（高分子化学与物理专业论文）聚乳酸软骨组织工程支架制备、改性及其细胞相容性研究.pdf

浙江大学罅士学位论文( 2 0 0 3 ) 摘要 摘要 研究了聚一l 乳酸( p l l a ) 软骨组织工程支架的制备、改性及细胞相容性。首 先以p l l a 平面膜为研究模型，研究了亲水性单体在p l l a 表面的接枝聚合、生物 大分子在p l l a 平面膜表面的化学接枝和涂层、生长因子在p l l a 平面膜表面的引 入。以致孔剂法和热致相分离法制备了p l l a 多孔支架。最后将p l l a 平面膜的表 面改性技术应用于p l l a 多孔支架的改性，制备了具有良好细胞相容性的软骨组 织工程用可降解多孔支架。 采用过氧化氢溶液中紫外光氧化的方法在p l l a 膜表面引入了大分子过氧化 氢基团。采用碘量法测定了p l l a 膜表面大分子过氧化氢基团的浓度，并考察了 氧化时间和氧化温度的影响。随氧化时间延长，大分子过氧化氢基团的浓度先升 后降。氧化温度升高能够加快氧化过程的进行。 利用光氧化后p l l a 膜表面的大分子过氧化氢基团作为自由基接枝聚合的引 发剂，采用紫外光引发或f e ”辅助引发的方式，引发了亲水性单体甲基丙烯酸羟 乙酯( h e m a ) 、丙烯酰胺( a a m ) 或甲基丙烯酸( m a a ) 在p l l a 膜表面的接枝聚 合，从而将羟基、酰氨基或羧基引入材料表面。a t r - i r 和x p s 测试结果证明了接 枝聚合的发生。接触角测试结果表明改性后p l l a 膜表面的亲水性明显提高。采 用a t r i r 、x p s 和比色法表征了p l l a 膜表面亲水性聚合物的接枝量，结果表明 接枝量随单体浓度的提高和接枝时间的延长而增大。采用s e m 和s f m 考察了改性 前后材料表面形貌的变化，结果表明接枝改性使得材料表面的粗糙度增大。与紫 外光引发接枝聚合所得到的p l l a 改性膜相比，p h f e 2 + 辅助引发接枝聚合所得到 的p l l a 改性膜表面的亲水性聚合物的分布更为均匀，表面粗糙度较低。 采用软骨细胞培养考察了接枝改性对材料细胞相容性的影响。材料表面亲水 性官能团的引入没有明显提高细胞的粘附率和增殖率，但却对细胞的铺展性能有 重要影响。通过改变单体浓度和接枝时间，制各了一系列不同接枝量的 p l l a - g p a a m 和p l l a g p m a a 平面膜，并考察了材料表面不同的官能团以及材 料表面的亲水性对细胞铺展性能的影响。结果表明细胞只有在适度亲水性的表面 才有良好的铺展性能，呈多角状；而在较高疏水性或较高亲水性的表面细胞主要 呈球形并团聚成细胞团。官能团的种类以及表面电荷对细胞的铺展性也有重要影 响。 为了将生物大分子化学接枝于p l l a 膜表面，首先在p l l a 膜表面接枝 p m a a ，将羧基引入p l l a 表面，利用水溶性碳化二亚胺e d a c 作为缩合剂，与 含有氨基的生物大分子反应，可将生物大分子如明胶、胶原和壳聚糖化学接枝在 p l l a 膜表面。a t r i r 、x p s 和茚三酮测试结果均证明了接枝的发生，但也表明 濒江大学礴士学位论文( 2 0 0 3 )摘要 生物大分子的接枝量较小( 羟基 酰氨基1 5 5 。 e r t e l 等认为羰基有利于牛血管内皮细胞的增殖，而羟基和羧基则不能【6 0 。利用 含氮化合物的等离子体处理聚合物表面，可在材料表面引入各种含氮基团，不仅 能调节表面的亲疏水性，还能使材料表面带上一定的正电荷( 胺的阳离子化) ， 已成为提高生物材料表面细胞相容性的一种重要措施 6 9 。利用接枝聚合技术可 将含有羟基、羧基和酰氨基等官能团的单体接枝于聚氨酯表面，以提高其对人体 血管内皮细胞的相容性【7 0 ，7 1 】。 精江大学博士学位论文( 2 0 0 3 )第一章文献综述 将生物活性因子固定在材料表面是提高材料细胞相容性的最有效的手段，但 也存在着成本高、活性因子易失活的缺点。细胞外基质( e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ) 及 血清中含有许多对细胞的粘附、生长和增殖有促进作用的活性因子。把这些活性 因子化学固定于材料表面，或对材料进行预吸附处理，可明显的改善细胞的粘附 和生长 7 2 1 。常见的活性因子包括各种贴壁因子如f n 、l n 、v n 、胶原、多聚赖 氨酸、各种生长因子如成纤细胞生长因子( f g f ) 和促进骨和软骨组织形成的骨 形态发生蛋白( b m p ) 等。 f n 是应用较多的一种活性因子，它来源于血清、结缔基质及细胞表面，是 一种促进多种细胞粘附和生长的糖蛋白，分子量为2 0 0 ，0 0 0 2 5 0 ，0 0 0 。由于细胞 在粘附生长过程中并不能区分外源性f n 与内源性f n ，因此材料表面预涂外源性 f n 后，有利于细胞粘附生长 7 3 1 。 前已述及，细胞膜表面的整合素受体与其配体如f n 、v n 、l n 和胶原等的相 互作用，实质上是与配体分子中的某些肽段如f n 中的 r g d ( a r g i n i n e g l y c i n e a s p a r t i c a c i m序列和l n中的y i g s r ( t y r o s i n e i s o l e u i n e g l y c i n e s e r i n e a r g i n i n e ) 序列的相互作用。因此在高分子生 物材料表面固定r g d 、y i g s r 等粘附肽段( a d h e s i o np e p t i d e ) 是提高其对细胞 粘附的有效手段。大量研究致力于r g d 肽段在聚合物材料表面的固定化，并取 得了理想的效果 5 9 ，7 4 8 2 1 。但必须注意的是过高密度的粘附肽段有可能不利于 细胞相容性的提高。m a n n 等 7 7 分别将5 种粘附肽段固定于玻璃表面并考察了 其对平滑肌细胞，内皮细胞和成纤细胞的胞外基质的分泌情况。发现当r g d 的 表面密度增大时，细胞的胞外基质分泌量下降；对于不同的粘附肽段，胞外基质 的分泌量随材料对细胞粘附力的升高而下降。o l b r i o h 等发现成纤细胞在含有 r g d 的玻璃表面的粘附率提高，但迁移速度下降；而在含有y i g s r 的玻璃表面， 成纤细胞的粘附率下降8 0 。d i m i l l a 等发现当材料对细胞的粘附力为中等大小 时平滑肌细胞的迁移速率达到最大 8 3 1 。 1 2 3 6 材料表面的徽图案化( m i c r o p a t t e r n i n g ) 对细胞相容性的影响 微图案化表面是指采用各种表面微构建技术( m i c r o f a b r i c a t i o n ) 如光刻， 等离子体刻蚀、离子束刻蚀、微接触印刷、分子自组装等技术制备的具有微米级 或亚微米级图案的表面。微图案化表面的图案既可以是物理形貌图案，也可以是 化学图案，都对细胞生长有重要影响 2 5 ，3 2 ，8 4 ，8 5 。目前微图案化表面已成为研 究细胞与材料表面关系的一种重要工具。本章1 2 3 1 节已经对微图案化的物理 形貌作了介绍，下面主要介绍化学图案对细胞的影响。 通过控制微图案化表面中不同区域化学性质可实现细胞在某些区域的选择 濒江大学博士学位论文( 2 0 0 3 ) 象一章文馘综述 性粘附、增殖和定向迁移，其中粘附蛋白和细胞生长因子的微图案化是实现细胞 选择性粘附、增殖和定向迁移的重要手段 1 8 ，8 5 ，8 6 。m a t s u d a 领导的实验室利用 光刻技术制备了含有高度亲水性微区的t c p s 表面，发现牛血管内皮细胞选择性 的粘附在t c p s 的区域。利用同样的技术制备了含有疏水微区的聚乙烯醇( p v a ) 表面，发现牛m 管内皮细胞选择性的粘附在疏水微区 8 7 。8 9 1 。d e f i f e 9 0 等利用 光刻技术制备了含有中性，正电荷及负电荷区域的微图案化表面，并考察了其对 巨噬细胞的影响，发现在亲水性的聚丙烯酰胺区域细胞不发生粘附：而在负电荷 的聚丙烯酸区域以及中性的聚( n ，n 二甲基硫代氨基甲苯二酯c o 苯乙烯) 区 域细胞可以粘附和铺展，并能够在白细胞介素( i n t e r l e u k i n ) 的诱导下融合为巨 大细胞：在正电荷的聚二甲基胺丙基丙烯酰胺区域细胞达到最大量的粘附，但不 能融合为巨大细胞。s t e n g e r 和s p a r g o 9 1 ，9 2 等利用自组装单分子层技术在会表 面形成了含有氨基微区和疏水性微区的表面。猪血管内皮细胞选择性的粘附于氨 基微区表面。利用这种表面还实现了小鼠海马神经细胞的定向生长。m r k s i c h 等 人( 9 3 】用微接触印刷技术在金或银表面形成以p e g 和甲基为末端基的图案化的 自组装单分子层，当在基底物上涂敷f n 后，牛毛细血管内皮细胞仅粘附在以甲 基为末端基、吸附有f n 的微区。i t o 等 9 4 9 7 幂1 j 用光刻技术在p e t 或p s 表面实 现了胰岛素或e g f 的微图案化固定，研究表明细胞在含有活性因子微区的增殖 率明显提高。 微图案化表面不仅用来控制细胞的选择性粘附和增殖，还被用来控制细胞的 形态及其功能。s i n g h v i 等人 9 8 用微接触印刷技术在金表面形成了以p e g 和甲 基为末端基的图案化的自组装单分子层，并利用其对蛋白质的不同的吸附能力在 表面上形成了矩形的l n 微区。微区的尺寸在1 5 1 0 0 1 x m 不等，研究表明多数情况 下，单个细胞局限在一个l n 的微区内生长，而且细胞的铺展形状与岛的形状一 致。细胞的大小与形状可通过改变粘附微区的大小和形状控制，而无须改变l n 的密度。当细胞的尺寸在1 6 0 0 1 0 0 0 0p m2 范围内变化时，细胞白蛋白的分泌量 随细胞尺寸的增大而减小，细胞d n a 的合成量却随细胞尺寸的增大急剧升高。 c h e n 等人f 9 9 1 0 0 用同样的方法制备了f n 的微图案化表面，用来控制人和牛毛 细血管内皮细胞( h c e b c e ) 的形状。发现当f n 微区相互距离较远时，单个细 胞可被碣限在f n 的微区内，其大小和形状与粘附微区相一致，虽然有向非粘附 区( p e g 末端区) 伸展的倾向，但是向外伸展几微米进入非粘附区几分钟后又 快速收回。当粘附岛的间隔小于2 0 9 m ( 1 0 1 x m ) 时，细胞可以从一个微区跨向另 一个微区，即形成“搭桥”现象，此时细胞的粘附仍然只发生在f n 微区。采用 牛毛细血管内皮细胞研究还发现，f n 微区中的单个细胞随微区尺寸的下降 ( 2 0 u 。) 将从生长转向凋亡。为了考察究竟是细胞的伸展程度( 即实际尺寸) 溉江大学博士学位论文( 2 0 0 3 )第一章文献综述 还是细胞与f n 微区的粘附面积( 粘着斑的数量) 控制着细胞的凋亡，c h e n 等减 小了f n 微区的尺寸( 3 - 5 1 t m ) 及其间隔距离( 1 0 p m ) ，使细胞能够搭桥，从而可 保持细胞与f n 微区的接触面积不变而改变其伸展程度。结果表明是细胞的伸展 程度而不是细胞与f n 微区的粘附面积控制着其生长和凋亡。 1 3 生物材料的表面改性 高分子生物材料由于具有良好的物理机械性能和化学稳定性而被广泛应用 于人造器官、组织工程，骨组织修复、外科整形、以及药物控释等领域。然而大 多数人工合成的高分子材料例如应用于组织工程的可降解高分子材料聚乳酸、聚 羟基乙酸等都不具有良好的生物相容性，其表面也都是生物学惰性的。因此有必 要对人工合成的高分子生物材料进行表面改性，这既可赋予材料表面良好的生物 相容性，又可以保留材料本体的性质而保持其特有的物理性能。 目前生物材料的表面改性技术主要有表面涂层( c o a t i n g ) 、等离子体 ( p l a s m a ) 、辉光放电( g l o wd i s c h a r g e ) 、电晕放电( c o r o n ad i s c h a r g e ) 、表面接枝聚 合( g r a f t i n gp o l y m e r i z a t i o n ) 、化学气相沉积( c h e m i c a lg a sd e p o s i t i o n ) 和离子束注入 ( i o n b e a m t r a n s p l a n t a t i o n ) 等方法。 1 3 1 物理涂层或吸附 物理涂层或吸附是最为方便的生物材料表面改性技术。在化学惰性的聚合物 表面涂附一层具有良好生物相容性的材料，可大大提高其生物相容性。表面涂层 的关键是要采取一定措施提高涂层的稳定性。q u i r k 等 7 6 】将含有r g d 序列的肽 段g r g d s 接枝在多聚赖氨酸上，然后利用多聚赖氨酸在聚乳酸( p l a ) 表面的 吸附实现r g d 在聚乳酸表面的固定，以提高材料表面对细胞的粘附。e l a m 等 1 0 1 】 为了将纤维素稳定涂层于聚四氟乙烯医用导管材料表面，制备了乙基- 羟乙基纤 维素( e t h y lh y d r o x y e t h y lc e l l u l o s e ，e h e c ) ，这种疏水化的多糖分子中的疏水基 团可与疏水性的聚合物表面发生较强的相互作用。而且e h e c 在高于3 6o c 时会 转变为不溶于水的聚合物，使e h e c 涂层更加稳定。e h e c 中的亲水部分可有效 地阻止血浆中蛋白质在材料表谣的吸附，缓延凝血现象的发生。实验表明表面涂 层e h e c 后的聚四氟乙烯医用导管的凝血时间明显延长。将亲水性的聚氧化乙 烯( p e o ) 链稳定吸附于药物缓释微球表面，可大大降低微球在体内引发排异反 应的可能【1 0 2 】。t a n 等 1 0 3 以聚苯乙烯微球( 6 9 4 8 2 n m ) 作为模型研究了p e o 、 p e o p p o p e o 三嵌段共聚物( p l u r o n i c ) 和其星型共聚物( t e t r o n i c ) 在微球表 面的吸附行为。研究表明含有疏水段p p o 的p l u r o n i c 8 和t e t r o n i c r 比p e o 更容 易吸附于聚苯乙烯微球表面，在直径大的微球表面吸附也更容易发生。改性后的 1 7 溉江大学薅士学位论文( 2 0 0 3 )第一章文献综述 微球表面吸附血浆蛋白的能力明显下降，排异反应降低，微球在血液循环中的存 活半衰期从未改性的2 0 m i n 延长至改性后的1 3 小时。 截留法( e n t r a p m e n t ) 是- - o o 有效的提高涂层稳定性的方法。利用含有被涂 物质的溶液溶胀材料表面，然后用非溶剂处理，可使被涂物质截留于材料表面。 q u i r k 等【1 0 4 n 用截留技术含将p e g 和含有g r g d s 肽段的多聚赖氨酸涂层在 聚乳酸表面，从而可控制细胞的粘附。计剑等1 0 s l n 用截留技术将海藻酸钠和 氨基酸的复合物涂层在聚乳酸表面，提高了其对软骨细胞的相容性。除了上述方 法以外，采用两亲性共聚物与生物材料共混，使其在材料表面发生自富集也是一 种有效的生物材料表面改性的方法 1 0 6 】。 1 3 2 等离子体、辉光放电和电晕放电 等离子体、辉光放电和电晕放电处理是应用最为广泛的生物材料表面改性技 术。影响等离子体改性效果的主要因素为反应气成分、等离子体功率、气体流速 和处理时间。最常采用的反应气体为空气、含氮化合物( 如氨气，氨类化合物) 和含硫化合物( 如二氧化硫) 等。通过等离子体或放电处理，可将一些极性的含 氧、含氮( 如氨基和酰胺基) 或含硫基团引入化学惰性的材料表面，提高其生物 相容性。王身国等 1 0 7 采用氨气等离子体处理聚乳酸表面，提高了材料表面的 亲水性和对3 t 3 细胞的相容性，在处理后的聚乳酸表面涂层胶原，可得到稳定 的胶原涂层，提高了材料的细胞相容性。h bl e e 等采用空气电晕放电处理，在 聚乙烯膜或可降解聚合物p l g a 表面引入亲水性的含氧官能团，通过控制功率 可获得不同亲水性的表面，提高了对细胞和血小板的粘附 3 9 ，1 0 8 1 1 0 。g r i e s s e r 等 6 9 1 分别利用庚胺、丁胺、烯丙基胺、n ，n 二甲基甲酰胺、n ，n 二甲基乙酰 胺，n ，n 二甲基丙酰胺的等离子体处理氟化的乙烯丙烯共聚物，使得材料表面 的亲水性明显提高，人体血管内皮细胞和人体成纤维细胞的培养结果表明改性后 的材料表面更有利于细胞的粘附和增殖；研究还表明利用酰胺类化合物等离子体 改性的材料比用胺类化合物等离子体改性的材料具有更好的细胞相容性，表明酰 胺基团比氨基更有利于细胞的粘附和增长。m u l l e r 等1 1 1 干l j 用三种不同的等离子 体改性技术直接等离子体改性( d i r e c tp l a s m am o d i f i c a t i o n ) 、等离子体引发 接枝聚合( p l a s m as u r f a c ea c t i v 撕o na n dg r a f f i n go f t h ef u n c t i o n a lg r o u p ) 和脉冲等 离子体技术( p u l s ep l a s m a t e c h n i q u e ) 并分别以不同的含氨基化合物以及氮气和 氢气的混合物( 体积比为1 ：2 ) 作为反应气对聚偏氟乙烯进行了表面改性。研 究表明材料表面的氮原子百分比与表面氨基的含量并不成简单的正比关系。说明 改性后的材料表面含有多种含氮官能团。较低的等离子体功率有利于氨基的生 成。三种方法中以等离子体引发接枝聚合技术得到的改性材料表面的氨基含量最 濒江大学博士学位论文( 2 0 0 3 )第一章文献综述 大。利用含硫化合物作为反应气氛的研究也多有报道，k l e e 等利用二氧化硫等离 子体处理p v c e v a 表面，明显提高了人体血管内皮细胞在材料上的粘附 1 1 2 】。 利用二氧化硫等离子体处理聚四氟乙烯表面，在材料表面引入含硫官能团如磺酸 基团，提高了材料的表面能，降低了接触角，有利于提高抗凝血性f 1 6 8 。为了 将磺酸基团引入聚氨酯表面从而提高聚氨酯的血液相容性，g i r o u x 等 6 7 】采用了 两种方法，第一种是先用氨气等离子体处理材料表面，将聚氨酯材料表面氨基化， 然后再使氨基与磺酸内酯反应，另一种方法是直接用二氧化硫等离子体处理聚氨 酯表面。k o 等1 1 3 禾t j 用两种不同的含硫化合物烯丙基苯基砜和二氧化硫作为气 氛对低密度聚乙烯进行等离子体处理，在聚乙烯表面引入了含硫官能团，两种方 法改性后材料的表面亲水性均明显提高。但发现用烯丙基苯基砜处理后的材料表 面有抑制血小板的粘附和铺展的功能，而二氧化硫处理后的材料表面却促进血小 板的粘附与铺展。 1 3 3 表面接枝聚合 表面接枝聚合也是一种应用广泛的生物材料表面改性技术。通过使具有某种 特殊官能团的单体于材料表面发生接枝聚合反应可将这种特定的官能团固定于 材料表面，改善材料的生物相容性。改性的关键是如何在化学惰性的材料表面引 入引发剂基团，引发剂基团可以为过氧基团，也可以是光敏基团。下面根据在材 料表面引入引发剂基团的不同方法来讨论表面接枝聚合改性技术。 1 3 3 1 氧化引入过氧基团 利用臭氧氧化的方法，可在高聚物材料表面产生过氧基团。d a s g u p t a 等 1 1 4 利用臭氧氧化聚乙烯和聚丙烯粉末，在材料表面引入了过氧基团，过氧基团与其 它还原剂一起组成氧化还原引发体系可引发丙烯酰胺等亲水性单体的聚合，改善 了聚合物表面的亲水性。为了降低聚丙烯微滤膜的吸附蛋白质的能力，w a n g 等 1 1 5 】利用臭氧处理微滤膜表面，在其上引入了过氧基团，过氧基团的含量随氧 化时间的不同为5 2 0 1 0 。9 m o l c m 2 不等。随后使亲水性单体甲基丙烯酸羟乙酯 ( h e m a ) 在聚合物表面接枝聚合，提高了聚丙烯微滤膜的亲水性。牛血清白蛋 白( b s a ) 的吸附实验表明，蛋白质在滤膜表面的吸附量降低，且容易发生解吸 附。为了提高材料的血液相容性，k o 等利用臭氧氧化p u ，p m m a ，硅橡胶和 p e 表面，在聚合物表面引入了过氧基团，随后引发含有p e g 或p e g s 0 3 n a 的 丙烯酸单体聚合，将p e g 或p e g s 0 3 固定在聚合物表面 1 1 6 】。 除了利用臭氧氧化，利用过氧化氢氧化也可以达到良好的效果。高长有等 7 0 将聚氨酯浸于过氧化氢溶液中，并在紫外光下辐照，可在聚氨酯材料表面引入过 浙江大学辩士学位论文( 2 0 0 3 )第一章文献综述 氧化氢基团。利用紫外光引发可将聚甲基丙烯酸羟乙酯( h e m a ) 、聚丙烯酰胺 和聚丙烯酸等亲水性聚合物接枝在聚氨酯表面。研究表明改性后的聚氨酯材料对 人体血管内皮细胞的相容性得到提高71 。 g e u s k e n s 等将微量的蒽混入材料中，在氧气环境下用3 5 0 n m 的紫外光照射 材料表面，蒽分子被紫外光激发，然后将激发的能量转移给氧分子，被激发的氧 分子再使聚合物氧化而在聚合物表面产生了过氧基团，随后实现了甲基丙烯酸在 聚合物表面的接枝聚合 1 1 7 】。 1 3 3 2 等离子体引发表面接枝聚合 当采用氧气或空气的等离子体处理材料时，会直接在材料表面形成过氧基 团。利用惰性气体( 如氮气、氩气、氦气) 的等离子体处理材料表面可在聚合物 表面产生自由基，这些自由基可以被直接利用来弓1 发单体聚合，也可于空气中放 置使自由基与氧气反应形成过氧基团，而后再引发聚合反应 1 1 8 。用氧气等离 子体处理p m m a 可在其表面引入过氧基团，然后接枝聚丙烯酸，进一步利用聚 丙烯酸的羧基，并采用水溶性的碳化二亚胺( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y le t h y l c a r b o d i i m i d e h y d r o c l o r i d e ) 作为脱水剂还可把白蛋白、明胶、胶原等蛋白质大分 子固定在材料表面【1 1 9 。采用空气等离子体处理可在硅橡胶表面引入含量为1 8 1 0 - 8 m o l c m 2 的过氧基团。将处理过的硅橡胶浸于丙烯酰胺溶液中加热可引发 丙烯酰胺在材料表面的接枝聚合。改性后材料表面的亲水性增强，接枝于材料表 面上的酰胺基团可在碱性环境中水解变为羧酸根基团，同样利用水溶性的碳化二 亚胺可把i 型胶原偶联于材料表面，可改善硅橡胶表面的细胞相容性 1 2 0 1 。肿 l e e 等采用空气电晕放电处理聚乙烯膜表面，引发了丙烯酸( a a ) 、苯乙烯磺酸 钠( s s n a ) 和n ，n 二甲基氨丙基丙烯酰胺( d m a p a a ) 的接枝聚合，并研究了材 料表面对细胞的影响，通过控制放电功率还可以控制聚合物的接枝量 5 6 ，5 7 。 c h e n 等1 2 1 利用低温氦等离子体在聚醚砜超滤膜表面引入过氧基团后再使亲 水性单体乙烯基吡咯烷酮接枝聚合于材料表面，提高了材料的亲水性，降低了蛋 白质在滤膜上的的吸附。利用氩气等离子体处理硅橡胶表面，然后直接用h e m a 的等离子体处理，可使h e m a 接枝聚合于材料表面。改性后的硅橡胶表面对人 体角膜上皮细胞的粘附与生长有良好的促进作用 1 2 2 1 。h s u 等利用氩气等离子体 处理聚氨酯表面随后引发了丙交酯的接枝聚合，人体血管内皮细胞和3 t 3 成纤 维细胞的粘附提高，血小板的粘附下降 1 2 3 】。利用相同的技术也可将聚丙烯酰 胺接枝于聚乙烯表面 1 2 4 署1 1 聚氨酯表面 1 2 5 ，改性后的聚氨酯表面对蛋白质和 血小板的粘附降低。为了将端基为羟基、羧酸基和磺酸基的聚乙二醇大分子以化 学键的方式固定在聚乙烯表面来提高其血液相容性，可预先将这些聚乙二醇大分 浙江大学搏j ：- 学位论文( 2 0 0 3 )第一章文献综述 子单体吸附在聚乙烯表面，然后用氨气等离子体处理来达到接枝的目的 1 2 6 】。 1 3 3 3 辐射、电子束、激光、紫外光引发接枝聚合 采用y 射线在聚合物表面激发出的自由基可引发单体在聚合物表面的接枝聚 合 1 2 7 ，1 2 8 】。采用电子束直接照射聚丙烯表面( e l e c t r o n b e a m t r e a t m e n t ) ，可有 效地在聚合物表面产生自由基( 2 0 1 0 8 m o l c m 2 ) ，并引发丙烯酸单体的接枝聚 合 1 1 8 】。聚己内酯( p c l ) 用电子束处理后直接浸入丙烯酸溶液中可引发丙烯酸 的接枝聚合反应 1 2 9 1 。 紫外光也是一种有效的引发接枝聚合的方法。把光敏引发剂2 葸醌基磺酸钠 或氯化三乙基二苯甲酮基胺吸附在聚乙烯薄膜表面，再将薄膜浸入丙烯酰胺或 n 。异戊烷基丙烯酰胺的水溶液中可进行紫外光接枝聚合，聚合体系中须加入一定 量的异丙醇作为光引发剂的氢供体。表面改性后聚乙烯膜的接触角从未改性时的 8 0 0 降到2 5 0 1 3 0 。a j a y a g h o s h 等【1 3 1 制备了侧链含具有光敏基团的聚苯乙烯， 在丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸单体的存在下利用紫外光照射材料将亲水性大 分子接枝于聚苯乙烯表面。e c k e r t 等1 3 2 将聚苯乙烯浸于甲基丙烯酸环氧丙酯的 水溶液中并加入二苯甲酮作为光引发剂，直接在紫外光下照射也可以达到表面接 枝聚合的效果。h a m i l t o n 等 1 3 3 以二苯甲酮作为光引发剂，采用紫外光照射将 聚丙烯酰胺和聚丙烯酸接枝在聚乙烯表面。 1 3 3 4 其他方法引发的表面接枝聚合 除了上述几种方法，还有许多特殊的方法被用于引发表面接枝聚合。将聚酯 薄膜( p e t ) 浸于丙烯酰胺单体溶液中并利用高锰酸钾作为引发剂实现了聚丙烯 酰胺在材料表面的接枝聚合，反应中引发剂分解产生的自由基向聚合物表面转移 而产生了大分子自由基 1 3 4 1 。采用过硫酸钾作为引发剂可将甲基丙烯酸环氧丙 酯接枝在明胶分子链上，并利用环氧基团进一步改善明胶的性能 1 3 5 】。b a m f o r d 等 1 3 6 采用过硫酸盐处理聚合物表面，首先在聚合物表面形成羟基，然后利用 四价铈离子和羟基组成的引发体系引发了丙烯酰胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸 3 一氨基丙酯在材料表面的接枝聚合，利用这种技术对多种聚合物包括聚丙烯、聚 苯乙烯、聚丙烯氰、聚氨酯、脂肪族聚酯、尼龙、芳香族聚酯和聚碳酸酯进行了 表面改性，而且还将丙烯酸酯化的抗凝血性大分子肝素作为单体接枝在了材料表 面。利用聚乙烯醇( p v a ) 分子链上的羟基，与四价铈离子配合可引发丙烯酰胺 和甲基丙烯酸甲酯的接校聚合，改善了聚乙烯醇的抗凝血性和细胞相容性 1 3 7 】。 c h e n 等 1 3 8 首先合成了分子链上带有双键的聚氨酯，然后利用这些双键与甲基 丙烯酸环氧丙酯( m a g e ，m e t h a c r y l i ca c i dg y l c i d y le s t e r ) 进行自由基共聚合， i t c z c j c 辨士学位论文( 2 0 0 3 )第一章文献综述 把p m a g e 接枝于聚氨酯分子链上。再将产物与二乙醇胺反应，使p m a g e 中的 坏氧基团打开，得到了分子链中含有大量羟基的聚氨酯材料。将这种聚氨酯薄膜 浸于甲基丙烯酸胆碱酯( m a c c ，m e t h a c r y l i c c h o l i n ec h l o r i d e ) 的溶液中，在四 价铈离子的存在下使p m a c c 接枝于材料表面。p m a c c 中的正电荷与肝素中的 硫酸根负离子通过静电作用相互吸引，从而制备了表面带有肝素的抗凝血聚氨酯 材料。 1 3 4 化学气相沉积技术 化学气相沉积技术( c h e m i c a lv a p o rd e p o s i t i o n ，c v d ) 主要被用来在金属材 料表面引入一层有机材料，它是将有机化合物的蒸气进行电离然后使其在低温的 金属表面沉积聚合。利用化学气相沉积法将2 一氯环二甲二苯沉积于具有形状记忆 功能的金属材料n i t i n o l 表面，再用二氧化硫等离子体处理，材料表面的血小板 粘附数量大大降低1 1 3 9 1 。将苯环上带有氨基、羟甲基和酸酐等官能团的环二甲 基二苯气相沉积聚合于n i t i n o l 的表面，再利用材料表面的活性官能团( 氨基、 羟甲基和酸酐等基团) ，并采用二异氰酸酯作为偶联剂，可将具有抗血栓形成功 能的天然大分子水蛭素( h i r u d i n ) 固定于材料表面，改性后材料表面的血栓形成 时间延长数倍。以此种材料做成的冠状动脉扩张器，有望有效的预防冠状动脉扩 张后的再狭窄 1 4 0 1 。利用化学气相沉积技术不仅可以在材料表面引入一层聚合 物材料，也可引入一层无机材料。在金属t i 表面利用c v d 技术沉积可一层钻石 状碳( d i a m o n dl i k ec a r b o n ，d l c ) ，提高材料的抗凝血性 1 4 1 。如果事先在金 属t i 表面引入一层t i c 或t i n 合金，则可增强钻石状碳层和金属t i 之间的粘 和力【1 4 2 ，1 4 3 。在石墨表面利用化学气相沉积技术可形成一层t i n 涂层。化学气 氛为t i c l 4 、n 2 和h 2 的混合物，反应方程式为t i c h + 1 2 n 2 + 2 h 2 = t i n + 4 h c l 。由 于t i n 对白蛋白的吸附较强而对纤维粘连蛋白的吸附较弱，因而不利于凝血现象 的发生 1 4 4 。 1 3 5 离子柬注入技术 将具有一定能量和密度的离子柬射向材料表面，可改变材料表面的化学组 成。离子束技术已广泛应用于提高由钛制成的矫形外科部件的耐磨性。用离子束 技术也可改变高聚物的表面能、亲水性和耐磨性。采用银负离子柬改性聚苯乙烯 表面，使得聚合物表面发生降解，亲水性得到了提高，提高了对人体血管内皮细 胞的相容性 1 4 5 1 。采用n d 离子束( 1 1 0 1 5 i o n s c m 2 ，1 5 0 k e v ) 处理聚氨酯材料表 面，可在材料表面形成具有任意图案的改性区( 被离子束注入的区域) ，改性区 部分的细胞相容性增强，细胞在改性区粘附和繁殖，而在未受到离子束照射的聚 浙江大学鞲士学位论文( 2 0 0 3 )第一章文献综述 氨酯表面细胞几乎不发生粘附 1 4 6 】。用n a + 离子束还可以对聚苯乙烯表面进行 改性，也可明显提高其细胞相容性。将s i 离子束注入聚氨酯、聚丙烯或聚苯乙 烯表面，材料对内皮细胞的粘附率有显著改善。采用a 什离子束处理后的聚乙烯 表面含有双键和氧化基团，其中的双键还可以用来接枝丙烯酸单体 1 4 7 。不仅 仅是离子注入，原子注入技术也可以改性材料表面。g k a l l g 等采用金原子溅射 多种聚合物表面，由于在聚合物表面引入金元素，材料的亲水性得到提高，成纤 维细胞在改性后的聚合物表面更容易粘附，铺展和增长【1 4 8 】。 1 3 6 表面腐蚀或其它化学反应 由于酸、碱的腐蚀性，许多聚合物都可以在酸或碱中进行表面腐蚀来提高其 表面亲水性。e m i y 旬i 等 1 4 9 用氢氧化钠处理硅橡胶表面，可使硅氧键断裂 而产生硅羟基，处理后的材料表面具有大量羟基，在人体内更容易引发羟基磷灰 石在其上的生成，从而可增强材料与骨组织的粘合力。酸碱处理还可用于金属材 料的表面改性。w e n 等 1 5 0 将用于整形外科植入物的金属钛用两步法进行表 面处理，首先用盐酸和硫酸处理金属钛，然后再将其浸于0 2 m 的氢氧化钠溶液 中，1 4 0 0 c 保持5 h ，处理后的金属钛表面一方面产生了大量微孔，另一方面由于 表面的氧化物含量增大而有利于磷酸盐在其上的形成。体外模拟实验表明在这种 改性后的钛金属表面2 天后便形成了2 0 9 i n 厚的羟基磷灰石沉积层，而且沉积层 与金属的结合非常牢固，为开发具有良好骨组织相容性的骨组织修复材料或整形 外科修复材料提供了一条途径。 对于易水解的高聚物材料，如p m m a 、p e t 、p c l 、p l l a 和p l g a 等，可 以使其在碱性溶液中适度水解，在其表面产生羧基 1 5 1 】。如在二元胺中进行氨 解反应可在材料表面产生氨基 1 5 2 1 。k h a l l g 等分别利用7 0 的高氯酸、5 0 的硫 酸或o 5 m 的氢氧化钠处理p l g a 表面，提高了材料表面的亲水性，成纤维细胞 在处理后的材料表面尤其是高氯酸处理的材料表面的粘附和增殖有明显提高 1 5 3 。 利用各种化学反应可以达到生物材料表面改性的目的。利用聚乙二醇钠与可 降解生物材料聚( 三氟乙氧基) 磷氰反应，可以把聚乙二醇固定于聚磷氰表面， 改善其亲水性。反应中聚乙二醇负离子亲核取代了聚磷氰中的三氟乙氧基团 【1 5 4 】。将自蛋白与4 氟3 硝基苯叠氮与白蛋白反应，制得带有叠氮基团的白蛋 白( a n p “b u m i n ) ，加热使得a n p a l b u m m 中的叠氮基团分解从而与聚丙烯反 应可将白蛋白接枝于聚丙烯表面，提高了聚丙烯的抗凝血性【1 5 5 】。用1 ，3 一丙磺内 酯或1 ，3 一丙内酯处理聚氨酯，可在材料表面引入磺酸基或羧基，提高了聚氨酯的 亲水性和细胞相容性f 1 5 6 ，1 5 7 。 游江大学博士学位论文( 2 0 0 3 )第一章文献综述 1 3 7 生物材料表面改性技术的未来发展方向 制备具有良好的生物相容性( b i o c o m p a t i b i l i t y ) 、降解性( d e g r a d a b i l i t y ) 干 1 生物 活性( b i o a c t i v e ) 的表面是生物材料发展趋势之- - 1 5 8 1 。许多天然大分子或多肽 序列具有特定的生物功能，利用各种生物表面改性技术，将这些生物活性物质固 定于材料表面，可制得具有特殊生物功能的生物材料。大部分生物活性物质为蛋 白质类或多肽类，因此生物活性物质的固定主要是蛋白质的固定问题。在惰性的 聚合物表面化学固定蛋白质通常分三步，第一步为聚合物表面反应性基团如 一o h 、c o o h 、n h 2 等的引入，第二步为反应性基团的活化，第三步为活化后 的反应性基团和蛋白质的反应。式( 1 4 ) y r 举了文献中常见的生物材料表面化学固 定蛋白质的方法i 1 5 9 1 6 2 1 ，其中n h 2 一l 为蛋白质分子，w s c 为水溶性碳化二亚 胺。姚康德等 1 6 1 1 和高长有等 1 6 2 分别利用水溶性碳化二亚胺( w s c ) 为脱水 剂在聚乳酸表面固定了蛋白质大分子，其中羧基的引入分别采用水解法和表面接 枝聚甲基丙烯酸法。 b1 卜，当卜 “3 1 0 型坚d - 卜c 一。一牡n h l c o o 攀鍪 _ l 一攀卜c 卜u 审一卜乳事 坐+ 卜c 。 1 4 软骨组织工程及其材料 人体的关节软骨是最容易受到损伤的组织之一。由于关节炎或运动创伤所造 成的关节软骨损伤给许多病人带来痛苦。造成这种情况的原因是软骨组织内无血 管，一旦损伤很难自然修复和痊愈，并容易引发更严重的关节软骨组织损伤 1 6 3 1 。多年来人们一直试图修复或重建受损后的软骨组织。l a n g e r 和v a c a n t i 提出组织工程的概念之后，首先将这一想法应用于软骨组织的修复。他们将软骨 q 。i 争 一 塑垒 一 镢江大学禧士学位论文( 2 0 0 3 )第一章文献综述 细胞接种在可生物降解的p l g a ( 或p l l a ) 支架后直接植入动物皮下组织或经 体外培养后植入动物皮下组织，诱发生成了与支架的三维形状相一致的新生软骨 3 - 6 。我国学者曹谊林等【4 】将牛肋软骨细胞接种于具有人耳形状的p g a 纤维多 孔支架后植于老鼠背部皮下组织内，成功地生成了人耳形状的软骨，如图1 7 所 示。目前软骨组织工程在种子细胞、支架材料以及生物活性因子等方面都得到广 泛研究，在有关组织工程的研究中所占的比重最大，取得的成功也最多。这一方 面与人们解决软骨损伤问题的迫切心情有关，另一方面也是因为软骨组织的组织 学结构较为简单，基本由单一种类的细胞( 软骨细胞) 和细胞外基质所构成，比 较容易作为组织工程研究的模型，而且软骨组织内无血管，减少了排异反应的可 能。 人体内的软骨具有极特殊的力学性能，例如关节软骨，具有很好的弹性和韧 性，可承受较大的负荷，又具有光滑的表面，使关节活动时的摩擦力极小，但是 至今软骨组织工程仍无法再造与天然软骨具有相同力学性能的软骨组织，这是目 前软骨组织工程所面临的最大问题。 f i g1 7i no c t o b e r1 9 9 5 ，u n i v e r s i t yo fm a s s a c h u s e t t sa n dm a s s a c h u s e t t si n s t i t u t eo f t e c h n o l o g yr e s e a r c h e r sa n n o u n c e ds u g c e s si ng r o w i n gc a r t i l a g ei nt h es h a p eo fa h u m a ne r ro nt h eb a c ko fam o u s ea ss e e na b o v e t h er e s e a r c h e r su s e dap o l y m e r s c a f f o l di nt h es h a p eo f a ne a rt og r o wh u m a nc e l l so nt h em o u s e 1 4 1 软骨的组织学特点 动物及人体内的软骨属于结缔组织，其中含有少量的软骨细胞和大量细胞间 质。软骨细胞( c h o n & o c y t e ) 散在于软骨基质内的小腔中，这些小腔称为软骨 陷窝( l a c u n a ) ，陷窝周围的基质染色较深称为软骨囊( c a p s u l e ) 。幼稚的软骨细胞 较小，常单个分布于关节软骨的边缘区，呈扁圆形。由边缘向中央，软骨细胞逐 渐长大，呈椭圆形或圆形，具有较明显的软骨囊。幼小的软骨细胞可分裂，深部 浙江丈学博士学位论文( 2 0 0 3 ) 箱一章文献综述 成熟的软骨细胞常2 8 个成群分布，每一群称为同源细胞群。 软骨细胞问质的化学成分主要包括胶原蛋白，蛋白多糖( p r o t e o g l y c a n 或 a g g r e c a n ) 和少量的非胶原蛋白。软骨组织中的胶原主要为i i 型胶原，占胶原总 量的9 0 以上。i i 型胶原纤维在软骨内呈三维网状分布，为关节软骨提供抗张强 度。蛋白多糖是通过一个蛋白质核心所连接的多糖类大分子聚集体。由一条长约 3 0 0 n m 的核心蛋白和1 0 0 条以上的糖胺多糖( g a g ) 链通过共价键连接所构成。 g a g 又称为酸性粘多糖，软骨中的g a g 主要包括透明质酸( h y a l u r o n i ca c i d 或 h y a l u r o n a n ) 、硫酸软骨素( c h o n d r o i t i ns u l f a t e ) 并l l 硫酸角质素( k e r a t a ns u l f a t e ) 等， 其中硫酸软骨素和硫酸角质素等参与构建蛋白多糖。蛋白多糖通过连接蛋白 ( l i n kp r o t e i n ) 以非共价键形式与4 舯长的透明质酸结合形成巨大的蛋白多糖 聚合体( a g g r e g a t e ) ，如图1 8 所示。蛋白多糖聚合体分子链上含有丰富的负酸根 离子，可以结合大量的水形成水凝胶，为软骨提供抗压强度和弹性。水分占软骨 组织全重的7 5 ，其中含有大量正离子以平衡g a g 分子中的负电荷，并含有许 多软骨细胞所需的营养物质和细胞代谢产物。软骨组织内无血管，但由于软骨基 质富含水分，营养物质易于渗透，故软骨细胞仍能获得必要的营养。 软骨组织中的其它非胶原蛋白如锚着蛋白( a n c h o r i nc i i ) 、f n 和t e n a s c i n 等通过与细胞表面受体和其他大分子之间的相互作用将软骨细胞粘连在软骨基 质上，并稳定着软骨基质的结构。 根据软骨基质成分和组织结构的不同，软骨分为透明软骨( h y a l u r o n i c c a r t i l a g e ) 、纤维软骨( f i b r o u sc a r t i l a g e ) 和弹性软骨( e l a s t i cc a r t i l a g e ) 。关节软骨属 于透明软骨，它的特点是纤维含量比纤维软骨和弹性软骨少，而蛋白多糖水凝胶 含量相对增多，软骨基质为透明状。成熟的关节软骨根据其细胞和基质的变化可 分为浅表层，中层，深层和钙化层( s u p e r f i c i a l ，m i d d l e ，d e e p ，a n dc a l c i f i e d ) 。其 中中层和深层中的蛋白多糖含量较高。图1 9 为关节软骨的结构示意图和组织学 显微照片( h e 染色) 。 f i 9 1 8m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fa g 酎e g a t e ，t h eh u g em o