（外科学专业论文）组织工程心脏瓣膜研究进展.pdf

的组织相容性，可避免血栓形成、凝血和钙化的产生，同时可随 机体的生长而生长，具有自我修复能力，因此其瓣膜的耐久性要 明显由于目前生产的各类生物瓣。组织工程瓣膜的研究和临床应 用 有 广 泛 的 前 景 踌 : : 是 1 1f n il、 分 邢胭“ 要构建组织工程瓣膜，我们首先要对组成瓣膜的各种细胞的 组织形态及在生长过程中各类细胞的相互作用有个全面认识，并 能充分的了解正常瓣膜的结构和功能的关系。 瓣膜是由心内膜构成 内部为致密结缔组织，与心骨骼纤维支 架相连， 外面被覆内 膜，内 膜由 两层细胞组成:内 皮细胞( e c s ) 和 内皮下层的间质细胞( i c s ) 。这两种细胞之间充满细胞外基质 ( e c m) . ( 1 )内皮细胞可以分泌多种血管活性因子，如前列环素 p g 1 2 、组织纤溶酶原t p a 、纤溶酶活化因子抑制物p a i 以 及类肝素 样物质， 参与凝血和抗凝过程6 ) ; e c s 还表达m h c 抗原 和粘附因 子， 分泌内 皮素、一氧化氮等7 -9 ，调控细胞粘附、 迁移以 及血管 的收 缩舒张。 ( 2 ) 间 质细胞主要包括成纤维细胞和肌细胞. 间质细 胞的功能是合成， 分泌， 填充局部结缔组织基质成分.i c s 可以表达 很多基因， 对瓣膜功能 有很重要的 调 节作用1 1 0 1 : 这包括m h c 及肌 钙蛋白，决定收缩功能;卷曲基因家族一 极性因子的表达，决定了 i c s 具有定向性，而不是无序排列;i c s 还表达转录调控因子及一 些代谢酶等 u 。 另外最近研究表明: 间质细胞表面有各种5 - h t 受 体的亚型， 并随血液中5 - h t的水平调节瓣膜活动及细胞外基质的 产生 ” 一 ， i o ( 3 ) 细胞外基质中除具有纤维、 胶原和糖蛋白 外， 还有 细胞分泌的分化因子、生长因子、信号调节因子，e c m通过这些 因子影响细胞的分化和功能特异性。 3 主动脉瓣从组织结构上可分为三层，每层都有相对特异的细 胞外基质( e c m ) 成分。 ( 1 ) g a .即流入面。主要由大量胶原和 其中放射状排列的弹性纤维组成。这种连接瓣膜交界间胶原键和 弹性纤维赋予瓣膜很大的张力。( 2 ) 49 0位于中央，由疏松排 列的胶原和大量的糖胺多糖( g a g s ) 组成。心室部的弹性纤维在瓣 叶关闭时拉伸，使瓣叶得到最大的接合面积; 相反，瓣叶开放，弹 性纤维回缩，瓣叶缩小。瓣叶的这种往复剧烈运动中各层组分间 所产生的剪切力以及瓣叶关闭时产生的震动力都能够被海绵部吸 收分散， 使瓣膜得到缓冲。 ( 3 ) 好s即流出 部。由 平行于瓣叶 游离缘环形紧密排列胶原纤维组成。这些胶原纤维通过调整其间 皱褶的间距保证瓣膜的开启与关闭并防止瓣叶的脱垂。 主动脉瓣的组织结构具有瓣膜结构的共性。主动脉瓣膜由分 层的细胞及高度特异化的细胞外基质组成，各组成成分之间的相 互作用保证了主动脉瓣能够在心动周期的反复剧烈变化中，将压 力有效地转移至主动脉瓣环及相邻的主动脉壁，从而保持其形态 的完整性; 同时也保证了瓣膜的修复和再塑p a d 由 此 可 见， 瓣 膜 各 组 成成 分间 这 种各向 异 性的 排列使 瓣 膜具 有很好的柔韧性，抗拉伸性及顺应性。构建组织工程瓣膜，要模 仿正常瓣膜结构，就不仅要获得一个由内皮细胞及间质细胞组成 的按天然瓣膜组织特异排列的分层结构，同时，有功能活性的细 胞要具有不断更新代谢细胞外基质的能力。 2 .丈突澎群 组织工程支架材料不仅仅是提供单纯的物理三维骨架，同时 它也为组织生长提供模板。目 前，主要有两大类支架材料:1 )生 物降解的高分子聚合物支架。2 )去细胞异种支架。从严格意义上 讲，去细胞异种支架不能降解并最终在体内长出一个新的组织， 因此它不属于组织工程范畴，用它制成的瓣膜为 “ 杂种瓣” ，但由 于 “ 杂种瓣”的构建采用了组织工程学的基本原理，故此它也被 纳入组织工程瓣膜。除了这两类支架材料，还有一些新的设想， 如纤维蛋白 胶支架、 纯细胞支架等 1 5 - 1 6 ， 但这些材料还未用于动物 实验，有待证实。 2 . 1 全数 /w 6 7 :/ /9 分子ma i 丈 用高分子聚合物制成瓣膜支架，在材料学方面具有很大的挑 战。首先，支架材料要有很好的组织相容性，目 前所用到的高分 子支架材料都不能完全做到无免疫原性，无毒性和无炎性反应; 其次，要具有优良的机械性能。它要在体内新生组织完全形成之 前提供足够的机械强度，来抵抗高速流动的血液所带来的压力和 剪切力;同时，材料还要易于加工塑性，利于外科操作，便于消 毒;另外，支架材料和新生组织之间相互作用，调控组织生长。 高分子聚合物构建的 支架在三方面影响着组织的生长发育 e 1 ) 支架本身立体构形是否与正常瓣膜结构相似，从而决定了血液动 力学和免疫特性。2 )材料上孔隙的形状大小调节细胞的迁移与生 长。3 )材料的表面化学性质控制着细胞的粘附 、铺展于基因表 达过程;最后，材料的生物降解速度也是非常关键的特性。支架 的降解应和组织生长速度相匹配。目 前应用于构建支架的高分子 材料主要有以下几种。 2 . 1 ，1 .pg a p lg a 聚轻基乙 酸( p o l y g l y c o l i c a c i d , p g a ) 和乳酸与轻基乙 酸的共 聚物 ( p o l y g l a c t i n l p o l y g l y c o l i c , p l g a ) 是最早用来制造瓣膜支架 的 。 8 - 1 9 1 。 美国 波士顿儿童医院m a y e r 小组 最早于1 9 9 5 年应用p g a 作支架制成单个瓣叶植入动物体内。实验结果表明:p g a具有良 好的组织相容性;在体内生理环境条件下，自 体细胞在植入 8周 后， 在p g a表面生长良好， 分泌形成了如正常组织的细胞外基质。 而 “ 盐析” 技术的应用可以 在高分子材料表面形成8 0 - 2 0 0 u m的孔 隙，更利于细胞的附着生长;p g a 的降解速度比较快，在植入实 验的对照组中，未种植细胞的单纯p g a支架于植入8 周后全部降 解2 0 1 。 但是， p g a在机械性能方面存在很大缺陷 2 1 1 : 由 于p g a材 料本身僵硬柔软度差、壁厚、可塑性差，难以成型，用p g a制成 三个瓣叶时，出现瓣叶狭窄的情况，同时，也给外科操作带来困 难;另外， m a y e r 等还用 p g a , p l g a构建了 组织工程带瓣血管 1 9 ,2 2 1 ， 植入动物体内 后形成动脉瘤， 这也表明p g a不能完全对抗 血流的高速冲击，物理强度不够，其弹性和韧性都有待加强。 2 . 1 .2 .尸 h a 由于p g a及p l g a存在的缺陷， 一些研究机构开始用聚轻基 烷酸 醋( p o ly h y d r o x y a l k a n o l a t e s , p h a ) 构建 支架。 p h a 是一 个 系 列的聚酷，目 前国内外所采用的是韧性、弹性最好的第三代 p h a 聚醋: 聚轻基乙 酸 和聚 经基辛酸的 共聚物( p o l y h y d r o x y o c t a n o a t e s , p h o ) ， 还有聚轻基乙 酸和聚4 轻基丁酸醋( p o l y - 4 - h y d r o x y l b u t y r i c a c i d , p h b ) o m a y e r 研究小组用p h a构建了 三瓣叶的完整心脏 瓣膜2 4 ,3 8 1 明显提高， 从测试结果看，p h a可以制成只有 0 . 3 m m厚，柔软度 未出现狭窄 易于成型，用p h a制成的瓣膜在植入动物体内6 个月 ， 瓣膜启闭良 好。同时， 拉力一 应力曲线表明p h a与正 常的主动脉更相近，有更好的机械强度，p h a 可以完全防止血液 的渗透。 在外科操作上， p h a也适合修剪缝合。 但p h a的缺点也 同样突出:它的组织相容性、细胞的 粘附生长都不如 p g a ;尽管 p h a和p g a的降解都是水解过程，但p h a的降解和再吸收要超 过5 2 周2 5 1 ， 大大超过p g a ， 和新生组织生长率不匹 配， 不利于组 织工程瓣膜的形成，这就造成了 瓣膜在很长时间没有生长2 3 1 2 .i .了 .尸 h. 刁 + 尸 g a 基于以上所述，国内外专家学者结合了p h a和p g a的优点， 将两 者结 合， 形 成 一 种 新的p g a - p h a 共聚物。 m a y e r 等 2 2 -2 3 1 用 这 种新材料构建出瓣膜和带瓣血管，并置入动物体内。其结构示意 图见图一。 血管壁由中间2 4 0 u m厚的无孔p h o层， 内外包裹 i m m 厚的无纺 p g a层，瓣叶则由单纯的有空隙的 p h o构建。这个设 计利用了p g a很好的生物特性，提供细胞附着生长的微环境，同 时又结合了p h a的优良 机械特性，起到支架作用。这种带瓣血管 虽然在很大程度上改进了组织工程血管的性能，但瓣膜本身改动 不大，即由于p h o的降解速度慢，瓣膜上的新生组织生长缓慢。 这就要求材料上仍需继续探索，寻找更好的组织工程学材料。 2 . 2 去 绷抱 劣全匆 颇il , 支架 异体生物源性的瓣膜生物相容性好、易种植细胞，并保存了 正常组织的天然结构，具有很好的组织强度，在临床上已经得到 广泛应用。目 前最常用的是经戊二醛处理的异种生物瓣，虽然这 种瓣膜免疫排斥反应很小，比较耐久，但仍然是没有活性的组织， 不能生长更新2 6 ，且由于戊二醛处理后瓣膜表面的毒性作用，宿 主的活体细胞不能在其表面迁移生长。低温保存的同种瓣在先心 病手术中的应用，己占重要地位。同种瓣是非固定的，保存了组 织结构的完整性，但目 前也没有证据表明同种瓣表面有宿主细胞 再生长2 7 l ，且由 于同 种瓣来源少， 及存在的免疫排斥反应和炎性 反 应问 题2 8 -2 9 ， 限 制了 它的 应用。 组织工程瓣膜构建中， 分别以同 种、异种瓣膜材料制成支架。 2 2 1 去 细 胞必 异砂种 全数 厦丈 架 在异种生物瓣膜中，主要是以猪瓣为材料制成支架。如上所 述，必须找到一种新的方法即去除了异种生物瓣的细胞，减少免 疫反应，又避免戊二醛的毒副作用，以利于种植人体细胞。德国 汉诺威 h a v e r i c h研究小组用去细胞猪瓣作支架种植上人体细胞， 并 在体外脉动流环境下测试3 0 -3 1 1 ， 结果表明 在猪瓣支架上人体细胞 生长良好，并产生了正常结构的细胞外基质。他们采用了新的无 去污剂处理方法去除瓣膜表面细胞:采集新鲜的猪的主动脉，立 即 放入 4 的h a n k s 平衡液中，尽量减少热缺血时间，然后在实 验室内， 将瓣膜放入1 % t r it o n x - 1 0 0 + 0 .0 2 % e d t a + r n a s e ( 2 0 u g / m l ) + d n a s e ( 0 . 2 m g / m l ) 的溶液 中， 置于3 7 c 9 5 % 的c 0 2 孵箱浸泡2 4 小时， 取出用p b s 液冲洗 表面残余物， 在4 条件下保存备用。 经光学显微镜和扫描电镜检 查， 这样处理的猪瓣细胞几乎都被除去， 3 - d结构的瓣膜支架完整 保存， 纤维带间 疏松， 便于细胞种植。 此后， b a d e r 等 1 6 1 又采用0 . 1 % 胰蛋白酶溶液浸泡2 4 - %小时的去细胞方法， 同样取得了满意的结 果。 2 .2 .2去细脸必同种瓣摸一乏契 同种瓣有优良的血液动力学表现，将同种瓣去细胞处理，并 种植人体细胞，可有效地抑制瓣膜免疫及炎性反应，减慢钙化退 行性变过程3 2 -3 3 o h a v e ri c h 3 等将同 种带瓣血管浸泡于胰蛋白 酶 / e d t a溶液4 8 小时， 充分去除其活体细胞， 先后种植上肌成纤维 细胞和内皮细胞，然后植入羊的肺动脉，三个月后结果显示这种 构建的瓣膜功能良好，表面有再细胞化及细胞外基质形成;而未 处理的同种瓣对照组都有不同程度的退行性变，也没有细胞再生。 2 .了 好猫蟹自丈架 由于生物高分子材料仍存在免疫原性、毒性及炎性反应， z u n d 等 1 5 于1 9 9 9 年研究应用了纤维蛋白 胶构建支架。 他们将人肌 成纤维细胞分离提取，体外培养扩增后，与消毒后的纤维蛋白原 溶液混合，并接种在6 孔培养板中，每孔含7 5 0 0 0 0 人肌成纤维细 胞和i m l 纤维蛋白 原溶液 ( 含2 .5 m m c 犷，2 n i h u n i t 凝血酶， 3 .5 m g 纤维蛋白 原) ， 共同 形成1 - m m厚的 细胞一 纤维蛋白 胶结 构。 此结构加入d me m培养液和不同浓度的抑肤酶培养一个月。 结果 培育成一种有自 体细胞生长、分泌细胞外基质、无毒性降解和炎 性反应的三维纤维蛋白胶结构。其降解速率由培养时的抑肤酶浓 度控制。纤维蛋白 在体内的自 然伤愈修复过程中起重要作用，其 降解再塑性与细胞相关的酶反应关联;抑肤酶是蛋白酶抑制剂， 可通过抑制纤溶酶来减慢和停止纤溶反应，决定纤维蛋白的降解 速率。 z u n d 的试验还处于设想阶段，i m m厚的胶体结构还远远不 能适应组织工程瓣膜的要求，其力学特性也有待考证。 了 .细胭功分离菇4 替 f 匆禅搭 了 .1 细决源 机体的细胞都表达一定的抗原性，特别是内皮细胞具有强烈 的同种异体原性，所以组织工程细胞一般采用瓣膜受体自 身3 a 这一点人们已达到共识，但具体的取材部位、方法尚无定论。构 建组织工程的细胞应是 ( 1 )容易培养，粘附性强 ( 2 )其分子结 构和功能与正常瓣膜细胞相似 ( 3 )临床上易获取，具有实用性。 目 前研究对哪种细胞最适合存在分歧。 3 . 1 . 1为及 内皮被覆于血管系统表面，保证血管系统最基本功能。内皮 细胞完成血管损伤的最初修复，形成新生毛细血管，产生肝素及 前列腺环素，抑制血栓形成; 同时它能通过胞饮作用将其表面的微 生物吞噬以发挥抗感染作用。血管内皮细胞被认为是最理想的天 然组织工程细胞3 5 - 3 6 1 0 1 9 9 0 年， z il l a 等3 7 1成功地建立了 血管内 皮 细胞快速大规模培养技术，使内皮细胞难以大量获取的难题得到 解决。研究表明: 种植于瓣膜上的内皮细胞能够象天然组织一样 表达姗因子，产生胶原，弹性纤维等，具有生物活性2 2 - 2 3 ,3 8 1 如前所述，瓣膜处于高压复杂的血流环境下，具有特殊的细 胞组织结构. 而人体不同部位的内 皮组织有其特殊的功能，如蛋白 合成及花生四烯酸代谢。而动脉系统处于同样的高压坏境，因而 动脉内 皮组织细胞被最多的研究应用。m u n e r e tt等3 5 1对动脉及毛 细血管系统内皮进行了研究. 他们分别提取人的主动脉，心耳毛细 血管和动脉滋养血管内皮细胞在体外培养，并从组织形态学，繁 殖率，形成毛细血管能力及对各种刺激因子方面对细胞加以研究 对比。结果发现:三处不同来源的内皮细胞在组织形态学及内皮 细 胞 标志 物( c d 1 4 , v 10 , f c , v l e x , l e c ti n ) 表达上基本 相似;但是 在 功能 表现上存在着差异:主动脉内 皮细胞( h a e c ) 具有最好的体外 培养动力学表现。同时h a e c所形成的毛细血管结构比其他两种 细胞形成的结构更稳定持久。所以，h a e c被认为更适合成为组 织工程的细胞来源。但是动脉组织在临床难以获取，最终应用中， 将存在一定问题。 表浅的静脉内皮细胞容易取得，也广泛地应用于试验中。颈 静脉，脐静脉，大隐静脉内皮都是研究中常取材的部位。g e r o s a 等3 9 将主动脉内 皮及大隐静脉内 皮制成冰冻切片后行免疫组化分 析。他们应用单克隆抗体对两种细胞中不同的细胞骨架蛋白和细 胞收缩蛋白 加以 鉴定，发现两种细胞的蛋白 组成相似。s h i n o k a 等 4 0 1 也发现静脉内 皮细胞和成纤维细胞同动脉壁细胞在组织及形态 方面无显著差异。目前，静脉内皮在人工血管内皮化的临床应用 中均有很好的表现。如z i ll a 等4 1 1 报道了用内皮化人工血管置换病 人骼一 股动脉3 3 例， 实验组通畅率明显高于对照组( p 0 . 0 5 ) a d e u t s h 等4 2 1 也报道了 应用该技术的临床研究结果， 效果令人满意。由 此 我们可以看出静脉内皮细胞也能应用于组织工程瓣膜。 了 .1 .2/7 ,6 t 间皮细胞和内皮细胞同属于单层扁平上皮细胞，在体内同样 具有抗血栓特性4 3 1 ，并且能够从大网 膜等处大量提取，因此间皮 细胞成为组织工程细胞的另一选择。 p r o n k 等4 4 1研究发现: 间皮细 胞在体外经分离后再培养时，产生大量组织因子，从而表现出很 强的促凝血特性，这就限制了间皮细胞的应用。也有报道3 6 认为 这可能与体外培养条件技术有关;组织培养过程中，细胞代谢所 产生的 氧自由 基对细胞产生毒性作用14 . m c c o r d 等4 6 发现黄嚓吟 氧化剂广泛存在于组织中，是氧自由基的主要来源。在此基础上， v e r h a g e n 等4 7 在间 皮细 胞 体 外培 养液中 加入了4 0 m m浓度的 别 嘿 吟醇一 黄嘿吟醇氧化剂的抑制剂，结果发现培养后的组织因子表达 减少了9 0 %。由 此可见， 通过调整体外培养环境及提高技术手段， 使间皮细胞应用于组织工程是可行的。目 前，将间皮细胞应用于 动物模型中的报道还很少，其功能也待于进一步研究。 了 .l .了麦贫 由于血管内皮细胞难以获取，尤其是主动脉内皮细胞的获得 更是不方便，因此有人考虑采用较易获得的人体体表鳞状上皮细 胞及其间 质细胞作为组织工程细胞。 s h i n o k a 等4 0 分别用羊的股动 脉和表皮的组织细胞构建瓣膜，并植入动物体内，对比 研究表明: 两组中的组织工程瓣叶( t e l ) 都能完好地存在于移植部位。 组织学 上， 内 皮组的t e l 含有更多的弹性纤维; 表皮组t e l较内 皮组t e l 厚并且存在收缩现象; 两组中胶原含量大体相同，t e l表面都检测 到硼因子，表明两组中均有内皮细胞覆盖。尽管两组中胶原含量 及物理学张力特性相似，但表皮组t e l的各组成成分之间是无序 杂乱排列的，内 皮组 t e l则更相近于正常瓣膜结构。这可能是由 于来源于外胚层的表皮组织不同与来源于中胚层的血管组织，它 具有不同表现型，表皮细胞不适于瓣膜的机械特性，同时两部位 的间质细胞所产生的细胞外基质也存在很大差异。因此，内皮细 胞比 表 皮 细 胞更 适 合 用于 组织 工 程细 胞。 但e g h b a l i 等4 s 研究 表明 : 微环境影响细胞的分化; 改变细胞生存环境，细胞同样会出现去分 化 现象， 并 根 据 微 环境 重新 组 织。 n i s h iy a m a 等4 9 1报道了 皮肤 成 纤 维细胞在不同的离体培养环境中表现出不同的生长特性和形态， 发现肿瘤生长因子p 能使成纤维细胞重新分化成软管细胞，并在 体外环境下产生纤维软管。因此，如果通过对体外培养环境加以 调整选择，从而控制表皮细胞的分化方向，表皮细胞也有可能成 为组织工程细胞。 3 . 1 . 4办刀旅功骨髓采派功内贫细脑宠多醋何好子细脸 当前最新的研究结果5 0 -5 4 1 显示骨髓中人类多能间叶干细胞 ( m u l t i p o t e n t h u m a n m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s , h ms c )和外周血中 存在的骨髓来源的内 皮细胞的前体细胞 ( c d 3 4 + 细胞)具有分化成 间质细胞和内 皮细胞的能力，经体外分化培养而用于组织工程细 胞。 在机体内，人间叶干细胞 ( ms c )存在于许多组织中，尤以 骨髓中 最多i l l . m s c 保持着多能分化能力， 通过一定条件的诱导， 可以定向分化，形成新的间叶组织，如骨、软骨、肌腔、脂肪和 基 质。 在体内 的 损 伤修复 过 程中 起重要 作 用。 p i t t e n g e r 等5 2 -5 3 在 人 的骨髓中成功提取 ms c ，并通过调控 ma p激酶，使其定向分化 成骨系和脂肪系组织。由此可以设想:通过一定的诱导方法，一 样可以用ms c分化培养组织工程学所需的间叶细胞。 有研究表明 5 5 -6 0 : : c d 3 4 作为造血干细胞的标记抗原， 在成人 和胚胎期的内皮细胞上有表达;同时，一些内皮细胞表面特异性 酪氨酸激酶受体， 如t i e . t e k 和f l k - 1 ， 也在造血干细胞c d 3 4 + 前 体细胞表达。因此有人提出，造血细胞和内皮细胞都来源于共同 的祖细胞一成血管细胞。s h i 5 o -5 i 等成功地在外周血中分离提纯 c d 3 4 + 细胞，在体外加入纤维生长因子、 胰岛素样生长因子 1 、 血 管内皮生长因子，诱导使之分化成内皮细胞，并通过建立狗骨髓 抑制模型， 证明这些c d 3 4 + 细胞来源于骨髓， 可以 在植入的瓣膜表 面形成单层内皮细胞层。 尽管目前对这两种细胞的研究还仅仅开始，却己显现出巨大 的潜能，并有可能取代血管内皮而成为最理想的组织工程细胞。 了 .2 .绷分as券形 从活体新鲜组织提取细胞的方法有机械刮取、组织块移植、 酶消化等方法，并根据不同取材部位的特点来选取相应的方法。 细胞培养技术则根据种植时的需要分为分别培养和混合培养。总 体来说，组织工程细胞技术可分为三类:( 1 )分卿资玫,分那替 养 分9- 茵 取来新鲜组织， 对内 皮细胞和间质细胞分别提取， 然后各自 培养， 种植时先种i c s 再种植e c s o ( 2 )虏甘蓬展， 分乙别 j 9 0,分屏种覆.细胞提取时将 e c s 和 i c s 一起取下，体外将细 胞用乙酞低密度脂蛋白 ( a c - d i l - l d l )标记，再用流式细胞仪把 两种细胞分离，分别加以培养扩增，分层种植。( 3 ) x分提聊, 群甘增赤，膊分神橙两种细胞一并提取，不分离，联合培养， 并一起无序地种植到支架表面。 了 . 2 . 1 分 j a玫,分别增赤，分禅覆 经过各研究小组长期的探索，不断地筛选更新，己经逐步形 成了 各自 成型的 提取 培 养种植技 术。 m a y e r 等 2 3 采集羊 颈 动脉， 冲 洗后用0 . 2 % a型胶原酶填充入动脉， 置于c 0 2 孵箱( 3 7 0c 9 5 % 0 2 5 % c o 2 ) 中2 0 分钟， 填充液经3 0 0 g 离 心5 分钟得到内 皮细胞团， 用培养液制成细胞悬液放入预先铺种胶原的培养瓶中培养，培养 液主要成分: m1 9 9 + 1 0 %胎牛血清+ 1 % 1 一 谷氨酞胺+ 5 0 1 u肝素+ 青 霉素、链霉素、两性霉素。内皮细胞培养传代过程中， 培养液每3 天一换。去掉内皮细胞的颈动脉，被切成 i m m大小的组织块， 采 用细胞贴壁移植的方法，放入培养瓶，加入d me m高糖培养液， 并补充1 0 % 胎牛血清、谷氨酞胺、 抗菌素等，大约经过7 - 1 0 天， 动脉中膜间质细胞从组织中游离出来并贴壁生长，此后对细胞传 代培养。 b a d e : 等3 0. 3 1 ,6 1 -6 2 1 也用相似方法对人大隐 静脉的内 皮和间 质细胞分别提取培养。 细胞经过约 4周时间的体外培养，达到种植所需的数量一 1 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ( 1 * 1 0 7 ) 后17 -2 4 ,3 8 1 ， 先将间 质细胞培养悬液滴注到支架 上， 连续接种4 天;( z u n d 等6 3 研究得出最佳细胞种植间隔为2 4 小时。 )之后再把内皮细胞同样种植到支架上，放入培养液中再培 养3 天， 最后得到可以 植入体内 的 组织工程瓣膜。 m a y e r 小组1 8 -2 1 ,2 4 1 在用高分子聚合物作支架材料时， 先用明 胶 ( 5 u g / m l ) 预先铺种 在支架表面，2 4小时后再种植细胞，这样以解决聚合物粘附性差 的问 题， 增加细胞的附 着率。 f i s c h l e i n等6 4 1 用酸性成纤维生长因 子 ( a c i d ic f ib r o b l a s t g r o w t h f a c t o r , a f g f ) 和肝素纤 维结 合蛋白 ( f i b r o n e c t i n - h e p a r i n ) 预铺在经戊二醛处理的 猪主动脉瓣叶， 并 证 明可以提高细胞的粘附增殖。 3 . 2 . 2 据分摺垅，分别增券，分层种潜 z u n d 等6 5 -6 6 对于细胞的分离采取了一种新技术:取2 - 3 c m长 羊的股动脉， 切碎成i n u n 大小组织块， 放入培养液中置于c 0 2 孵 箱培养，培养液成分为:d me m + 1 0 % 胎牛血清+ l 一 谷氨酞胺十 抗 菌素。培养液每 7天一换，约 8 周后，得到足够数量的内皮细胞 和间质细胞的混合液。然后混合细胞用乙 酞低密度脂蛋白 ( l d l ) 标记， 这种标记物可以被内皮细胞选择摄取而成为l d l阳性细胞， 成纤维细胞和肌细胞则为l d l阴性细胞，再用流式细胞仪将两种 细胞分开，并分别培养，此后培养和种植技术同前所述。s h i n o k a 等4 0 1 发现l d l + 的内皮细胞只占 混合培养的细胞数量的2 - 3 %. 3 . 2 . 3 泥台藉玫，群甘增赤，蔗诊禅馗 m a y e r 小 组 2 2 ,3 8 ,4 0 在 实 验中 运 用了“ 混 合 培 养 混 合 种 植” 的 技 术:即将内皮细胞和间质细胞从组织中提取下来后，不对其分离， 联合体外培养，种植时将混合细胞悬液滴注到支架材料上，待结 合牢固就直接植入体内; 经扫描电镜及v wf ， 因子染色发现: 经过 一定时间后，杂乱无序种植的细胞在体内具有分层定向能力，内 皮细胞分布到表面，其下面是成纤维细胞和肌细胞，且细胞平行 于血流方向生长，弹性纤维和胶原纤维也成束顺血流方向分布， 这完全和正常组织结构一致。由于混合培养混合种植技术不需分 离细胞，不用分层种植，大大简化了 操作流程，减少了细胞感染 的 机会。 研究发现6 7 -6 8 细胞的 结构和功能 受其所处的 环境影响有一 个在适应变化过程。 r e d m o n d等6 9 证实:内 皮细胞与肌细胞联合 培养是，细胞间相互作用，内皮细胞的粘附力增加，生存时限延 长，抗应变力增强。因此有人推断，细胞极具 “ 智能”性，人为 的 干涉手段反而损坏了细胞的功能。 m a y e r 小组的实验证明 混合培 养种植技术是一种简便而有效的方法。 了 . 了汾动 wa禅 左3 救应屏 随着细胞培养种植技术的进展，研究人员发现体外培养的细 胞其粘附力低，且生理功能与活体细胞相比明显不足;构建的组 织工程瓣膜抵抗血液动力压力的机械特性远达不到正常主动脉瓣 的要求，以及由于残存的未降解高分子材料，表现一定的宿主反 应 7 0 a v a n 等 7 1研究 认为: 内 皮细 胞的 形 态、 功能 与 起所处的 体内 微环境有关，包括流体动力环境、细胞外基质、神经体液相互作 用。 也有研究表明 7 2 -7 3 : 在体内 流体环境中， 内 皮细胞骨架系统在 力的作用下发生变构和重排，形态学发生改变。因此，组织工程 瓣膜体外构建中 引 入 动 态培养种植 概念6 7 ,7 4 - 7 5 1 ， 在体外模拟人 体内的血液流体力学场一脉动流，并在此环境下种植培养细胞， 以 解决上 述问 题。 b e n b r a h i m等7 6 建立了 血管模拟装置 ， n i k l a s o n 等7 7 于此后也建立了脉动流培养装置。 目前，有多种脉动流生物反应器用于组织工程瓣膜构建。脉 动流系统机械装置内装有培养液，模拟体内流体环境产生脉动流， 其流速、压力可以调节监测，整个系统在无菌条件下安全易控制， 并 可 置 于细 胞培 养 环 境中 。 m a y e r 小 组 3 8 和h a v e r i c h 小 组 3 0 ,6 1 分 别应用各自的脉动流系统构建了体内、体外组织工程瓣膜模型。 m a y e r 等 3 8 用p g a / p h a 构 建 瓣 膜 支 架， 混 合 种 植 体 外 培 养 细 胞，放入脉动流生物反应器中培养 8天后观察，发现在脉动流体 外种植培养的组织，细胞同样可以像体内培养一样，具有分层定 向生长能力，细胞呈伸长性生长，细胞长轴与流场方向一致;通 过d n a分析、轻脯氨酸分析分别证明脉动流条件下细胞的繁殖能 力和胶原产生 ( 即细胞外基质的形成能力)明显高于非脉动流培 养条件;但弹力纤维的产生却变化不大，作者认为可能与脉动流 装置仍不能完全模仿体内流体环境有关，这有待于脉动流技术的 改 进。 有 研究表明 8 1 1 : 脉动流循环压力使内 皮细胞的 粘附 力提高。 其他研究 7 8 -8 0 也认为在组织工程瓣 膜植入体内 前， 脉动流系统是非 常重要的口 一个组织工程瓣膜应该象其他瓣膜替代物一样，在植入体内 时就己 经是一个功能完整的器官。因此 m a y e r等提出 “ 预调” ( p r e c o n d i t i o n in g ) 概 念: 运用 脉动 流生 物反 应系统 在体 外完 全仿 真体内流体环境，在体外构建成能抵抗血流应力、生物材料完全 降解而免除宿主反应的纯自体组织的、功能完整的组织工程瓣 膜 。 夕 总之，组织工程瓣膜研究工作己 取得了很大的进展，m a y e r 小组和h a v e ri c h小组都已经构建成组织工程瓣膜及带瓣血管，并 成 功 的 植 入 动 物 体 内 ， 其 功 能 和 组 织 结 构 的 改 变 都 令 人 鼓 舞 少 但 目前组织工程瓣膜实践中也存在一些问题:( 1 )支架材料。如何 合成生物相容性好、降解速率匹配、机械性能优良的高分子材料 仍面临很大挑战。( 2 )体外 “ 预调” 。体外调节包括力学调节和化 学调节，力学调节指在体外建立能完全模拟体内血液流体环境的 脉动流系统;化学调节则是通过添加化学物质完全模拟体内微环 境，最终在体外就构建出功能完备的自 体组织瓣膜。( 3 )细胞技 术。目 前人们尚未找到最佳的组织工程的细胞来源。细胞培养种 植技术仍需进展， 提高细胞粘附能力，保存细胞的生理功能。( 4 ) 植入实验。目 前所有植入实验的瓣膜都被放入了肺动脉瓣位，肺 动脉血流为体内低压血流，瓣膜功能和结构能保持完整，一旦植 入主动脉，组织工程瓣的机械特性，对抗增大了几倍的血流应力 的 。 。 力 以 及 在 高 压 血 流 中 细 胞 的 粘 附 率 都 有 待 检 验 o 乙 此 夕 卜 o b r i e n 2 7 等将猪的无冠瓣去细胞处理，并去除细胞相关的免疫原 性，取三个匹配的无冠瓣缝制成无支架主动脉瓣膜植入动物体内， 结果发现这种未种植细胞的瓣膜在经过体内 1 5 0天后，瓣膜边缘 有细胞覆盖，3 3 6天后覆盖有细胞的瓣膜面积已 扩大到 6 0 - 8 0 %, 且细胞密度与正常组织相似。由此考虑组织工程瓣膜植入体内后， 其表面的细胞来源是体外种植的，还是瓣膜周围正常组织细胞迁 移或血液中细胞沉积所致?这个问题的解决需要在种植的细胞上 加入能长期存在、不损害细胞功能的示踪剂。这些问题需要研究 人员不断努力，进一步研究。组织工程瓣膜将在不远的将来展现 给 r if 广 阔 的 前 景 。 万 厂升 1 . s c h o e n f j , l e v y r j . t i s s u e h e a rt v a lv e s : c u r r e n t c h a l l e n g e s a n d f u t u r e r e s e a r c h p e r s p e c t iv e s . f o u n d e r s a w a r d , t w e n t y - f i ft h a n n u a l m e e t i n g o f t h e s o c i e t y f o r b i o m a t e r i a l s , p r o c i d e n c e , r i , a p r i l 2 8 - ma y 2 , 1 9 9 9 2 . j a m i e s o n wr e , t o s a d o l j , mu n r o a i , e t a l . c a r p e n t i e r - e d w a r d s s t a n d a r d p o r c i n e b i o p r o s t h e s i s . p r im a r y t i s s u e f a i l u r e b y a g e g r o u p s . a n n t h o r a c s u r g 1 9 8 8 ; 4 6 : 1 5 5 - 6 2 3 . h a m m e n n e i s t e r k e , s e t h i g k , h e n d e r s o n wg , r a h i m t o o l a s , e t a l . a c o m p a r i s o n o f o u t c o m e i n m e n 1 1 y e a r s a ft e r h e a r t - v a l v e r e p l a c e m e n t w i t h a m e c h a n i c a l v a l v e o r b i o p r o s t h e s i s . n e n g l j me d 1 9 9 3 ; 1 8 : 1 2 8 9 - 9 6 4 . ma y e r j r . u s e s o f h o m o g r a ft c o n d u i t s f o r r i g h t v e n t r i c l e t o p u l m o n a ry a rt e r y c o n n e c t i o n s i n t h e n e o n a t a l p e r i o d . s e m i n t h o r a c c a r d i o v a s c s u n g 1 9 9 5 ; 7 : 1 3 0 - 2 5 . h a r k e n d w c u r i s l e . h e a r t s u r g e ry: l e g e n d a n d a l o n g l o o k . a m j c a r d i o l 1 9 6 7 ; 1 9 : 3 9 3 - 4 0 0 6 . s a u n d e r s k b , p a t r i c i a a. a n i n v i t r o m o d l e f o r c e l l - c e l l i n t e r a c t i o n s i n v i t r o c e l l . d e v b i o l , 1 9 9 2 ; 2 8 a : 5 2 1 - 8 7 . f a l l o n mb , a b r a ms g a , k u d d , e t a l . t h e r o l e o f e h d o t h e l i a l n i t r i c o x i d e s y n t h a s e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f a r a t m o d e l p f h e p a t o p u l m o n a ry s y n d r o m e . g a s t r o e n t e r o l o g y 1 9 9 7 a u g ; 1 1 3 : 6 0 6 - 1 4 8 . l i y , mc c o r m a c k a m, b r a n d n j , y a c o u b mh . a s t r a t e g y f o r i n d u c i n g i m m u n e t o l e r a n c e t o v a l v e e n d o t h e l i a l c e l l s t h r o u g h g e n e t r a n s f e r . j h e a r t v a l v e d i s 2 0 0 0 ma y ; 9 ( 3 ) : 4 3 9 - 4 4 9 . k u d d , n e l s o n j m, c a u l f i e l d j b , wi n n mj . r e l e ase o f e n d o t h e l i u m - d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r s fr o m 1 6 ( 2 ) : 2 1 2 - 8 c a n i n e c a r d i a c v a l v e s . j c a r d i o v asc p h a r ma c o l 1 9 9 0 ; 1 0 . r o y c e l l s a , b r a n d n j , y a c o u b mh . mo l e c u l a r i s o l a t e d fr o m h u ma n h e a r t v a l v e s . c h a r a c t e r i z a t i o n o f i n t e r s t i t i a l j he a r t v a l v e di s 2 0 0 0 ma y ; 9 ( 3 ) :4 5 9 - 6 4 1 1 . y a c o u b mh f u n c t i o n a l , c e l l u l a r a n dmo l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e h u m a n a o rt i c v a lv e . f i r s t i n t e rna t i o n a l s y m p o s i u m o f t i s s u e e n g in e e r i n g f o r he a r t v a l v e b i 1 2 . r o y a , b r a n d n j , o p r o s t h e s e s 1 9 9 9 u k . 1 2 y a c o u b mh . e x p r e s s i o n o f 5 - h y d r o x y t r y p t a m in e r e c e p t o r s u b t y p e m e s s e n g e r r n a i ni n t e r s t i t i a l c e l l s fr o m h u ma n h e a r t v a l v e s . j h e a r t v a l v e d i s 2 0 0 0 ma r ; 9 ( 2 ) : 2 5 6 - 6 0 1 3 . n a c k m a n g b , b e c h f r , p a l m i e r iq e t a l . e n d o t h e l i a l c e l l s mo d u l a t e s m o o t h m u s c l e c e l l m o r p h o l o g y b y i n h i b i t i o n o f t r a n s f o r m i n g r o w t h f a c t o r - b e t e r l a c t i v a t i o n . s u r g e ry 1 9 9 6 ; 1 0 : 4 1 8 - 2 6 1 4 . f r e d e r i c k j s c h o e n . t i s s u e e n g i n e e r i n g h e a rt v a l v e s :t h e p r o b l e m d e f i n e d b y s t r u c t u r e - f u n c t i o n - p a t h o l o g y c o r r e l a t i o n s i n n a t u r a l a n d r e p l a c e me n t v a l v e s . f i r s t i n t e rn a t i o n a l s y m p o s i u m o f t i s s u e e n g i n e e r in g f o r h e a r t v a l v e b i o p r o s t h e s e s 1 9 9 9 u k 1 0 - 1 1 1 5 . q in g y , z u n dq b e n e d i k t , p , t u r i n a m , e t a l . f i b r i n g e l a s a t h r e e d i m e n t i o n a l m a t r i x i n c a r d i o v asc u l a r t i s s u e e n g