（预防兽医学专业论文）抗鹅γ干扰素单克隆抗体制备及鉴定.pdf

摘要 摘要 i f n - 7 主要是由活化的c d 4 十1 1 1 l 细胞、c d 8 十t 细胞和n k 细胞产生，除具有抗病毒、 抗肿瘤活性外，免疫调节作用是其主要的生物学功能，如：激活巨噬细胞、上调m h ci 。i i 类分子表达水平、促进抗原提呈，诱导t h 细胞的分化等，在机体针对肿瘤及多种胞内病原 体感染等疾病的细胞免疫中发挥重要的作用，是体现机体免疫功能的一项重要指标。而抗 i f n 吖特异性单克隆抗体( m c a b ) 在评价机体细胞免疫功能方面具有重要的应用价值。本研究 成功的构建了重组质粒p c d n a 3 1 - i 刚- 丫免疫b a b l c 鼠制备抗鹅i f n 吖m c a b 并对其特性进 行鉴定，为进一步研究鹅i f n 吖的生物功能及鹅细胞免疫应答提供物质基础。 本研究将p c d n a 3 1 载体和p m d l 8 - t - m g o l f n q 质粒分别经h i n di i i 和e c o r i 双酶切后， 将其克隆至真核表达载体p c d n a 3 1 的相应位点，构建了鹅i f n - 5 基因的真核重组表达质粒 p c d n a 3 1 一i f n 吖。经酶切鉴定，结果表明所构建的重组质粒为鹅i f n 吖基因特异性真核表达 质粒。将获得的重组质粒命名为p c d n a 3 1 - i f n 吖。大量提取p c d n a 3 1 一i f n 吖质粒免疫 b a l b c 鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术，获得3 株可稳定分泌抗鹅i f n 吖m c a b 的杂交瘤细胞 株，分别命名为1 e 8 ，1 h 1 1 和2 d 6 。3 株m c a b s 的亚型均为i g m ，轻链为1 c 链。e l i s a 鉴 定结果表明，腹水效价分别为1 ：8 0 0 0 ，1 ：1 6 0 0 0 和l ：2 8 0 0 0 ，且i h ll 相对亲和力大于i e 8 和2 d 6 的相对亲和力。采用相加e l i s a 法证明，1 h 1 l 与2 d 6 分泌的m c a b 识别相同的抗原 位点，1 e 8 与1 h 1l 和2 d 6 分泌的m c a b 识别不同的抗原位点。经w e s t e r nb l o t 检测，3 株 m c a b s 均可与原核表达的鹅i f n 吖发生反应，表明本试验所制备的3 株m c a b s 均为针对鹅 i f n - y 的特异性m c a b 。 关键词：鹅p 干扰素；m c a b a b s t r a c t d e v e l o p m e n to f m o n o c l o n a la n t i b o d i e sa g a i n s tt h e g o o s e i n t e r f e r o n - g a m m a a b s t r a c t i f n 吖，p r o d u c e dm a i n l yb yc d 4 十t h lc e l l s ，c d 8 + tc e l l sa n dn a t u r a lk i l l e rc e l l s ，p l a y sa c r i t i c a lr o l ei na n t i v i r u s ，a n t i t u m o r , a n di m m u n em o d u l a t i o n i t si m m u n em o d u l a t i o ni n c l u d e s a c t i v a t i n gm a e r o p h a g e s ，u p r e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no fm h cc l a s sia n dc l a s si im o l e c u l e s ， p r o m p t i n gt h ep r e s e n t a t i o no fa n t i g e n s ，a n di n d u c i n gt hc e l lg r o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o n t h el e v e l o fi f n 吖i sa ni m p o r t a n ti n d e xt ot h ec e l l u l a ri m m u n i t y c o n s e q u e n t l y ，m o n o c l o n a la n t i b o d i e s ( m c a b s ) s p e c i f i c a l l ya g a i n s ti f n 吖a r ev e r yv a l u a b l ei nd e t e c t i n ga n de v a l u a t i n gt h ec e l l u l a r i m m u n es t a t u s i nt h i ss t u d y ，r e c o m b i n a n tp l a s m i dp c d n a 3 1 - i f n - 5 i m m u n i z e db a l b cm i c et o g e n e r a t eh y b r i d o m ac e l ll i n e ss e c r e t i n gm c a b sa g a i n s tg o l f n - y t h er e s u l t sp r o v i d eac o n c r e t e b a s ef o rc o n s t i t u t i n gt h em e t h o d sa n dt e c h n i q u e su s e di nt h ed e t e c t i o na n da n a l y s i so fi m m u n ec e l l s a n di m m u n er e g u l a t i o nb yu t i l i z i n gt h e s em c a b s v e c t o ro fp c d n a 3 1a n dp l a s m i d so fp m d - 1 8 t i f n - ，rw e r ei d e n t i f i e dw i t hr e s t r i c t i o ne n z y m e a n dt h e nw a sc l o n e dt ot h es i t eo fp c d n a 3 1 t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h er e c o n s t r u c t e dv e c t o r sw e r e e s p e c i a lg o o s e i f n - yg e n ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r s r e c o m b i n a n tp l a s m i d sw a sn a m e d p c d n a 3 1 一i f n 吖r e c o m b i n a n tp l a s m i dp c d n a 3 1 一i f n 吖i m m u n i z e db a l b em i c e t h ei n d u c e d s p l e e nc e l l sw e r ef u s e dw i t hs p 2 0m y d o m ac e l l t h r e eh y b r i d o m ac e l ls t r a i n ss t e a d i l ys e c r e t m o n o c l o n a la n t i b o d i e s ( m c a b ) a g a i n s tg o o s ei f n - q , w e r eo b t a i n e d , w h i c hw e r es e p a r a t e l yn a m e d 1 e 8 1 h 1ia n d2 d 6 t h ei s o t y p eo f t h e1 e 8 ，i h l1a n d2 d 6w a sl g ma n dh a d1 cc h a i n t h ee l i s a t i t e r so ft h r e em c a b sa s c i t i cf l u i d sw e r e1 ：80 0 0 ，1 ：1 6 0 0 0a n d1 ：2 8 0 0 0 r e l a t i v ea f f i n i t yo f1 h 11 w a st i g h t e rt h a nt h a to f1e 8a n d2 d 6 t h r e em c a b sc o u l do n l yr e a c tw i t ht h ep u r i f i e di f n - 1 , p r o t e i n o ft h ep r o k a r y o t i c e x p r e s s i o ni nw e s t e r nb l o t a l l t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h r e em c a b s 1e 8 ，1h11a n d2 d 6a g a i n s tg o o s ei f n 吖h a v eb e e ns u c c e s s f u l l yd e v e l o p e d k e yw o r d s ：g o o s ei n t e r f e r o n g a m m a ；m o n o c l o n a la n t i b o d y c a n d i t a t e ：j i nh o n g y a n s p e c i a l i t y ：p r o p h y l a x i sv e t e r i n a r ys c i e n c e s u p e r v i s o r ：v i c e - p r o f w a n gj u n w e 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼；如遗直甚丝盏璺挂别主明的! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：垒匆劣 日期：2 枥年莎月如日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解密 后适用本授权书) 。 日期：瑚年6 月即日 日期：如翊年6 月刀日 1 t 秒卜 铠韶 垒厂- 名 名 签 者 签 作 文论 师 位 学 导 引言 1 引言 2 0 世纪3 0 年代以来，很多学者研究发现机体感染某一病毒后会对另外一种抗原性毫无 关系的病毒产生干扰现象。直到1 9 5 7 年i s a a c s 和l i n d e n m a n n 在研究流感病毒时发现，先将 流感病毒加温灭活，然后与鸡胚绒毛尿囊膜块共同培养，将没有吸附到细胞的灭活病毒彻底 洗去，在3 7 。c 条件下数小时之后去掉膜块，另外加入新鲜的鸡胚绒毛尿囊膜块，3 7 。c 培养过 夜后用活病毒感染细胞，感病毒的复制明显受到抑制，这说明灭活的流感病毒作用于细胞后， 细胞产生一种可干扰病毒的复制的可溶性物质。国际干扰素命名委员会在1 9 8 0 年正式将干扰 素( i f n ) 定义：同种细胞上具有广谱抗病毒活性的一类蛋白质，其活性受基因调控并可影 响r n a 及蛋白质的合成环节。 i f n 普遍存在于生物界中，目前所知，所有哺乳动物和大多数禽类均能产生。i f n 基因 序列的研究结果显示，此序列早在数亿年前就存在于生命细胞的基因序列，因此是生物体内 一种原始的保护因子( r o b e r t sr m 1 9 9 8 ) 。现代生物学研究中，根据i f n 蛋白的氨基酸序列、 细胞来源及其结合受体不同，可将i f n 分为i 型和i i 型。i 型i f n 又可分为a 、1 3 两个亚型， 由白细胞和成纤维细胞产生，它们作用于同一受体，可抑制病毒d n a 复制和蛋白质合成、 活化n k 细胞及促进m h ci 类分子提呈抗原；i i 型i f n ( i f n - t ) ，也称免疫i f n ，主要由 c d 4 十t h l ，c d 8 十t 细胞及n k 细胞产生，除具有抗病毒和抗肿瘤活性外，还可促进m h ci i 类抗原表达、增强抗原提呈细胞( a p c ) 与t 细胞的相互作用及增强辅助t 细胞和细胞毒性 t 细胞产生等免疫调节活性( 金伯泉，2 0 0 1 ) 。i 型i f n 的抗病毒作用最强，主要是通过旁 分泌作用，在这种情况下，病毒感染的细胞分泌i f n 保护邻近细胞不再受感染，即i f n 使邻 近细胞处于抗病毒状态。i i 型i f n 对病毒呈现抗增殖活性，其抗病毒作用远较i 型i f n 低。 i f n 吖是一种淋巴因子，是由病毒抗原刺激致敏的淋巴细胞产生的。因此，i f n - ，是在机体发 挥免疫作用之后才产生，与i 型i f n 相比，其发挥防御病毒感染的作用较迟( 刘建欣等，2 0 0 2 ) 。 由于i f n - t 具有独特抗肿瘤、抗病毒和免疫调节作用，临床上具有广阔应用前景，有关其本 质、功能及作用方式一直是细胞生物学、免疫学及病毒学领域研究中高度重视的课题之一。 以前的研究中，主要通过诱导培养外周血淋巴细胞或其他细胞系生产i f n 吖，但此方法产量 低，纯化工序繁琐，很大程度上限制了其研究的深入。因此，为了对i f n - 丫做进一步的深入 研究，抗i f n 吖m c a b 是必不可少的研究工具。 1 1 f n v 的产生及其诱生剂 111i f n _ v 的产生 正常情况下，正常细胞不会自发产生i f n mi f n l 基因被抑制处于静【l 状态，当机体受 外界抗原和有丝分裂索等刺激时，可由活化c d 4 + t n l ，c d 引t 细胞及n k 细胞所分泌( 如 削l - i ) 。研究发现，n kt 细胞、树突状细胞和巨噬细胞也能产生i f n l ( e l e w a u t d2 0 0 0 ；s c h i n d l e r h2 0 0 d 。n k t 细胞表面具有n k 细胞的激活和抑制受体和t 细胞的表面受 体，产生i f n - t 的时间非常短暂反复刺激屙i f n - t 的分泌和产生量并不增加在特异性免 瘦应咎中可能同时起着激活年【| 抑制的双重作坩。树突状细胞和巨噬细胞属a p c ，也能产牛 i f n y ，产牛过程受许多其它细胞因子调控，i 州小i l 一4 、i l1 0 均可抑制a p c 产生i f n l ( 如幽l - 2 ) ，i l - 2 和j l - 1 8 叮促进a p c 产生i f n 一一r 。a p c 所产生i f n - y 与n k 细胞产生i f n - - 1 存机体感染的最初阶段是在特异性免疫建立之前起着重耍的作h j ，在机体特异眭免疫和非特 异性免疫之间起着重要的联系作j h ( f u k a o te l a l2 0 0 6 ) 。经研究发现( d a y t o n m a “a 1 9 9 2 年) ，b 细胞也可产生i f n t 且i f n t 的合成在卅多己建市的人b 细胞系中可观察到。t h 2 细胞则不能或极少产生i f n l 。 翟 j 。墨交 n 1 l h t ，。 * a i $ 日目2a p c p l h v i 自h 摘自( 戴华，2 0 0 5 ) 112i f n l 诱生剂 i f n - y 基因受一种抑制物的作用并处于抑制状态，只有在诱生剂的刺激作用下才可转录 表哒。能礴导细胞产生干扰素的物质统称为十扰索诱生剂( s e k e i i i c k m je l a l l 9 8 6 ) 。目前己 经靛现的i f n q 诱牛剂有多种，主要分为以下几粪。 1121 病毒诱生剂 痫毒复制时，通过某些细胞内的毒性成分直接引起宿主细胞崔白台成抑制，由于宿主细 胞中i f n - f 抑制物为不稳定蛋白质其合成速度稍微降低就会导致其臼身迅速耗尽，从而使 l f n l 转录活化因子与p r di 和p r di i 结合，导致i f n - t 的转录台成：病毒群放的般股r n a 引言 进入细胞后可直接诱导淋巴细胞等产生i f n - 7 ，负链单股r n a 病毒与其复制过程中形成的正 链r n a 退火后形成少量双股r n a ，后者刺激淋巴细胞和巨噬细胞产生i f n 吖。 1 1 2 2 代谢物诱生剂 代谢激活物和抑制物是另一类重要的i f n 吖诱生剂，代谢激活物如促有丝分裂原i f h a ， c o n a ) 、细胞因子( i l 2 ，i l 一1 2 ，i l 一18 ) 能够诱导未定型( 没有受特异性抗原刺激) 的淋巴细胞 产生i f n - t ( s c h i n d l e rh 1 9 9 2 ) ，特异性抗原可诱导定型( 受过抗原刺激) 的淋巴细胞产生 i f n - 7 。肿瘤激动剂，如肉豆蔻酸，丁酸盐，脱氧尿嘧啶等能够在不同细胞中诱导各种i f n 吖。 其它i f n 吖诱生剂，如细菌内毒素、布氏杆菌、李氏杆菌、支原体、原虫、立克次氏体 和合成的多聚物( 如硫酸葡聚糖和硫酸多糖) 都属于i f n 吖诱生剂，他们的共同特征是具有 细胞毒性，不同程度地抑制宿主细胞蛋白的合成。除上述诱生剂外，还有一些物质抑制i f n l 的产生，如1 ，2 5 二轻基维生素d 3 、地塞米松、环胞霉素a 、糖皮质激素、i l 1 0 等。 1 2if n 一丫的基因结构 很多研究表明，人、猪、牛、鼠等动物和家禽的i f n 吖基因被克隆出来。不同动物的外 显子和内含予核昔酸数量不同，h ui f n - t 基因长度为6k b ，m r n a 约1 2 k b ，含有4 个外显 子和3 个内含子，位于1 2 号染色体；m ui 烈吖基因定位于第1 0 对染色体上，m r n a 约1 2k b 。 i f n 吖基因的第一外显子编码5 端l r 限和信号肽及成熟肽的部分氨基酸，第2 和第3 外显子 编码成熟肽的部分氨基酸，第4 外显子编码含终止密码子部分的氨基酸及3 端u t r ，共编码 1 6 6 个氨基酸的前体，其中信号肽2 3 个，成熟i f n 吖有1 4 3 个氨基酸残基，i f n 吖有等位基 因存在。h ui f n 吖有两个强的n 糖基化位点。由大肠杆菌生产的r h ui 刚吖与天然i f n 相比， 无糖基化但却具有完全的抗病毒活性，在人体内的生物效应与天然i f n 吖相比无显著差异。 g oi f n - q , 基因己被成功克隆( 秘品伟等，2 0 0 5 ) ，完整开放阅读框编码含有1 6 4 个氨基酸的 多肽，其中n 末端的1 9 个氨基酸残基可能为信号肽序列，成熟多肽为1 4 5 个氨基酸，含有3 个半胱氨酸残基，3 个潜在的n 糖基化结合位点( n a s 、n w t 和n l s ) ，3 个潜在的o 糖 基化位点和9 个磷酸化位点。i f n - 7 只有一种活性形式的蛋白质，活性是以二聚体的形式存在 ( 如图3 ) ，单体没有活性，单体内无二硫键存在。二聚体空间构象上呈球状( 如图4 ) ，每个单 体都是由多个a 螺旋组成。g oi f n - 7 基因与已公布的d ui 刚吖( x 8 4 7 6 4 ) 氨基酸同源性为 9 3 2 9 ，与c hi f n 吖( x 9 2 4 7 ) 氨基酸同源性为6 8 2 9 ，与人和哺乳动物的i f n - 丫氨基酸同 源性更低，介于2 1 3 1 。几种常见动物和人的i f n - 7 基因结构比较结果见图5 ( 李洪涛，2 0 0 5 ) 。 3 图卜0 鹅l f n l 二聚体结构模式 f i g1 3g “f n ld i m c rs t r u c t u r a lp a t t e r n 13if n - v 的受体 图卜4 鹅i f n l 空间构象模式 f i g1 4g o l f n wv a c u l t yc o n f o r m a t i o n p a t t e r n i f n ：r 受体( 1 f n l r ) 具有种属特异性儿乎所有的有核细胞的表面都表达i f n y r ，每 个细胞自5 0 0 2 0 0 0 0 个不等。i f n - 7 r 分为再己体吸雕链i f n t r i 和第二受体链( 附属链) i f n ? r 2 ，两者都属于细胞闻子i i 类受体超家族。i f n - r | 结合引起两个i f n - y 受体砸单仲的寡聚化 这引起信号传导，j a k l 和j a k 2 ( 受体相薨蛋白酪氢酸激酶) 酒化；潜在转录四于s t a m 磷酸化和激括后r i f n l r l 胞内区域的t y r 4 4 0 磷酸化。 f n - t r 山两种 f n - y r i 和i f n f f r 2 糖蛋白链组成，表舰分于量分别为9 0 和6 0 k u ，i f n l r 复台物广泛分布于各种细胞和组织 十。 0 2 兰：三翌1 3 兰：二= 兰：三兰! 望：j 兰：，。 图1 - 5 鹅i f n - y 与其它脊椎动物1 f n 的进化树不意图 f i g1 5u n r o o t e dp h y l o g e n e o et r e eo f r e p r e s e n t a t i v ei f n - 7p o l y p e p t i d e sf r o mv e r t e b r a t e s 黧|量i| 引言 各种动物i f n 的基因序列来源于g e n b a n k ：c a t t l el f n - 丫( z 5 4 1 4 4 ) ；c h i c k e ni f n 丫 ( x 9 9 7 7 4 ) ；d u c ki f n 吖( a f 0 8 7 1 3 4 ) ；h u m a ni f n 吖( x 1 3 2 7 4 ) m o u s ei f n - y ( k 0 0 0 8 3 ) ； p i gi f n - 丫( x 5 3 0 8 5 ) ；t u r k e yi f n - t ( a j 0 0 0 7 2 5 ) ；g u i n e af o w li 刚吖( a j 0 0 12 6 3 ) ；p h e a s a n ti 刚丫 ( a j 0 0 1 2 8 9 ) ；q u a i ll f n 吖( a j 0 0 1 6 8 7 ) 。 研究发现i f n 吖r 具有与配体结合的高特异性，只有i f n 吖r 1 与i f n yr 2 共同存在时 i f n - 丫才能诱导与i f n - 丫相关的信号传导和活性。有研究发现i f n 吖r 1 完全结合配体的最短片 断是由胞外区域的6 - - 2 2 7 个残基组成的2 5 k u 肽，第二个g l u 位于成熟蛋白的第l 位。s t u b e r 等用m c a b 来测定i f n 吖r l 链的配体结合位点，发现未还原的人i f n - 丫r 1 链用c y s 6 0 ( 半胱 氨酸6 0 ) - 4 2 y s 6 8 ，c y s l 0 5 - 4 2 y s l 5 0 ，c y s l 7 8 - 4 2 y s l 8 3 ，c y s l 9 7 - 一c y s 2 1 8 残基间的二硫键结合 配体，且所有二硫键是活性最大化所必需。细胞外i f n 吖r l 链构成两个类似免疫球蛋白形状， 大约为1 1 0 个氨基酸残基的区域，一个包含9 4 - - 2 2 7 残基的1 5 k u 肽在溶液中对i f n 吖表现低 亲和性，这一片断被假设含有所有或部分配体结合区域。然而，残基6 2 1 也被发现是完全 结合配体必需的。通过核磁共振结构分析，i f n - t r l 的胞外配体结合部由2 个f b n m ( f i b r o n e c t i nt y p eh i ) 区组成，f b n i 由2 个反向平行的p 折叠和7 个p 片层( a 、b 、e 和 g 、f 、c 、c ) 形成夹心结构。n 末端( d 1 ) 和近膜端即c 末端( d 2 ) 相向呈1 2 0 0 角，i f n 吖 结合位点位于d l 和d 2 的缝隙问。受体通过5 段不同区域( l 2 - l 6 ) 与i f n - y 接触，这5 段 对应于d 1 的c c 和e f 环，2 个f b n i 区域的连接处以及d 2 的b c 和f g 环。i f n a r 2 的结 构与i f n 吖r 1 相似，2 个f b n i i i 段呈9 0 0 ，并且只有i f n a r 2 的d i ( l 2 - l a ) 的环部对i f n o 2 的结合起重要作用。 人体液中存在i f n - ) , 受体相关蛋白。根据报道在人尿液和羊膜液中检出一些i f n - t 受体相 关蛋白，分子量接近4 0 k u 。通过i f n - 丫柱亲和色谱法证实，这些蛋白具有足够高的亲和性来 与膜结合受体竞争结合配体。可溶性i f n - 丫受体的生理发生可能起源于i f n 吖受体m r n a 的 可选择拼接或病毒感染。除可溶性i 刚吖受体外，作为i f n - 7 拮抗剂，具有i g - ) , 或k 链恒定区 域的i f n 吖r l 链胞外区融合蛋白也已被合成，称为i f n 吖受体凝集素。正在研究这些重组i f n 吖 拮抗剂，在自身免疫疾病、慢性炎症和迟发型超敏反应中的治疗作用，似乎i f n - y 拮抗剂可 通过阻止巨噬细胞和t 细胞浸润靶器官而阻止自身免疫疾病的发生( s i d n e y p se t a l 1 9 9 7 ) 。 1 4lf n l 的信号传导 i f n - y 的作用是通过与细胞膜上的特异性受体结合，引发级联性的信号放大过程，将信 号最后传递到细胞核内，对一系列基因的表达进行调控，并引发各种生理反应( 孙志宏等， 2 0 0 0 ；王云等，2 0 0 2 ；杨吉成等，1 9 8 9 ) 。i f n - 丫受体为穿膜糖蛋白，i f n - t 配体诱导i f n 吖 5 东北农业人学农学硕卜学位论文 二聚体在信号转导中，可能起重要的作用并与受体的磷酸化有关，i f n q 与受体结合后可活 化多种i f n 吖调节的基因。目前己知，干扰素刺激后至少有二十种蛋白被表达，其中1 2 种是 干扰素刺激后所特有的，这种表达是由于活化特异的d n a 结合蛋白使其从胞浆移位到胞核。 i f n 吖可促进h l a b ，h l a d r ，i p 1 0 ，p i 激酶和2 5 a 合成酶的的合成。其中p i 激酶可能抑 制病毒蛋白的翻译，而2 - 5 a 合成酶则可裂解病毒r n a 。 张学文曾归纳出一个相对完整的i f n - 信号传递分子过程的模型。在未激活的细胞中， i f n 吖受体亚基彼此不紧密结合，但它们的膜内结构域特异地与j a k i 和j a k 2 结合。功能上 活跃的i f n q 是同体二聚体，结合到两个i f n g r l 亚基上，然后为两个i f n g r 2 亚基的结合 产生结合位点。在自主磷酸化和转移磷酸化作用下j a k 2 首先被活化，活化后表现酶活性， 并对j a k l 进行活化( s t a r r re t a l 1 9 9 7 ；e n d o t a 甜以1 9 9 7 ) 。一旦活化后，结合了受体的 j a k s 对i f n g r i 近c 末端含酪氨酸的5 残基序列磷酸化，使其为s t a t l 的结合形成配对的 配体诱导的锚定位点。两个潜在的s t a t l 蛋白这时结合到这些位点上，因为s h 2 识别酪氨 酸磷酸化的y d k p h 序列。结合受体的s t a t l 蛋白上靠近c 端的7 0 1 位酪氨酸残基又被与 受体相连的激酶磷酸化活性机制作用下，转位到核内。s t a t i 同体二聚体结合到i f n 吖诱导 性基因的特异g a s 序列并激活其表达。s t a t l 同体二聚体的转录活性还可被m a p 激酶特异 作用，对其7 2 7 位丝氨酸残基磷酸化而使活性加强。 1 5if n l 主要生物学活性 i f n 叶具有抗病毒、影响细胞生长分化、抗肿瘤和免疫调节等多种活性，可抑制正常细 胞和变性细胞的增殖，并能与i f n a ，i f n 一1 3 协同在抑制不同类型的细胞增殖中发挥作用。 i f n 吖的生长抑制活性较其他类型的i f n 更明显。然而，i f n - y 的主要生物学活性表现为免疫 调节作用，而其他类i f n 的主要功能为抗病毒活性。 1 5 1if n l 的抗病毒作用及机制 i f n - 7 的抗病毒作用有种属特异性，但其作用约占i 型i f n 抗病毒作用的1 1 0 0 1 1 0 0 0 。 不能诱导m x 蛋白的产生。但是i f n - q , 能够诱导病毒感染细胞表面病毒抗原，增加免疫系统 识别和杀伤感染细胞的能力。i f n 吖还可通过其它未知的途径抗病毒繁殖。i f n 吖引起的抗病 毒作用主要是通过诱导某些目的基囚的表达米实现，这些目的基因表达产物主要是一些参与 病毒r n a 降解和剪切的酶和蛋白质，这是i f n 吖抗病毒作用的主要机制，一些病毒感染过 程中产生的抑制其信号传导过程的蛋白也是通过抑制i f n q 诱导这些酶类的产生而进行的。 i f n - 7 和i f n 1 3 有相互加强抗病毒作用( 郭小权等，2 0 0 0 ) 。主要有3 种与l f n 吖抗病毒有关 的酶：双股r n a 依赖的蛋白激酶、2 ，5 腺昔酸合成酶和腺嘿吟核昔酸氨基酶，这三种酶也能 6 引言 被i 型i f n 所诱导产生。 通过基因缺失i f n 吖及i f 】m 信号传导过程中所需的分子如s t a t l ( c a n t i nee ta l l 9 9 9 ) 等后，i f n - ? 在病毒感染如乙型肝炎病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、鼠痘病毒感染中的 抵抗作用明显下降( s h t r i c h m a nre ta 1 2 0 0 1 ) ：将i f n 吖基因与病毒的保护性抗原基因共表 达可增强机体免疫应答等作用( 程坚等，2 0 0 2 ) 。尽管i f n 吖的抗病毒效果远远低于i 型i f n ， 但在机体对病毒感染的长期控制过程中起着非常重要的作用。 1 5 2lf n l 的免疫调节作用及机制 l f n 吖具有很强的免疫调节作用，i f n 吖免疫调节活性为i 型i f n 的1 0 0 1 0 0 0 倍( p a l l a d i o n m 甜a 1 1 9 8 4 ；a d o l ag re ta 1 1 9 8 5 ；g a r o t t age ta 1 1 9 8 7 ) ，并能显著增加抗原递呈细胞表达 m h ci i 类抗原，增强抗原递呈细胞与t 细胞的相互作用，进而增强t 细胞辅助抗体产生和 辅助细胞毒t 细胞的产生的能力( h e a t ha we t a l 1 9 9 0 ) 。i f n - ? 日- 3 活化巨噬细胞促进其释放 过氧化氢杀伤胞内寄生病原体，活化巨噬细胞杀伤肿瘤的水平也明显提高：活化n k 细胞， 提高其杀伤能力，而且活化的n k 细胞也能分泌l f n - 丫；i f n - 丫j 丕可促进n o 的合成，是i f n - 丫 杀伤胞内病原体和抗肿瘤以及抑制病毒复制的分子机制之一( b e n e n c i a f e t a l 1 9 9 9 ；z h e n g x e t a l 2 0 0 0 ) 。 i f n - t g j - m h ci 类分子表达及抗原提呈的调控主要表现在对m h c1 分子合成的促进、对 i 类分子抗原提呈过程中辅助分子表达的调控和对参与抗原多肽加工形成过程的酶类及其辅 助分子的调控等3 个方面。 m h ci i 类分子主要分布在a p c ( 如巨噬细胞、树突状细胞和b 细胞) 的表面。i f n - t 对m h ci i 类分子及其参与的抗原提呈过程的调控主要是通过其诱导细胞后所产生的转录因 子c i i t a ( c l a s si it r a n s a c t i v a t o r , c i i t a ) 来实现的。c i i t a 是在i f n o , 二聚体与细胞表面的i f n 一 丫r 结合后，导致j a k 和j a k 2 磷酸化，继而与s t a t 形成磷酸化的二聚体并转移到核内， 与m h ci i 类分子基因区中a i r l ( a c t i v a t o ro f i m m u n er e p o n s e 1 ) 位点的g a s 序列结合后， 诱导所产生的；同时c i l t a 的产生也需要另外两个调节因子的参加，一个是酬吖诱导后产 生的i f n 调节因子i r f 一1 ( i f n r e g u l a t i n gf a c t o ri , i r f 1 ) ，一个是上游刺激因子u s f 一1 ( u p s t r e a m s t i m u l a t o r yf a c t o r1 ，u s f 1 ) ，缺乏该类因子，i i 类分子在细胞表面的表达将大大降低甚至消 失。i f n 丫对m h ci i 类分子的诱导表达可被i f n a 或i f n p 所抑制，这种抑制并不是由于 i f n a 或i f n p 作用于c i i t a 基因而抑制c i i t a 转录合成所引起，而是作用于c i i t a 介导的 m h ci i 类分子的转录调：i 了过程，但是具体机理不太清楚，有待于进一步研究。 总之，i f n 丫对整个机体的免疫功能包括免疫监视、免疫防卫、免疫稳定等均有不同程 度的调节作用。 7 东北农业大学农学硕i ：学位论文 1 5 3lf n l 的抗肿瘤作用及机制 i f n 吖抗肿瘤作用主要是通过促进机体免疫功能，提高巨噬细胞、n k 细胞和c t l 的杀 伤水平而达到目的。由于i f n i f , 、i f n 1 3 对恶性肿瘤的治疗不理想，人们对i f n 吖寄以厚望。 i f n 吖在机体肿瘤发生、肿瘤移植排斥和肿瘤免疫监测过程中发挥着重要作用。u 附吖的抗肿 瘤作用是多方面的，包括多方面抑制肿瘤细胞生长和诱导多方面抗肿瘤的免疫应答。 i f n l , 抗肿瘤可能有以下几种机n - ( 1 ) 有些肿瘤的发生与病毒有关，这些病毒的核酸往往需要整合到细胞的d n a 中去，形 成病毒基因，这些基因持续存在是肿瘤的发生原因之一，i f n 吖抑制病毒繁殖，从而抑制肿 瘤的发生与成长( l i a ofe ta 1 1 9 9 5 ) 。 ( 2 ) 抑制肿瘤细胞分裂，i f n y 作用于细胞膜并刺激腺普酸环化酶，使c a m p 增加，抑制 d n a 的合成及细胞分裂，发挥抗瘤作用( a l i m o n t ij 甜a 1 2 0 0 0 ) 。 ( 3 ) 调动机体免疫系统，提高机体抗瘤免疫力，i f n 吖能增强巨噬细胞及n k 细胞的杀伤 性，增加细胞表面抗原和受体的表达，抑制b 细胞的功能，从而降低肿瘤细胞表面封闭抗体 的水平。 ( 4 ) i f n - 3 , 激活机体先天性免疫应答，发挥抗肿瘤作用。 ( 5 ) i f n - 1 , 可通过激活机体内参与先天性免疫应答的多种细胞而发挥抗肿瘤作用( e b e r lg 2 0 0 0 ；s h a n k a r a nve ta 1 2 0 0 1 ) 。 许多肿瘤细胞均具有很低的免疫原性，不能激发机体产生有效的免疫保护反应，这主要 由于参与肿瘤特异性免疫应答过程中的抗原加工和提呈过程受到了某种程度的抑制和破坏， 肿瘤抗原不能正确地加工和提呈给t 细胞，而参与抗原加工和提呈的许多分子都受到i f n - , 的诱导和调控，因此，i f n - q 在机体获得抗肿瘤特异性应答过程中起着非常重要的作用。 1 5 4lf n l 抗菌作用及机制 i f n 的抗菌作用主要体现于i f n - t 。i f n - 1 , 能通过下调转铁蛋白受体减少细菌供铁量或通 过诱导产生内源性n o 直接抑制细胞内细菌，还能增加单核巨噬细胞的吞噬小体酶体溶解细 菌作用，通过以上途径共同达到消灭细菌的作用。 1 5 5 抗寄生虫作用及机制 i f n 的抗寄生虫作用主要表现于i f n 吖上，干扰素可激活巨噬细胞( m q d ，活化的m ( p 可表达高水平的诱导型氧化氮合酶( i n o s ) 催化l 精氨酸产生n o ，n o 对接种病原体有抑 制和杀伤作用。并据报道，i f n 吖能激活m ( p 产生n o ，同时促进n o 合成作用受剂量依赖性， 剂晕越高作用越明显。有学者发现用i f n - y 刺激人瞒微向管内皮细胞( h b m e c ) 能诱导其抗 弓形虫病。i f n 吖刺激后的h b m e c 能抑制弓形虫生长，提高t n f n 的出现，这与i d o 的活 性有关。另外，在h b m e c 的培养中加入过量的色氨酸能完全抑制i f n - 3 t n f a 介导的抗弓 8 引言 形虫病，表明1 1 3 0 能介导其保护性，并且据报道，i f n 7 依赖i d o 的表达而起作用。 1 6 if n l 的临床应用 由于i f n - t 具有的独特的免疫调节和抗病毒、抗肿瘤作用及其强大的免疫调节能力，是 机体发挥免疫功能和清除体内病原体不可缺少的成分，与疾病的发生、发展和转归有着密切 的关系。因此，i f n 吖在疾病的诊断、治疗和预防等方面起着重大作用，在临床上有着极其 广阔的应用前景。相对于h ui f n r 而言，动物的i f n 丫的研究相对滞后，用于临床治疗的 甚少，虽然到目前为止，己有猴、猪、马、牛、羊、驴、大、猫、兔、鹿、鼠、海豚、鸡、 鸭、鹅等动物的i f n y 基因相继被克隆出来，也有利用大肠杆菌、酵母、杆状病毒等表达系 统表达重组i f n y 的报道( 程坚等，2 0 0 3 ) 。许多研究报道均证实动物的i f n 丫在直接作为 治疗制剂或作为疫苗使用的佐剂呈现出一定的效果，然而天然i f n 吖难以大量制备。因此， 利用基因工程技术生产大量的重组i f n 吖并用于动物疾病的控制越来越受重视( 夏伦斌等， 2 0 0 7 ) 。i f n 吖最早发现于禽类，但由于禽和其它较低等的脊椎动物与哺乳动物的i f n 吖差 别较大，所表达的蛋白质与针对哺乳动物的i f n - i 抗体交叉反应小，许多应用于哺乳动物i f n 研究中的方法并不适合于禽类。然而，禽类i f n 吖的研究尤其是分子生物学水平的研究一直 比较滞后。近年来，随着畜牧业的快速发展，对l f n 吖的研究提出了新的要求，并促进非哺 乳动物的i f n r 的研究在短时期内取得了巨大的发展。 1 7 抗if n l 的m c a b 的研究 国内外关于人与动物的i f n - t 的研究和应用方面的工作开展得很多，有关抗i f n y m c a b 的研究也得到进一步深入。近几年，我国学者对人和动物i f n 1 ，及其m c a b 也进行了 大量研究，并取得很好的成绩，先后研制成功了抗人i f n 仅及i f n 吖m c a b ( 吴美英等，2 0 0 2 ； 屠宗青等，2 0 0 1 ；+ 杜贤宇等，2 0 0 1 ) ，抗猪i f n - 7m c a b ( 余斌，2 0 0 6 ) ，抗牛i f n - i m c a b ( 杨卫冲等，2 0 0 5 ；李川等，2 0 0 7 ) ，抗鸡i f n - tm c a b ( 戴华，2 0 0 5 ；秦立延，2 0 0 6 ) 等， 有的已经开发应用。 1 7 1 关于if n l 定性及定量分析 国内外关于人与动物的i f n 吖的研究和应用方面的工作开展得很多，但无论是在制备和 纯化i 刚吖过程中对i f n 吖进行定性与定量的分析，还是判定内源性i f n - t 水平的高低，都 需有一种简便、快速、可靠、经济的i f n - ye l i s a 检测手段对i f n - 7 进行定性与定量分析， 特异性好、亲和力高的抗i f n - tm c a b 在这方面有着重要的作用。国内外均有i f n - t 的检测 试剂盒。i f n 吖检测试剂盒多是采用生物素亲和素双抗体夹心酶联免疫吸附法 o 东北农q p 大学农学硕l ：学位论文 ( a 8 c e l l s a ，其特舞性，敏感性霹精确度均霹达裂实翔要求。 目前，很多研究均着眼于利用特异性抗i f n 吖m c a b 作为标记抗体，应用于e l i s a ( 额 尔敦等，1 9 9 8 ) 、e l i s p o t ( d e a ng a e ta 2 0 0 4 ) f ： 流式缨胞术