（生物化学与分子生物学专业论文）体外cik细胞的细胞因子表达谱研究.pdf

雷静硕士学位论文答辩委员会成员名单 _ 珏需职称单位备注 研究员 严缘昌中国科学院生物化学与细胞生物学研究所 主席 博导 教授 孙皎第二医科大学附属第九人民医院 博导 教授 吴自荣 华东师范大学生命科学学院 博导 叶希韵副教授华东师范大学生命科学学院 周忠良副教授华东师范大学生命科学学院 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他 个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和 集体，均巳在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：遴 学位论文使用授权声明 日期：! 尘! ：z 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复剁并允许论文进入学校图书馆被查阅。有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 、 学位论文作者签名：谱稽导师签名：饧甲 日期：w d o 日期：莎叫，t 兰銮塑苎苎兰! ! 竖! 塑主塑兰 体外e lk 细胞的细胞因子表达谱研究 院系：生全盘堂堂瞳 专业：垒堑垡生墨佥主生堑茔 方向：金i 鱼瘗鲎 研究生：重盐 指导老师：童型塾撞 奎迄盟窒员 芒缝置塑窥员 垡量錾撞 摘要 1 9 8 6 年，s c h m i d t 和l a n i e r 等人先后报道用细胞因子从外周血单核细胞r 扣 诱导出表型为c d 3 + c d 5 f 的细胞。因其在体外能经i l - 1 、l l 一2 、i f n y 等的刺激 诱导分化成效应细胞，故称为细胞因子诱导的杀伤细胞( c y t o k i n e i n d u c e dk i l l e r c e l l s ，c i k ) 。目前，c i k 用于肿瘤治疗已进入临床试验阶段，并发展了d c 与 c i k 的共培养体系用于肿瘤的免疫治疗。 最近我们发现，c i k 细胞的培养上清液能够有效地阻断s a r s 病毒感染非 洲绿猴肾源e 6 细胞( 未发表) ，推测c i k 细胞可能是在诱导和培养过程中表达 了某些重要的细胞因子而抑制病毒的增殖和感染性，这为治疗s a r s 疾病提示 了一种可能途径。c i k 细胞的高效肿瘤抑制活性在临床试验中已经得到广泛认 可，但有关其细胞因子类别和表达水平的研究还未有系统报道。 我们用f i c o l l 分层液从健康人外周血中分离得到非黏附性淋巴细胞，采用 抗c d 3 单克隆抗体包被瓶培养的方法。用细胞因子i f n ni l l 、i l 2 刺激和 诱导使其分化成具有c d 3 + c d 5 6 + 表型特征的c i k 细胞。用流式细胞仪进行表型 检测，以确定效应细胞的纯度和质量。用台盼蓝染色和f a c s 鉴定细胞的存活 华东师范火学2 0 0 5 届硕j 论殳 率，用m t t 法检测c i k 的肿瘤杀伤活性。以人g a p d h 为参照基因，r t - p c r 定性和半定量检测在培养的第6 、1 0 、2 0 和3 0 d 四个时期c i k 细胞的i f n s 1 1 t n f 家族和t g f 家族成员中的2 5 个细胞因子的表达情况。用s y b r g r e e n i 掺 入的r e a l t i m ep c r 技术进行定量，探讨了c i k 细胞的细胞因子表达随着培养 时间延长的变化，揭示了目标细胞因子与c i k 细胞抗肿瘤和抗病毒作用问的关 联。构建和克隆了新的细胞因子i f n l 2 全长e d n a 。结果表明。在我们的诱导 方法和诱导条件下获得的c d 3 + c d 5 6 + 细胞阳性百分率均可达5 0 以上，存活率 9 0 以上。增殖活性随着培养时间的延长而上升，最高集中在1 4 2 1 d 。该诱导 条件下获得的c i k 细胞不表达i f n - 毋、i f n k 等细胞因子，但能广泛表达i f n 、 t n f 和i l 家族的多种细胞因子。i f n 家族成员多集中在1 0 2 0 d 高表达，初期 和末期都较低；i l 家族多数成员在6 1 0 d ( 或2 0 d ) 时稳定表达，后略有下调： t n f b 和t r a i l 各时期组成性表达，表达水平变化很小或几乎不变。t n f d 第 2 0 d 时高表达。t g f d l 则集中在后期表达，个体差异小。因此，c i k 或d c l k 免疫疗法除了用于抗肿瘤治疗外还有可能用作临床抗病毒感染治疗。 关键词：c i k ，细胞因子，肿瘤，r t - p c r ，r e a l t i m ep c r 一竺查堕些查兰! ! ! ! 旦堡! ：笙兰 s t u d y o nt h ec y t o k i n e se x p r e s s i o n p r o f i l e so fc i k c e l l si nv i t r o a b s t r a c t s c h m i d ta n dl a n i e rf o u n dc d 3 + c d 5 6 + c e l l sf r o mp e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a r c e l l si n d u c e db y c y t o k i n e si n c l u d i n gi l 一1 、i l - 2 、i f n yi n1 9 8 6f o r t h ef i r s tt i m e ，a n d t h e nb et i t l e da sc y t o k i n ei n d u c e dk i l l e rc e l l so rc i kc e l l s n o w a d a y s ，c i kh a sb e e n a p p l i e d i nc l i n i c a lt r i a l sf o rm m i g n a n c yt h e r a p y a n dm a n yn e wa l t e r n a t i v e sf o r c a n c e r t h e r a p yh a v ed e v e l o p e d ，s u c h a sd c ，c i ka n dc o c u l t u r eo fd ca n dc i k o u rl a bh a v ef o u n dt h a tt h es u p e m a t a n to fc ! kc e l l sc u l t u r e di nv i t r oc o u l d b l o c kt h ee 6c e l l s b e i n gi n f e c t e db ys a r sv i r u s t h e yc a nb e i n d u c e di nt h e p r e s e n c eo fc y t o k i n e si n c l u d i n gl l 一1 ，i l - 2 ，i f n ya n dm o n o c l o n a la n t i b o d ya g a i n s t c d 3f r o mi t sp r e c u r s o rl y m p h o c y t e s c i kc e l l sh a v ead o u b l ep o s i t i v ep h e n o t y p e c h a r a c t e r s - - c d 3 + c d 5 6 + , t h e yb e l o n g t ot l y m p h o c y t e s w i t hn k l i k es u r f a c e m a r k e r sc d 5 6 + c i kc e l l sh a v eb e e nr e g a r d e da san o v e lc h o i c et oc u r em a l i g n a n t t u m o r sa n da c u t el e u k a e m i ao ro t h e rd i s e a s e s a c t i v a t e dc i kc e l l sc o u l de x e r ta b r o a da n t i t u m o rf u n c t i o na n dc l e a rt h em i n i m a lf o c u si np a t i e n t sw i t hl e u k a e m i aa n d m a l i g n a n tt u m o r t h e e f f e c t o rp a t h w a y si n c l u d es e c r e t i n gg r a n u l e sw i t h b a c t e r i o l y s i n a n de n z y m e s ，l i g a n da n dr e c e p t o rp a t h w a y s ，s u c ha sf a s f a s la n dt n fr e l a t e d p a t h w a y s g r a n u l e sw i t hp e r f o r i n gp r o t e i n sp l a yt h em o s ti m p o r t a n tr o l ei nt h e i r a n t i t u m o re f f e c t w es u p p o s e dt h a t c y t o k i n ee x p r e s s e do rs e c r e t e db yc i kc e l l s m i g h tf u n c t i o na l o ti nt h ep r o c e s so f d e l e t i n gt u m o r c e l l sa n dn o r m a lc e l l sa t t a c k e d b ym a l i g n a n c ya n dv i r u s w em a d e as t u d yo nt h ec y t o k i n e se x p r e s s i o np r o f i l e so f c 1 kc e l l st ol e a r na b o u tw h a ti st h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n c y t o k i n e sa n da n t i t u m o ro r a n t i v i r u st os e tu pan e w p r o j e c ti nc l i n i c a lt r i a l st oc u r ep a t i e n t si n f e c t e dw i t hv i r u s f i c o l lw a su s e dt os e p a r a t en o n - a d h e s i v el y m p h o c y t e sf r o mp e r i p h e r a lb l o o d m o n o c y t e so fh e a l t h yd o n o r sa n dt h e nt h e yw e r ei n d u c e dt oc i kc e l l sw i t ht h ec e l l p h e n o t y p e c h a r a c t e r so fc d 3 + c d 5 6 + i nt h e p r e s e n c eo fi l 1 、i l 一2 、i f n - t a n d m o n o c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tc d 3 ，t h ef l a s kw a sc o a t e dw i t hm o n o d o n a la n t i b o d y a g a i n s tc d 3 t om a i n t a i n h i g ha m p l i f i c a t i o na b i l i t yb e f o r ec i kc e l l sw e r et r a n s f e r r e d i n t oi t t h ec e l ls u r f a c em a r k e r sw e r ed e t e c t e db yf l o wc y t o m e t r i c a n a l y s i si no r d e r t oc h e c kt h e p u r i t ya n dq u a l i t yo fc i kc e l l sf o rm a k i n gt h ef o r t h e rs t u d vt 1 1 e 一3 一 华东师范大学2 0 0 5 届硕士论文 s u r v i v a lr a t ew a sd e t e r m i n e dd y e i n gb yt a i p a n l a na n dt h ec y t o t o x i c i t yt ot u m o r so f c i kc e i l sw e r ea n a l y z e db ym t ta s s a y w em a d ea n o t h e rs t u d yo nc y t o k i n e s e x p r e s s i o np r o f i l e su s i n gs e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c r m e t h o dd u r i n gc i kc e l l sw e r e c u l t u r e di nv i t r of r o md a y 6t od a y 3 0 t h er e s u l t sw e r en o r m a l i z e dt oh u m a ng a p d h t h e nw e p r o c e e d e d t o q u a n t i f y i n g s o m e i m p o r t a n t a n di n t e r e s t c y t o k i n e sb y r e a l t i m er t - p c ru s i n gs y b rg r e e nia n dc l o n i n gan o v , q c y t o k i n e s ( 1 f n 一尥、 w h i c hm i g h th e l pl e a r nt h ea n t i t u m o ra n da n t i v i r a lm e c h a n i s m so fc i kc e l l so rf i n d s o m en o v e lc y t o k i n e sa b l et oi n t e r d i c tv i r u st oi n f e c t i n g w es u c c e e d e dt o a c q u i r i n gt h ee y t o k i n e se x p r e s s i o np r o f i l e si nt h el e v e l o f m r n a ，a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tc i kw a sah e t e r o g e n e o u sp o p u l a t i o nw i t h d i f f e r e n tc e l l u l a rp h e n o t y p e s t h e p e r c e n t a g eo fc d 3 + c d 5 6 + p o s i t i v ec e l l sc a m eu p t o8 02l a st h ed o m i n a n te f f e c t o rc e l l s i na d d i t i o n c i kc e l l sc o u l dw i d e l y e x p r e s s i nv i t r ov a r i o u sk i n d so f i n f l a m m a t o r y r e l a t e d c y t o k i n e ss u c ha si f n s 、i l s 、 t n f sa n d t g f 一1 31 s u p e m a t a n t o fc i kc e l l s p o s s e s ss t r o n gc y t o t o x i c i t y o n s a r s i n f e c t e de 6c e l l s i nc o n c l u s i o n ，c y t o k i n e sm i g h t p l a yak e yr o l ei na n t i t u m o r a n da n t i i n f e c t i o ni m m u n er e a c t i o n c i ko rd c i kw o u l db ea n p r o m i s i n ga p p r o a c h i nc l i n i c a lt r a i l st oi n h i b i to r c u r e p a t i e n t si n f e c t e dw i t hv i r u s e sv i av a r i o u sc y t o k i n e s s e c r e t e do r e x p r e s s e db y c i k k e y w o r d ：c i k c e l l s ，c y t o k i n e ，t u m o r , r t - p c r ，r e a l t i m ep c r ，s a r s 4 - 生查墅垄叁兰! ! ! ! 旦堡土丝兰一 综述 第一章免疫效应细胞及细胞因子在肿瘤治疗中的研究 第一节c i k 细胞研究概述 1 、c l k 细胞的发现 1 9 8 6 年，s c h m i d t 1 1 和l a n i e r 2 等人最早发现c d 3 + c d 5 6 + 细她的存在。之后 o f t a l d o | 3 1 等证实该表型特征的细胞能以非m h c 限制方式广谱杀瘤，并对该细胞 的生物学功能、t c r 受体基因重排及穿孔蛋白的表达等作了比较分析。c i k 细 胞的前体是t 细胞而非n k 细胞，体外在i l - l 、i l 一2 、i f n y 等的刺激下能诱导 增殖并活化成杀瘤效应细胞。活化的c i k 细胞能分泌多种细胞因子，参与免疫 应答反应。一般常用外周血单核细胞( p b m c ) 或脐m 来源的单核细胞诱导c i k 细胞的产生。l up h 等最早发现加入i f n ni l - 2 、i l 一1 和m a b c d 3 能使 c d 3 + c d 5 6 + 细胞数目增长1 0 0 0 倍，杀瘤活性也大大提高。体夕 c i k 细胞的诱 导分化技术也在不断完善和发展。已有报道，添加i l 5 、i l 一7 、i l 1 2 等细胞因 子也能诱导c i k 细胞的增殖和杀伤活力。 2 、c i k 细胞的生物学特性 许多研究表明，c i k 细胞能广谱杀瘤，如对人肝癌细胞b e l 一7 4 0 4 、肺腺癌 上皮细胞a 5 4 9 、乳腺癌细胞a 3 7 5 等都有较好的抑制和杀伤活性。目前，l f i 床 发展的用于肿瘤免疫治疗的效应细胞主要有细胞毒t 细胞( c y t o t o x i ct l y m p h o c y t e ，c t l ) 、肿瘤侵润性淋巴细胞( t u m o r i n f i l t r a t e dl y m p h o c y t e 。t i l ) 、 淋巴因子活化的杀伤细胞( l y m p h o k i n e a c t i v a t e dk i l l e r , l a k ) 、c d 3 单抗活化 的杀伤细胞( c d 3m a ba c t i v a t e dk i l l e r , c d 3 + a k ) 、细胞因子诱导的杀伤细胞 ( c y t o k i n e i n d u c e dk i l l e r , c i k ) 和树突状细胞与c i k 共培养获得的效应细胞群 ( d c i k ) 等。这些效应细胞一般是在体外加入一定的活化剂或诱导剂，经体外 培养而获得的具有更高增殖能力和效应功能的细胞。通过多种途径对肿瘤细胞 起到杀伤作用，且各途径之间密切关联，但细胞来源方面有一定的差异。 自然杀伤细胞( n a t u r a lk i l l e r ，n k ) 来源于骨髓，一般认为是原始杀伤性 t 细胞。l a k 细胞的前体是n k 和t 淋巴细胞，体外可以经i l 一2 单独作用活化 诱导产生效应细胞。c i k 为异质性细胞群体，9 6 以上为t 细胞，由外周血单 核细胞在c d 3 单抗及外加细胞因子诱导产生。d c i k 是d c 与c i k 共培养获得 的效应细胞群，研究表明，该条件下效应细胞增殖与细胞毒活性、抗原特异性 华东师范大学2 0 0 5 届硕士论文 都明显增强。c i k 能以非m h c 限制方式在抗肿瘤免疫中发挥作用。一般而言， c i k 的免疫活性强于l a k 。临床应用表明，自体c i k 细胞对骨髓中白血病细胞 的清除率比l a k 细胞高2 3 个数量级。d c 与c i k 共培养，理论上应能得到 具有二者抑瘤共同优点的d c i k ，靶向专一性和其杀伤效力都明显高于同样条 件下的c i k 细胞。细胞表型测定证明其仍属c i k 细胞范畴。 效应细胞多表达一些特征性的细胞表面分子，以启动免疫应答或介导肿瘤 或病毒的杀伤途径。已知n k 、l a k 、c i k 及d c i k 都表达c d 5 6 分子，兼有免 疫监视和抗肿瘤功能。研究发现，在l a k 和c i k 异质性细胞群中c d 5 6 + 细胞 能更有效地杀伤肿瘤。不同来源的c d 5 6 + 细胞表达的趋化因子种类不同，可能 是通过相应的趋化因子受体将效应细胞引导定位到肿瘤组织或炎症部位，从而 发挥杀伤作用。有关效应细胞生物学特性的相对比较综合文献和我们的实验结 果做以下估计( 见表1 ) 。 表1 免疫效应细胞生物学特性的比较 t a b 1c o m p a r i s o no f b i o l o g i c a lc h a r a c t e r so f i m m u n o e f f e c t o rc e l l s m a i ne f f e c t o r1 b t a l c e l lc e l lt y p em h c r e s t r i c t i o n p r o l i f e r a t i o nc y t o t o x i c i t y c e l l l c e l i s c y t o t o x i c i t y 3 c i k 细胞的细胞因子表达情况 已知c d 5 6 + 细胞能高表达i f n - y 和t n f nn k 细胞静息状态几乎不分泌 细胞因子，活化后可表达i l - 3 、g m - c s f 、i f n - 7 、i f n a p 、t n f a 1 3 等。人类 v a l 4 i n k t 细胞的c d 4 亚类优先表达i f n 吖、t n f q ；而c d 4 + 亚类能表达i l 4 、 i l 一1 3 、i l 一2 、g m - c s f 、i l 一6 、i l 1 0 、i f n 一弘t n f 0 c 。病理状态下，人外周血 b 、t 淋巴细胞、n k 和c d 3 + c d 5 6 + 细胞都能自发产生大量t n f a 和表达水平大 致递减的i f n - y 、i l 一1 8 、i l 一4 、i l 一1 0 、i l - 6 、i l 2 。健康个体n k 和n k t 细胞 能自发表达i l 一6 ”o 。i l - 1 8 与i l 一1 2 - i 束u 激n k 和t 细胞表达i f n - t 、i l 一2 、i l - 3 、 i l _ 8 、l t - 1 3 、g m c s f 、t n f 一仪等细胞因子。我们用半定量r t - p c r 检测发现， 在转录水平c i k 细胞能低表达i l - 4 、i l 一1 0 和t g f 1 3 l ，并广泛表达其它的白介 素，干扰素以及t n f 家族的多数细胞因子。 堡查塑苎叁堂! ! ! i 旦堡主堕l 4 、c i k 细胞的肿瘤杀伤途径 c i k 细胞主要通过胞外分泌颗粒酶、f a s f a s l 途径和t n f 相关途径这三利。 经典方式对肿瘤细胞发挥杀伤作用，但主要是以颗粒酶途径杀伤靶细胞。另外， c i k 细胞低或不表达c d l 6 抗原，提示它可能不参与a d c c 作用。 c 1 k 与n k 、l a k 及c t l s 等其它效应细胞在肿瘤杀伤途径方面有许多相 似之处，同时存在一定的差异。分别介绍如下： 4 1 凋亡诱导途径 c i k 、d c i k 、l a k 和n k 都能通过诱导肿瘤细胞发生凋亡而发挥杀伤功能， 作用方式分接触依赖型和非接触依赖型。其细胞毒效应机制至少包括：( 1 ) 效靶 细胞接触后，在胞外钙离子条件下，效应细胞释放穿孑l 素和颗粒酶，致使靶细 胞溶解或凋亡；( 2 ) 效应细胞表达的凋亡基因配体f a s l 与靶细胞表面的f a s 结合 诱导靶细胞发生凋亡，这一过程无需胞外钙离子的存在；( 3 ) 效应细胞膜上或 分泌到胞外的t n f 一旺与靶细胞表达的相应受体结合发生靶细胞慢性溶解。n k 和l a k 细胞在低免疫原性肿瘤杀伤中起的作用更大：c i k 表现为t c r 非依赖 性细胞毒性，主要通过穿孔素机制杀伤肿瘤。 许多细胞因子如i f n y 1 6 j 、i l 1 2 4 5 、i l 1 2 、i l ，1 5 等能诱导或上调效 应细胞表达穿孔素，粒酶b 而使靶细胞凋亡。i l - 1 8 不仅能上调穿孔素介导的n k 细胞毒性，并可以促进f a s f a s l 途径介导的靶细胞凋亡。另外，i f n s 、i l ，l 、 t n f 等能介导效应细胞的非接触依赖方式杀伤肿瘤。k w a k 等【_ 7 j 在体外检测到， 与l a k 共培养的d l d 一1 细胞中i n o sm r n a 表达与对照相比有明显提高，推 测人的l a k 细胞可能通过直接诱导了d l d 1 结肠癌细胞内源性n o 的合成而 启动了靶细胞的凋亡。 近来发现，i f n 除了能抗肿瘤和抗病毒感染外，还能作为一种凋亡诱导因 子促进恶性黑素瘤、卵巢癌细胞发生凋亡。i f n d 较i f n 旺2 能优先诱导凋亡而 起到抗肿瘤作用疆j 。t r a i l 在免疫系统多种细胞中都有表达，并在n k 细胞介 导的肿瘤免疫监视中起重要作用。研究发现，c i k 培养过程中t r a i l 的表达明 显上调，并能诱导j u r k a t 细胞凋亡i n 】。在我们的实验条件下，c i k 细胞培养的 每个时期都能检测到t r a i l 的表达，且表达水平较稳定，个体差异不明显。 4 2 共刺激分子，细胞因子活化c i k 细胞 n k 与共刺激分子c d 8 6 或c d 8 0 结合能提供n k 细胞的活化信号或启动 n k 介导的细胞毒活性【l 。b e t h 等将b 7 1 转入肿瘤中，结果发现n k 被活化而 l a k 细胞活性无明显变化，推测可能是i l 一2 下调了c d 2 8 的表达而影响了b 7 1 与l a k 细胞问的黏附作用。i f n - 丫、t n f 一0 【、i l 一1 p 等能在体外诱导或增强某些 肿瘤的表面分予i c a m 一1 的表达，体外i l 一2 、i l 一7 、1 l 一1 2 的单刺激能不同程度 华东师范大学2 0 0 5 届硕士论文 上调c i k 细胞表面分子l f a 1 和i c a m 一1 的表达，这些都有利于效应细胞与靶 细胞的识别。抗l f a 。1 和i c a m 1 的单抗能阻断c i k 细胞的杀瘤作用。研究还 发现，i l 一1 2 能最有效的诱导c i k 增殖，i l 一7 能馒l f a i c d ! l a 表达上调最高， 并使c i k 高表达c d 2 5 和c d 2 8 。 细胞因子除了通过诱导共刺激分子的表达来活化效应细胞外，也可以促进 免疫细胞的成熟和分泌次级因子来启动肿瘤的杀伤。已知l i 。一2 和i l 1 5 在n k 细胞的成熟过程中起重要作用：i l 4 、g m c s f 能诱导d c 细胞的成熟，协助 c i k 细胞发挥效应功能。体外实验表明，i f n b 能上调d c 表面分子c d 8 0 ，尤 其是c d 8 6 的表达。c i k 可使d c 高表达特异性共刺激分子c d 8 0 和c d 8 6 ，并 上调抗原递呈分子m h c i i i ，促使d c 大量分泌i l 一1 2 ；而i l 一1 2 又可使t 绌 胞大量分泌i f n - ? 、i l 一2 和t n f a ，并诱导出以c d 3 + c d 8 + 及c d 3 + c d 5 6 + 为主 的c i k 细胞群。同时，d c 能刺激c i k 细胞使其分泌i l 2 ，并表达共刺激受体 c d 2 8 、粘附分子c d 4 0 配体c d 4 0 l 和释放i f n q 。这些成熟和活化的效应细胞 通过配体一受体的识别或自身表达的细胞因子，信号分子共同对肿瘤组织发起 免疫进攻。 4 3 体液免疫协同细胞免疫对肿瘤杀伤 某些细胞因子能启动b 细胞的体液免疫及补体系统，协助效应细胞对肿瘤 发起进攻。c i k 细胞低或不表达c d l 6 抗原，提示它可能不参与a d c c 作用。 已知i l 一2 、i f n 一0 l 、g m c s f 能有效增强a d c c 。f l i e g e r 等j l i 】发现，加入b s a b ( 双功能单链抗体) 的c i k 培养液其肿瘤杀伤毒性显著高于同样条件下的 p b m c ，且细胞毒性高峰期早于p b m c 。i l 一2 、i f n a 能极大的提高b s a b 导向 的c i k 或p b m c 的靶细胞毒性，而g m c s f 联合b s a b 对提高c i k 的杀伤毒性 作用很小。c d l 9 + 白血病或淋巴瘤细胞与o k t 3 x h d 3 7 ( 抗c d 3 和c d l 9 双特异 抗体) 预培育后，再与该多功能抗体诱导活化的c i k 细胞相作用，结果表明， c i k 细胞的靶杀伤活性相比仅加入抗c d 3 或抗c d l 9 单抗或直接加入 o k t 3 x h d 3 7 的对照组都要高出许多1 1 2 j 。 4 4 其他功能途径 此外，效应细胞也可能通过诱导组织内源性d n a s e 的表达而使靶细胞d n a 受损断裂。n k 细胞的毒性作用与i l - 2 的释放及分泌型颗粒相关的d n a s e 活力 也有一定关联。细胞内氧化压能改变某些黏附分子的表达而阻断其与配体间的 【 别和相互作用，最终降低效应细胞对靶细胞的杀伤力。 5 免疫效应细胞与肿瘤逃逸 f a s l + 肿瘤细胞能诱导f a s + t 细胞发生凋亡而实现免疫逃逸。少数c i k 虽也 发生此类形式的凋亡，但因其主要以分泌型毒性颗粒杀瘤，并借助表达的f a s i 一些查墅些查兰! ! 堕旦堡圭堡苎 以一种自发的体外“筛选”机制保留对f a s - - f a s l 凋亡途径而敏感的效应细胞， 从而阻断肿瘤的逃逸。效应细胞t c r c d 3 复合物6 链缺失引起的功能缺陷也将 导致肿瘤逃逸免疫监视。此外，肿瘤细胞能分泌某些免疫抑制分子如t g f p 、 i l 一1 0 、p g e 2 和v e g f ，抑制d c 的发育和成熟而削弱效应细胞的功能。某些 瘤细胞表达的d c r 3 能中和f a s l 或通过低表达f a s 而阻断或影响t 细胞的作用。 肿瘤细胞高表达补体调= 青蛋白c d 4 6 、c d 5 5 和c d 5 9 ，致使补体系统某些成分 失活也会影响效应细胞的免疫应答功能。 6 、d c 与c i k 的生物学关系 d c 与c 1 k 是肿瘤免疫治疗的两个重要部分，前者识别病原、激活获得性免疫 系统，后者通过发挥自身细胞毒性与分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞，二者联合确保 了一个高效和谐的免疫反应的完成。 在共培养过程中，d c 、c i k 两种细胞的数目显著增多，增殖速度甚至呈倍数 增长。成熟的d c 可通过m h c i 、m h c 。i i 类分子及表面标志白细胞分化抗原c d l 分子途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制l l i “l ，并能分泌t h l 型细胞因子i l 一1 2 ，起到激活t 细胞应答的作用。以往许多研究已证实d c 能够激 活多种n k 样t 淋巴细胞( n k t ) 细胞增殖1 15 ，1 6 i 。m a r t e n 等i l 迸一步研究发现，共培 养1 4 d 后c i k 细胞的增殖倍数比共培养7 d 时高出2 倍左右。另外，j o m a n t a i t e 等1 1 州 发现体内活化的n k t 细胞也能使小鼠肝脏中的d c 细胞增殖3 4 倍。共培养的细 胞d c c i k 具有更高的肿瘤杀伤活性且杀瘤谱广。t o n g 等【l9 用荧光原位杂交技术 ( f i s h ) 检测到d c c i k 比l a k 能更有效杀伤慢性骨髓瘤白血病细胞。l i n n 等俐又 发现d c 束i j 激c i k 后，细胞毒活性显著增强。而且共培养d c c i k 还能在低效靶比 条件下清除大量肿瘤细胞。m a r t e n 等【2 l 】观察负载肿瘤特异性抗原的d c c l k 细胞 的杀瘤作用，发现在效靶比为1 6 ：1 的情况下，d c - c i k 对骨髓瘤细胞杀伤活性可 以达到8 3 8 。在效靶比为5 ：l 的情况下可达到最大细胞裂解力。d c c i k 能够杀 伤多种肿瘤细胞，尤其是负载肿瘤相关抗原的d c c i k 对白血病细胞系k 5 6 2 、结 肠癌细胞系l o v o 与c o l 0 2 0 5 、胰腺癌细胞系d a n g 及肝癌细胞系7 4 0 4 等都有较好 f 匀杀伤作用。对胰腺癌细胞d a n - g 杀伤活性的研究发现，c i k 细胞对肿瘤的杀伤 率为( 1 5 3 4 - 7 2 ) ，d c c i k 细胞为( 7 0 8 士1 4 6 ) ，而负载肿瘤相关抗原的d c c i k 杀伤率增加到( 8 6 2 士1 3 2 ) 1 1 ”。混和细胞比不同的d c 与c i k 的数量比对于肿瘤的 杀伤结果不同，低比例和高比例都不利于肿瘤杀伤，其中高比例混和细胞作用后 的靶细胞死亡率要低于低比例混和细胞。 培养基会引起d c 和c i k 细胞活性的变化，从而间接影响到整个共培养体系的 肿瘤杀伤活性。d u p e r r i e r 等2 2 1 研究发现，用人血清培养、自体血浆、小牛血清和 无血清的培养基培养d c 时，前两种培养基中成熟的d c 细胞数要比后两者多， - 9 兰查塑苎查兰! ! 堕旦竺丝塞 e t 是d c 的细胞总数少。他们认为这是因为人血清培养或f j 体血浆能够诱导d c 成熟，而小牛血清和无血清培养液主要刺激生成不成熟的d c 。另外，m u l d e r s 等 2 3 1 对无血清培养基a i m v 、r p m i 与含不同浓度自体血清的a i m v 、r p m i 进行分 析，发现含有1 0 自体血清的r p m i 具有最高的d c 成熟数。同样，人血清培养的 c i k 细胞，其活性要比用含胎牛血清和无血清的高。 高剂量的负载抗原可能会降低整个共培养细胞的杀伤活性。m a r t e n 等l 用不 同剂量的肿瘤抗原c a l 9 - 9 负载d c 细胞时，发现2 5 1 0 0 u m l 的抗原是刺激c i k 的 最佳剂量。随着抗原浓度的增大，细胞毒活性呈不同程度的下降，抗原浓度高于 2 0 0 u m l 细胞毒活性时下降速度增加，表明高剂量负载抗原会抑$ 1 d c c i k 的杀瘤 作用。除了上述影响因素外，d c 的密度和辐射作用【2 4 】也会引起共培养细胞杀伤 活性的变化。成熟的d c 对c i k 细胞的激活能力更强，且表达c d 3 + c d 4 + 、c d 2 8 和c d 4 0 l 的c i k 细胞含量有不同程度增加。c d 4 0 、c d 8 0 和c d 8 6 以及h l a d r 等 明显高表达，比单一培养的d c 均增加1 5 倍左右。如果d c 在共培养前先经蛋白抗 原冲击，成熟表面标志表达量更大。d c 能够激活静止t 细胞使其向t h l 型分化并 可以活化t 淋巴细胞引发肿瘤特异性免疫。d c 与c i k 共培养，其抗肿瘤活性和特 异性显著高于c i k ，c i k 的增殖率显著提高，并能使d c 特异性共刺激分子和i 【。，1 2 的表达上调。肿瘤或白血病特异抗原致敏的d c 与c i k 共培养也已经进入临床试验 阶段。 8 、研究现状及展望 目前国内夕卜有关共培养d c c i k 的报道还仅集中在对白血病的研究中，研究 内容也主要停留在共培养细胞的杀伤活性上，而对其机制的研究有很大不足。此 外，相关体内及临床研究开展较少。今后的研究将主要集中在：寻找有效肿瘤 细胞抗原( 包括人工合成抗原肽) 以提高其对特定肿瘤的杀伤活性；研究特异性 杀伤作用是否确实因为存在特异性c t l 细胞；d c c i k 的临床试验研究。 目前，用基因工程和细胞转染技术将细胞因子或联合单克隆抗体导入c 1 k 或d c 等免疫细胞治疗肿瘤，已显示出明显的临床应用优势。电穿孔法将i l 一2 表达质粒导入转移性肾癌、结肠癌及淋巴瘤病人p b m c 来源的c i k 细胞，结果 c i k 回输后病人血清中i f n - y 、g m c s f 和t g f 。d 都n b , 显i - 调，c d 3 + 细胞数日 也有一定增长，肿瘤杀伤活性明显高于未转染的c i k 细胞，一期临床试验未可 见有明显的毒副作用 2 5 i 。国内杨等1 2 6 1 将m d r l 基因表达质粒p h a m d r 转入c i k 细胞，结果使c i k 获得了多药耐药性，但对m c f 7 肿瘤细胞的杀伤活性无明显 变化。据此推测将某些细胞因子联合m d r l 基因转入c i k 细胞用于多药耐药性 肿瘤或病毒感染的免疫治疗将具有极大的f 临床意义。s i e v e r s 等f 2 7 1 将端粒酶作为 肿瘤抗原致敏肾癌病人和健康个体来源的d c 后与c i k 共培养，6 0 ：1 效靶比 生查塑笙叁兰! 塑! 旦塑! = 笙苎 的抑瘤率为1 0 0 ，而对照组c i k 为4 1 7 ，表明d c 向淋巴细胞递呈端粒酶 抗原肽能增强c i k 细胞抗原特异性的效应功能。 目前，c i k 细胞用于肿瘤治疗已经通过临床i i i 期试验，d c 作为肿瘤基因治 疗的方案已获f d a 批准并进入i i i 期临床。致敏d c c i k 共培养体系用于肿瘤 治疗己显示出较l a k 和c i k 更高的杀伤活性和特异性- 正申请用于i 期临床 试验。用抗体，细胞因子融合蛋白导向治疗肿瘤，或将细胞因子、共刺激分子和 m h c 分子单独联合转染到c i k 或d c 中，开发新型高效的效应细胞制剂( c i k 、 d c 和d c c i k 疫苗) 正逐步成为当今肿瘤免疫治疗途径的研究和丌发热点。 第二节细胞因子研究概述 细胞因子( c y t o k i n e ，c k ) 是指由免疫细胞( 如t 、b 、n k 、单核巨噬细胞 等) 和某些非免疫细胞( 如内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞等) 经刺激而合成 分泌的一类生物活性物质，多属分子量为6 6 0 k d 的多肽或糖蛋白。通常包括白介 素( i l ) 、干扰素( i f n ) 、肿瘤坏死因子( n 盯) 、造血因子、趋化因子和各种细 胞生长因子等。细胞因子在体内广泛参与免疫应答及调节，刺激细胞增殖分化， 参与细胞凋亡等重要生理活动。某些因素可以导致些细胞因子的表达或功能异 常，从而凋控炎症反应、免疫性疾病、肿瘤等的发生和发展。细胞因子必需与靶 细胞膜表面特异性受体( c k r ) 结合才能发挥其广泛的生物学效应。 l 、研究现状 目前常以效应细胞t i l 、c t l 、l a k 、m q o 、n k 抗肿瘤或以反转录病毒为 载体将细胞因子基因如i l - 2 、i f n