（微生物与生化药学专业论文）苦荞麸皮总黄酮提取工艺研究.pdf

c l 目录 舢 y 18 8 1 3 彳1 3 1 1 1 | | 。 摘要i a b 刚瞳a c t ： 第一章文献综述。1 1 1 概述。1 1 2 苦荞的化学成分1 1 3 苦荞化学成分的药理活性2 1 4 苦荞的开发前景3 第二章苦荞麸皮总黄酮测定方法5 2 1 材料、仪器与试剂5 2 2 实验方法6 2 3 实验结果与讨论1 0 第三章苦荞麸皮总黄酮提取工艺研究1 7 3 1 实验材料、仪器与试剂1 7 3 2 实验方法18 3 3 结果与讨论1 9 第四章苦荞麸皮总黄酮纯化工艺的研究2 1 4 1 实验材料、仪器与试剂2 l 4 2 实验方法2 2 4 3 结果与讨论2 4 参考文献2 8 j 苗【谢3l 发表论文及参加课题一览表3 2 o， 西南大学硕士学位论文 摘要 曾量量量量量曼寡量鼍i i , 曼鼍量皇皇皇量量量曼皇皇量量量量量曼曼鼍置曼皇曼量量量舅置罾量曹 苦荞麸皮总黄酮提取工艺研究 微生物与生化药学顾涛 指导教师王彦涵副教授 捅晏 苦荞麸皮中含有大量的黄酮类化合物，这些黄酮具有抗自由基活性、拮抗血 小板活化因子、保护急性缺血性脑损伤、调节血糖和血脂代谢紊乱等药理作用。 本文的研究目的是以苦荞麸皮为原料，研究苦荞麸皮总黄酮提取物的提取工 艺。首先建立了苦荞麸皮总黄酮的含量测定方法，以芦丁为对照品，采用础c b 络合显色分光光度法测定总黄酮含量，确定了显色反应条件，即含适量黄酮的样 品溶液，加入lm l 结晶a i c l 3 无水乙醇溶液，再加入7 0 乙醇至总体积为1 0m l ， 室温下反应4 h ，在4 1 0 r i m 波长下测定吸光度。优化了苦荞麸皮总黄酮含量测定的 样品溶液制备方法，先后采用单因素考察和正交设计，考察了提取方式、溶剂的 醇浓度、料液比、提取时间等因素对总黄酮含量测定的影响，确定苦荞麸皮总黄 酮含量测定方法的样品溶液制备方法为：以7 0 乙醇为溶剂，料液比1 ：5 0 ，超声 提取3 0 m i n 。其次，探讨了苦荞麸皮总黄酮的提取工艺，以总黄酮提取率为评价指 标，比较了超声波辅助提取、回流提取、渗漉提取三种方式提取苦荞麸皮的总黄 酮回收率，最后确定，用7 0 7 , 醇回流提取苦荞麸皮，提取两次，每次用溶剂量 为材料的1 0 倍，每次提取2h 。最后，探讨了大孔吸附树脂法纯化苦荞麸皮总黄 酮的工艺条件。采用静态吸附和静态解吸附比较了m l - 7 、l i p 2 0 、。m l - 4 0 、 h d 2 m g l ，h p 2 0 s s ，d 2 0 2 ，f p d a ，c d l 8 0 ，1 2 2 ，7 1 7 ，7 1 ，c m 6 5 0 ，d 0 0 4 ， d 1 5 1 和7 3 1 大孔吸附树脂对苦荞麸皮总黄酮的纯化效果，选取黄酮静态吸附率和 黄酮静态解吸率表现均好的m l 7 、h p 2 0 和m l - 4 0 三种树脂进行动态吸附和动 态解吸研究，比较它们的黄酮载样量和解吸率，最后确定用m l 7 纯化苦荞麸皮 总黄酮，并通过累积洗脱曲线确定载样树脂的洗脱溶剂为7 0 乙醇，洗脱体积为 4 日玑 关键词：苦荞麸皮总黄酮提取纯化工艺 钆 ， 、 s t u d i e so nt h ee x t r a c t i n gt e c h n i q u eo f t o t a l f l a v o n o i d sf r o mt a r t a r yb u c k w h e a tb r a n m i c r o b i a la n dbi o c h e m i c a lp h a r m a c y p o s t g r a d u a t eg u t a o s u p e r v i s o rw a n g y a nh a n a b s t r a c t t a r t a r yb u c k w h e a tb r a ni s r i c h i nf l a v o n o i d sw h i c hp r e s e n tu n i v e r s a lp h a r m a c o l o g i c a la n d p h y s i l o g i c a l a c t i v i t i e ss u c ha sa n t i - f r e er a d i c a l ，a g a i n s tb i n d i n go fp l a t e l e ta c t i v a t i n gf a c t o r , p r o t e c t i n gf r o ma c u t ec e r e b r a li s c h e m i c 坷u d ，a n di m p r o v i n gt h ed i s o r d e ro fg l u c o s ea n dl i p i d m e t a b o l i s m t h i sw o r kd e d i c a t e dt oo p t i m i z i n gt h ee x t r a e t 伽gt e c h n i q u ef o rt h et o t a lf l a v o n o i d se x t r a c tf r o m t a r t a r yb u c k w h e a tb r a n ( t b b t f e ) f i r s t l y , q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o nm e t h o do f t o t a lf l a v o n o i d s w a se s t a b l i s h e dw i t hs p e c t r o p h o t o m e t r ym e t h o db yc o l o r a t i o nw i t ha i 弘a n du s i n gr u t i na sr e f e r e n c e s u b s t a n c e p r o p e ra m o u n to fs a m p l es o l u t i o n s w a sa d d e dw i t h1m lo fa 1 c i a 6 h 2 0 - e t h a n o l s o l u t i o n , t h e nw i t h7 0 e t h a n o ls o l u t i o nt ot h et o t a lv o l u m et ob e10 m l ，i n c u b a t e df o r4 h a tl o o m t e m p e r a t u r ea n d t h ea b s o r b a n c ew a sd e t e r m i n e da t4 1 0n m t h ee f f e c t so f t h et e c h n o l o g i c a lf a c t o r s i n c l u d i n ge x l r a e t i n gm e t h o d , t h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o la q u e o u ss o l u t i o n , t h er a t i oo fs o l v e n tt o s t u f fa n de x t r a c t i n gt i m eo nt h et o t a lf l a v o n o i d sd e t e r m i n a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e db y t h es i n g l e f a c t o r r e s e a r c ha n do r t h o g o n a ld e s i g n f i n a l l y , t h ep r e p a r a t i o nm e t h o df o rs a m p l es o l u t i o nw a sd e t e r m i n e d a sf o l l o w s ：e x t r a c t i n gt h em a t e r i a lw i t ht h eh e l po fu l t r as o u n df o r3 0m i n w i t h7 0 a q u e o u se t h a n o l 雒s o l v e n t , w i t ht h er a t i oo fs o l v e n tt os t u f f1 ：5 0 n e x t ；t h ee x - w a c t i n gt e c h n i q u ef o rt b b t f e w a so p t i m i z e d t h ee x t r a c t i n gr a t eo ft o t a lf l a v o n o i d s w a su s e d 豳t h ei n d e xt oa s s e s st h ee x t r a c t i n gt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n s u l t r a s o n i ce x t r a c t i o n , r e f l u x a n dp e r c o l a t i o nw e 他i n v e s t i g a t e d f i n a l l y , t h ee x t r a c t i o np r o c e s s e sf o rt b b t f ew e r ed e t e r m i n e da s f o l l o w s ：翻地l c l 【i i l gt h em a t e r i a lb yr e f l u xw i t h10t i m e so f7 0 e t h a n o l a q g o o n ss o l u t i o nf o r2 h a n d e x t r a c t i n gf o rt w i c e k 瓯t h ep u r i f i c a t i o nt e c h n i q u ef o rt o t a lf l a v o n o i d sf r o mt a r t a r yb u c k w h e a t b r a nw a so p t i m i z e d 、 它 、 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 i l 第一章文献综述 1 1 概述 苦养( f a g o p y r u mt a t a r i c u mg ) g a e r t n ) 又名鞑靼荞麦，为双子叶蓼科 ( p o l y g o n a e e a e ) 荞麦属( f a g o p y r u mm i l l ) 一年生宿根性植物，其种子可供食用。 苦荞在我国境内自然野生的历史已有两千多年，主要分布在黄土高原高寒山区和 云贵高原山地。我国是全球苦荞的主要产区，美国、加拿大、日本、韩国、波兰、 印度和斯洛文尼亚等国也有种植【。 苦荞粉中抗性淀粉和膳食纤维的含量较高，适用于糖尿病人的主食；苦荞蛋 白是全营养蛋白，作为高血脂、高血糖病人的食物安全健康；苦荞作为一种具有 多种特殊保健功能的粮食，能满足当代人对健康的渴求。故近二十年来，苦荞倍 受食品界和消费者的青睐；其国内外的消费量日益增长。 近年涌现了大量关于苦荞的研究论文，本文仅对苦荞的化学成分和药理作用 研究进展进行了综述，希望能对苦荞的进一步研究提供参考。 1 2 苦荞的化学成分 苦荞麦营养价值高，是谷类作物中唯一集七大营养素于一身的作物，被誉为 “五谷之王。其七大营养成分包括： 1 、生物类黄酮：成熟苦荞籽粒中主要含有槲皮素、芦丁、槲皮素3 芸香糖葡 萄糖苷、山奈酚和山奈酚3 芸香糖苷。其中含量最高的是芦丁，占苦荞总黄酮的 9 0 以上【2 】。芦丁又名维生素p ，在其它谷物中几乎没有。 2 、微量元素和矿物质：苦荞麦含有多种有益人体健康的无机元素，如钙、磷、 铁、铜、锌和微量元素硒等，k r e f t 等对普通苦荞微量元素检测表明苦荞中硒和锌 的含量分别是o 0 5 8 m g k g 和7 8 8 m g k g 【3 】。国外食品硒的来源多为将无机硒添加在 饲料中转化，在食物链上为二级吸收，苦荞硒为天然有机硒，以绿色植物为载体， 十分珍贵。 3 、淀粉：与一般谷类淀粉相比，苦荞淀粉食后不易被人体消化吸收。抗性淀 粉进入大肠后，被肠道菌群分解，能起到平缓血糖反应曲线的作用，对糖尿病人 有重要的保健功能。抗性淀粉在大肠内发酵，也有助于阻止结肠癌发生。苦荞麦 淀粉为支链淀粉，畲大量凝胶黏液，加热后呈弱碱性，对胃酸过多有抑制作用【l j 。 4 、纤维素：也称膳食纤维，是一类不被人体消化酶分解的高分子碳水化合物。 苦荞中的纤维素含量具有降脂减肥和排毒养颜的生理活性【l j 。 5 、脂肪：苦荞的不饱和脂肪酸主要为c 1 8 ：1 、c 1 8 ：2 、c 1 8 ：3 和c 2 0 ：1 ，并主 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 要存在于麸皮中【1 1 ；由于苦荞含不饱和脂肪酸量高，所以摄食苦荞可以有效降低体 内血脂黏度。如果缺乏亚油酸，胆固醇就会与一些饱和脂肪酸结合，发生代谢障 碍，在血管壁上沉积下来，逐步形成动脉粥样硬化，引发心脑血管疾病。 6 、蛋白质：苦荞的蛋白含有1 9 种天然氨基酸，特别含有一般植物如小麦、 稻米所缺少的赖氨酸，富含精氨酸和组氨酸降5 】。由于苦养蛋自富含精氨酸，可以 防止体脂增加。 7 、维生素：苦荞中含有丰富的维生素，如维生素b l 、维生素b 2 、维生素b 6 i s 、 维生素e 、维生素p p 。苦养麸皮中维生素b 6 的含量高达o 6 1 m g 1 0 0 9 【1 1 ；此外苦荞 还含有其他谷类粮食所不具有的维生素p ( 芦丁) 和维生素c 。 1 3 苦荞化学成分的药理活性 1 3 1 黄酮类化合物药理活性 苦荞黄酮具有抗氧化、抗栓塞、改善微循环药理活性，能有效降低微血管脆 性和渗透性，有预防大脑微血管出血和维护眼循环的作用。苦荞黄酮生理活性主 要有： 1 、抗氧化：黄酮类化合物具有各种不同的酚羟基，分子中心的a 、p 不饱吡 喃酮使其表现出一定的抗氧化活性。王敏等人研究了苦荞总黄酮提取物的自由基。 清除活性，结果表明苦荞总黄酮提取物对o h 自由基、d p p h 自由基、h 2 0 2 以及 n o 2 离子都有清除活性，表现出良好的抗氧化能力睁1 0 。 2 、拮抗血小板活化因子作用：血小板活化因子( p l a t e l e ta c t i v a t i n gf a c t o r ，p a f ) 与血栓形成、动脉粥样硬化、炎症反应及缺血再灌注、自由基损伤等诸多心脑血 管疾病的发病均密切相关，因此拮抗p a f 的作用是目前缓解缺血性心脑血管疾病 的重要途径。林静实验结果表明，芦丁可浓度依赖地拮抗p a f 与兔血小板膜受体 的特异性结合，抑制p a f 介导的兔血小板黏附与p m n s 内游离c a 2 + 浓度的升高， 表明芦丁抗p a f 的作用机制是通过抑制p a l ：受体活化，进而阻断p a f 诱发的反应， 从而起到保护心血管的作用【1 1 1 。 3 、急性缺血性脑损伤保护作用：黄叶梅等利用苦荞黄酮对大鼠脑缺血再灌注 实验表明，结扎双侧颈总动脉血流3 0 r a i n 后进行再灌注9 0 r a i n ，实验组与假手术组 相比，大鼠脑组织的丙二醛、乳酸脱氢酶、n o 有明显的升高，s o d 活力有所降 低。说明苦荞总黄酮能降低乳酸脱氢酶的活力，减少n o 和丙二醛的产生【1 2 j 。徐 峰等的研究也表明苦养黄酮对脑缺血有一定的保护作用【1 3 1 。 4 、降血糖、降血脂、降血压：祁学忠等利用实验性高血糖动物模型观察苦荞 黄酮提取物对动物血糖的影响，研究结果表明苦荞提取物1 8 0 m g k g 、9 0 m g k g 分 别对小鼠灌胃l 周，对正常小鼠血糖无明显影响，对实验性高血糖的小鼠血糖有 2 西南大学硕士学位论文 第一苹文献综述 明显降低作用。苦荞黄酮提取物能促进肝糖原合成。与正常小鼠比较，可提高 6 9 8 ，对高血糖小鼠糖耐受量也有明显的改善作用。1 8 0 m g k g 能改善氢化可的松 诱发的小鼠胰岛素抗性。苦荞提取物1 2 5 m g k g 、6 2 5 m g k g 分别对大鼠灌胃2 周， 对实验性高血糖大鼠血糖有显著的降低作用；对糖化蛋白也有显著降低作用【1 4 1 。 祁学忠等用苦荞黄酮提取物1 2 0 r a g k g 或1 2 5 m g k g 给小鼠或大鼠灌胃l 周或 2 周，显示出有降低血清胆固醇和甘油三酯的作用。此外，苦荞黄酮提取物还可降 低肝甘油三酯，说明苦荞提取物有改善脂质代谢异常的作用。苦荞提取物与维生 素c 联合使用，不增强其降血糖作用，但对其降低血脂活性有一定的增强作用l l5 1 。 薛长勇等人研究了苦荞总黄酮降血糖和降血脂的作用机制。表明苦荞总黄酮 提取物除了直接抑制三酰甘油的吸收外；还能明显抑制a 糖苷酶的活性，与贝特 类降脂药物具有相似的作用机制。证实了苦荞总黄酮表现出良好的降血糖和降血 脂药理活性【1 6 1 。k a w a s a k it 等研究表明，苦荞总黄酮有很好的降血压的作用【1 7 】。 t a t s u r os u z u k i 等还对苦养中单体芦丁对内皮依赖血管舒张的药理活性进行了研究 1 1 8 o 1 3 2 微量元素药理活性 ， 镁元素参与人体细胞能量转换，调节心肌活动并促进人体纤维蛋白溶解，还 具有抑制凝血酶生成，降低血清胆固醇，预防动脉硬化、高血压、心脏病的作用。 钾元素是维持体内水分平衡、酸碱平衡和渗透压的重要阳离子。硒在人体内与金 属相结合形成一种不稳定的“金属硒蛋白”复合物，有助于排泄人体中的有毒物 质，如铅、汞、镉等。 1 3 3 手性肌醇药理活性 手性肌醇能调节胰岛素活性，对中度糖尿病患者有明显的降糖作用。曹文明 等人通过实验表明苦荞中的d 手型肌醇抽提物对糖尿病小鼠具有显著降低空腹血 糖；对糖尿病患者具有显著降低空腹血糖和极显著降低餐后血糖的作用【1 弘2 2 1 。 1 4 苦荞的开发前景 近年来市场上涌现了大量的苦养产品，如荞麦面、养麦饼干、苦荞茶、荞麦 枕等，但几乎都是低技术含量产品。为充分发挥苦荞的保健功能，有必要开展更 深入的研究，探明苦荞的活性成分及其理化性质，提高加工工艺水平，增强苦荞 产品的保健作用。 苦荞是四川大凉山彝族居民的主要食物来源之一，四川凉山彝族自治州现在 有彝家山寨黑苦荞食品有限公司、西昌三匠苦荞开发有限公司和西昌环太有限责 3 4 西南大学硕士学位论文第二章苦荞麸皮总黄酮测定方法 第二章苦荞麸皮总黄酮测定方法 苦荞麸皮含丰富的黄酮类成分，主要有槲皮素、芦丁、槲皮素3 芸香糖葡萄 糖苷、山奈酚和山奈酚3 芸香糖苷等化合物【7 1 。这些黄酮化合物有多种药理活性 或生理活性，故不能通过把某种或某几种黄酮单体化合物的定量作为评价苦荞麸 皮或其提取物的质量标准，常常需要测定它们所含的总黄酮含量。 总黄酮的定量方法有多种，至今尚无统一标准。常用方法有a l c h 显色分光 光度法、n a n 0 2 - a i ( n 0 3 ) 3 - n a o h 显色分光光度法、h p l c 法和毛细管电泳、法l 7 矧。 根据徐宝才等人的研究，可以看出a l c h 显色分光光度法的测定值与h p l c 法相近，偏差为3 9 l 4 9 1 ，而n a n 0 2 a i ( n 0 3 ) 3 - n a o h 分光光度法的测定值偏差 较大，偏差为4 6 3 6 。1 3 6 6 3 。a i c l 3 显色分光光度法测定时，芦丁、桑色素等黄 酮类物质反应强烈；而对酚酸、原花色素的反应很小；因此该法对黄酮类化合物 的专属性较强，适于苦荞黄酮的测定。n a n 0 2 - h l ( n 0 3 ) 3 - n a o h 分光光度法源于芦 丁含量测定法，并逐步用于黄酮类化合物的测定。后来发现这并不是黄酮类化合 物的专属反应，因为凡是具有邻苯二羟基的物质均能用此法进行显色定量 7 1 。由于 a i c h 显色分光光度法的测定值与h p l c 法相近，更适用于苦荞黄酮的定量测定。 而阳? l c 法虽然准确度和精确度均佳，但只能用于有对照品的成分的含量测定， 而不适用于测定没有对照品的黄酮类成分。因为苦荞麸皮所含黄酮类成分种类繁 多，并且组成常有变化，难以同时得到这些化合物的对照品，故h p l c 法不适用 于测定苦荞麸皮总黄酮的含量。所以，本实验采用a i c b 显色分光光度法测定苦 荞麸皮及其提取物中的黄酮含量。 据文献报道，苦荞麸皮的总黄酮中，9 0 以上是芦丁【7 】，且芦丁具有显著而明 确的药理活性，故本实验选择芦丁作为苦荞麸皮总黄酮含量测定的对照品。 2 1 材料、仪器与试剂 电子天平( j a 2 0 0 3 n ，上海精科) ；超声波清洗器( k q 5 2 0 0 e ，昆山市超声仪 器有限公司，2 0 0 w ) ：s h i m a d z u 阱2 4 0 0 p c ( 岛津公司，日本) 分光光度计； 7 2 2 可见分光光度计( 菁华科技仪器有限公司，上海) ；w h ? 1 微型旋涡混合仪( 上 海沪西分析仪器有限公司) ；电炉；d f 1 0 1 s 集热式恒温磁力搅拌器( 郑州长城科 工贸易有限公司) ；2 5 0m l 圆底烧瓶；2 5 0m l 烧杯、2 5 0m l 具塞三角烧瓶；纯水 、 机( m i u i p o r e ，u s a ) 。 结晶氯化铝( 成都科龙试剂厂，分析纯) ；无水乙醇( 成都科龙试剂厂，分析 纯) 。对照品芦丁( 批号：f 2 0 0 5 0 5 1 2 ) 购自中国药品生物制品检定所。苦荞麸皮 由云南省新平华兴食品有限责任公司提供。 5 西南大学硕士学位论文第二章苦莽麸皮总黄酮测定方法 量罾鼍曼量皇曼量曼曼曼曼曼量皇蔓量量量量| 奠量量量鼍量量i 鼍皇舅量墨量量量量量曼曼曼曼葛曼曼曼量暑皇一 2 2 实验方法 2 2 1 确定检测波长 精确量取o 2m g m l 的芦丁对照品的7 0 乙醇溶液o 4m l ，加入8 6m l7 0 乙醇，再加入1m l5 结晶氯化铝无水乙醇溶液，用涡流振荡器混匀，密塞，室 温下放置4 h 后，扫描芦丁灿3 + 络合物的u v 二s 吸收光谱。 称取苦荞麸皮粉末1 0 0 2 9 ，置于2 5 0m l 具塞三角烧瓶中，加入1 0 0m l 7 0 乙醇，超声提取4 0 m i n ，过滤，弃初滤液，取续滤液1m l ，加入8m l7 0 乙醇溶 液，再加入1m l5 结晶氯化铝无水乙醇溶液，用涡流振荡器混匀，密塞，在室 温下放置4 h 后，扫描样品总黄酮础3 + 络合物的u v 二s 吸收光谱。 比较对照品和样品显色液的u v - v i s 吸收光谱，选取二者一致的最大吸收波长 ( z a m x ) 作为测定波长。 2 2 2 考察显色时间 称取苦荞麸皮粉末1 9 左右6 份，分别置于2 5 0m l 具塞三角烧瓶中，再分别 精确加入7 0 乙醇1 0 0m l ，称重，超声提取3 0 m i n 。提取结束后，分别取出，擦 干瓶外壁，静置至室温，称重，用7 0 乙醇补至原重，混匀，过滤，弃初滤液， 取续滤液。分别精确吸取续滤液1m l ，置于1 0m l 试管中，分别依次加入0 5m l 5 结晶氯化铝无水乙醇溶液和8 5m l7 0 乙醇稀释，用涡流振荡器混匀，密塞， 3 份室温放置，3 份4 0 0 水浴放置。放置3 0 m i n 测定于4 1 0 r i m 波长的吸光度( a 4 l o 姗) ， 每隔2 h 测一次1 0 i h i i ，并求每次测得的吸光度平均值。确定显色液的a 4 1 0 m 达稳 定所需的时间，作为显色反应的时间。 2 2 3 线性关系 称取芦丁3 0 m g 放入1 0 0m l 容量瓶中，再加入7 0 乙醇，超声助溶。最后用 7 0 乙醇定容至1 0 0m l ，得浓度为0 3 r a g m l 的对照品母液。得浓度为0 3 m g m l 的对照品溶液。分别用移液管精确吸取o 5 、0 6 、0 7 、0 8 、0 9 、1 0m l 对照品 溶液于1 0m l 容量瓶中，置于1 0m l 试管中，分别加入1m l5 结晶氯化铝无水 乙醇溶液，再分别用7 0 乙醇溶液定容至1 0m l ，用涡流振荡器混匀，密塞，室 温下放置4 h 后检测l o m n 。以显色反应溶液中芦丁的浓度为横坐标，吸光度为纵 坐标，绘制工作曲线。采用线性拟合，求得标准方程。 、 2 2 4 样品溶液制备 2 2 4 1 提取溶剂考察 6 西南大学硕士学位论文第二章苦荞麸皮总黄酮测定方法 考虑生产安全性，本实验选择乙醇或其水溶液作为提取溶剂，料液比1 ：1 0 0 对 提取溶剂的乙醇浓度进行了单因素考察。称取苦荞麸皮粉末1 9 左右1 8 份，分别 置于2 5 0m l 具塞三角烧瓶中，每3 瓶一组，分为六组。每组分别加入4 0 、5 0 、 7 0 、7 0 、8 0 、9 0 、9 5 乙醇1 0 0m l 。分别称重，均用超声波辅助提取4 0 m i n ， 分别取出，擦干瓶外壁，静置至室温，称重，分别用各自的溶剂补至原重，混匀， 过滤，弃初滤液，取续滤液。分别精确吸取各续滤液0 5m l ，置于1 0m l 试管中， 分别依次加入1m l5 结晶氯化铝无水乙醇溶液和8 5m l7 0 乙醇溶液，用涡流 振荡器混匀，密塞，室温放置4 h 后，测定a 4 1 0 a m ，并根据线性方程计算为每克样 品相应的总黄酮含量。 2 2 4 2 提取方法 比较了用回流提取、室温搅拌提取、超声辅助提取制备待测样品溶液的测定 结果。 2 2 4 2 1 回流提取 2 2 4 2 1 1 提取时间考察 称取苦养麸皮粉末l g 左右1 2 份，分别置于2 5 0m l 磨口圆底烧瓶中，再分别 精确加入7 0 乙醇1 0 0m l ，称重，每3 瓶一组，共四组。分别水浴回流提取l h 、 2 h 、3 h 、4 h ，取出，擦干瓶外壁，静置至室温，称重，分别用7 0 乙醇补至原重， 混匀，过滤，弃初滤液，取续滤液。分别精确吸取各续滤液o 5m l ，置于1 0m l 试管中，分别依次加入1m l5 结晶氯化铝无水乙醇溶液和8 5m l7 0 乙醇溶液， 用涡流振荡器混匀，密塞，室温放置4 h 后，测定l 蛐，并根据线性方程计算为 每克样品相应的总黄酮含量。 2 2 4 2 1 2 提取溶剂用量考察 称取苦荞麸皮粉末1 9 左右9 份，分别置于2 5 0m l 磨口圆底烧瓶中，再分别 精确加入7 0 乙醇5 0m l ，1 0 0 m l ，2 0 0m l 称重，每3 瓶一组，共3 组。水浴回 流提取2 h ，取出，擦干瓶外壁，静置至室温，称重，分别用7 0 乙醇补至原重， 混匀，过滤，弃初滤液，取续滤液。分别精确吸取各续滤液o 5m l ，0 5m l ，lm l 置于1 0m l 试管中，分别依次加入1m l 5 结晶氯化铝无水乙醇溶液和8 5m l ， 8 5m l ，8m l7 0 乙醇溶液，用涡流振荡器混匀，密塞，室温放置4 h 后，测定 1 0 咖，并根据线性方程计算为每克样品相应的总黄酮含量。 2 2 4 2 2 室温搅拌提取 7 西南大学硕士学位论文第二章苦荞麸皮总黄酮测定方法 2 2 4 2 2 1 提取时间考察 称取苦荞麸皮粉末1 9 左右1 2 份，分别置于2 5 0m l 烧杯中，再分别精确加入 7 0 乙醇1 0 0m l ，称重，每组3 个平行，共四组。分别在3 0 c 水浴条件下搅拌提 取1 h 、2 h 、3 h 、4 h ，取出，擦干瓶外壁，静置至室温，称重，分别用7 0 乙醇补 至原重，混匀，过滤，弃初滤液，取续滤液。分别精确吸取各续滤液o 5m l ，置 于1 0m l 试管中，分别依次加入1m l5 结晶氯化铝无水乙醇溶液和8 5m l7 0 乙醇溶液，用涡流振荡器混匀，密塞，室温放置4 h 后，测定l o 砌，并根据线性 方程计算为每克样品相应的总黄酮含量。 2 2 4 2 2 2 提取溶剂用量考察 称取苦养麸皮粉末1 9 左右9 份，分别置于2 5 0m l 烧杯中，再分别精确加入 7 0 乙醇5 0m l ，1 0 0m l ，2 0 0m l ，称重，每组3 个平行，共3 组。分别在3 0 1 2 水浴条件下搅拌提取2 h ，取出，擦干瓶外壁，静置至室温，称重，分别用7 0 乙 醇补至原重，混匀，过滤，弃初滤液，取续滤液。分别精确吸取各续滤液0 5m l ， 0 5m l ，lm l 置于1 0m l 试管中，分别依次加入1m l5 结晶氯化铝无水乙醇溶 液和8 5m l ，8 5m l ，8 0m l7 0 乙醇溶液，用涡流振荡器混匀，密塞，室温放 置4 h 后，测定l o i i ，并根据线性方程计算为每克样品相应的总黄酮含量。 2 2 4 2 3 超声波提取 2 2 4 2 3 1 提取时间考察 称取苦荞麸皮粉末1 9 左右1 8 份，分别置于2 5 0m l 具塞三角烧瓶中，再分别 精确加入7 0 乙醇5 0m l ，称重，每3 瓶一组，分为六组。分别超声提取l o m i n 、 2 0 m i n 、3 0 m i n 、4 0 m i n 、5 0 m i n 、6 0 m i n 。提取结束后，分别取出，擦干瓶外壁，静 置至室温，称重，分别用7 0 乙醇补至原重，混匀，过滤，弃初滤液，取续滤液。 分别精确吸取各续滤液o 5m l ，置于1 0m l 试管中，分别依次加入lm l5 结晶 氯化铝无水乙醇溶液和8 5m l7 0 乙醇溶液，用涡流振荡器混匀，密塞，室温放 置4 h 后，测定l0 n i i i ，并根据线性方程计算为每克样品相应的总黄酮含量。 2 2 4 2 3 2 提取溶剂用量考察 称取苦荞麸皮粉末l g 左右9 份，分别置于2 5 0m l 具塞三角烧瓶中，再分别 精确加入7 0 乙醇5 0m l ，1 0 0m l ，2 0 0m l ，称重，每3 瓶一组，分为3 组。分 别超声提取3 0 m i n 。提取结束后，分别取出，擦干瓶外壁，静置至室温，称重，分 别用7 0 乙醇补至原重，混匀，过滤，弃初滤液，取续滤液。分别精确吸取各续 滤液0 5m l ，0 5m l ，1m l 置于1 0m l 试管中，分别依次加入1m l5 结晶氯化 8 西南大学硕士学位论文第二章苦荞麸皮总黄酮测定方法 铝无水乙醇溶液和8 5m l ，8 5m l ，8 0m l7 0 乙醇溶液，用涡流振荡器混匀，密 塞，室温放置4 h 后，测定l o 岫，并根据线性方程计算为每克样品相应的总黄酮 含量。 2 2 4 2 3 3 超声波提取正交试验 采用正交设计试验优化超声波辅助提取制各样品溶液的方法，采用l 1 6 ( 4 5 ) 正 交设计表，考察因素和水平见表2 1 ，正交实验设计及其结果见表2 1 2 。 表2 1 正交设计优化超声波提取制备苦荞麸皮样品溶液方法的考察因素和水平表 t a b l e 2 1t h ef a c t o r sa n dl e v e l st e s t e di nt h eo r t h o g o n a ld e s i g nf o ro p t i m i z i n gt h ep r e p a r a t i o n 一一望! ! 堕垒q 垒q ! ! ! ! ! 翌旦! 皇兰q ! 坚垒! 翌鱼：q 堡垒坠呈! 坌也曼型垒! 璺旦噬坠鲢! 箜q 垡宝茎垒：璺堕q 塾 各因素水平 a ( 乙醇浓度)b ( 料液比)c ( 提取时间)d ( 随机因素)e ( 提取温度) 考察因素 2 2 5 精密度 对苦荞麸皮总黄酮含量测定方法进行了日内精密度和日间精密度考察。 2 2 5 1 日内精密度 分别取高( 3 0 i ，t g m l ) 、中( 2 0 i - t g m l ) 、低( 1 5 p g m l ) 三个浓度的对照品溶 液和某二样品溶液各1m l ，分别置于1 0m l 具塞试管中，分别精确加入5 结晶 氯化铝无水乙醇溶液1m l ，再加入7 0 乙醇8m l ，涡流振荡器混匀，密塞室温 放置4 h 后，测定a 4 1 0 岫，然后每隔2 h 测一次a 4 1 0 n m ，共测定4 次。计算各次测定 值的r s d 。 2 2 5 2 日间精密度 用于考察日内精密度的高、中、低对照品反应液和样品反应液在第一次测定 后2 4 h 、4 8 h 和7 2 h 后，再次测定a 4 1 0 r a n ，测定间隙反应液均密塞避光室温保存。 计算各次测定值的r s d 。 2 2 6 准确度 采用加样回收率评价该总黄酮含量测定方法的准确度。 称取1 9 左右苦荞麸皮粉末3 份，分别置于2 5 0m l 具塞三角烧瓶中，再分别 精确加入1 0 0m l7 0 乙醇，称重，超声提取4 0 m i n ，取出，擦干瓶外壁，静置至 室温，称重，分别用7 0 乙醇补至原重，混匀，过滤，弃初滤液，取续滤液。分 9 西南大学硕士学位论文第二章苦荞麸皮总黄酮测定方法 | i , ,a 。i ta 舅量罾| 曹置| 皇置量量量量量量皇量量皇置| 皇置量墨皇皇量鼍量皇皇童_ 别精取各续滤液0 5m l ，置于1 0 m l 具塞试管中，分别依次加入5 舢c b - 无水乙 醇溶液lm l 和7 0 乙醇8 5m l ，混匀，密塞，室温放置4 h ，测定a 4 1 0 n m ，分别 带入标准方程，再按稀释倍数计算样品中总黄酮含量，取三个测定值的平均，即 为材料的总黄酮含量。 称取1 9 苦荞粉末9 份，分别置于2 5 0m l 三角烧瓶中。每3 瓶一组，共分三 组。第一组各瓶分别加入芦丁对照品2 8 8 0 m g ( 1 9 样品所含总黄酮量的8 0 ) ，第 二组各瓶分别加入芦丁对照品3 6 0 0 m g ( 1 9 样品所含总黄酮量的1 0 0 ) ，第三组 各瓶分别加入芦丁对照品4 3 2 0 m g ( 1 9 样品所含总黄酮量的1 2 0 ) 。各瓶分别精 确加入1 0 0m l7 0 乙醇，称重，超声提取4 0 m i n ，取出，擦干瓶外壁，静置至室 温，称重，分别用7 0 乙醇补至原重。混匀，过滤，弃初滤液，取续滤液。分别 精确吸取各续滤液o 2 5m l ，置于1 0m l 具塞试管中，分别依次加入5 a 1 c 1 3 一无 水乙醇溶液1m l 和7 0 乙醇8 7 5m l ，混匀，密塞，室温4 h ，测定a 4 1 0 = ，分别 带入标准方程，再按稀释倍数计算加样后的总黄酮量，并计算加样回收率。 加样回收率计算公式为： 加样回收率= ( 加样后总黄酮量材料含总黄酮量) 加入对照品量】1 0 0 2 2 7 重复性 称取1 9 左右苦荞麸皮粉末6 份，分别置于2 5 0m l 具塞三角烧瓶中，分别精 确加入1 0 0m l7 0 乙醇，称重，超声提取3 0 m i n ，取出，擦干瓶外壁，静置至室 温，称重，用7 0 乙醇补至原重。混匀，过滤，弃初滤液，取续滤液。分别精确 吸取各续滤液1m l ，置于1 0m l 具塞试管中，分别依次加入8m l7 0 乙醇和5 结晶氯化铝无水乙醇溶液1m l ，用涡流振荡器混匀，密塞，室温放置4 h 后，测 定1 0 l 蛐，分别带入标准方程，计算材料的总黄酮含量。并计算各测定值的r s d 。 2 3 实验结果与讨论 2 3 1 确定测定波长 由图2 1 和图2 2 可知：苦荞麸皮总黄酮枷3 + 络合物的u v - v i s 吸收光谱与芦 丁灯+ 络合物的很相似，证明苦荞麸皮总黄酮确实以芦丁为主，选择芦丁作为测 定苦荞麸皮总黄酮含量的对照品是正确的。芦丁捌3 + 络合物和苦荞麸皮总黄酮- 胛 + 络合物的最大吸收波长均为4 1 0 r i m 左右，故确定测定波长为4 1 0 r i m 。 1 0 西南大学硕士学位论文 第二章苦养麸皮总黄酮测定方法 一一一一 - 一”一一f j 莲 h 。一 图2 1 芦丁a 1 3 + 络合物的u v - v i s 吸收光谱 f i g 2 1u v - v i ss p e c t r u mo ft u r i n - a 1 3 + c o m p l e x 图2 2 苦荞麸皮总黄酮a 1 3 + 络合物u v - v i s 吸收光谱 f i g 2 2l r v - v i ss p e c t n u no f t h et o t a t a lf l a v o n o i d so f t a r t a r yb u c k w h e a tb r a nc o m p l e x e dw i t ha 1 3 + 2 3 2 显色时间的考察结果 表2 2 苦荞麸皮提取液与a 1 3 + 在室温下络合不同时间后的吸光度( ，产3 ) t a b l e2 2a b s o r b a n c eo f t h ec o m p l e xo f a l 3 + a n dt h ee x l r a e t so f t h et a r t a r yb u c k w h e a tb r a na f t e r r e a c t i n ga tr t f o rd i f f e r e n tt i m e ( n = 3 ) 表2 3 苦荞麸皮提取液与a 1 3 + 在4 0 温度条件下络合不同时间后的吸光度( 萨3 ) t a b l e2 3a b s o r b a n c eo ft h ec o m p l e xo f a l 3 + a n dt h ee x t r a c t so f t h et h et a r t a r yb u c k w h e a tb r a n a f t e rr e a c t i n ga t4 0 cf o rd i f f e r e n tt i m e ( n = 3 ) 西南大学硕七学位论文第二章苦养麸皮总黄酮测定方法 表2 2 和2 3 数据可知，室温条件下的检测结果和4 0 c 温度条件下检测的结果 没有显著性差异，所以a l c b 显色反应在室温下进行即可。反应进行4 h 后的测定 结果最高，且反应络合物在之后的6 h 内稳定，故确定a l c b 显色反应需4 h 。即舢c 1 3 显色反应条件为室温下反应4 h 后，在4 1 0 r i m 波长下测定吸光度1 0 m n 。 2 3 3 线性考察结果 表2 4 不同浓度芦丁- - a l 络合物的吸光度 t a b l e2 4a b s o r b a n c eo f t h ec o m p i e xo f a l 3 + a n dr u t i no f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s c o n c e m t r a t i o no ft u r i n ( m s m l ) 图2 3 苦荞麸皮总黄酮含量测定工作曲线 f i g 2 3t h e s t a n d a r dc o r v ef o rd e t e r m i n a t i o no f t o t a lf l a v o n o i d so f t h et a r t a r yb u c k w h e a tb r a n 对图2 3 中的工作曲线进行线性拟合，得标准方程为y - 2 0 7 4 3 x + 0 0 0 3 6 ； r 2 - = 0 9 9 9 0 3 。表明该总黄酮含量测定方法在o 0 1 5 m g m l , - 4 ) 0 3 9 m g m l 的浓度范围 内，线性关系良好。 2 3 4 提取溶