器对凝血酶检测的特异性5 4 目录 四结论5 5 参考文献5 6 附录”5 8 致谢”6 0 i f 1 第一章绪论 第一章绪论 2 0 0 2 年2 月初，由美国制定并发起的最庞大的基因组研究计划“人类基因组计 划”被报道已完成9 9 的基因序列的测定。从这时起，生物学被重新划分为前基因 组和后基因组两部分，并且以揭示基因组的功能及调控机制为目标的后基因组时代 宣告正式到来。功能基因组研究成果不仅具有巨大的科学意义，而且有着十分光明、 广泛的应用前景【1 捌。基因实质上是d n a 大分子中的各功能片段，不同的基因具有不 同的碱基序列。d n a 分子序列中的微小改变将导致基因突变及多态性，如一个或几 个核苷酸的取代、缺失或插入d n a 序列，就会导致遗传性状的改变或各种疾病的出 现【3 4 】，其中单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s s n p s ) 是频率最高、 信息含量最多的一种变异，占所有多态性的9 0 以上。由于s n p s 具有数量多、分布 广和稳定遗传等特点，跟许多疾病都直接相关，如1 3 一地中海贫血、乳腺癌等肿瘤 等，是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素。因此，s n p s 的灵敏、快速、 方便特异分析检测对于疾病的临床诊断和治疗将起到极其重要的作用。 在人类基因组d n a 中不到1 0 0 0 个碱基就存在一个单碱基突变，如果这种突变发 生在外显引起有功能意义的突变，会导致所编码的蛋白质的表达发生变化，结构和 功能的改变，影响人类的生命活动，导致基因疾病的产生【5 。7 】。对蛋白质结构和功能 的研究不仅能够反应基因的突变，而且将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化 机制，因而蛋白组学是后基因组科学研究的核心内容之一。蛋白质的定量检测是研 究蛋白质的基础，对蛋白质结构和功能研究，人体营养健康研究，疾病诊断以及药 物、食品及临床分析中有重要意义。生命科学的飞速发展对蛋白质的检测提出越来 越高的要求，开发出更灵敏，稳定和简便的蛋白质检测技术是目前生命科学研究的 热点所在。 材料科学、生命科学、电子技术、生物技术等许多新技术的开发，为发展高灵 敏度、高特异性的基因和蛋白的分析检测方法注入了活力，其中基于w a s t o n c r i c k 模型的碱基互补配对原则发展起来的各种d n a 生物传感技术，相比于传统的d n a 凝胶电泳法，d n a 生物传感器免去了放射性标记的危险性，节省了电泳操作的繁杂 性，具有操作简便、快速灵敏、选择性好、无污染等特点，并具有分子识别、分离 纯化基因等功能【蹦1