（海洋生物学专业论文）两株海洋有益菌快速检测方法的建立及其应用.pdf

两株海洋有益菌快速检测方法的建立及其应用 两株海洋有益菌快速检测方法的建立及其应用 摘要 从健康的对虾养殖环境中分离筛选到一株有机物降解菌y 5 ，从海水养殖水体中防 腐钢片的微生物粘膜上分离筛选到一株有抑菌作用的细菌d l 2 。根据菌株形态特征，a p i 2 0 e 生化鉴定试剂条鉴定结果及1 6 sr r n a 基因序列分析，菌株y 5 鉴定为芽孢杆菌属的 坚强芽孢杆菌( b a c i l l u sl i t m u s ) ，d l 2 鉴定为p h a e o b a c t e ri n h i b e n s o 对菌株y 5 胞外 酶活力及d l 2 抑菌活性进行测定，发现y 5 具有较强的酪蛋白酶、明胶酶、淀粉酶、 卵磷脂酶、腊酶等胞外酶活性，菌株d l 2 具有较广泛的抑菌谱，对致病性弧菌表 现出较强的抑菌作用，表明菌株y 5 、d l 2 可以作为潜在的有益菌应用到水产养殖中。 用菌株y 5 免疫新西兰大白兔制得特异性抗血清，建立了菌株y 5 的间接e l i s a 检测 方法，检测灵敏度为1 0 5 c e l l m l ；利用细菌g y r b 基因的通用引物u p 一1 u 卜2 r ，成功的 扩增了菌株y 5 和d l 2 的g y r b 基因，根据所测得g y r b 基因序列，设计了y 5 和d l 2 的特 异性引物，建立了y 5 和d l 2 菌的p c r 快速检测方法。引物8 f 1 b r 2 能特异性的扩增出 y 5 的g y r b 基因，最低检出浓度为6 o x1 0 3 c f u m l ，5 0 p i p c r 反应体系中的检测灵敏度 为1 2 5 p g ：引物p f l p r l 能特异性的扩增出d l 2 的g y r b 基因，最低检出浓度为2 9 8 1 0 c f u m 1 ，5 0 p l p c r 反应体系中的检测灵敏度为3 1 p g ，结果表明引物b f l b r 2 和 p f l p r 2 能较灵敏的检测出目的菌株。 分别将y 5 和d l 2 与饵料混合饲喂实验室小水体养殖的斑马鱼和蛤蜊，利用建立的 p c r 检测方法，并结合传统的分离方法对菌株y 5 和d l 2 进行检测，研究它们在养殖动 物消化道中的存活情况。发现有益菌y 5 可以在养殖动物消化道内能存活两周以上，数 量稳定后基本不发生明显变化，而且成为肠道中的优势菌：有益菌d l 2 在两种养殖动物 肠道内能存活2 4 h 左右，表明有益菌y 5 进入养殖动物肠道后，可以快速的在养殖动物 肠道中定植并繁殖下来，而有益菌d l 2 在肠道内的定植能力较弱，只能在蛤蜊和斑马鱼 肠道中短暂停留。 用所建立的p c r 检测方法对青岛近海岸的环境总9 n a 以及从不同海水环境中分离保 存的6 8 株菌进行检测。在对环境样品总d n a 检测中，引物b f l b r l 和p r l p r 2 均未扩 增出特异性条带；在对不同海水环境中分离的6 8 株菌的检测中，引物b f i b r i 检测到 了两株能扩增出特异性条带的菌株，这两株菌均分离自养殖环境，引物p r l p r 2 未扩增 出特异性条带。对环境中检测引物b f l b r l 检测到扩增出特异性条带的两株菌进行1 6 s 两株海洋有益菌快速检铡方法的建立及其应用 r n a 基因测序分析，进一步确证这两株菌均为坚强芽孢杆菌，表明引物b f t 3 r 1 可以用 于坚强芽孢杆菌的快速检测。检测结果也表明坚强芽孢杆菌多存在于养殖环境中。而 p h a e o b a c t ei n h i b e n s 可能在环境中存在较少。 关键词：有益菌，坚强芽孢杆菌，p h a e o b a c t e ri r 咖i b e n s , 间接e l i s a ，p c r 检测 两株海洋有益菌快速检测方法的建立及其应用 e s t a b l i s h m e n to fr a p i dd e t e c t i o nt e c h n i q u e so ft w os t r a i n so f m a r i n ep r o b i o t i c sa n dt h e i ra p p l i c a t i o n s a b s t r a c t m a r i n eb a c t e r i ay 5w h i c hc a nd e g r a d eo r g a n i c sp o l l u t a n t sw a si s o l a t e df r o mh e a l t h y s h r i m pc u l t u r ew a t e ra n dd l 2 w a si s o l m e df r o mm i c r o b i a lb i o f i l m so fa n t i s e p t i cs t e e lp i e c e s i na q u a t i cw a t t w h i c hh a da n t i b a c t e r i a la c t i v i t y b a s e do nm o r p h o l o g i c a l ，a p i2 0 ea n d1 6 s r r n ag e n ea n a l y s i s y 5w a si d e n t i f i e da sb a c i l l u san u sa n dd l 2w a si d e n t i f i e da s p h a e o b a c t e r 砌f 6 口脚e x t r a e e l h d a re n z y m a t i ca c t i v i t yo f s t r a i ny 5a n di n h i b i t o r ya c t i v i t yo f s t r a i nd l 2w e r et e s t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a ty 5h a dh i g ha c t i v i t i e so f e a s e i n a s e ，# u f i n a s e ， a m y l a s e ，l e c i t h i n a s ea n dl i p a s e ，a n dd l 2s h o w e d 埘d ei n h i b i t o r ys p e c t r u mi nt h e4 3s t u d i e d s t r a i n s ，e s p e c i a l l yf o rp a t h o g e n i cv i b r i os p a n t i s e r u mw a sp r o d u c e di naf e m a l en e wz e a l a n dw h i t er a b b i tb yi n j e e t i n gy 5 ，t h e i n d i r e c te n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y s 但l i s a ) d e v e l o p e df o rt h er a p i dd e t e c t i o no f y 5w a sd e v e l o p e da n dt h ed e t e c t i o nl i m i to f t h ee l i s aw a s1 0 5e e l l m 1 t h eg y r bg e n e so fy 5a n dd l 2w e r ea m p l i f i e du s i n gu n i v e r s a lp r i m e r su p - 1 f o p - 2 r o l i g o n u c l e o t i d ep c rp r i m e r sw e r ed e s i g n e db a s e do nt h es e q u e n c eo ft h et a r g e tg y r bg e n e t h ep r i m e rs e tb f i b r 2c a l ls p e c i f i c a l l yd e t e c ty 5 t h ed e t e c t i o nl i m i to f p r i m e rb r l b r 2 w a s7 6 x 1 0 3 c f u m la n di n5 0 u lp c rm i x t u r e st h el o w e rd e t e c t i o nl i m i t so f p r i m e rb r i b r 2 w a s1 2 5 p g t h es p e c i f i cp r i m e rs e tp f l p r 2c a ns p e c i f i c a l l yd e t e c td l 2 t h ed e t e c t i o nl i m i t o fp r i m e rp f l p r 2w a s2 9 8 x1 0 4 c f u m la n di n5 0 1 x lp c rm i x t u r e st h el o w e rd e t e c t i o nl i m i t s o f p r i m e rp f l p r 2w a s31 p g y 5a n dd l 2w e r ea p p l i e di nz e b r af i s ha n dc l a mc u l t u r e 晰t l lh i 曲d o s e t h el i v a b i l i t yo f y 5a n dd l 2i nh o s ti n t e s t i n e sw a ss t u d i e du s m gp c ra s s a ya s s o c i a t e dw i t hp l a t ec o u n t y 5 r e m a i n e dv i a b l em o r et h a n14d a y si n a q u a t i ca n i m a l si n t e s t i n e s ，w h i l ed l 2 r e m a i n e dv i a b l ef o ro n l ya b o u t2 4hi nt h ei n t e s t i n e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ty 5c a n i n c r e a s ea n ds u r v i v er a p i d l yi nt h eh o s ti n t e s t i n e s ，a n dt h es u r v i v a lo f d l 2w a sf e e b l e i nh o s ti n t e s t i n e s 两株海洋有益蓖快速检测方法的建立及其应甩 t h ep c r a s s a yw a sa p p l i e di nt h ed e t e c t i o no f s a m p l e si s o l a t e df r o md i f f e r e n te n v i r o m n e n t f o rt h ed e t e c t i o no fe n v i r o n m e n t a lt o t a ld n ao fq i n g d a os e a s i d e ，b os p e c i a lb a n d sw e r e a m p l i f i e dw i t hp r i m e rp a i r sb f l b r 2a n dp f l p r 2 h o w e v e r , t h e r ew e r e t w op o s i t i v e i s o l a t e sd e t e c t e df r o me n v i r o n m e n tw i t hp r i l l l e l s e tb f i b r 2 ，w h i l en op o s i t i v ei s o l a t e s d e t e c t e dw i t hp r i m e rs e tp f l p r 2 t oe n s i l r et h ed e t e c t e dv e r a c i t yo fp r i m e rb f l b r 2 ，16 s r r n ag e n e so ft h et w op o s i t i v ei s o l a t e sd e t e c t e df r o ma q u a t i ce n v i r o n m e n tw g l - ea m p l i f i e d a n ds e q u e n c e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb o t ho ft h ep o s i t i v ei s o l a t e sw g t ei d e n t i f i e da s b a c i l l u sa r m u s i nt h i ss t u d y ，i tw a sf o u n dt h a tt h e r ew e r em o r eb a c i l l u sf l r m u se x i s t e di n a q u a t i ce n v i r o n m e n tt h a ni no t h e re n v i r o n m e n ta n dt h e r ew a sf e wp h a e o b a c t e r 打咖访哪 e x i s t e di nn a t u r a le n v i r o n m e n t t h e r e f o r e ，p c ra m p l i f i c a t i o nw i t ht h ep r i m e rb f l b r 2c o u l d b ear a p i da n dr e l i a b l em e t h o df o rt h ed d e c t i o f b a c i l l u s f i r m u s k e y w o r d s ：p r o b i o t i c ；b a c i l l u s f i r m u s ；p h a e o b a c t e ri n h i b e n s ；i n d i r e c te l i s a , p c rd a 蜥o n 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得! 逵! 麴鎏查墓丝壶基挂型 虚蛆的! 奎拦卫窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名；蓄；毫培签字日期：刀司年i 月了e 1学位论文作者签名；暂，昏讶签字日期：刀司年i 月了 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名： 莓毒诵 签字日期：五田年多月弓日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签字： 签字日期：7 z 彩7 车月口日 电话： 邮编 两株海洋有益菌快速检测方法的建立及其应用 1 综述 1 1 微生物对养殖动物微生态系统的作用 微生态系统中微生物与微生物、微生物与宿主、微生物与其所处环境之间，存在着 错综复杂的依赖和制约关系。在养殖水体中，微生物处于流动的介质环境中，更易接近 宿主表面，所有水生生物暴露于各种各样的微生物中，生物体就成了微生物群落的天然 过滤器f j 缸等，2 0 0 1 ) 。因此，水生动物体内的微生物群落会受到环境中微生物菌群的 影响，随着外部环境的变化丽变化。其最佳状态是有益茵占优势，此时整个微生态系统 处于稳定的平衡状态。 水产动物是变温动物，体表和体内均有由正常菌群组成微生态系，对维持机体的微 生态平衡，抵抗病原菌的入侵发挥着重要的作用。消化道微生态系统对水产养殖动物有 着尤其重要的作用。消化道正常菌群区系建立后，肠道菌群作为一个整体对宿主产生影 响，参与并调节许多与化学环境有关的反应( t a n n o c k ，1 9 9 8 ) 。有益菌是通过对肠道菌群 施加影响而发挥作用的，保持肠道菌群平衡是肠道功能发挥最佳的前提条件( f o o k s 等， 1 9 9 9 ) 。根据细菌在宿主肠道上的定植力和停留时间，消化道菌群可分为固定菌群 ( a u t o c h t h o n o u s 或i n d i g e n o u s ) f 过路菌群( a l l o c h t h o n o u s 或t r a n s i e n t ) 。在水生动物上，有 益菌群多为过路菌群( m o r i a r t y 等，1 9 9 0 ) ，由于是变温动物，水产动物肠道中微生物菌 群会随着温度变化而发生变化( l 6 s e l 等，1 9 9 0 ) ，同时盐度、饲料、周围环境也对水产 动物肠道菌群产生重大影响( s a k a t a 等，1 9 8 0 ；m o r i a r t y 等，1 9 9 0 ；b e r g h a 等，1 9 9 4 ； r i n g o 等，1 9 9 5 ) 。过去对水环境中微生物的研究，大多侧重于有害微生物，尤其是病原 菌，现在随着健康养殖的发展，越来越多的学者从改善微生态环境入手，侧重于有益菌 的研究。 1 2 有益菌及其在水产养殖中的作用 1 2 1 有益菌的发展历史 有益菌( p m b i o t i c ) 这个术语最先由v e r g i o ( 1 9 5 4 ) 提出，l i l l y 和s t i l l w e l l ( 1 9 6 5 ) 把它引 申为“能促进其它微生物生长的微生物”，1 9 7 4 年p a r k e r 首次将有益菌定义为“有助 两株海洋有益菌快速检测方法的建立及其应用 于肠道菌群平衡的微生物和物质”，f u l l e r 等( 1 9 8 9 ) 则认为“有益菌是一种活的微生物饲 料添加剂，通过改善肠道的微生物平衡而有益于动物”。m o r i a r t y 等( 1 9 9 8 ) 把有益菌的 含义扩展到水产养殖中，定义为“一类添加到养殖水体中的有益微生物”。还有一些研 究者把“有益菌”的定义扩展为“一种单一或者复合的活菌培养物，应用于动物或人 体，通过改善消化道菌群的特性来对宿主产生有益的影响”。g a t e s o u p e 等( 1 9 9 9 ) 则具 体提出有益菌是“通过某种方式施用从而进入宿主肠道并保持活性，可改善动物健康的 活的微生物细胞”。而在某种程度上水环境中的微生物不仅作用于肠道还作用于动物的 鳃和皮肤的表面，甚至对栖息的水环境也起作用。在此基础上，g r a m 等( 1 9 9 9 ) 去掉对 肠道的限制，将有益菌的定义扩展为。一种活的微生物添加剂”。由于水生幼体早期阶 段的主要微生物群落部分地取决于所生存的水环境，故水中细菌的性质尤为重要( c a t f i u 。 1 9 9 0 ) 。因此，v e r s c h u r e 等( 2 0 0 0 ) 将益生菌的定义进一步扩展为“一种活的微生物添加 剂，通过改善与动物相关的或其周围的微生物群落，确保增加饲料的利用或增强其营养 价值，增强动物对疾病的应答或改善其周围环境的水质而有益于动物”，在水产养殖中 的应用也有单一的菌株发展到多种菌株的制剂，有益菌的概念由微生态环境中的生理性 菌群变迁为生态环境中的微生物优势菌群，微生态制剂( m i c r o b i a le c o l o g i c a la g e n t s ) 也应 运而生。 1 2 2 有益菌的作用 有益菌的研究己引起人们的广泛重视，并且通过实验数据也明确证实了许多作用方 式( f t f l l e r 等，1 9 8 9 ) 。大量的科学试验证实有益菌对动物机体能产生有益作用。水产养 殖中有关有益菌的作用方式往往是就具体情况而言的。下面介绍水产养殖应用中微生态 制剂几种可能的作用方式。 1 2 2 1 抑制物的产生 益生素的代谢产物如乳酸、醋酸、丙酸、过氧化氢和细菌素等活性物质能改善机体 生境的生物化学和生物物理环境，抑制外来和致病微生物的繁殖，从而有利于机体保持 生态平衡。许多从水产养殖环境分离的细菌体外可抑制己知的水产动物中出现的病原菌 ( a u s t i n 等，1 9 9 0 ；r e n g p i p a t 等，1 9 9 8 ；b e r g h 等，1 9 9 5 ；s u g i t a 等，1 9 9 8 ；t a n a s o m w a n g 等，1 9 9 8 ；p l a n a s 等，2 0 0 6 ) 。通过体外拮抗试验分离益生菌是本研究中获得益生菌菌 株的重要途径之一。益生菌在体外对病原菌的抑制作用与其在体内对宿主的保护之间存 2 两株海洋有益菌快速检测方法的建立及其府用 在联系，但到目前为止还没有这方面的报道明确证明在体内所观测到的菌株的抑制作用 是由于抑制物的产生。因而在这方面的研究还需深入。 1 2 2 2 竞争营养或附着位点 s m i t h 和d a r v y ( 1 9 9 3 ) 研究表明，荧光假单胞菌能抑制杀鲑气单胞菌( a e s a l m o n i c i d a ) 在培养基中的生长是由于竞争游离铁的缘故。s u g i t a 等( 1 9 9 8 ) 报道芽孢杆菌的抗菌活性 至少与含铁细胞的作用有关。g r a m 等( 2 0 0 1 ) 研究了能产生铁载体的荧光假单胞菌a h l 2 的应用。细菌在肠壁上的定植力是致病菌产生致病性的前提条件，同时也是衡量益生菌 的特征重要指标之一( b e a e h e y 等，1 9 8 1 ；f i n l a y 和f a l k o w ，1 9 9 7 ) ，通过竞争粘附位点 来排除致病菌也是益生菌的作用方式之一( e v e l y n ，1 9 9 6 ；f o o k s 等，1 9 9 9 ) 。王斌等( 1 9 9 6 ) 报道对肠壁有定植力益生菌能减少鲤鱼肠道大肠杆菌等致病菌的数量，提高鲤鱼的生产 性能。t o v a r 等( 2 0 0 2 ) 利用d t a f 标记酵母进行体外粘附性研究，结果表明酵母对鲈鱼 ( d i e e n t r a r c h u sl a b r a x ) 幼体的肠道具有粘附性。 1 2 2 3 刺激免疫系统，增强免疫力 有益菌以作为非特异性免疫调节因子的方式，通过细菌本身或细胞壁成分刺激机体 免疫细胞，使其激活，产生促分裂因子，促进吞噬细胞活力或作为佐剂发挥作用。此外， 微生态制剂中的有益菌还可发挥特异性免疫功能，促进机体的b 细胞产生抗体的能力。 r e n g p i p a t 等( 1 9 9 8 ) 向斑节对虾投喂芽孢杆菌s l l ，结果表明，菌株s l l 菌株能有效地激 活对虾细胞吞噬作用，而且能通过激活对虾的细胞和体液免疫以及通过肠道中的竞争排 斥而防御疾病。但是目前对于有益菌的免疫刺激作用仍处于争论之中。 1 2 2 4 营养作用 有益菌的营养作用表现为： 1 ) 自身作为营养物质能被机体消化利用； 2 ) 参与维生素的合成，提高机体对矿物质和微量元素的利用率； 3 1 能够产生消化酶，提高营养物质的利用率( h o l z a p f e l 等，1 9 9 8 ) 。 研究表明，肠道菌群能够提高消化酶活性( l e s e l ，1 9 7 9 ) 、提供多种微量营养元素。 s c h r i j v c r 和o l l e v i e r ( 2 0 0 0 ) i 句大峻鲜幼苗饲料投饲弧菌能提高饲料中蛋白质的消化率。 l y n n 等( 1 9 9 9 ) 报道具有芽抱杆菌分泌淀粉酶和蛋白酶的功能。此外，有益菌还能够调节 肠道微生物酶的活性( g o l d i n 等，1 9 9 2 ；p e d r o s a 等，1 9 9 5 ) 。因此，在本研究中，从健康 对虾养殖环境中分离筛选出具有分泌消化酶或提高肠道消化酶活性的土著菌株作为获 得有益菌的途径之。 两株海洋有益菌快速检测方法的建立及其应用 1 2 2 5 改善水质 有益菌进入养殖池后，发挥其氧化、氨化、硝化、反硝化、解磷、硫化、固氮等作 用，把养殖动物的排泄物、残存饲料、动植物残骸等有机物迅速分解为硝酸盐、磷酸盐 等，为单细胞藻类生长繁殖提供营养。单细胞藻类的光合作用又为有机物的氧化分解、 微生物及养殖生物的呼吸提供溶解氧构成一个良胜生态循环，使养殖池里的菌藻趋于平 衡，维持和营造良好的水质条件。张庆等( 1 9 9 9 ) 每隔1 5 d 向罗非鱼养殖水体中添加菌剂 能明显改善水质条件，增强底层溶解氧，有效降低氨氮与亚硝酸盐。李卓佳等( 1 9 9 8 ) 应 用以芽抱杆菌为主的微生物复合菌剂进行分解养鱼池有机污泥的试验，发现芽孢杆菌能 有效地分解有机污泥，促进鱼类生长。l i n 等( 2 0 0 6 ) 报道向养殖水体中添加有益菌能有 效改善养殖生态环境。 1 2 2 6 促生长作用机理 有益菌不仅能提高对病原菌的抵抗力，防治疾病，而且具有促生长的作用。作为饵 料添加剂的许多有益菌，其菌体本身含有大量的营养物质，同时随着它们在动物消化道 内的繁衍、代谢，可产生动物生长所需的维生素、有机酸、蛋白质等营养物质和未知生 长因子。d o u i l e t 和l a n g d o n ( 1 9 9 4 ) 报道了一株有益细菌对太平洋牡蝠幼体生长的促进作 用。g a r r i q u e s 和a r e v a l o ( 1 9 9 5 ) 报道了有益微生物溶藻胶弧菌对万氏对虾幼体的作用， 他们发现在养殖水体中使用这种菌能提高万氏对虾幼体的成活率并促进幼体的生长。 1 2 3 有益菌在水产养殖中的应用 k o z a s a ( 1 9 8 6 ) 首次将有益菌应用于水产养殖中，用1 株从土壤中分离的芽孢杆菌 ( b a c i l l u st o y o o 处理日本鳗鲡，降低了由爱德华氏菌引起的死亡率。从此，有益菌的研 究得到了迅速的发展。有益菌的应用旨在调节和改善养殖环境微生态平衡，控制和减少 养殖动物爆发性病害的发生，提高养殖动物的的免疫力，增强其抗病能力，促进水产养 殖业健康稳定发展。 目前从养殖水体、养殖动物体表或体内筛选分离土著菌作为潜在的有益菌应用于水 产养殖中已成为众多学者的研究热点。n o g a m i 和m a e d a ( 1 9 9 2 ) ：报道了自蟹池中分离到一 株益生菌，该菌可以竞争性抑制养殖池水体中常见病原菌的生长，同时不会杀死和抑制 有益微藻等其他生物，提高蟹菌的成活率。r o b e r t s o n 等( 2 0 0 0 ) 从大西洋鲑鱼的肠道内分 离到有拮抗作用的肉杆菌，可以减少由杀鲑气单胞菌等引起的病害。v i n e 等( 2 0 0 4 ) 从二 4 两株海洋有益茵快速检测方法的建立及其应用 线小丑鱼的幼鱼体内分离到一株有拮抗作用的海洋细菌，对弧菌和气单胞菌有较强的抑 菌作用。a u s t i n 等( 1 9 9 5 ) 报道了一株溶藻胶弧菌，用此菌处理鲑鱼可减少杀鲑气单胞菌、 鳗弧菌等病原菌感染所造成的疾病，而且该菌对大西洋鲑鱼没有危险性。g a r d q u e s 和 a r e v a i o ( 1 9 9 5 ) 报道了有益菌溶藻胶弧菌对万氏对虾幼体的作用，发现在养殖水体中使用 这种菌能提高万氏对虾幼体的成活率并促进幼体的生长。g i b s o n 等( 1 9 9 8 ) 等将中间气单 胞菌应用于太平洋牡蛎养殖中，发现该菌能增强牡蛎幼苗对塔式弧菌病害的抵抗力。 m a e e y 和c o y n e ( 2 0 0 5 ) 发现有益菌的使用可以增强鲍鱼抵抗病害的能力，促进它们的生 长。 国内的研究者在水产微生态制剂方面也做了不少的工作，例如，游锦华等( 1 9 9 5 ) ， 孙舰军和丁美丽( 1 9 9 9 ) ，王怡平等( 1 9 9 9 ) 报道了光合细菌添加在对虾饲料中和养殖水体 中，对促进对虾的生长和改善水质都有重要的作用，能为生物体宿主提供蛋白质、维生 素、矿物质等，同时可产生生物活性物质。薛恒平等( 1 9 9 6 ) 将用芽抱杆菌、光合细菌、 蛭弧菌等制成的“益生菌王”应用到虾池内，发现能提高对虾的抗病力，提高对虾产量。 莫照兰和徐怀恕( 1 9 9 8 ) 报道了有益菌在水产养殖中应用，提出了有益微生物及其代谢产 物能抑制有害微生物，改善水生动物机体代谢，补充机体营养物质生长、刺激机体免疫 系统，提高机体免疫力以及参与生物降解，消除水中有机污染物等。王祥红等( 2 0 0 2 ) 将 有广谱抑菌作用的橙色交替单胞菌a 1 8 ( a l t e r o m o n a sa u r a n t i a ) 应用于海湾扇贝育苗系统 中，降低了水体的弧菌数量，提高了扇贝幼苗的变态率和成活率。“等( 2 0 0 6 ) 将对弧菌 有拮抗作用的烟草节杆菌口r t h r o b a c t e r n i c o t i a n a ) 应用于中国对虾仔虾培育系统中，发现 该菌能抵抗弧菌，可以作为有益菌对对虾幼苗产生保护作用。 有益菌在海水养殖中的使用，通常通过浸浴、饲料添加剂、饵料动物携带、直接施 入水体等方法施加( 毕永红和王武，2 0 0 0 ：b r a m b i l l a 和f i l i p p i s ，2 0 0 5 ) ，尽管这四种方 法有一定的使用范围，但在实践中都取得了良好的效果。 1 3 细菌检测的方法的建立及应用 当前国内外检测细菌的手段主要分为三大类，即：传统的细菌鉴定检测方法、血清 学检测技术和分子生物学检测技术。 两株海洋有益菌快速检测方法的建立及其应用 1 3 1 传统的细菌鉴定检测方法 1 3 1 1 依据形态和生理生化反应特征 这种方法就是对细菌进行分离、培养和纯化，观察菌落形态，包括大小、质地、颜 色等；再对纯培养物进行染色和各种生理生化测定，进一步对其作出判断。因为此种检 测方法需要对细菌进行分离和纯化，且特性试验的结果因培养温度、培养时间长短、培 养基成分和确定阴性阳性的标准不同而变化，可靠性、稳定性差，且费时费力，不便于 生产上的应用。目前也有一些细菌可以用选择性培养基来检测。例如检测弧菌可以用 t c b s 培养基培养观察是否产生绿色或黄色的菌落进行初步诊断( 徐怀恕等，1 9 9 9 ) 等。 1 3 1 2 利用自动化鉴定系统来检侧 2 0 世纪8 0 年代后期美国研制出一种专门用于细菌诊断、鉴定的专家系统，将细菌 生理生化过程的检测、分析和统计等有机地结合起来，利用一些辅助软件和设备，自动 完成待测细菌对各种碳源的利用及代谢情况的指数，自动完成数据的检索和鉴定。目前 还有许多其它自动鉴定系统，如b i o l o g 细菌自动鉴定系统。b i o l o g 鉴定系统主要 根据细菌鉴定对9 5 种碳源的利用情况，将结果经计算机处理后并与数据库内己知的细 菌比较，通过比较菌株碳源利用的代谢指纹，实现对待测菌株的快速鉴定及检测。该系 统是一种快速、相对准确且标准化程度高的鉴定系统，已广泛应用于细菌快速鉴定，但 由于不同菌株的生理代谢不尽相同，数据库中的标准菌株也不多，对一些未知细菌的鉴 定常有误差，故鉴定结果还不十分理想。 1 3 2 血清学检测技术 血清学检测技术是以抗原、抗体为基础，利用抗原抗体的特异性反应来检测细菌， 目前细菌血清学检测技术的应用主要有以下几个方面： 1 3 2 1 凝集反应测定 颗粒性抗原如细菌菌体、红细胞等在适当的电解质条件下与相应的抗体会互相凝集 成肉眼可见的凝集小块，凝集试验是常规血清学检验方法之一，是颗粒性或细胞性抗原 ( 如菌体细胞等) 与相应的抗体混合后。在电解质环境中，彼此发生特异性结合，形成抗 原抗体复合物，再由这些复合物相互凝集成为肉眼可见的凝集块。因此利用凝集反应可 以较快地对细菌进行定性检测，将抗血清繁殖稀释后可定量地检测抗原( 病原细菌) 的数 6 两株海洋有益菌快速检测方法的建立及其应用 目。其操作方法可分为玻片法、玻板法、试管法及微量凝集试验等。凝集反应是一种最 基本且简便快速的实用方法，不需要特殊的技术和仪器设备，但该方法对于同源免疫原 无法区别，且灵敏度不高，当结合交叉吸附试验时，也能鉴定出亲缘关系相近的细菌。 1 3 2 2 酶联免疫吸附技术( e l i s a ) 1 9 7 1 年e n g v a l l 建立了酶联免疫吸附测定( e n z y m el i n k e di m m u n o l o g ya s s a y , e l i s a ) 。该方法是把抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起来 的一种综合技术。它以酶或者辅酶作为标记物，标记抗原或者抗体，用酶促反应的放大 作用来显示初级免疫学反应，并用聚苯乙烯微量反应板( 或球) 吸附抗原或者抗体，使其 固相化，在其中进行免疫反应和酶促反应。e l i s a 具有选择性好、结果判断客观准确、 实用性强、样品处理量大等优点，弥补了经典化学分析方法和其他仪器测试手段的不足。 r o b e r t s o n 等( 2 0 0 0 ) 利用e l i s a 方法结合平板涂布法成功检测了对虾及水体中哈维氏弧 菌的存在情况。 e l i s a 的最大特征是灵敏度高，特异性强，安全、快速并易观察。它可进行定性定 量测定，适于大批量样品的检查、可用于病害普查，口岸检疫和产地检疫等，是目前应 用最广、发展最快的一项免疫测定技术。但是由于e l i s a 对试剂的选择性高，很难同 时分析多种成分，抗体对结构类似的抗原有一定程度的交叉反应，分析分子量很小的化 合物或不稳定的化合物有一定的困难。 1 3 2 3 免疫荧光抗体技术( i f a t ) 免疫荧光是另一种以抗体为基础在细菌检测中具有重要应用价值的技术。其原理是 将荧光物与微生物抗体结合得到荧光抗体，荧光抗体与相应的抗原结合，在荧光显微镜 下发生荧光，以此来检测抗原。免疫荧光技术有直接法和间接法两种，在实践中常用间 接法，一抗与结合有荧光色素的二抗结合，通过免疫荧光显微镜来检测所发出的荧光。 免疫荧光技术检测的灵敏度一般为l 矿1 0 4 c e l l m l ，不仅可对每个着色细胞计数，而且 可观察细胞的形态。i f a t 和e l i s a 技术是最常用的免疫学检测技术。在某些情况下， i f a t 与e l i s a 相比，灵敏度大致相等，在定性检测方面，i f a t 比e l i s a 表现出操作 更简便、更灵敏快速的优点。 1 3 2 4 免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是8 0 年代继三大标记技术( 荧光素、放射性同位素和酶) 后发展起 来的固相标记免疫测定技术。其基本原理是以微孔滤膜为载体包被已知抗原或抗体，加 入待检标本后，经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗 7 两株海洋有益菌快速检测方法的建立及其应用 体或抗原结合，再用胶体金结合物标记而达到检测目的。其特点是单份测定、简单快速、 特异敏感、不需任何仪器设备和试剂，几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明的实验结果， 并可保存实验结果。 1 3 2 5 免疫金银染色技术 1 9 8 1 年d a n s c h e r 建立了免疫金银染色技术( i m m u n og o l d - s i l v e rm i n i n g ，i g s s ) ，在 普通光镜下就可观察到清晰的胶体金标记抗体的阳性结果，扩展了胶体全标记抗体的应 用范围。免疫金银染色技术具有可在光镜下观察，成本低，灵敏度高，快速，操作简单， 定位正确，具有双重标记功能等优点。随着这项技术的不断完善，其在细菌的检测、定 位和鉴定上，将发挥更大的作用。 1 3 2 6 免疫磁性分离技术 免疫磁性分离技术是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检细菌发生特 异性的结合，载有细菌的磁性颗粒在外加磁场的作用下，向磁极方向聚集，弃去检样混 合液，使待检菌不断得到分离、浓缩。免疫磁性分离技术代替了常规的选择性增菌培养 过程，可特异有效地将目的微生物从样品中快速的分离出来。在实际应用中，该技术还 可以与直接镜检技术、酶联免疫试验、p c r 等技术相结合应用。 1 3 2 7 免疫微球技术 免疫微球技术是以血清学为基础利用包被有免疫活性物质的各种微球进行血清学 或其它生物学检测的一项技术。因为简便、高效、实用，近年来已渗透到免疫学、微生 物学、分子生物学等各个领域，尤其在血清学检测、细胞分离和蛋白质纯化等方面己取 得巨大进展。 1 3 3 分子检测技术 自1 9 8 5 年m u l l i s 等发明多聚酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ，p c r ) 技术以来， 随着分子生物学的发展、信息化和计算机的辅助分析，细菌的快速检测和病害诊断成为 现实。p c r 检测技术是利用相应的引物，在d n a 聚合酶催化下对目标d n a 进行体外 扩增，根据预期d n a 条带的有无来判断检测的结果。其特异性取决于引物和扩增反应 条件；灵敏度则取决于每次分析样品中目标菌的最低剂量，以及样品制备方法对p c r 反应的影响。 1 3 3 1 使用特殊基因和d n a 序列检侧细菌 1 3 3 1 1 核糖体d n a 为基础的检测 两株海洋有益菌快速检测方法的建立及其应用 细菌核糖体d n a 的操纵子由3 个有功能的保守序列1 6 sr d n a ，2 3 sr d n a 和 5 s r d n a 组成，由可变异的转录间隔区( i n t e r n a l l yt r a n s c r i b e ds p a c e r ，i t s ) 分隔。现在根 据r d n a 的特征区别细菌的许多方法己被应用。用保守序列的引物( 一般是通用引物) 可 以扩增出系统发育中不同的细菌核糖体基因片段。从有关核糖体数据库中，可以得到一 些资料来设计特异性扩增的引物；或者通过扩增r d n a ，产物经测序后选择病原菌特异 性的引物序列。 ( 一) 1 6 sr r n a 基因扩增和序列分析 以1 6 sr r n a 为基础的分子生物学技术己成为鉴定微生物普遍接受的方法，该技术 主要利用不同微生物在1 6 sr m a 基因序列上的差异来进行微生物种类的鉴定和定量分 析。m u t s u k i 等( 1 9 9 8 ) 设计了针对1 6 s r r n a 的种和亚种特异性的引物，可以鉴定出入肠道 中常见的双歧杆菌群；沈永才和袁佩娜( 2 0 0 1 年) 等利用1 6 sr r n a 基因的p c r 法鉴定了8 株双歧杆菌，并1 6 sr r n a 基因荧光定量p c r 法对双歧杆菌进行了定量检测；g o r k i e w i c z 等( 2 0 0 3 ) 利用1 6 sr r n a 基因部分序列的分析对弯曲杆菌进行了鉴定。a l t u n 等( 2 0 0 4 ) 利 用1 6 sr r n a 基因序列分析对分离自虹鳟鱼中的格氏乳球菌( l 8 c - c t o c o c c u sg a r v i e a e ) 进行 了鉴定。 ( 二) i t s - p c r i t s p c r 分析是首先由g o n z a l e a 提出，随后逐步发展起来的全新的分子标记。它 是利用保守的1 6 s r d n a 和2 3 s r d n a 序列，设计引物扩增转录间隔区域。1 6 s r d n a 和 2 3 s r d n a 之间的i t s 区域包括一些t r n a 基因和非编码区域，其优点在于：具有高拷 贝数，同时包含保守与变异序列，能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异 性扩增比较。虽然细菌的i t s 总的说来是相对保守的，但其问有足够的变异位点可以用 于鉴别性比较，比1 6 s 和2 3 s r d n a 变异更大，而且其多拷贝数使鉴别性的扩增更加灵 敏。b y u n 和y o o n ( 2 0 0 3 ) 利用分析1 6 sr d n a 和2 3 sr d n a 间区序列的方法对一株鼠李糖 乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s r h a m n o s u s ) 进行了鉴定；k w o n 等( 2 0 0 4 ) 利用对1 6 s - 2 3 sr d n a 进行 套式p c r 的方法，对多株乳杆菌进行了快速鉴定。 ( = ) a r d r a 扩增核糖体d n a 限制性酶切分析( a m p l i f i e dr i b o s o m a l d n ar e s t r i c t i o n a n a l y s i s a r n r a ) ，是利用通用引物扩增r d n a 序列，用内切酶限制性切割消化( r e a ) 后，得到其多态性用于属水平上有时可达到种水平上的细菌菌株的鉴定和分类的方法。 a r d r a 可以用于细菌属或种水平上的鉴定，对于系统发育和分类的研究也非常有用。 9 两株海洋有益菌快速检测方法的建立及