（分析化学专业论文）用于生物分析的近红外荧光染料的合成与应用.pdf

山东师范大学硕士学位论文 中文摘要 生命科学的发展就是人们对组成生物体的各种物质( 如蛋白质，d n a ，糖， 及微量的金属离子，阴离子，中性分子等) 进行不断深入研究和了解的过程，在 这个过程当中对某种物质的检测是研究的根本，要达到识别和检测这些物质的目 的就需要有一种能够被检测到的信号来反映这些物质的浓度和所处的状态。荧光 化合物能够发出光信号，而且对生物体无损伤，是完成这一任务的理想选择，所 以荧光化合物的研究一直是人们关注的焦点，它伴随着生命科学的发展发挥着越 来越重要的作用。 结合使用荧光染料和分子探针的荧光光谱检测方法，由于其灵敏度高、选择 性好，在分析化学，特别是生物分析中有较广泛的应用。近年来，吸收和发射在近 红外区域的近红外荧光染料由于具有以下优点而倍受关注。如：近红外荧光染料 在用于生物体内物质的检测时，可以极大的降低生物体内物质的自吸收和自发荧 光的干扰，提高检测的灵敏度和选择性，同时还能够减少对生命体的损伤，有利 于实现活体检测。近红外荧光染料可以作为一种安全、非侵入性的成像荧光探针 广泛应用于医学和生物学领域，设计合成新颖的近红外荧光染料已经成为近几年 研究的热点问题。但是在近红外荧光染料的制备和应用过程中也遇到了一些困 难，例如染料本身容易聚合、易发生光漂白、量子产率比较低等。因此，合成化 学和光学性质更加稳定、量子产率更高的新型近红外荧光染料具有重大的理论意 义和应用价值。目前，用于生物分析的常用染料主要有：罗丹明类，花菁类， b o d i p y 类及香豆素等。其中花菁类染料的最大吸收波长大都在6 0 0 - 8 0 0n m z 间，有的甚至超过8 0 0n l t l ，在制得探针用于生物样品的测定时可以有效避免生 物体内自发荧光和散射光的干扰，极大的提高检测灵敏度。而罗丹明类荧光染料 和b o d i p y 类荧光染料由于良好的光稳定性和化学稳定性，高荧光量子产率及对p h 值不敏感等优点也越来越受到人们的重视。 针对新型近红外荧光染料的合成与应用，本论文开展了以下四个方面的工 作： 山东师范大学硕士学位论文 一、综述了目前常用的荧光染料的种类、性质以及在生物标记和生物分析检 测以及化学分析中的应用。 二、以对硝基苯甲醛和八羟基久洛尼定为原料，合成了一种新型的罗丹明荧 光染料，并通过核磁共振、质谱等手段对染料结构进行了表征。研究了染料在不 同溶剂中的吸收光谱和荧光光谱，测定了染料在不同溶剂中的荧光量子产率，并 对染料的光稳定性及对p h 值的敏感性进行了探讨。结果表明染料有望作为一种 极性探针，用于标记蛋白质构象的变化。 三、通过一系列反应合成了一种发射在近红外区的b o d i p y 类荧光染料， 并通过核磁共振，质谱及红外谱对染料的结构进行了表征。研究了染料在不同溶 剂中的吸收光谱和荧光光谱，测定了染料对p h 值的敏感性，并对染料的光稳定 性和化学稳定性进行了探讨。实验证明染料对碱性p h 值比较敏感，可以作为一 种碱性p h 值荧光探针。 四、设计合成了一种新型的近红外花菁型荧光探针。并对其结构进行了表征， 考察了它的光谱性质。实验表明该探针具有较宽的激发波长和发射波长范围，并 且对铜离子具有较高的灵敏度和很好的选择性，能够实现在近红外区对细胞内铜 离子的检测。 关键词：近红外，荧光染料，罗丹明荧光染料，b o d i p y 染料，花菁染料 分类号：0 6 2 1 3 n 山东师范大学硕士学位论文 a bs t r a c t t h ed e v e l o p m e n to fl i f es c i e n c ei sap r o c e s so fad e e p e ra n dw i d e rs t u d yo ft h e s p e c i e sw h i c hm a k eu po fo r g a n i s m s ( s u c ha sp r o t e i n ，d n a ，s u g a r , m e t a li o n ，a n i o n a n dn e u t r a lm o l e c u l a r ) i nt h i sp r o c e s s ，ab a s i cp r o b l e mi sh o wt od e t e c ta n di d e n t i f y t h e s es p e c i e s f l u o r e s c e n td y ei sa ni d e a ll a b e l i n gr e a g e n tb e c a u s ei tc a n g i v eo f fl i g h t s i g n a l ，d ol e s sh a r mt oo r g a n i s m t h e yp l a ym o r ea n dm o r ei m p o r t a n tr o l e sd u r i n gt h e d e v e l o p m e n to fl i f es c i e n c e ，s om u c ha t t e n t i o nh a sb e e na t t r a c e t e dt os t u d yt h e f l u o r e s c e n td y e s o w i n gt oh i 曲s e n s i t i v i t ya n de x c e l l e n ts e l e c t i v i t y , t h em e t h o do ff l u o r e s c e n t s p e c t r o s c o p yd e t e c t i o ni sw i d e l yu s e di na n a l y t i c a lc h e m i s t r y , e s p e c i a l l yi nb i o l o g i c a l a n a l y s i s i nr e c e n ty e a r s ，n e a r - i n f r a r e d ( n i r ) f l u o r e s c e n td y e s ( e x c i t e da t6 5 0 9 0 0n m ) a p p e a l e dm o r ea t t e n t i o nb e c a u s eo fs o m ea d v a n t a g e s f o re x a m p l e ，t h e yc a na v o i dt h e b a c k g r o u n da b s o r p t i o n ，f l u o r e s c e n c ea n dl i g h ts c a t t e r i n gt oi n c r e a s et h ed e t e c t i o n s e n s i t i v i t y a l s o ，t h e yc o u l dd ol e s sd a m a g et ot h eb i o s y s t e r ma l o n gw i t ht h e a v a i l a b i l i t yo fl o w - c o s ts o u r c e so fi r r a d i a t i o n t h u s ，r e c e n td e v e l o p m e n t si nm e d i c a l a n db i o l o g i c a lr e s e a r c hh a v es t i m u l a t e dg r e a ti n t e r e s ti nd e s i g na n dp r e p a r a t i o no f n i rf l u o r e s c e n t d y e s h o w e v e r , m a n yp r o b l e m s w e r ee n c o u n t e r e dw i t ht h e p r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no ft h en i rf l u o r e s c e n td y e s ，s u c ha sa g g r e g a t i o n ， p h o t o b l e a c h i n ga n dl o wf l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d s s oi ti sn e c e s s a r yt os y n t h e s i z e n o v e la n dm o r ee f f e c t i v ed y e st h a ta b s o r ba n de m i ti nt h en i r r e g i o n a tp r e s e n t ，t h e w i d e l yu s e dd y e si nb i o l o g i c a la n a l y s i sa r er h o d a m i n e ，b o d i p y , c y a n i n e ，c o u m a r i n a n ds oo n a m o n gt h e m ，t h ea b s o r p t i o na n de m i s s i o nw a v e l e n g t h so f c y a n i n ed y e sa r e m o s t l yi nt h er e g i o no f6 0 0 8 0 0n n l ，e v e nb e y o n do f8 0 0n l n ，s ow h e nt h e ya r eu s e da s p r o b e s ，t h e yc a na c h i e v et h ea b s e n c eo rr e d u c t i o no fb a c k g r o u n da b s o r p t i o n ， f l u o r e s c e n c ea n dl i g h ts c a t t e r i n gt oi m p r o v et h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t y a n dr h o d a m i n e a n db o d i p yd y e sa t t r a c tm o r ea n dm o r ea t t e n t i o nb e c a u s eo ft h e i r g o o d p h o t o s t a b i l i t y , h i 曲f l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d sa n di n s e n s i t i v i t yt op h t h ef o l l o w i n ga r et h em a i nc o n t e n to ft h i sd i s s e r t a t i o n ： o n e ：r e v i e w sw e r eg i v e nf i r s t l yo nt h e c a t e g o r i e s 、p r o p e r t i e sa n dt h e a p p l i c a t i o n so ft h ef l u o r e s c e n td y e si na n a l y t i c a lc h e m i s t r y , l i f es c i e n c ea n do t h e r i i i 山东师范大学硕士学位论文 f i e l d s t w o ：s y n t h e s i z e dan o v e lr h o d a m i n ed e r i v a t i v ew i t has i n g l ea m i d o g e n , t h e n a n a l y z e da n dc h a r a c t e r i z e dt h ed y eb y 1h n m ra n de 1 m s w ea l s os t u d i e dt h e s p e c t r ao ft h ed y ea n dd e t e r m i n e dt h ef l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d si nd i f f e r e n t s o l v e n t s a l s od i s c u s s e di t sp h o t o s t a b i l i t ya n ds e n s i t i v i t yt od i f f e r e n tp h t h er e s u l t s s h o w e dt h a ti tc a nb eu s e da sa p o l a r i t yp r o b et ol a b e lp r o t e i n t h r e e s y n t h e s i z e dan o v e lb o d i p yd y ew h i c he m i t t e di nt h en e a r - i n f r a r e d r e g i o n a n dc h a r a c t e r i z e dt h ed y eb y1 hn m r ，i ra n de i m s w ea l s os t u d i e dt h e s p e c t r ao ft h ed y ea n dd e t e r m i n e dt h ef l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d si nd i f f e r e n t s o l v e n t s a l s od i s c u s s e di t sp h o t o s t a b i l i t ya n di t ss e n s i t i v i t yt od i f f e r e mp h i tc a nb e u s e da sa na l k a l i n ep h p r o b e f o u r ：d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e dan o v e lf l u o r e s c e n td y ei nt h en e a r - i n f r a r e d r e g i o n t h ep r o b es h o w e dw i d ee x c i t a t i o na n de m i s s i o ns p e c t r u m t h ea n a l y t i c a l e x p e r i m e n t i l l u s t r a t e dt h a ti tc o u l dd e t e c tc o p p e ri o nw i t hh i 曲s e n s i t i v i t ya n d s e l e c t i v i t y a n di tc o u l dr e a l i z et h ei m a g i n go fc o p p e ri o ni nl i v i n gc e l l s k e y w o r d s ：n e a r - i n f r a r e d ，f l u o r e s c e n td y e ，r h o d a m i n ed y e ，b o d i p yd y e ， c y a n i n ed y e i v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名： 红震 导师签字气拟啶 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 压霞 导师签字： 签字日期：2 0 0 c 7 年肛月2 彩日签字日期：2 0 0 7 年肛月冲日 劾乏 夕1 山东师范大学硕士学位论文 第一章荧光染料的研究近况 随着荧光分析检测技术的发展，荧光染料在基因重组检测、d n a 杂交测试、 免疫检测、肿瘤细胞早期诊断和生物体内各种自由基以及各种生物活性离子的分 析检测等方面得到广泛应用，从而极大地促进了荧光染料的发展【l 】。近年来大量 文献和专利对各类功能性染料的研究及应用进行了报道。 荧光光谱检测方法由于灵敏度高、选择性好，在分析化学，特别是生物分析中 有着较为广泛的应用。我们知道大多数生物分子本身没有荧光或荧光较弱，检测 灵敏度较低，为使之高灵敏地检出，人们常用荧光染料或荧光探针与待测物进行 标记或反应，生成具有强荧光的共价或非共价结合的物质，使检出限大大降低。目 前用于标记或衍生的荧光染料主要有花菁类、b o d i p y 类、荧光素类、罗丹明类 以及香豆素类等化合物，它们本身或衍生产物具有很高的荧光量子产率，但最大 吸收波长和荧光发射波长多小于6 5 0i i i i i ，其中只有花菁的发射波长相对较长。 而我们知道，生物样品基体和一些杂质在可见区域会有吸收或荧光，再加上光散 射的影响往往会产生较为严重的背景干扰，因而限制了荧光分析法灵敏度的提高 【2 ，3 1 。相对于常规荧光( k 6 5 0n 1 1 ) 光区，生物 样品基体光吸收或荧光强度很小，因而背景干扰大大降低，并且随波长的增加，散 射干扰也大为减少。另外，近红外荧光染料还可以降低对生物体的损伤。近年来， 以稳定性好、价格低廉的二极管激光器为基础发展起来的近红外荧光标记染料及 检测技术具有更高的灵敏度，已用于近红外荧光免疫分析、流动式细胞光度法、 高效毛细管电泳分离中荧光检测生物活性物质等方面。同时，随着许多激光荧光、 传感器、免疫检测装置的建立【4 】，近红外荧光染料在生物分析中显示出很大的优 越性。下面就目前生物分析中常用的荧光染料及其衍生的荧光探针的种类及其应 用进行评述。 山东师范大学硕士学位论文 第一节花菁类荧光染料及其应用 花菁染料一般由两个n 原子中心构成，其中一个n 原子带正电荷，并与一个 含奇数碳原子的共轭链相连，共轭链上的碳原子再与另一个n 中心相连。人们根 据花菁结构的显著特征常称花菁为“推一拉”烯烃，所有含有亚甲基链生色团的 聚亚甲基染料都具有这种结构特征。其代表结构如下图所示： r 1 r 1 人们对花菁染料产生广泛兴趣，源自于花菁对卤化银感光乳剂具有独特的光 敏作用。花菁类荧光染料的最大吸收波长大都在6 0 0 - 8 0 0n l l l 之间，有的甚至超 过8 0 0n n ，在制得探针用于生物样品的测定时可以有效避免生物体内自发荧光 和散射光的干扰，极大的提高检测灵敏度。自1 8 5 6 年以来，花菁染料已逐渐应 用在红外激光染料、非线性光学材料、核酸染色或标记，氨基酸、肽和蛋白质的 衍生或标记，荧光探针及生物传感等方面。近几年关于新型花菁染料的研制以及 花菁染料制成荧光探针用于体内活性物种检测的文章屡见报道。 1 1 花菁染料在生物分析中的应用研究 生物分析中花菁染料与核酸或蛋白的作用一直倍受科研工作者的重视，对这 一问题的广泛研究有助于深化人们对核酸或蛋白质结构以及功能的认识。 花菁染料在d n a 序列分析中有较多的应用，c h e r t 5 】等人合成了含有n 一羟基琥 珀酰亚胺活性酯类花菁染料用于标记寡聚核苷酸m 1 3 弓 物用作d n a 序列分析，使 用c e ( 毛细管电泳) 分离，l i f ( 激光诱导荧光) 检测，检出限为1 0 - 1 0m o l l ，且可用 作d n a 杂交探针。s h e a l y 等人把取一1 4 4 经过修饰后，最大吸收波长可发生红移， 与商业化半导体激光器最大输出波长相匹配，吸收光谱的改变主要在于分子中酯 和醇单体的距离，用作d n a 序列分析，每次可以分析样品中大约5 0 0 个碱基对，能 够检测到o 卜1 。0f i n o l 的d n a 片段 6 1 。l e e 等人研究发现单甲川花菁染料即噻唑 2 山东师范大学硕士学位论文 橙( t o ) 可作为非共价d n a 及r n a 测定的一类重要的荧光探针7 一。d r e x h a g e 研究 小组设计合成出一系列阳离子型噻唑橙类单甲川花菁染料，实验表明这类染料与 d n a 或r n a 作用时都有明显的荧光增强，因此都可应用于d n a 分子的检测【9 】。 花菁类染料也可共价或非共价地标记蛋白质。d o d c i 、d o t c i 、d t t c i 、 d t d c i 被用来标记人和多种动物的血清白蛋白【1 0 1 。许金钩【l l 】等人采用花菁染料 分光光度法测定血清蛋白质，其检测限为5 0n g m l 。i r l 2 5 在血浆分析中有应用【1 2 】， 用光吸收法测定时检出限为1 2 5n g m l ，用l i f 贝j j 为o 8n g m l 。l i 等人【1 3 】利用新 型水溶性近红外花菁染料d t c y 与蛋白结合后吸收光谱的变化来研究其与蛋白 质间的相互作用。该方法还用于人血液及尿液中蛋白含量的测定，取得了满意的 结果。p a n o v a 等人【l4 】研究了新型的阴离子花菁染料与蛋白之间强烈的非共价结合 作用，并对细胞外蛋白及胶原质进行非共价标记后，利用其标记前后吸收光谱的 变化研究了人体器官内蛋白的功能。该方法有望用于某些疾病的诊断。 n y g r e n ，n o d e n ，o g u l c h a n s k y 【1 5 - 17 】等许多工作者分别研究了不同种类的花 菁染料与核酸的相互作用。研究发现，花菁既可以以单体，也可以以二聚体与核 酸作用；花菁与核酸结合所形成的聚集体在结构上不同于染料在没有核酸存在下 形成的聚集。随着核酸研究方法的发展，人们对双发射团的核酸探针表现出浓厚 的兴趣。相对于单发射团染料，这种双发射团染料同核酸有着更强的亲和力【1 8 】。 r y e 1 9 】等研究发现噻唑橙二聚体t o t o ( 两个t o 发射团通过双阳离子连接臂连 接) 能同核酸形成稳定性更高的荧光络合物，而t o 与核酸的作用是可逆的。联 二花菁类染料( j t l i t o t o 和y o y o ) 较之花菁单体具有更强的聚集倾向，因此正 逐步成为核酸分析领域中一类非常重要的荧光染料。 1 2 花菁染料用于光学分子传感的研究 由于花菁染料良好的光学性质，花菁染料被制成各种分子荧光探针用于金属 离子、自由基、p h 值等的检测。m a z i & e s 等人【2 0 】将两个环磷酸酯分别固定于n ， n 二羧基烷基硫羰花菁的两个羧基上，设计出新型的近红外荧光探针，并研究 了乙腈溶液中其与c a 2 + g l m 9 2 + 离子的键合行为。研究发现：c a + 、m 9 2 + 离子的加 入使探针分子的自由转动受到约束，整个分子的刚性及平面性大大增强，因此体 系的荧光也随之显著增强。a k k a y a 等a t 2 1 】将c a 2 + 受体富电子的二( 2 氨基苯 3 山东师范大学硕士学位论文 酚) 乙烷- n ，n ，n ，n 四乙酸( b a p t a ) 与七次甲基花菁染料相连，设计了一 种近红外分子荧光探针。由于b a p t a 与七次甲基阳离子花菁染料间存在强的p e t 效应，因而在水溶液中探针分子表现为弱荧光，而当b a p t a 与c a 2 + 螯合后，分子 内p e t 过程受到抑制，体系的荧光逐渐增强，从而达到了对c a 2 + 的检测目的。由 于测定波长位于近红外区且b a p t a 对c a 2 + 特异识别，该化合物对c a 2 + 的检测不仅 具有高的灵敏度，还具有高的选择性。pa j t o n a y 等人2 2 】研究了冠醚花菁j c m 1 5 一 冠一5 的光物理性质及其与碱金属l i + 结合的光学特性，由于分子内电荷转移的存 在，探针本身有强的荧光，而当与“+ 结合后，抑制了分子内电荷转移，导致i c t 态荧光强度显著降低；又由于溶剂化后的l i + 的相对尺寸恰与冠醚1 5 - 冠5 空腔尺 寸相匹配，化合物对“+ 的测定显示出很高的选择性；形成的络合物也具有很高 的稳定性。n a g a n o 2 3 】等人将七次甲基阳离子花菁染料与二吡啶乙基乙二胺 ( d p e n ) 相连，设计合成出一种近红外荧光探针，并利用比率荧光法实现了对z n 2 + 的检测。由于测定在近红外区，相对于其它z n 2 + 传感器来说，该方法不仅选择性 好，灵敏度也得到了大大的提高。本课题组通过在花菁结构上连接一个能够和锌 离子络合的二( 2 一吡啶甲基) ( d p a ) ，实现了在生理条件下对细胞内锌离子的 检测，并通过激光共聚焦成像验证了探针对锌离子的选择性检测【2 4 】。另外本课 题组还合成一种新型的用于汞离子成像的近红外荧光探针( d m a c y ) 。该探针以 丙基花菁作为荧光团母体，高选择性识别汞离子的3 ，9 二硫6 氮杂十一烷 ( d m a ) 基副2 5 粕1 作为受体。探针合成步骤简单，在水溶性环境中对汞离子快速 响应，由于探针优良的化学和光谱特性，我们将其成功应用于人肝癌细胞和斑马 鱼的激光共聚焦成像【2 9 1 。另外，花菁染料还被用来检测自e h 基。n a g a n o 课题组 将七次甲基花菁染料与邻苯二胺相连组成一种传感分子【3 0 】，在研究其光物理性 质的基础上，利用邻苯二胺与n o 生成苯并三氮唑的特异性反应，建立了一种近 红外区测定n o 的新方法。由于探针分子具有良好的膜渗透性，该方法成功地被 应用于细胞内n o 的检测。本课题组发展了一种新型近红外花菁荧光探针来检测 生物体系中的脂质氢过氧化物【”】，它是基于亲核取代反应并随着含磷五元环开 环的的机理设计合成的。我们把探针用于分析细胞提取液中的脂质氢过氧化物的 浓度，最终将探针应用于活的巨噬细胞、人体正常的肝细胞和肝癌细胞内，实现 脂质氢过氧化物的“可视化 。 4 山东师范大学硕士学位论文 1 3 其他应用 花菁染料还被用于非线性光学材料，光盘存贮等领域。花菁染料是非线性光学 中的一类重要发色团，用这类发色团制成的极化聚合物其电光系数在1 3 1 3 n m 已 达至u 5 5 p m n ，这是技术上具有很重要应用的无机晶体铌酸锂电光系数的两倍【3 2 1 。 s i m o n s e n 等人【3 3 】合成了一系列二硫多甲川染料并对其三阶非线性性质进行了研 究，发现y 值在l 1 0 一，并且某些染料稳定性好，非线性光学系数大。另外， 唐黎明等【蚓利用花菁染料作为红外增感剂，合成的红外激光增感引发体系，使 增感剂、引发剂之间所发生的能量传递或电子转移而产生引发活性种的这一过程 处于同一分子内，提高了引发效率。在光学信息存储领域，花菁染料作为c d r o m 感光层材料，最早是由t a y i o y u d e n ( 太阳诱电) 为了相容于大多数c d r o m 驱动器读取激光头的功率而研发的，是目前做为c d r o m 记录层的三种常用染 料之一。作为具有良好光学性能的甲川花菁染料可以有效降低噪音，提高数据存 储与读取的可靠性。 5 山东师范大学硕士学位论文 第二节b o d i p y 类荧光染料及其应用 b o d i p y 类荧光染料的基本结构单元有a 和b 两种，即我们通常所说的 b o d i p y 和唑系b o d m y 。 ，f a p ，f b b o d i p y 类染料与其它荧光染料相比具有以下优点：( 1 ) 由于b o d i p y 染料母 体结构周围一般不直接连接对酸碱较敏感的氨基，羟基等，所以b o d i p y 染料一 般对p h 值不敏感。( 2 ) b o d i p y 染料的荧光量子产率一般都比较高，有的在水中 的荧光量子产率可以达到接近1 0 的水平。( 3 ) 具有相对较好的光稳定性，比荧光 素、花菁等稳定。( 4 ) b o d i p y 类荧光染料的荧光光谱半峰宽较窄，作为荧光标 识的时候有很好的灵敏度。( 5 ) b o d i p y 类荧光染料的摩尔吸光系数很大，吸光 效率比较高。基于上述优点，该类染料被广泛的应用于各种金属离子的检测，检 测自由基，测定p h 值，进行d n a 标记及测序等。 2 1 碱金属、碱土金属离子探针 2 1 1 镁离子探针 19 9 8 年，m a t t h i a sk o l l m a n n s b e r g e r 和j 6 r gd a u b 等人以带有单氮杂冠醚的苯 甲醛为原料合成了带有冠醚识别集团的b o d i p y 荧光染料的首个分子探针3 5 1 ，该 分子探针对于碱金属和碱土金属离子具有很好的响应和识别能力，对于m f + 的识 别能力相对较强，与镁离子反应后探针荧光强度增大超过1 0 0 0 倍，荧光寿命也相 应的变长，但是探针分子对溶液极性比较敏感。 2 1 2 钠、钾离子探针 钾钠是人体内两种极为重要的常量元素，发挥着关键的作用。两者各司其职， 又相互协调。钾参与细胞的新陈代谢，为某些酶的正常活动提供适宜的条件。钠 能加强神经肌肉的兴奋性，同时，钾钠在调节酸碱平衡，维持渗透压及保持水平 6 山东师范大学硕士学位论文 衡方面，也都起着极重要的作用。因此钾钠离子荧光探针也是人们关注的一个热 点。2 0 0 5 年，m u k u l e s hb a r u a h 等人设计合成了一种以b o d i p y 为母体，单氮杂十 八冠六的冠醚作为钾离子的螯合体，基于分子内电荷转移机理( i c t ) 的比率荧 光探针【3 6 】。该探针对钾离子具有高选择性，当与钾离子螯合后，吸收光谱明显 发生蓝移，并伴随着荧光的增强，而其他碱金属离子( l i + 、n a + 、c s + ) 则无明 显响应，从而有效地检测钾离子。后来，k o j is u z u k i 课题组利用一种不同于p e t 和i c t 的机理一构象约束机理设计合成了一种b o d i p y 探针，当与钠离子发生作用 之后，其吸收光谱发生红移，而对其他碱金属离子没有响应，包括钾离子这种主 要的干扰离子，从而高选择性的检测了钠离子【3 7 1 。但是以上两种探针均没在细 胞内对钾钠离子进行分析。接着w a nn a m k u n g 等人合成了一种水溶性的，可用于 细胞内检测钾离子的荧光传感器【3 8 1 ，它仍然是以b o d i p y 为发光团，该传感器对 钾离子具有高灵敏度，而且对生理p h 值范围5 9 ，阴离子和其他阳离子不敏感， 室温下，在盐水溶液中能稳定存在1 4 天，是一种比较理想的钾离子传感器。 2 2 重金属离子探针 重金属如汞、铬、镉、铅等残留在环境中或者在食物链中逐渐富集，通过农 畜产品进入消费者体内长期超量积累，对人类健康构成威胁【3 9 1 。它们不仅可以形 成复合物，而且在固氮、水净化、碳碳键的重排、基因转录、细胞的发育调控等 复杂的生化反应中起着重要的作用。然而，在更多情况下它们却担当着负面效应 的角色，重金属离子在浓度很高的情况下会在细胞内累积形成非特异性的复合物 而引起细胞中毒【4 0 1 ，某些金属离子例如c d 2 + 、a g + 等有很高的毒性，它们能够替 代细胞内有功能的金属离子，结合于重要的呼吸蛋白上，导致蛋白质和d n a 变性。 汞及其化合物属于剧毒物质【4 3 1 ，汞在自然界中以多种形式存在，汞的形态不同， 产生的毒性也不同。无机汞盐会引起急性中毒，表现为急性胃肠炎，脑，胃等器 官的损害。另外，水溶性环境中的细菌能把无机汞离子转化成甲基汞，甲基汞的 脂溶性高，易和蛋白质中的巯基结合，其毒性是无机汞的1 0 0 倍，它能在海洋生 物体内蓄积，经过食物链进入人体，导致中枢神经系统和内分泌系统的疾病。因 此设计合成重金属离子荧光探针意义重大。 2 2 1 汞离子探针 7 山东师范大学硕士学位论文 在人们设计合成的重金属离子探针中，汞离子探针占很大比例【“4 7 】。而基于 b o d i p y 染料的汞离子探针主要有以下几种：2 0 0 3 年，s oy o u nm o o n 和s u k - k y u c h a n g 等人采用8 一羟基喹啉作为重金属离子的识别分子，当把h 9 2 + 加入到探针 系统时，会使探针的荧光淬灭9 8 以上，同时h 9 2 + 加入后还会引起探针系统溶液 的颜色发生变化，从亮的橘红色变为没有荧光的普通红色，完全可以通过肉眼观 察到。而其他金属离子对探针的淬灭作用很小，或者根本没有影响，唯独h 9 2 + 淬 灭非常显著，这样保证了探针具有很好的专一性识别功能。然而，该探针与h 9 2 + 相互作用的机理并不明确，目前也难于给出一个很好的解释，有待于以后的工作 给予进一步阐明【4 8 】。2 0 0 7 年，d a o b e nz h u 等人在一个b o d i p y 分子上引入两个硫 氮冠醚分子合成了探针，其对汞离子具有高选择性和高灵敏度，它巧妙地同时利 用了i c t 和p e t 机理，当探针与汞离子作用后，其吸收和发射光谱发生显著蓝移， 荧光强度明显增强，溶液颜色从紫色变为粉红色，为其他金属离子的检测提供了 设计依据【4 9 1 。另外，e n g i nu a k k a y a 等人合成了一种含吡啶基的唑系b o d i p y 荧 光探针【5 0 1 ，该探针对h f + 有很好的选择性，而且发射在近红外区，但b o d i p y 类 汞离子荧光探针至今还没有应用到活细胞成像中，这就对探针提出了更高的要 求：低毒性，好的膜穿透性等。 2 2 2 银离子探针 2 0 0 0 年，k n u t 和j b r gd a u b 合成了带有单氮杂的硫冠醚b o d i p y 荧光分子探针。 该探针和金属阳离子反应后荧光增强，它主要是利用硫冠醚对重金属离子很好的 识别作用来进行重金属离子的荧光检测，结果证明该探针在乙腈溶液里对重金属 离子有很好的选择性，对a 矿具有很强的响应，荧光增强，荧光量子产率有明显 提高( 从0 0 0 0 1 增加到o 2 2 ) 。另外该探针对h f + 和c u 2 + 也有荧光增强作用， 尤其是对h 矿+ 的响应最为强烈，荧光量子产率能够升至o 5 9 ，说明该探针选择性 不够高【5 1 】。另外，e n g i nu 舢! ( 1 ( a y a 等人利用共振能量转移，合成了一种高选择性， 高灵敏度的银离子荧光探针吲。 2 2 3 镉、铅离子探针 x i a o j u np e n g 课题组利用b o d i p y 为母体，修饰上一个共轭的c d 2 + 螯合体，利用 分子内电荷转移机理，在活体细胞中对c d 2 + 进行了荧光成像分析【5 3 1 。2 0 0 8 年， 8 山东师范大学硕士学位论文 x uh o n gq i a n 等人设计合成了一种以b o d i p y 为发色团，高灵敏度测定镉离子的 荧光探针。该探针以聚酰胺作为镉离子的螯合体，当与镉离子结合后，荧光强度 增强了1 9 5 倍而且量子产率也增加了近1 0 0 倍，还很好的解决了锌离子的干扰问 题，成功应用于细胞成像【5 4 】。2 0 0 5 年，j u y o u n gy o o n 课题组合成了两种b o d i p y 的衍生物，其中一个化合物可以跟c u 2 + 和p b 2 + 生成螫合物，从而可以达到识别c u 2 + 和p b 2 + 的目的，但是却没有达到对p b 2 + 的专一性识别 5 5 1 。 2 3 过渡金属离子探针 2 3 1 锌离子探针 锌是人体内含量比较丰富的一种过渡金属，它在基因表达、神经传递、信号 转导等方面起着重要的作用，因此近年来锌离子荧光探针引起了大家的广泛关注 5 6 - 6 0 。以b o d i p y 为发光团的探针主要有以下几种：2 0 0 2 年，b i l g et u r f a n 和e n g i n u a k k a y a 等人合成了一种z n 2 + 探针，探针的结构中以2 ，2 一联吡啶为z n z + 的识别 基团，每一个吡啶上连有一个b o d i p y 染料，这个探针与z n 2 + 的作用使探针的荧 光极大的淬灭，原因是当联吡啶络合了z n 2 + 后，在光激发下联吡啶z n 2 + 络合物会 向b o d i p y 染料基团转移电子，从而使整个探针分子的荧光强度降低，达到荧光 淬灭的效梨6 1 】。这个探针巧妙的利用了联吡啶上氮原子能够络合并识别金属离 子的特点采用引入醛基的办法成功的引入了b o d i p y 染料基团，但该探针却不适 于细胞内检测锌离子。2 0 0 4 年，t e t s u on a g a n o 课题组也以b o d i p y 染料为母体合 成了一种锌离子荧光探针，该探针络合锌离子后荧光增强，而且p k a 降n 5 ，使得 其在人体内几乎不受p h 值的影响，非常适合应用于细胞内锌离子的检测，在锌离 子探针中又迈进了一大步【6 2 】。2 0 0 8 年，s e r d a ra t i l g a n 等人利用分子内电荷转移机 理( i c t ) ，在b o d i p y 上共轭的接上一个锌离子的螯合体d p a ，当d p a 与锌离 子结合后，发射峰从7 3 0 n m 蓝移至6 8 0 n m ，移动非常明显，而且该探针是一种水溶 性很好的近红外z n 2 + 荧光探针。【6 3 】但是对细胞内z n 2 + 进行动态跟踪检测仍然是一 个研究难点和热点，这就对探针提出了更高的要求。 2 3 2 铜、亚铜离子探针 2 0 0 5 年，j u y o u n gy o o n 课题组合成了两种b o d i p y 的衍生物，其中一个化合 物由于在c u 2 + 存在时发生水解，导致荧光强度发生变化，可以特异性的识别 9 山东师范大学硕士学位论文 c u 2 + 【5 5 】。2 0 0 6 年，l iz e n g 和c h r i s t o p h e rj c h a i l g 等人【删通过在b o d i p y 上修饰 一个硫醚合成了一种检测细胞i 勾c u + 的荧光探针，b o d i p y 上修饰一个硫醚之后 由于发生了光诱导电子转移，探针本身没有荧光，当探针分子和c u + 结合之后， 光诱导电子转移受限，荧光恢复，从而可以根据反应前后荧光强度的变化测定 c u + 的浓度，而且他们利用激光共聚焦技术做到了细胞内成像，验证了探针对c u + 的高灵敏度和高选择性。除此之外，b o d i p y 还连上冠醚测定铁离子【6 5 1 。 2 4 阴离子探针 b o d i p y 染料除了用来对金属阳离子进行检测外，还被用来检测阴离子。e n g i n u a k k a y a 等a t 6 q 设计了一种b o d i p y 荧光探针，该探针对c n 一有很好的响应，与 c n 。反应后，探针溶液颜色由红色变为蓝色，并伴随着荧光强度的减弱，因此该 探针可以掺杂在聚合材料中来检测c n 。 2 5 检测自由基 自由基在细胞正常活动中连续不断的少量生成，对信号转导、神经传递、血 压调节、免疫系统控制、细胞生长调节等【6 7 刁o 】起着重要作用。但是，当其生产 过量或抗氧化剂水平严重偏低时，自由基便会通过生物分子内氧化造成氧化胁 迫，例如破坏细胞膜的类脂、蛋白质、碳水化合物及d n a ，对生物体造成严重 伤害，在定程度上造成不可逆的细胞损伤。有非常重要的证据表明氧化胁迫同 多种疾病和衰老的产生有很大的关联【7 卜7 3 1 。所以，设计有效的自由基检测荧光探 针是目前的研究热点之一。2 0 0 4 年t e t s u on a g a n o 课题组设计合成了一种钡j j n o 的 荧光探针【7 4 】，该探针以b o d i p y 为荧光发色团，由于邻苯二胺p e t 的作用几乎不 发荧光，荧光量子产率只有0 0 0 2 ，当与n o 反应后，邻苯二胺形成一个三唑环， 荧光恢复，量子产率高达0 7 4 。2 0 0 7 年g o n z a l oc o s a 等人利用仅一生育酚对过氧 化烷氧自由基( r o o ) 的清除能力，通过共价键和荧光染料b o d i p y 结合起来， 在激发光下，酚对b o d i p y 产生了光诱导的分子内电子转移( p e t ) ，从而引起荧 光猝灭。当酚结构被r 0 0 氧化变成醌式后，p e t 消失，b o d i p y 的荧光恢复，而 且荧光增强与r o o 的浓度是成正比的，所以b t o h 能够用来定量地检测r o o 【嘲。 2 0 0 8 年d a ny a n g 等人利用对甲氧基苯酚和次氯酸的专一性反应，合成一种 b o d i p y 为母体的荧光探针，当对甲氧基苯酚被次氯酸氧化成苯醌后，荧光恢复， l o 山东师范大学硕士学位论文 从而高选择性的检测次氯酸【7 6 1 。 2 6 测定p h 值 荧光技术检澳l j p h 值也日益受到人们的关注【7 刀，因为b o d i p y 染料母体结构周 围一般不直接连接对酸碱较敏感的氨基，羟基等，所以b