（分析化学专业论文）毛细管区带电泳测定离解常数的方法研究.pdfVIP

摘要 摘要 本文主要进行了毛细管区带电泳测定离解常数的方法研究，共分4 章，其主 要内容如下： 第一章：绪论。简要介绍了测定离解常数的目的和意义。将测定离解常数的 方法进行了概括和综述。测定离解常数的传统方法主要有电位滴定法，分光光度 法，色谱法等。本章着重介绍了毛细管区带电泳法，并对于一些关键步骤，例如 如何检测电渗流及如何进一步提高分析速度等进行了详细论述。 第二章：大多数利用毛细管区带电泳法测定物质的离解常数时，需要加入有 机物质作为中性标记物来标记电渗流，尽管有机物质的用量很少，但是也会给环 境带来污染，并且中性标记物也可能与样品中的某些物质发生反应，对于复杂的 分析物质，也很难找到合适的有机试剂作为中性标记物。为此，本部分针对这个 问题进行了探讨，研究在不加中性标记物的情况下，利用电流突跃计算电泳淌度， 从而测定三种硝基酚的离解常数。所测得的三种硝基酚的离解常数分别为7 1 0 ， 7 2 2 ，8 3 6 ，与文献值7 1 5 ，7 2 2 ，8 3 6 相接近，证明了电流突跃法标记电渗流 测定离解常数是可以实现的，并且可以达到减少环境污染，简化操作步骤的目的。 第三章：本部分研究了压力对毛细管区带电泳法测定离解常数的影响。分别 研究了水体系和不同配比的甲醇一水体系中，压力对测定喹诺酮药物离解常数的 影响，并讨论压力在两种体系中的适用情况。通过控制实验中压力的大小，选择 合适的压力以达到缩短分析时间而又不影响测定的目的。施加压力后所测定的四 种喹诺酮的p k a 值与文献中没有施加压力所测得的数据相比，差距不大于o 3 l 。 不仅缩短了分析时间，提高了工作效率，而且不影响电泳淌度的测定，可以同时 适用水体系和甲醇一水体系。本部分研究了压力对电泳行为的影响，压力对有机 溶剂的影响及各种实验条件对分析结果的影响。通过控制各种实验条件达到快速 准确测定喹诺酮药物离解常数的目的。 第四章：本部分研究了在喹诺酉同药物的分离分析过程中，离解常数( p 蜀) 的作用。利用上一章中所测定几种药物的o k , 值，以p e a k m a s t e r 软件为手段，模 拟不同的实验条件，预测最佳分离的p h ，及其他分离条件。并进行实验进行验 证。p e a k m a s t e r 软件所模拟的最佳p h 为8 0 ，缓冲液浓度为2 5 m m o l l ，与实际 i 摘要 情况相符。实验证明p e a k m a s t e r 软件可以用于最佳反应条件的预测，作为具体 实验的参考。同时也证明了压力辅助毛细管电泳法所测定的离解常数的可靠性。 关键词：离解常数毛细管区带电泳电流突跃喹诺酮压力辅助毛细管电泳 i i a b s t r a c t a b s t r a c t s e v e r a lm e t h o d so fd e t e r m i n a t i o nd i s s o c i a t i o nc o n s t a n ti n c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sz o n e ( c z e ) w e r es t u d i e di nt h i sp a p e rt h e d i s s e r t a t i o nh a s4c h a p t e r s a n dt h em a i nc o n t e n t sa r ea sf o l l o w i n g ： i n c h a p t e r1 ：t h i sc h a p t e ri n t r o d u c e d t h em e t h o d sf o rp k am e a s u r e m e n t t h e c o n v e n t i o n a lm e t h o d so f 隔d e t e r mi n a t i o ni n c l u d e d p o t e n t i o m e t r i ct i t r a t i o n ， s p e c t r o p h o t o m e t r i c ，c h r o m a t o g r a p h y , e t c c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i sw a sm o s t l y i n t r o d u c e di nt h i sc h a p t e r t h em a i ns t e p ss u c ha se l e c t r o o s m o s i sf l o wm e a s u r e m e n ta n d s h o r t e n i n ga n a l y s i st i m ew e r ed e t a i l e dd e s c r i b e d i nc h a p t e r2 ：o r g a n i cc o m p o u n d sh a v eb e e nu s e da se o fm a r k e ri nm a n ys t u d i e so f d e t e r m i n a t i o nd i s s o c i a t i o nc o n s t a n t s a l t h o u g ht h ea m o u n to fo r g a n i cc o m p o u n d si s l i t t l e ，i tc a nb r i n ge n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n ，a n dt h en e u t r a lm a r k e rm a yr e a c tw i t h s o m es u b s t a n c eo fs a m p l es o l u t i o n s m o r e o v e r , t h ea p p r o p r i a t en e u t r a lm a r k e ri sh a r d t oc h o o s ef o ra n a l y z i n gt h ec o m p l e xm a t t e r t h e r e f o r e ，t h i sc h a p t e rs t u d i e dh o wt o u t i l i z et h ea b r u p tc h a n g eo fc u r r e n tw h i c hi si g n o r e db yp e o p l et om e a s u r et h e d i s s o c i a t i o nc o n s t a n t s ( 陇) o fn i t r o p h e n o l sw i t h o u tu s i n gn e u t r a lm a r k e r t h e d e t e r m i n a t i o nv a l u e sw e r e7 1 0 ，7 2 2 ，8 3 6 ，a n dt h er e f e r e n c ed a t aw e r e7 1 5 ，7 2 2 ， 8 3 6 ，t h e r ew a sag o o da g r e e m e n tb e t w e e nd e t e r m i n e d ( p k a ) v a l u e sa n dr e f e r e n c ed a t a t h i sm e t h o dh a ss o m ea d v a n t a g e s ，s u c ha sn on e e da d d i n ge x t r ae q u i p m e n t sa n d r e a g e n t s ，r e p r o d u c i b i l i t yi n c r e a s e d ，e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o nr e d u c e d ，a n ds oo n i n c h a p t e r3 ：t h ee f f e c to fp r e s s u r eo nd e t e r m i n a t i o no f 隔w a ss t u d i e d a c o m p a r a t i v es t u d yo fd e t e r m i n a t i o np k v a l u e so fq u i n o l o n e sb yp r e s s u r e a s s i s t e d c a p i ll a r yi na q u e o u sa n di nd i f f e r e n tp r o p o r t i o nh y d r o - o r g a n i cm e d i aw a si n v e s t i g a t e d a n dt h es c o p eo fa p p l y i n g p r e s s u r ew a sa l s od i s c u s s e d t h ed i f f e r e n c eb e t w e e n d e t e r m i n e dp 岛v a l u e sw i t hr e f e r e n c ed a t aw a sn o te x c e e d i n g0 3 t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ep r e s s u r e a s s i s t e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si ss u i t a b l ef o r d e t e r m i n a t i o nt h ed i s s o c i a t i o nc o n s t a n t si nw a t e ra n di nm e t h a n o l - w a t e rm e d i a t h e a p p l i c a t i o no fp r e s s u r en o to n l yr e d u c e sm i g r a t i o nt i m e s ，b u ta l s oi m p r o v e st h e i i i a b s t r a c t r e p e a t a b i l i t yo fe f f e c t i v em o b i l i t ym e a s u r e m e n t s h o w e v e r , t h eo b s e r v e de f f e c t i v e m o b i l i t ys h i f tb yt h ea p p l i e dp r e s s u r ed i dn o ts i g n i f i c a n t l ya f f e c tt h ed e t e r m i n e dp k , v a l u e s i n c h a p t e r4 ：t h ee f f e c to f 瞄v a l u e so ns e g r e g a t i o na n a l y s i so fq u i n o l o n e sw a s i n v e s t i g a t e d t h ep e a k m a s t e rs o f t w a r ew a su s e da sa n a l y s i si n s t r u m e n tt os i m u l a t e d i f f e r e n te x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h ep r e d i c t e do p t i m a lp ha t8 0 ，a n dt h eb u f f e r c o n c e n t r m i o ni s2 5 m m o l l t h ee x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tt h ep r e d i c t e do p t i m a l c o n d i t i o n sf i t t e dw e l lw i t ht h ea c t u a ls i t u a t i o n t h ep r e d i c t e dr e s u l t sw i t hp e a k m a s t e r s o f t - w a r ec a nb eu s e da sr e f e r e n c e ，a n da c c o r d i n g l ys i m p l i f ye x p e r i m e n t a lp r o c e d u r e k e y w o r d s ：d i s s o c i a t i o nc o n s t a n t sc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i sa b r u p t c h a n g eo fc u r r e n tq u i n o l o n e s p r e s s u r e - a s s i s t e dc a p i l l a r y 河北大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名：瀣生动日期：叟5 1年月厶 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在一 年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密。 ( 请在以上相应方格内打“4 ”) 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为( 毛嘲缭厦带电泳旅必龋解嘻圾钓疙棚知 的学位论文，是我个人在导师( 孑鏖指导并与导师合作下取得的研究成果，研 究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资 助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的 各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人：翌焦豇 日期： 翌皇年月纽一日 作者签名：錾堡函 导师签名：殛兰三匡 日期：! ! 年上月日 日期：皇! 年月“一日 第1 章绪论 第1 章绪论 酸碱试剂的离解常数是表征其性质和强度的重要物理常数，在药物作用机理 和化学反应行为的解释以及分析方法设计方面有重要的参考作用，为此离解常数 的测定一直是分析工作者研究的课题。关于其测定的方法也在不断发展，其中毛 细管区带电泳法是八十年代后发展起来的一种新颖快速的测定离解常数的方法。 本文概括了测定离解常数的不同方法，重点介绍如何利用改进的毛细管区带 电泳法测定离解常数，并利用此种方法测定了一些物质的离解常数。 1 1 测定离解常数的目的和意义 随着科学技术的不断发展，新型试剂和药品的不断涌现，对其性质的分析提 出了更高的要求，离解常数是物质的基础数据，对于物质的分析分离具有一定的 指导意义。为此离解常数的测定虽然不是新课题，但一直是分析领域不可忽视的 研究内容。 知道了离解常数，就可以计算出在某一p h 条件下物质的离子化程度，这对 于理解化学现象如反应速率，生物活性，生物吸收等具有一定的帮助作用【l 】。另 外，药物有效成分的酸碱性不仅是药物的生产、制剂、分析及贮存中常要利用的 性质，与药物对皮肤、黏膜、肌肉、内脏的刺激等密切相关【2 】。为此离解常数也 是药物的重要理化参数之一，是影响药物在体内的吸收，代谢过程及药理作用的 重要因素【2 ，3 1 。 1 2 测定离解常数的方法 1 2 1 离解常数的测定原理 离解常数的测定方法有电位滴定法，分光光度法，色谱法，毛细管电泳法等， 虽然方法多样但这些方法的测定原理大体相同。 对于一元弱酸h a ，电离平衡可表示为： h a 营h + + a 一 其离解常数可表示为： 疋= 趔酱产 ( 1 1 ) ( 1 2 ) 河北大学理学硕七论文 其中，局是热力学酸离解常数，y 是活度系数。无论那种方法都是设法求出离 解的物质的浓度与没有离解的物质浓度之比。每种方法都各有其特点，以下将进 行介绍。 1 2 2 电位滴定法 离解常数的测定方法有很多种，其中电位滴定法是历史上测定离解常数的标 准方法，并且到目前为止，对于测定纯度高，含量大，水溶性好的物质仍然是广 泛使用的方法。 电位滴定法测定离解常数具有准确，快速，重现性好的特点。但是在测定过 程中需要对样品进行复杂的纯制，并且汁算公式比较复杂。由于经典的电位滴定 法需要测定许多对标准溶液体积及与其对应的电位值，然后用作图法找出化学计 量点，既麻烦，又费时，对于没有明显电位突跃的物质，就无法找出化学计量点。 近些年来，人们应用双点电位滴定法测定离解常数，这种方法不需要找出化学计 量点，就可以直接算出分析结果，对于没有明显电位突跃的物质也能得到满意的 结果。a v d e e f 和b o x 等人利用双点电位滴定法测定了两种药物的p k a 值，得 到了较好的结果【4 】。研究证明了双点电位滴定法不仅简便快速，而且易与各种电 化学分析方法相互结合、取长补短，尤其便于计算机技术的应用。 1 2 3 分光光度法 分光光度法也是比较传统的测定离解常数的方法。分光光度法测定离解常 数，要求所测定的物质必须具有与离子化基团相似的发色团，以便鉴别混合物中 的中性物质和离子物质。因此分光光度法具有一定的选择性。目前应用比较多的 是紫外分光光度法，它具有专属性强，灵敏度、准确度高，操作快速、安全，样 品用量少等特点f 5 】，因而受到分析者的青睐。 另外双波长分光光度法测定离解常数也得到发展。吕时群等人【6 】曾利用双波 长分光光度法测定指示剂类多元酸的离解常数，得到较好的结果。 1 2 4 色谱法 对于一些在紫外可见区域没有吸收的小分子物质，或分子态和离子态的最大 吸收波长十分接近的物质，可以利用色谱法测定其离解常数。 目前比较常见的色谱法有高效液相色谱法( h p l c ) ，薄层色谱p h 法和离 2 第l 章绪论 子色谱法等。h p l c 法的主要优势在于可以达到分离的目的，并且可测定水溶性 不好的物质的离解常数。但h p l c 法的不足之处在于准确度不如电位滴定法和分 光光度法。其次，h p l c 法不适合在水有机介质中测定物质的离解常数。再次， 流动相的p h 范围及固定相的化学稳定性也会限制离解常数的测定。所以在利 用h p l c 法测定物质的离解常数时，同定相及流动相的选择极为重要。张庆合 等人【7 】报道，利用氧化锆固定相反相高效液相色谱法测定1 3 种典型芳香胺和吡 啶衍生物的离解常数，得到的结果与文献值接近，表明此种方法具有准确，快捷 的特点，适合于测定碱性化合物的离解常数。 薄层色谱p h 法是由b i d l o m 首先提出的【8 1 ，随后研究人员将其应用于一元 酸碱药物离解常数的测定。贾沪宁等人 9 1 首次利用薄层色谱p h 法测定二元有机酸 的离解常数，得到较好的结果。薄层色谱p h 值法使用设备简单，样品用量较少； 但此法目前只有用于一元酸碱药物离解常数测定的报道，值得进一步研究应用。 此外离子色谱法也可用于测定物质的离解常数。其检测的基础是离子电导， 可用来测定溶液中的离子。朱岩等人【o 】利用此方法测定了p k a 亘 e 0 饯m 1 5 o 们o - 0 0 1 5 o 0 1 5 o 0 1 0 - o 0 1 5 24681 01 2 p h 2 681 0 1 2 p h 2 4 第3 章比较压力辅助毛细管电泳法测定水和水一有机介质巾喹喏酬离解常数 o 0 1 5 0 0 0 0 1 0 m a ) 5 o 0 1 0 o 0 1 5 o 咖 o o o 啪 o 0 1 0 o 删1 5 1 01 2 81 0 1 2 图3 41 0 1 手i 醇水体系巾压力为o 5 p s i 四种喹诺酮的非线性拟合曲线 l o q 3 醇一水体系运行电压2 0 k v ，温度2 5 1 2 ，检测波，长：2 8 0 n m ，进样压力为0 5 p s i ，进样时 n 5 s 。分析过程巾施加压力为0 5p s i 一 一 o o 一-仁皂e 侣 啪 啪 啪 o o o 河北大学理学硕士论文 o 0 1 5 o 0 1 0 ，、0 0 0 0 0 5 0 0 1 0 2468 2 468 p 最 一psp-5一e 第3 章比较压力辅助毛细管电泳法测定水和水一有机介质巾喹喏司可离解常数 o 0 0 0 1 5 o 0 1 0 - o o 0 5 - o o 1 0 0 们5 0 0 1 0 0 o 0 5 o 0 4 881 01 2 p h 图3 53 0 甲醇一水体系中压力为0 5 p s i 四种喹诺酮的非线性拟合曲线 l o 甲醇一水体系运行电压2 0 k v ，温度2 5 c ，检测波长2 8 0 n m ，进样压力为0 5 p s i ，进样时 间5 s 。分析过程中施加压力为0 5p s i 3 3 2 比较压力对迁移时间和电泳淌度的影响 本实验考察了不同的压力对迁移时间和电泳淌度的影响。在实验中，分别尝 试了在压力分别为0 p s i ，o 1p s i ，o 4p s i ，0 5p s i 条件下进行测定。图6 所示 是p h - - 7 3 时，沙拉沙星的迁移时间随压力的变化图。从图中可以看出随压力的不 2 7 一 一 o n ( 1 s 暑) 山 一 一 旬 河北大学理学硕十论文 i i 詈詈量葛薯皇置詈量詈置置皇量量| 量量詈皇鼍置曼篁量量置量量量曼詈! 暑詈詈鲁置_ _ | | 量_ _ 皇鼍皇置置 断增大，分析物的迁移时间逐渐缩短。但并不是压力越高越好，在某些p h 条件 下，压力增大，使样品峰与中性标记物峰不能有效地分离。并且从表l 的数据可 以看出，随压力的升高，会导致电泳淌度的r s d 增大。这主要是因为迁移时间的 降低所引起的。实验中考察了压力为0 5p s i 时，沙拉沙星的分离情况的重现性， 见图3 6 ，从图可以看出重现性比较好。所以在本实验中压力应选择0 5p s i 为宜。 1 舢 1 咖 硼 3 6 0 0 0 4 啪 舢 0 k ， 一乓之= 专 23458 t m i n 图3 6 压力为0 5p s i 时，s a 玎o x a c i l l 分离重现性研究 o 4 8 m i n u 伯，s 图3 7 压力对迁移时问和分离效率的影响 第3 章比较压力辅助毛细管电泳法测定水和水一有机介质r f l 喹喏酮离解常数 表3 1 达氟沙星( p h = 7 3 ) 的迁移时间和电泳淌度随压力的变化及电泳淌蜘r s d ( n - - 5 ) 1 0 和t m 分别是电渗流和达氟沙星的迁移时间 很明显，选择合适的压力不仅能缩短样品的迁移时间，特别是在较低的p h 条件下，每种样品的测定时间可控制在5 0 m i n 以内，而且能够提高电泳淌度测定 的重现性【6 2 】。实验中所测得四种喹诺酮的p 局值与文献值的比较见表2 。从表中 的数据可以看出在水，1 0 和3 0 的甲醇一水体系中，施加压力后所测定的四种 喹诺酮的p k a 值与文献中没有施加压力所测得的数据相比，差距不大于0 3 1 。因 此可以得出这样的结论，可以采用压力辅助毛细管电泳法测定喹诺酮的离解常 数，不但可以缩短整个分析时间，而且并不降低测定的准确性。 表3 2 水介质与甲醇一水介质中测定的喹诺酮p 心值与文献值的比( n - 3 ) 2 9 河北大学理学项十论文 3 3 3 比较甲醇含量对喹诺酮离解常数测定的影响 关于在非水介质中测定喹诺酮的p k 值，d o l o r e sb a r r 6 n 等人做过多方面的 研究【6 3 - “6 5 1 。分别考察了乙腈一水和甲醇一水对p k 的影响。因为喹诺酮在纯水 中的溶解性不是很好，更易溶于甲醇，所以本实验在甲醇一水介质中测定了分析 物的离解常数。本实验考察了有机溶剂( 甲醇) 对喹诺酮p k a 值的影响，通过 在水体系和甲醇二水体系中所测得喹诺酮的隔值( 见表3 - 2 ) 可以看出，在甲 醇一水介质中所测定的p k 。比纯水介质中要高，并且随着有机溶剂含量的增加， 眯。也随之增加。而眯。：却呈现相反的趋势，并且随有机溶剂含量的增加，隧。： 随之减小。p k 。和隧。：在甲醇一水溶液中的变化很难做出明确解释，可能要通 过质子平衡关系来理解这个现象。喹诺酮在甲醇水中的离解主要受静电作用和 溶剂的作用】。对于喹诺酮羧酸的离解，a pp k 。，当缓冲溶液中加入甲醇时， 溶液的介电常数会降低，也就是说此时静电作用起主要作用，抑制羧酸的离解， 所以p k 。增大6 3 】；而对于氨基的离解，即p k 。：，溶液介电常数的改变不影响离 解过程，溶剂作用占优势，所以当缓冲溶液中含有甲醇时p k 。减小。具体的原 理还有待于进一步研究。 3 4 结论 本实验表明，在测定喹诺酮的离解常数时，施以合适的压力可提高测定的速 度。尽管这并不是首次研究压力辅助毛细管电泳测定物质的离解常数，但是通过 考察不同介质中压力对p k a 值的影响，可以得出这样的结论：压力辅助毛细管电 泳法可用于水体系和甲醇一水体系中喹诺酮离解常数的测定，在压力的作用下， 缩短了迁移时间，提高了测定效率，而且选用合适的压力不影响电泳淌度的测定。 第4 章喹喏酮分离优化巾p k 值的作用 第4 章喹诺酮分离优化中p 甄值的作用 4 1 引言 离解常数的测定对于分离检测有一定的指导意义。本章将介绍离解常数的实 际应用。 喹诺酮类药物在临床及兽医临床大量使用，尤其是作为添加剂在饲料中的应 用越来越多。当此类药物进入畜禽体内后，一部分以原型留在动物体内造成抗生 素残留，另一部分以原型或代谢物形式经粪便、尿等排泄到外界环境，造成环境 污染，产生人体内耐药菌和环境耐药菌，对人类造成极大的威胁【圃。因此喹诺 酮类药物残留量的测定引起人们的广泛关注，寻找一种可靠、灵敏、简便易行的 分离测定喹诺酮含量的方法很重要。毛细管电泳法是比较好的检测喹诺酮的方 法。 但是在检测的过程中，对于实验条件的优化可能要花费大量的时间与精力， 为此我们提出利用p e a k m a s t e r 毛细管区带电泳模拟器进行模拟实验。 p e a k m a s t e r 是由捷克c h a r l e s 大学b o h u s l a v g a s 等人研发的一款快速计算毛 细管电泳背景电解质p h 和预测分析物毛细管区带电泳行为的免费软件【6 7 1 ，可以 方便快速地计算出分析物有效淌度等相关参数，并且可以模拟出混合分析物的电 泳图，确定系统特征峰的位置等，是一种非常实用的软件。p e a k m a s t e r 软件模拟 出的电泳图可以预测被分析物的峰型和位置，而且简单方便，对具体的分离实验 ； 工作起到很好的辅助作用。 p e a k m a s t e r 的功能可分为计算功能和模拟实验功能。在计算方面，p e a k m a s t e r 可以完成背景电解质有关参数的计算( 如p h 、离子强度、缓冲容量等) 、分析物 的重要参数计算( 如直接紫外检测信号或荧光信号、淌度等) 、分析物峰扭曲变 形趋势( 受到电迁移扩散因素的影响) 的估算；在实验模拟方面，p e a k m a s t e r 可以模拟出某一背景电解质条件下混合样品的电泳图，并能预测和模拟系统特征 峰的位置和振幅大小。在利用p e a k m a s t e r 软件计算背景电解质的p h 和模拟分 离喹诺酮实验时，需要输入物质的离解常数和极限淌度值，为此要利用我们前面 所测定的喹诺酮的离解常数和极限淌度值，因此喹诺酮的离解常数对于其分离检 测具有重要的作用。 另外在毛细管区带电泳中，我们也可以利用荷质比与p h 的关系来预测最佳 河北大学理学硕十论文 分离p h 条件。质合比与背景电解质的p h 成反比关系6 扪，与迁移时间也成反比 关系，为此我们可以分别通过计算五种物质的质荷比，根据以上的关系作图预测 分离的最佳p h ，从而选择合适的p h 条件进行实验，并且能够预测物质的出峰 顺序。在本实验中，我们利用所测定的喹诺酮的离解常数，分别通过计算荷质比 来预测分离喹诺酮的最佳p h ，和利用p e a k m a s t e r 软件模拟不同的实验条件，预 测最佳分离的p h ，及其他分离条件。并进行实际实验验证这两种方法的可靠性， 结果证明这两种方法所模拟的最佳条件与实际情况相符，可以作为具体实验的参 考。 4 2 实验部分 4 2 1p e a k m a s t e r 软件模拟实验 p e a k m a s t e r 是一款免费共享的软件可以从网站下载6 7 1 。利用此软件分别改 变p h ，缓冲液浓度，电压预测最佳分离条件。 4 2 2 仪器和试剂 b e c k m a np a c e t m 电泳仪( b e c k m a n 公司，美国) ，二极管阵列检测器 ( b e c k m a n 公司) ；毛细管柱：总长6 0 2 c m ，有效长度5 0 c m ，柱内径7 5 u m ；p h s 3 c 精密p h 计( 上海) 。 达氟沙星，恩诺沙星，氟罗沙星，沙拉沙星，氧氟沙星 ( s i g m a - a l d r i c h l a b o r c h e m i k a l l e n 公司，德国g m b h ) 。磷酸( 8 5 ) ，氢氧化 钠，乙酸，化学试剂均为分析纯。所用水均为二次蒸馏水。 4 2 3 样品溶液的制备 分别称取定量个样品，用5 0 m m o v l 乙酸溶液溶解定容至1 0 0 m l ，配成 1 0 u g m l 的混合样品储备液。 4 2 4 背景电解质 移取一定量的8 5 浓磷酸，用二次蒸馏水稀释定容，配置成2 5 m m o l l 的磷酸 储备液。用4 m o l l 的n a o h 溶液调节其p h ，使p h 分别为2 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 ，8 5 ， 1 0 0 。 4 2 5 电泳条件 应用电压为2 2 k v ，温度2 0 ，检测波长为2 8 0 n m ，采用流动力学进样，进样 第4 章喹喏酮分离优化巾p k 值的作用 压力为0 7 p s i ，进样时间8 s 。使用前毛细管要用1 0 m o i l n a o h 溶液冲洗1 0 m i n 以活化毛细管柱，再用水冲洗1 0 m i n ，最后用缓冲液冲洗5 m i n 。为了平衡毛细管 柱，每两次运行之间用运行缓冲液冲洗3 m i n 以保证良好的重现性。每天实验结束 后，用0 1 m o i l n a o h 冲洗1 0 m i n ，然后用水冲洗2 0 m i n 。 4 3 结果与讨论 4 3 1 比较p h 对分离效果的影响 本文研究的喹诺酮类药物结构在前章已经介绍过见图3 1 所示，结构中羧 基和可质子化的氮原子( 包括氨基) 影响整个基团的带电性。其中，质子化氨基 的p 局值在上一章我们已经测定出为7 5 8 5 ，羧基的p k 值为5 5 , - + 6 0 ，因而该 类药物在水溶液中呈两性，其表观电荷数受到缓冲液p h 值的影响，p h 值的变 化将影响它们的迁移速率进而影响分离。 本文同时利用荷质比和p e a k m a s t e r 模拟软件预测分离的最佳p h 。通过计算荷 质比，以荷质比( q r o w ) 对p h 作图，比较不同p h 条件下，五种喹诺酮的分离情 况见图4 1 。从图4 1 可以看出在2 旺1 0 0 的p h 范围内，在p h 为8 时，这五种物质 基本能够分离。p h j , 于8 和p h 大于8 ，都不能实现分离。并且根据物质从上到下 的排列顺序，预测其出峰的顺序。p h = 8 时，所预测的出峰顺序为d a n o f l o x a c i n ， e n r o f l o x a c i n ，s a r a f l o x a c i n ，f l e r o x a c i n ，o f l o x a c i n 。 图4 2 a 是不同p h 条件下，利用p e a k m e a s t e r 软件模拟的实验结果。从图中可以 看出，在p h 为8 0 时，五种物质也基本达到分离，p h 大于或小于8 0 时，五种物质 的峰有重叠现象，都不能实现分离。并且通过比较图4 1 与图4 2 a 可以看出，在整 个p h 范围内，两种方法对所预测的p h 分离条件一致。图4 2 b 是实际实验的分离 情况。可以看出碱性缓冲液对此类药物的分离有利，当p h = 8 0 时，五种药物基本 上可以分离，所预测的出峰顺序与实验结果一致，证明了两种方法所预测的分离 p h 是可靠的，可以作为实际实验的依据。 3 3 河北大学理学硕十论文 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 2 0 0 0 _ 0 0 2 - 0 0 4 0 0 6 - 0 0 8 12345 4 3 2 o 67891 01 1 p h 图4 1 不同p h 条件下荷质比的变化曲线 02356 78 t m i n i a 呈 第4 章喹喏酮分离优化巾p 心值的作用 o o o o o 们 o o - o o 们 4 3 2 o 01 2 345b78g t j m i n 0123 3 5 45678 t m i n o 0 1 0 o 胞 3 2 1 o t m l n i b 2 i s 第4 章喹喏酮分离优化巾p 心值的作用 0 0 1 0 o 棚 o 6 4 3 2 0 - 1 0234567 t r a i n o123 3 7 45678 帅n 3 i a u l 河北大学理学硕十论文 0 0 1 6 0 0 1 4 0 0 1 2 o 0 1 0 三0 0 0 0 o 6 0 0 0 4 o 2 o o - o 2 012345678 t r a i n 图4 2 p h 对分离五种喹诺酮药物的影响 运行电压2 2 k v ，温度2 0 ，检测波长2 8 0 n m ，进样压力为0 7 p s i ，进样时间8 s 4 3 2 比较缓冲液浓度对分离效果的影响 利用p e a k m a s t c r 软件同样可以模拟缓冲液浓度的改变对分离的影响，预测 最佳的缓冲液浓度。由于当缓冲溶液浓度过低时，背景电解质不稳定，会影响分 离效果，为此本实验中缓冲溶液对于1 0 m m l 的情况不作讨论。 图4 3 a 是p e a k m a s t e r 模拟的分离情况。从图可以看出在p e a k m a s t e r 模拟实 验中，随缓冲液浓度的增大，五种物质的分离度逐渐增大，当缓冲液浓度为2 5 m m 时，分离效果最好，然后随缓冲液浓度继续增大，分离度有所降低。 为检验预测的结果是否正确，同样进行了实验验证。图4 3 b 是实际实验考 察的缓冲液浓度从1 5 m m - - 4 0 m m 的电泳谱图，可以看出随缓冲液浓度的增加， 迁移时间有所增加，当缓冲液浓度达到2 5 m m 时分离效果最好，当缓冲液浓度 继续增大时，分离度降低，所预测的结果与实验结果相一致。 3 2 o o12 o 0 1 0 o o o o d 4 b 3456 t m i n o12 3 9 3456 帅i n i 西u i 河北大学理学硕十论文 2 o 1 o12 o 0 2 2 o 0 1 8 乏o 0 1 6 o 0 1 4 o 0 1 2 o 0 1 0 3458 t r a i n o2 4 0 3 58 t r a i n 葛西u j 第4 章喹喏酮分离优化中p 心值的作用 2 1 o 1 o 0 1 0 0234567 t m i n o 1234567 t r a i n 4 l i 口u l 3 河北大学理学硕士论文 i i i i i _ _ 置| 置量詈量詈暑詈曼曼詈曼墨_ _ | 皇量量阜目_ _ _ _ 置曩置_ _ _ - 2 o 01234 567 u m i n 0 删 o o 2 0 0 4 0 0 0 3 6 o 0 3 o123 5 67 u m i n 4 2 i 口c ! s 第4 章喹喏酮分离优化中p 圪值的作用 i p 历 o1234587 t m i n 图4 3 缓冲液浓度对分离五种喹诺酮药物的影响 运行电压2 2 k v ，温度2 0 c ，检测波长2 8 0 h m ，进样压力为o 7 p s i ，进样时间8 s 4 4 结论 通过以上模拟预测与实际实验的比较，证明离解常数的测定对物质的分离检 测有一定的辅助作用，并证明利用p e a k m a s t e r 软件及通过计算荷质比模拟实验条 件预测最佳分离条件是可行的。所提出的预测实验的方法简单易行，不需要其他 设备，并且可以节省实验时间，提高工作效率，对实际实验起到一定的辅助作用。 4 3 似 辇 咖 啪 咐 0 o o 0 o o 河北大学理学硕士论文 参考文献 【l 】z u s k o v ti ，n o v o t n 磊a ，v 6 e l 矗k o v f ik ，g a b ，d e t e r m i n a t i o no fl i m i t i n gm o b i l i t i e sa n d d i s s o c i a t i o nc o n s t a n t so f 21a m i n oa c i d sb yc a p i l l a r yz o n ee l e e t r o p h o r e s i sa tv e r yl o wp h ，j c h r o m a t o g r b ，2 0 0 6 ，8 4 1 ( 3 ) ：1 2 9 - 1 3 4 【2 】冯俭，谢萍中药有效成分理化性质分析在新药开发研究巾的重要意义与基本方法中 国巾药杂志，2 0 0 3 ，2 8 ( 9 ) ：7 9 8 7 9 9 【3 】徐斌一元酸碱离解常数测定的通用方法湖北师范学院学报( 自然科学版) ，1 9 9 6 ，1 6 ( 1 ) ： 2 8 - 3 1 4 】王丽平，毛士虎双点电位滴定法及其应用，安徽教育学院学报，2 0 0 3 ，6 ，5 7 - 5 8 【5 】张爱梅，崔惠，王怀生分光光度法测定酸碱指示剂p 心值的研究聊城师院学报( 自然 科学版) ，19 9 6 ，9 ：5 0 5 2 【6 】吕时群，买光昕，李环中双波长分光光度法测指示剂类多元酸( 铬天青s ) 离解常数 菏泽师专学报，1 9 9 4 ，2 ( 1 ) ：1 - 6 7 】张庆合，张维冰，李彤，张玉奎氧化锆固定相反相高效液相色谱法测定碱性化合物 的离解常数色谱，2 0 0 5 ，2 3 ：5 5 1 5 5 4 【8 】b i o l dm t h i n - l a y e rp h - c h r o m a t o g r a p h yo fm o n oa n dd i b a s i co r g a n i ca c i d so nb u f f e r e ds i l i c a g e ll a y e r s a n a l y t i c ac h i m i c aa c t a ，1 9 7 6 ，8 8 ( 2 ) ：l1 6 1 - l1 6 3 【9 】贾沪宁，于清峰，王志群，倪坤仪薄层色谱p h 法测定人参三醇2 3 ，6 2 二琥珀酸单酯的离 解常数中国药科大学学报，2 0 0 4 ，3 5 ( 3 ) ：2 3 2 - 2 3 4 【1 0 】朱岩，戚文彬，徐素君，杜欢永，张刚峰离子色谱法测定一元弱酸的离解常数分析 化学，1 9 9 3 ，2 1 ( 2 ) ：2 0 2 - 2 0 5 【ll 】白宝林，张海容荧光法研究胆环糊精( c d ) 体系中有机小分子对萘酚离解常数的影响 光谱学与光谱分析，2 0 0 3 ，2 3 ( 4 ) ：7 7 2 - 7 7 5 【1 2 】江云宝，黄贤智，陈国珍荧光光谱法测定环糊精包络物离解常数厦门大学学报( 自然 科学版) ，1 9 9 3 ，2 9 ( 2 ) ：1 8 8 - 1 9 1 【1 3 】唐