（动物学专业论文）car及rack1在大鼠子宫中的表达与调节之研究.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注 如没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：童p 漳群导师签字 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂蕉有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权兰蕉一可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文 在解密后适用本授权书) 学位论文作者躲却样 签字日期：2 0 0l f 年6 月孕日 翮签字她膨 签字目期：2 。莎年莎月夸日 山东师范大学硕士论文 摘要 本研究分2 部分。第一部分运用r t p c r 技术，从妊娠第9 天的大鼠子宫中扩增出长为 4 2 3 b p 的钙离子敏感受体c d n a 片段。p c r 产物经凝胶回收纯化后，克隆在p g e m t 载体的t 位点。测序结果和序列分析表明：成功克隆了钙离子敏感受体基因c d n a 序列，为进一步 研究钙离子敏感受体在大鼠子宫中的表达与调节奠定了基础。 第二部分以大鼠为实验动物，建立了大鼠早期妊娠、假孕、延迟着床和人工诱导蜕 膜化4 个动物模型；收集了各种模型的子宫材料，利用免疫组织化学的方法进一步研究 了钙离子敏感受体( c a l c i u m s e n s i n gr e c e p t o r ，c a r ) 、有活性的激酶c 受体( r e p e c t o r f o ra c t i v a t e dck i n a s e ，r a c k l ) 与胚胎着床及蜕膜化的关系。结果发现：c a r 蛋白葙融 早期妊娠第1 天的腔上皮细胞中呈弱表达；到第2 5 天，在腔上皮细胞中呈中等强度 表达；到第6 天胚胎着床后，着床位点处的上皮下基质中c a r 蛋白的水平瞬时显著上升。 而在非着床位点及假孕第6 天子宫的基质细胞中未见c a r 表达改变。在早期妊娠第7 4 8 天，c a r 在整个蜕膜组织中强烈表达；妊娠第9 天，c a r 的强烈表达扩展到子宫内膜的 次级蜕膜区，并且c a r 在胚胎中强烈表达：在人工蜕膜化模型中，c a r 蛋白随着蜕膜化 的进程其表达强度逐渐增加，而在对照子宫的基质中未见c a r 表达；r a c k l 在妊娠第6 9 天的子宫蜕膜上较强表达：假孕第6 9 天和延迟着床的大鼠子宫腔上皮下基质中无明 显的免疫信号，而延迟着床激活胚胎周围的腔上皮下基质中有强的免疫信号。蜕膜化子 宫中整个蜕膜区呈强的免疫染色信号。这些结果强烈表明：c a r 和r a c k l 参与了胚胎植 入及蜕膜化过程。提示将来可研究c a r 、r a c k l 受体阻断剂干扰胚胎的着床，以达到避 孕的目的。 关键词：克隆；钙离子敏感受体；有活性的激酶c 受体；胚胎植入；蜕膜 分类号：q 4 9 2 山东师范大学硕士论文 t h es t u d i e so ne x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no fc a ra n dr a c k li nr a tu t e r u s a b s 仃a c t t h ep r e s e n tr e s e a r c hi n c l u d e dt w op a r t s p a r to n e , 4 2 3 b pc a l c i u m - s e n s i n gr e c e p t o r ( c a r ) g e n ee d n aw a sa m p l i f i e db yr t - p c rt e c h n i q u ef r o mt h en i n t h - d a yp r e g n a n tr a tu t e r u sa n dw a s c l o n e d t o t s i t e o f p g e m - t v e c t o r a t ! 【e r t h e p c r p r o d u c t i o n w a s r e c o v e r e d a n d p u r i f i e d f r o m t h e g e l t h e s e q u e n c i n gr e s u l t sa n da n a l y s i ss h o w e d t h a tc a r g e n ee d n as e q u e n c ew a ss u c c e s s f u l l yc l o n e d , w h i c hl a i das o l i df o u n d a t i o nf o rf u r t h e rr e s e a r c ho ne x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no f c a ri nr a tu t e r u s 穗 p a r tt w o ，f o u ra n i m a lm o d e l si nr a t s ：p r e g n a n c y , p s e u d o p r e g n a n c y , d e l a y e di m p l a n t a t i o na n d a r t i f i c i a ld e c i d u a l i z a t i o nw e r es e tu p ；t h eu t e r u so f f o u ra n i m a lm o d e l sw e r ec o l l e c t e dt of l l r f f l e rs t u d y t h er e l a t i o n s h i p sa m o n gc a r r a c k l ( r e p e c t o rf o ra c t i v a t e dck i n a s e ) a n de m b r y oi m p l a n t a t i o n a n dd e c i d u a l i z a f i o nb yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t h er e s u l t ss h o w e dt h a to n l yb a s a ll e v e lo fc a r 西洲nw a sd e t e c t e di nt h el u m i n a le p i t h e l i u mo nd a y1o f 糊e y ；c a r w a sm o d e r a t e l yl o c a l i z e d i nt h el u m i n a le p i t h e f i u mf r o md a y s2t o5o fp r e g n a n c y ；c a rp r o t e i ni sc l e a r l yd e t e c t e di nt h e p r i m a r yd e c i d u ao nd a y6o f p r e g n a n c y ；as i m i l a re x p l x 嫱o np a t t e r nw a sa l s oi n d u c e di nt h eu t e r u s a f t e rt h ed e l a y e di m p l a n t a t i o nc o n d i t i o nw a st e r m i n a t e db ye s t r o g e nt r e a t m e n ta n dt h ee m b r y o i m p l a i a t e d , w h i l eo n l yab a s a ll e v e le x p r e s s i o nw a so b s e r v e du n d e rt h ed e l a y e di m p l a n t a t i o nc o n d i t i o n o r o n d a y 6 0 f p s e u d o p r e g n a n c y f u r t h e r m o r e ，c a r p r o t e i n w a s i n d u c e d i n t h e d e c i d u a u n d e r a r t i f i c i a l d e c i d u a l i z a t i o n ；r a c k lp r o t e i nw a ss t r o n g l yd e t e c t e di nt h ed e c i d u ao nd a y s6t o9o f p r e g n a n c y ；, a s i m i l a re x p r e s s i o np a t t e r nw a sa l s oi n d u c e di ns u b - l u m i n a le p i t h e f i u mg i t o m aw h e nt h ed e l a y e d i m p l a n t a t i o nc o n d i t i o nw a st e r m i n a t e d , w h i l et h e r ei sn od i s t i n c ts i g n a li ns u b l u m i n a le p i t h e l i u m s t r e m au n d e rt h ed e l a y e di m p l a n t a t i o nc o n d i t i o no ro nd a y s6t o9o f p r e g n a n c y ；r a c k lp r o t e i nw a s s t r o n g l yi n d u c e di nt h ed e c i d u au n d e ra r t i f i c i a ld e c i d u a l i z a t i o n o u rd a t as u g g e s t e ds t r o n g l yt h a tc a ra n dr a c k lm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ed u r i n ge m b r y o i m p l a n t a t i o na n dd c c i d u a l i z a t i o ni nr a t t h er e s u l t sh n p l i e dt h a t , i nt h e 矗l t 山眩w ec a nc o n t r i v et h e r e c e p t o ra n t a g o n i s to f c a r , r a c k lt od i s t u r bt h ee m b r y oi m p l a n t a t i o nf o rt h ec o n c e p t i o nc o n t r 0 1 k e y w o r d s ：c l o n e ；c a r ；r a c k l ；i m p l a n t a t i o n ；d e c i d u a l i z a f i o n c a t e g o r yn u m b e r ：q 4 9 2 2 山东师范太学硕士论文 第二篇文献综述 第一章哺乳动物生殖概况 1 哺乳动物子宫内膜的基本结构及周期性变化 1 1 子宫内膜的基本结构 哺乳动物子宫由左右两条牟勒氏管( 米氏管) 后端愈合在一起。在原始的情况下， 愈合仅限于阴道，即形成单阴道，其后，愈合的范围由后向前逐渐扩展，因而子宫也由 双子宫经过一些过渡逐渐合并为单子宫。子宫壁很厚，由内向外分为内膜、肌层和外膜。 子宫内膜分两层：近内膜表面的4 5 部分为功能层，月经周期的变化主要在此层进行； 内膜深层的l 5 部分为基底层，月经周期中内膜功能层脱落后，由此层再生。子宫内膜 表层由单层柱状上皮组成。少数上皮细胞具有纤毛，多数是无纤毛的分泌细胞。上皮向 固有膜陷入，形成单管腺，称子宫腺。固有层内有增生能力很强的结缔组织，细胞成分 多，纤维和基质较少，血管丰富，小动脉呈螺旋形，称螺旋动脉。 1 2 子宫内膜周期性变化 不同种类动物子宫的结构存在着一定的差异，但子宫内膜的周期性变化及细胞间的 相互关系和作用是相同的。哺乳动物( 包括人类) 的子宫内膜是由不同细胞组成的“特 化”组织，在卵巢雌激素和孕酮调控下发生周期性变化。人类( 包括非人灵长类) 月经 周期可根据子宫内膜功能层中腺体、螺旋动脉和基质细胞的变化分为月经期、增生期和 分泌期。啮齿动物的发情周期分为发情问期、发情前期、发情期、发情中期和发情后期。 1 3 子宫内膜的蜕膜化过程 在分泌期的晚期，围绕螺旋动脉的基质细胞开始变大，这一变化和基质细胞分裂一 起构成了最早期的蜕膜前变化【2 1 。子宫内膜蜕膜样变化开始于胚胎着床以前，胚泡接触 部位的间质成纤维细胞增殖、分化为成熟的蜕膜细胞，并逐渐向周围扩展，最终遍及整 个子宫内膜层，这一变化称为蜕膜反应f 3 1 。蜕膜细胞的增殖与退化同时发生，二者共同 协调蜕膜细胞数量的动态平衡和滋养细胞的侵入。蜕膜细胞的增殖与退化不依赖于胚胎 山东师范大学硕士论文 本身的存在，而是受特定的程序控制。 蜕膜化过程伴随着子宫内膜腔上皮细胞、间质细胞、细胞外基质和血管结构的一系 列适应性改变。其诱导机制可能是蜕膜反应诱导因子作用于腔上皮细胞，后者又通过旁 分泌作用于上皮下间质细胞，诱发特定基因表达，促使间质细胞增生、分化，表现出蜕 膜细胞的形态和功能。l e j e u n e 等1 4 】发现，刮除小鼠子宫腔上皮细胞后，不能诱导蜕膜反 应，这说明腔上皮细胞在间质蜕膜化过程中起着传递信息的重要作用。较早形成的蜕膜 细胞可通过旁分泌机制进一步诱导其周围的成纤维细胞发生蜕膜化。蜕膜化过程中，子 宫内膜呈现以巨噬细胞和颗粒细胞为主的非特异性炎性反应，同时伴有多种细胞因子的 产生，如集落刺激因子i ( c s f i ) 【5 】、粒细胞单核细胞集落刺激因子( g m c s f ) 、白血 病抑制因子( l i f ) f 6 、白细胞介素1 ，6 ( i l 1 ，6 ) 和肿瘤坏死因子一( t n f q ) l7 】等，表 明这些细胞因子可能参与诱导子宫内膜的蜕膜化。前列腺素和血小板激活因子( p a f ) 列子宫内膜蜕膜样变也十分重要【8 】。局部应用前列腺素或p a f 可以诱导蜕膜反应，而其 拮抗剂则阻止或延迟蜕膜反应发生。 胚胎植入过程及分子机理 銎1 胚胎植入的过程 胚胎在子宫中植入是一个十分复杂的过程。一个携带父方和母方遗传物质的“异源 物”一受精卵，在母体子宫中“着床”，不仅要克服对其“异源物”的免疫排斥反应， 而且涉及母体和胚胎在时间和空间上的同步发育和相互协同作用。在一个周期变化的大 多时间，子宫内膜对胚胎没有特异的“黏附性”，处于非接受状态，不会发生植入【9 j 。胚 胎植入窗口的形成，首先是在雌激素作用下对子宫内膜行使短暂的触发作用继而在孕 酮作用下诱发内膜在形态上，生理上和生化上发生一系列明显变化。所谓胚胎植入“窗 口”是指在胚胎植入前在子宫内膜所发生的一种暂时性的“生理接受状态”，换句话说， 是一种所建立的适应于胚胎植入的环境条件口”。从输卵管来的胚胎，在“这种极其有限时 f 司的生理接受状态”条件下，胚胎细胞与子宫内膜“识别”，相互作用，信息交流，并发 生着床过程 1 l , t 2 。“宫内植入窗口”开放时间，在人类一个月经周期中只有几天，大约发 生在卵巢黄体形成开始分泌孕酮后4 5 天，到9 一l o 天时，“窗口”自动“关闭”吲。 山东师范大学硕士论文 2 2 胚胎植入的分子机理 子宫内膜着床窗口的建立实际上是在卵巢两种甾体激素的协同作用f “，通过子宫 所表达的各种细胞因子【1 卯，生长因子【1 6 ，血管发生相关因子f 1 7 _ 1 9 1 ，蛋白酶类激活抑制 因子【2 。0 1 2 3 1 及细胞凋亡调控因子 2 4 , 2 5 1 和其他因子1 2 6 - 2 s 】，在生殖道中形成了一种特殊的微 环境 2 9 , 3 0 1 。这种微环境可能还受生殖道中发育中的胚胎和伴同的卵丘细胞分泌因子的调 控，形成了胚胎植入微环境的信息网络 3 1 - 3 5 】。与此同时，受精卵从输卵管向子宫运动过 程中，要发生一系列有序的分化，完成植入前的分裂。上述网络分子通过自分泌、旁分泌 机制调节待植入的胚胎与子宫内膜上皮的“对话”，信息交流、分子间的识别、细胞与细 胞，细胞与外基质的相互作用。因此，有人假定，子宫内膜与胚胎“特异”调控基因的相 互作用内膜与胚胎相关植入基因网络的识别是子宫内膜一胚胎信息交流和植入“窗口” 形成的前提，是胚胎植入的分子基础。 生殖生物学家多年来一直致力于寻找子宫内膜表达的与调控胚胎植入“窗口”形成 或在植入过程中起重要作用的己知“特异”分子。发现了许多细胞因子和生长因子是“理 想”的候选者。如某些整合素，肝结合上皮生长因子和p i n o p o d e ，钙调素基因相关肽及 受体、g a l e e t i n 及f i b r i n e c t i n 32 1 ，c h e m o k i n e s 3 ”，蛋白水解酶类和它们的抑制因子等， 它们在胚胎着床“窗口期”的子宫内膜中表达都较强，可能在胚胎对子宫内膜黏附和穿入 过程中起重要作用，并建议列为“植入窗口”的标记分子。还有研究资料表明，子宫内膜产 生的白细胞抑制因子( l i f ) ，白介素6 和1 1 在胚胎植入过程中起重要作用。剔除l i f 基 因的小鼠不能着床。白介素1 1 可能对诱发子宫基质细胞内膜蜕膜化有重要作用u “。 c h e m o k i n e s 也属于细胞因子大家族成员，它可通过特异g 蛋白偶联受体介导白细胞游 走，通过免疫和内分泌系统调节子宫内膜分化，滋养层细胞生长和协同胚胎植入过程。它 是一类具有“吸引”白细胞功能的特殊分子。 在胚胎着床过程中，一个重要适应性变化就是在着床点局部建立暂时性母一胎血液 循环系统。鼠类和灵长类新血管的产生是通过血管新生过程实现的。剔除基因小鼠实验 发现，来自胎盘中的某些因子调控母体子宫血管发生。滋养层巨细胞所产生的某些血管 发生和促血管形成因子调节母体子宫血管产生【3 8 。美国s i l e r - - k h o d r 教授研究证明，由 胚胎滋养层细胞产生的小肽分子，i i 型g n r h ，有望发展成为一种特异的抗胚胎植入的 有效分子【3 9 。研究表明，在排卯后1 6 天，给予缓释i i 型g n r i - i ，可1 0 0 阻止妊娠，而对 山东师范大学硕士论文 血中促性腺激素，卵巢甾体激素没有影响，未发现有明显副作用。源于胎盘的i i 型g n r h 不同于丘脑下部产生的i 型g n r h ，前者在垂体中没有其特异受体，对垂体l h f s h 的 合成和分泌没有明显作用。实验证明，在子宫内膜，胚胎滋养层细胞，输卵管和精子上 都有i i 型g n r h 特异受体，卵巢也产生i i 型g n r k - i 受体。i i 型g n r h 在上述组织中的 亲和系数比丘脑下部产生的i 型g n r h 高百倍以上。因此，它除直接抑制滋养层细胞 c g 和孕酮分泌外，还可直接抑制黄体孕酮的分泌，抑制子宫内膜表达的某些旁分泌因 子和前列腺素的合成，从而直接影响子宫和胚胎功能。i i 型g n r h 避孕作用可能发生在 不同细胞水平上，如影响受精，抑制受精卵运行和子宫内膜的特异性变化，阻止胚胎着 床和胎盘形成等。 山东师范大学硕士论文 第二章c a r 和r a c k l 的研究进展 1 c a r 的研究进展 1 1c a r 的发现及生物学特性 c a 2 + 是生物体内一种最简单而多效的信使，除了大家熟知的细胞内第二信使功能 外，现已认为钙离子在细胞外还发挥第一信使的作用。从整体水平而言，生物体欲正常 运转，必须处于适当的钙环境稳态；从组织或细胞水平而言，几乎所有的细胞在执行正 常生理功能时都要求胞内胞外钙离子处于平衡稳定状态。近年来发现c a r 在调节机体钙 平衡中起着重要作用，同时它参与多种生理病理过程，最近发现它还与生殖有关。 早在c a r 分子被鉴定之前就发现甲状旁腺细胞中存在着c a 2 十受体1 4 0 】。s h o b a c k 等 4 2 1 研究发现，提高分离的甲状旁腺细胞周围的细胞# b c a 2 十的浓度可产生细胞内钙信号， 进一步研究发现这种钙信号是由于激活磷脂酰肌醇磷脂酶c ，导致肌醇三磷酸、甘油二 酯和细胞内钙离子的增加引起的 4 3 删，这是第一个证明在甲状旁腺细胞中存在着c a ” 受体的报道。数年后，在非洲爪蟾卵母细胞中用牛甲状旁腺p o l y ( a ) + r n a 进行表达克隆， 得到5 3k b 长的克隆片段，称之为b o p c a r ，而且功能研究证实这一克隆片段具有介导 g d 3 刺激的、c 矿激活的c 厂流的作用，这是首篇有关c a r 克隆的报道【4 5 4 6 1 。自此以后 在多种组织中，包括人甲状旁腺 4 7 】，大鼠p ”，人及兔的肾脏，大鼠c 细胞唧5 2 1 , 大鼠脑纹状体 5 3 中相继克隆出高度同源的全长c a r ( 与b o p c 姐的氨基酸同源性大于 9 0 ) 。除哺乳动物外，在鸡的甲状旁腺、两栖类( 火蜥蜴) i s 5 ，硬骨鱼和软骨鱼中 也发现存在与人c a r 同源性很高的类似物。鸡及两栖类的c a r 与哺乳动物c a r 的同源性 达8 4 ，说明c a r 基因是一个高度保守的基因。c a r 的发现使人们认识到钙离子实际上 起到细胞外第一信使的作用。 c a r 与代谢型的谷氨酸受体、2 氨基丁酸b 型受体( ( g a b a ) b 受体) 、信息素受体 及几种孤j l g 蛋白偶联的受体一起，属于c 型g 一蛋白偶联受体( g p c r s ) 1 5 6 , 5 7 1 , 由1 0 8 5 个氨基酸残基构成，对细胞外c a 2 + 、新霉素、g d ”及其它多价离子敏感。c a r 由3 个独立 的区域构成。1 大的细胞外结构域( e c d ) ：大约含6 0 0 个氨基酸残基，又分为膜周类 细胞外结构域、富半胱氨酸细胞外结构域两部分 5 8 l ；2 中问核心区：大约由2 5 0 个氨基 山东师范大学硕士论文 酸残基构成7 个g p c r 超家族典型的跨膜结构域( t m d s ) ；3 长的细胞内结构域，大约由 2 0 0 个氨基酸残基构成三个细胞内环( i c l s ) 和c o o h 尾。c a r 直接受p k c 磷酸化的调节 ”9 j ，每个单体含有5 个p k c 磷酸化位点，此外还含有2 个p k a 作用位点，其生理学意义还 不清楚【6 0 6 ”。c a r 位于细胞膜的穴样内陷，并结合于脚手架蛋i 刍f i l a m i n ，由此c a r 通过 m a p k 介导信号转导f 62 。”j 。另一个有意义的结构是e c d 富半胱氨酸细胞外结构域，起着 从捕蝇器结构向7 个跨膜螺旋传递信号的作用。e c d 中1 1 6 位丙氨酸至1 3 6 位脯氨酸区域 在维持该受体的非激活构中起作用删，c a r 配基结合位点也位于e c d 6 5 j 。此外，e c d 中 还包括多个n 一糖基化位点【6 。能够激活c a r 的配基包括：1 钙、镁、钆等多价阳离子； 2 抗生素类，如新霉素和托普霉素；3 聚胺，如精胺、亚精胺及腐胺；4 三价和二价 金属离子，女l j l a h 、g d ”、b a 2 十、c d 2 + 、c o ”、f e “、n i 2 + 及p b ”；5 变构激活物：l 氨基 酸及苯基烷基氨类来源的c a l c i m i m e t i c s i 6 ”。c a l c i m i m e f i c s 增m c a 嬲寸细胞外钙离子的敏感 性，作用于跨膜结构域。c j + 在0 5 1 0 m m 范围内对c 水起作用。c a = + 结合于c a r 是一个 高度协作的复杂过程【6 8 】，这一过程得以使c a r 作为一个敏感的c a 2 + 浓度增减探测器0 艮容 易地辨别细胞9 h , 的c a ”波动，肩动相应的激素和离子转运反应，从而维持机体的钙环 境稳态。 1 2c a r 的功能 1 2 1 在甲状旁腺和。肾脏中的作用 对c a r 在l 肾脏和甲状旁腺中作用的认识来自于遗传突变研究。实验表明，c a r f l , j 失 活突变将导致家族性低钙尿性高血钙( f h h ) 和新生儿严重甲状旁腺功能亢进 ( n s h p t ) ”j 。f h h 是一种常染色体显性遗传病，杂合c a r 缺陷表现为血钙过多、尿钙过 少、p t h 水平异常。f h h 纯和病人表现出对钙离子抑制的p t h 分泌的抗性，在肾脏中， 由于缺少c a r ，肾小管列钙、镁的重吸收增加。2 3f h h 病人自g c a r 发生突变。c a r 定点 突变小鼠的临床表现类似于n s h p t 和f h h 病人。纯合c a r 缺陷小鼠的症状类似于 n s h p t ，严重血钙过多，围产期死亡率增加；杂合c a r 缺陷小鼠表现为轻微血钙过多、 尿钙过少，类似于f h h 。c a r 激活突变对甲状旁腺功能的作用恰好相反，导致甲状旁腺 功能减退i ”】。c a r 在甲状旁腺和肾脏中的重要性由此可见。在肾脏中，c a r 位于近端和 远端弯曲小管管腔及h e n l e 环粗升段的基侧膜。c a r 的功能为调节粗升段的钙离子排泄及 后叶加压素介导的远曲小管水流入。在粗升段，c a r 抑制管腔钾离子通道，n a c i 的重吸 山东师范大学硕士论文 收降低? 建立管腔钙离子的正向梯度，抑制钙离子的重吸收。钙离子受体拮抗齐l c a l c i l y t i c s 可以用来治疗高尿钙紊乱病口”。c 撮在近曲小管中的作用研究的还不清楚，现在推测它 可能调节1 一d 羟化酶活性及磷转运。c a r 在甲状旁腺中定位于主细胞。细胞外钙离子的降 低刺激主细胞p t h 的分泌和基因转录，导致甲状旁腺增生。c a r 是甲状旁腺功能调节的 主要靶分子。尽管并未发现c a r 突变或c a r 多态性在初级甲状旁腺功能亢进的发病中起 重要作用0 7 “，但次级甲状旁腺功能亢进患者 c a r 表达确实降低m7 ”。 1 2 2c a r 和c a 2 + 震荡 大多数情况下，细胞表面受体长时间暴露于配体时，细胞受到过度刺激，受体会变 得失去敏感性。然而，c a r 却能够缓慢接受刺激( 女n c a 2 + 、m g ”和氨基酸) 荠且失敏很 慢75 1 。进一步实验发现，细胞采取c a 2 + 信号震荡的方式来防止受到细胞内长期升高的c a 2 + 浓度的有害作用。实验观察到，当甲状旁腺细胞接受c a r 激活物刺激时，细胞内发生强 烈的c a 2 + 震荡。同样，在c a r 转染的人胚胎肾脏2 9 3 细胞【7 6 7 8 1 、绵羊甲状腺滤泡旁细胞【7 9 】 及胰腺腺泡细胞中也观察到显著的c a ”震荡。 i2 3c a r 在胎儿及胎盘中的作用 b r a d b u r y 等利用n o r t h e r n b l o t 手段从人的终期胎盘中检测到一种6 2k b 大小的c a r ， 有别于甲状旁腺细胞中5 6k b 转录本。运用原位杂交和免疫组化方法检测到c a r 在人胎 盘的绒毛和绒毛外区域表达。在绒毛区，c a r 在合体细胞滋养层表达量高，同列在细胞 滋养层也有低水平表达。进一步研究显示，在合体细胞滋养层中，c a r 定位于刷状缘， 说明它在控制母体c a 2 + 浓度跨上皮转运中起作用；在胎盘的绒毛外区域，c a r 定位于锚 定绒毛及过渡细胞滋养层的滋养层柱细胞中，这些细胞与母体血管紧密接触。由于绒毛 外滋养层在母体侵入及维持胎盘的免疫豁免方面起重要作用，推测c a r 在局部控制胎盘 的钙离子跨膜转运，调节胎盘发育中起作用。利用c a r 基因敲除小鼠研究c a r 在调节 胎儿钙离子代谢中的作用。发现胎儿血液中的正常钙离子水平比母体中要高，c a r 阴性 的胎儿钙离子水平进一步升高。进一步研究发现，c a r 阴性的胎儿骨骼重吸收增加，胎 盘的钙离子转运降低，肾脏钙离子排泄增加。这些研究结果表明，正常情况下，c a r 通 过抑制p t h 的分泌来调节血钙水平，c a r 敲除导致胎儿甲状腺功能亢进，衄钙升高。 c a r 广泛存在于其它组织和细胞中，功能有待于研究。迄今为l e ，在这些组织中的 山东师范大学硕士论文 特异性表达和功能之伺的因果关系还未确定。非哺乳动物中的功能研究可使我们得到某 些借鉴 8 0 - 8 2 】。c a r 在哺乳动物生殖中的作用报道很少，在胚胎植入中的作用还未见报道。 2 r a c k l 的研究进展 2 1r a c k l 的发现和生物学特性 r a c k l 是一个正在不断被发现的有活性的激酶c 受体家族的一个新成员，最初，它 是从小鸡的肝脏和人的p 一淋巴母细胞中克隆出来的。以后相继从果蝇 、猪的肝脏 和大鼠、小鼠等多种动物的组织中克隆出来，是w d 4 0 蛋自家族中的一个成员8 5 8 6 3 分子量为3 6 k d a 的g 蛋白b 亚单位的异三聚体，在结构上高度保守。1 9 9 1 年，r a c k l 首次被鉴定为一种有活性的p k c 受体，是一种重要的细胞内信号分子，充当一种穿梭 蛋白，协同b 1 1p k c 正确的功能定位1 8 7 1 “j 。 2 2r a c k l 的功能： 2 2 1r a c k l 在p k c 中的相互作用 众所周知，p k c 是细胞内重要的信号蛋白，它调节的细胞效应极为广泛，参与膜离 要t 子转运功能的调节、膜受体功能的调节、生物活性物质的合成与分泌、还参与糖代测和 转录过程的调节。在细胞培养和体外实验的条件下都已证明p k c 存在于细胞膜和细胞质 中，胞质中的呈钝化状态，在特定条件下，p k c 从胞质转移到细胞膜上而呈“待激状态”， 这一过程称为p k c 的转位【8 9 】，而r a c k l 参与了p k c 的转位过程。它能够与p k c 结合、帮 定p k c 多j 细胞骨架上并使它与底物结合，从而激活p k c 9 0 1 , 这是r a c k l 的重要生理功能 之一。它的命名也是m o c h l yr o s e n 研究小组用来描述r a c k l 结合p k c 的能力时采用的， 若二f 实验证明了r a c k i 的这一功能。例如，在刺激衰老大鼠的大脑皮层引起的反应中发 现了p k c 活性的缺乏，开始，几个实验小组认为是由于脂质膜的成分变化引起了p k c 活 性的缺乏，进一步实验证明了p k c 活性的缺乏是由于r a c k l 的缺乏导致p k c 转位受到抑 制的原因，因为衰老大鼠d ? r a c k l 的含量只是正常成年鼠的5 0 【9 0 ；在大鼠急性局部缺 血实验中发现，r a c k lm r n a 和蛋白的表达在大鼠肾脏的再生组织中大大提高了，因为 r a c k l 表达上调提高了p k c 的活性，加快了再生组织的进程。r a c k l 除了与p k c 相互作 用外，还与酪氨酸蛋白激酶相互作用，是s r c 酪氨酸蛋白激酶的一种重要底物，向下传 山东师范大学硕士论文 递生长因子受体酪氨酸蛋白激酶的信号，参与s r c 功能的调节和细胞生长的调节【9 2 1 。 2 2 2r a c k l 与胞内受体的作用 r a c k l 是细胞内多种受体的相关蛋白，这些受体的活性需要由r a c k l 来激活。实验证 明，r a c k l 是胰岛素样生长因子一1 ( t h e i n s u l i nr e c e p t o r a n d i n s u l i n 1 i k eg r o w t h f a c t o r 】， i g f 1 ) 和胰岛素样生长因子受体( r h ei n s u l i nr e c e p t o ra n di n s u l i n 1 i k eg r o w t hf a c t o r1 r e c e p t o r ，i g f 1 r ) 的相关蛋白，一种新奇的i g f 一1 f l i g f 一1 r 的信号分子，能够与i g f 一1 和 i g f 一1 r 相互作用，促进细胞的生长、增殖、发育和分化【9 孔，同时在某些卵巢癌细胞中1 g f l 和i g f 一1 r 诱导的无贴壁依赖性生长也是i 由r a c k l 介导的【州。r a c k l 是一种内在的s r c 激酶 的抑制剂，通过抑制致癌的s r c 酪氨酸激酶，防止它在细胞周期的g ( 1 ) 关键期失调导致肿 瘤基因的过分表达一”。此外，r a c k l 作为雄激素受体( t h ea n d r o g e nr e c e p t o r ，a r ) 、e a 蛋 白的相关蛋白，问接地促进细胞增殖、抑制肿瘤发生、诱导细胞凋亡、调节基因转录【9 。 2 2 3r a c k l 在神经系统中的作用 r a c k l 是参与中枢神经系统各种信号级联调节的多功能结构蛋白，a s h i g u eam 等 对胚胎期和成年大鼠大脑中蛋白的表达进行了检测，发现：在大鼠神经系统的发育中 r a c k l 担任了重要角色，为成年大鼠脑中k l 蛋白具有多功能性提供了依据9 训。有大量 证据证明，r a c k l 在调节几个主要神经通路中发挥作用 9 ”。除此之外，最近的资料表明， r a c k l 还可以通过影响体内细胞的信号通路过程，间接地消弱酒精对人体的伤害 9 9 】。 除此之外，r a c k l 还能调节c a 2 + 的释放 i o o 、促进t 细胞凋亡1 、在血管新生过程中 呈上调表达、在肿瘤细胞中表达 1 0 c i 。因此，r a c k l n 能在血管形成和肿瘤发生过程中发 挥重要作用。胚胎着床与肿瘤发生、血管新生及浸润性等诸多过程具有相似性，然而， r a c k l 在哺乳动物生殖系统中的表达情况仅限于卵巢，在子宫中的表达未见报道。 山东师范大学硕士论文 2 参考文献 h i l lj a m a t e r n a l - e m b r y o n i cc r o s s - t a l k a n nn y a c a ds c i ，2 0 0 1 ，9 4 3 ：1 7 - 2 5 b u l l e t t ic ，b a l a s s ia ，j a s o n n iv m ，m a r t i n e l l igt a b a n e l l is ，f l a r n i g n ic b a s e m e n t m e m b r a n ec o m p o n e n t si nn o r m a lh y p e r p l a s t i ca n dn e o p l a s t i ce n d o m e t r i u m c a n c e r , 1 9 8 8 ，6 2 ：1 4 2 一1 4 9 m a c l e r m a na h ，w y n nr v l m e n s a - u a l c y c l eo ft h eb a b o o n 0 b s t e tg y n e c o l ， 1 9 7 1 ，2 7 ：3 5 0 3 5 8 e n d e r sa c ，w e l s ha o ，s c h l a f k es i m p l a n t a t i o ni nt h er h e s u sm o n k e y ：e n d o m e t r i a l r e s p o n s e s a mj a n a l ，1 9 8 5 ，1 7 3 ：i 4 7 - 1 6 9 n a r a h a r ah ，m i n es ，k a w a n oyj o h n s t o nj m ，m i y a k a w ai e f f e c t so fc o l o n y - s t i m u l a t i n gf a c t o r s o nt h es e c r e t i o no fp l a t e l e t a c t i v a t i n gf a c t o ra c e t y l h y d r o l a s eb y h u m a nd e c i d u a lm a c r o p h a g e s a mjo b s t e tg y n e c o l ，2 0 0 3 ，1 8 8 ：1 5 7 1 6 1 p i c c i n n im rt - c e l lc y t o k i n e si np r e g n a n c ya mjr e p r o di m m u n o l ，2 0 0 2 ，4 7 ：2 8 9 2 9 4 c h o u d h u r ir ，w o o dg wp r o d u c t i o no fi n t e r l e u k i n 一1 ，i n t e r l e u k i n 一6 ，a n dt u m o rn e c r o s i s f a c t o ra l p h ai nt h eu t e r u so f p s e u d o p r e g n a n tm i c eb i o lr e p r o d ，1 9 9 3 ，4 9 ：5 9 6 6 0 3 n o r w i t ze r w i l s o nts e c r e t o r yc o m p o n e n t ：ap o t e n t i a lr e g u l a t o ro fe n d o m e t r i a l - d e c i d u a lp r o s t a g l a n d i np r o d u c t i o ni ne a r l yh u m a np r e g n a n c y a mjo b s t e tg y n e c o l ， 2 0 0 0 ，1 8 3 ：1 0 8 1 1 7 p a r i ab c ，s o n gh ，d e ys k i m p l a n t a t i o n ：m o l e c u l a rb a s i so fe m b r y o - u t e r i n ed i a l o g u e i n tj d e vb i o l ，2 0 0 1 ，4 5 ：5 9 7 - 6 0 5 o k u l i c zw c ，a c ec i t e m p o r a lr e g u l a t i o no fg e n e e x p r e s s i o nd u r i n gt h ee x p e c t e d w i n d o wo fr e c e p t i v i t yi nt h er h e s u s m o n k e ye n d o m e t r i u m b i o l r e p r o d ，2 0 0 3 ， 6 ( 3 ) ：3 3 2 3 3 8 f e n gq ，l i uk ，l i uy x ，e ta 1 ：p l a s m i n o g e na c t i v a t o r sa n di n h i b i t o r sa r et r a n s c r i b e d d u r i n ge a r l y m a c a q u e i m p l a n t a t i o np l a c e n t a ，2 0 0 1 ，2 2 ：1 8 6 1 9 9 f e n gq ，l i uy x ，l i uk ，e ta 1 e x p r e s s i o no fu r o k i n a s ep l a s m i n o g e na c t i v i t o r ，i n h i b i t o r a n du r o k i n a s er e c e p t o ri np r e g n a n tr h e s u sm o n k e yu t e r u sd u r i n ge a r l yp l a c e n t a t i o n p l a c e n t a ，2 0 0 0 ，2 1 ( 2 ) ：18 4 1 9 3 m a r t i nj ，d o m i n g g u e zf ，a v i l as h u m a ne n d o m e t r i a ir e c e p t i v i t y ：g e n er e g u i a t i o nj r e p r o di m m u n o l ，2 0 0 2 ，5 5 ：1 3 1 - 1 3 9 s i m o nc ，d o m i n g g u e zf ，v a l b u e n ad