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(分析化学专业论文)羟基磷灰石纳米溶胶凝胶dna修饰电极的制作与应用.pdf.pdf 免费下载
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文档简介
聊城大学硕士学位论文 摘要 脱氧核糖核酸( d n a ) 是一类很重要的生命物质,是大多数生物体遗传信息的载体, 对d n a 的研究是生命科学研究领域中极为重要的内容。随着人类基因组计划的顺利实 施,基于d n a 探制的基因传感器、基因芯片的研究正成为基因组研究的一个热点。无 论是在基因传感器和芯片研究中,还是在其他诸如d n a 与药物小分子的相互作用研究 中,d n a 在基底材料上的固定化都是一个令人感兴趣的课题。羟基磷灰石是脊椎动物 骨骼和牙齿的主要无机成分,因其具有优良的生物相容性而被广泛用作骨修复材料,但 在修饰电极方面的应用还未见报道。 本论文利用溶胶凝胶法制备了纳米多孔羟基磷灰石( h a p ) 聚乙烯醇( p v a ) 溶 胶凝胶混合涂层修饰玻碳电极( g c e ) 用于固定双链d n a ,制备d n a 修饰电极,然后 利用该d n a 修饰电极研究d n a 与一些电活性小分子及药物间的相互作用和检测由 f e n t o n 反应介导的d n a 氧化性损伤。主要内容如下: i d n a 在纳米多孔羟基磷灰石聚乙烯醇涂层修饰玻碳电极上的固定及表征 用溶胶凝胶法在玻碳电极上制备了h a p - p v a 混合材料涂层膜,利用h a p 对 d s d n a 的特异性吸附,将d s d n a 固定在h a p - p v a 混合涂层j 二,制备了一种新型d n a 修饰电极。经实验发现,混合材料中h a p 与p v a 的最佳体积比为2 :1 ,扫描电镜显示 该膜为均匀的纳米多孔结构,颗粒和孔径大小约在5 0 - 1 0 0i l m 之间。以 f e ( c n ) d “。和 c o ( p h e n ) 3 1 3 ”为探针,用循环伏安法证明了d n a 可以牢固地吸附在h a p - p v a 溶胶- 凝胶混合膜修饰的玻碳电极上。重生后的d n a 修饰电极在i c o ( p h e n ) ,1 3 m + 溶液中连续测 量6 次,变异系数为2 1 。相同方法重复制备d n a 修饰电极,5 次测定结果的变异系 数为2 4 。2 4h 后, c o ( p h e n ) 3 ”在d n a 修饰电极上的f p ,约为原来的9 8 ,其稳定 性可以满足一般实验的需要,该电极可用来研究d n a 与其它小分子问的相互作用。 2 电化学方法研究d n a 与电活性小分子之间的相互作用 选择典型活性小y , = t l c o ( p h e n ) 3 r + y 6 1 c o ( b p y ) 3 3 + 来研究与d n a 之间的相互作用。 我们利用h a p p v a 涂层固定d n a 制备的d n a 修饰电极,仅用2p gd n a 样品,即可 得到d n a 与探针分子相互作用的信息。当一= 5 4 6m m 时,从a 层。值可分别推知 i c o ( p h e n ) 3 l ”和 c o ( b p y b 3 懈+ 的氧化态和还原态与d n a 的键合常数之比。结合耳,= 聊城大学硕士学位论文 h 2 f 2 u a l 7 ( 4 r t ) ,可分别i 盘 c o ( p h e n ) 3 3 “2 + 或l c o ( b p y ) j “+ 计算山d s d n a 在h a p p v a 涂层上的吸附量几当溶液离子强度从1 4 6m m 改变到6 4 6m m 时, c o ( p h e n ) 3 3 m + 与 d n a 之间的作用方式从静电作用变为嵌入作用,发生了本质的变化,转折点为= 4 9 m m ,此时静电与嵌入作用处于5 r 衡状态;i - 而 c o ( b p y ) 3 】3 ”+ 与d n a 在1 4 6m m 到7 4 6 m m 离子强度变化范围内一直为静电作用。a 压”与p 成线性关系,可获得截距值,由截 距值可分别得 c o ( p h e n ) 3 “甜和 c o ( b p y ) 3 1 3 ”的氧化态和还原态在零离子强度下与 d n a 的键合常数之比。结果与文献报道的数据完仝或基本致。 3 电化学方法研究d n a 与亚甲基蓝之间的相互作用 采用循环伏安法系统研究了固定在h a p p v a 混合涂层膜上的d n a 与亚甲基蓝 ( m b ) 之间的相互作用。实验结果表明,在2 0 2 0 0m v s 扫描速度范围内,m b 在 d n a 修饰电极上的氧化和还原峰电流与扫速均成线傩关系,说明该电极反应过程系表 面反应控制;在p h6 0 7 4 范围内,m b 在d n a 修饰电极上的氧化和还原峰电位均随 p h 值的增加向负方向移动,且与p h 值基本上成线性关系,由p h 系数知参加反应的电 子数与质子数不同;改变溶液的离子强度,d n a 修饰电极上的f 7 与h a p p v a g c e 上 的e 均l 嗣j i 三方向移动,但足a e o 值却艇木i :没彳r 改变,表明= 粥之i i i j 为静i 乜作用,作 用方式并不受溶液离子强度变化的影响。根据l a n g m u i r 吸附公式,得出m b 与d n a 之间的吸附常数为4 2 1 0 4m 。 4 电化学方法研究d n a 与芦丁之间的相互作用 采用循环伏安法系统研究了d n a 与芦丁之间的相互作用。考察了扫描速度、溶液 p h 值和离子强度对芦丁在d n a 修饰电极上电化学行为的影响。实验结果表明,在5 0 5 0 0m v s 扫描速度范围内,芦丁在d n a 修饰电极上的氧化和还原峰电流的对数与扫速 的对数均成线性关系,i o g v 的系数分别为o 6 6 5 和o 7 3 1 ,说明该电极反应过程同时受扩 散和吸附控制,且扩散控制占主导作用;在p h5 6 7 0 范围内,芦丁在d n a 修饰电极 上的条件电位f 随p h 值的增加向负方向移动,且成线性关系,由p h 系数知参加反应 的电子数与质子数相同;h a p p v a g c e 和d n a h a p p v a g c e 上的f 随离子强度增 大均向正方向移动,但它们之间的相对移动却几乎没有变化,表明二者之间的作用方式 基本上不受溶液离子强度改变的影响。根据d s d n a h a p - p v a g c e 的f 相对于 h a p p v a g c e 的f 。正移,可判断出二者之间为嵌入作用。 聊城大学硕士学位论文 5 d n a 电化学传感器检测d n a 氧化性损伤 心定在电极上的d s d n a 坝伤后,j i c o ( p h e n ) 3 i “+ 的作川减弱, c o ( p h e n ) z ”“的 电化学信号变小。损伤越严重,信号则越小。因此根据 c o ( p h e n ) 。l ”“电化学信号的变 化可判断d n a 的损伤程度。利用该d n a 修饰电极检测了由f e n t o n 反应引起的d n a 的氧化性损伤,并泔 了抗坏m 酸( a a ) 、f e 2 + 和e d t a 浓度对d n a 损伤的影响。结果 显示,在该实验条件下,过量浓度的a at t j j i 速f e n t o n 反应的进行,使d n a 损伤很快 达到极限;损伤试剂中f e 2 + 浓度越大,产生的羟基自由基( o h ) 也就越多,对d n a 的损伤也就越严重;损伤试剂巾e d t a 的浓度越小,溶液中游离的f e 2 + 以及与d n a 键 合的f e 2 + 的浓度则相列越火,对d n a 的损伤也就越严重。结果与其它检测方法一致。 关键词:羟基磷灰石,脱氧核糖核酸,亚甲基蓝,芦丁,氧化性损伤 聊城大学硕士学位论文 a b s t r a c t d n a ( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ) i sag e n e t i cs u b s t a n c eo fa l m o s ta l lo r g a n i s m s t h es t u d y a r o u n di ti so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ts u b j e c t si nl i f es c i e n c e w i t ht h es u c c e s s f u l i m p l e m e n t a t i o no ft h eh u m a ng e n o m ep r o j e c t ( n e g ) ,m a n yr e s e a r c hg o a l sh a v ef o c u s o nt h es t u d yo fg e n i cs e n s o r sa n dg e n i cc h i p s i m m o b i l i z a t i o no fd n ao nm a t r i xi sa n i n t e r e s t i n gs n b j e c ti ng e n i cs e n s o r s ,g e n i cc h i p sa n do t h e rf i e l d ss u c ha st h es t u d yo ft h e i n t e r a c t i o n so fd n aw i t hm e d i c i n em o l e c u l e s h y d r o x y a p a t i t e ( h a p ) ,t h em a i ni n o r g a n i c c o m p o s i t i o no fs k e l e t o na n dt o o t ho fv e r t e b r a t e s ,h a sb e e ne x t e n s i v e l yu s e d a sb o n e r e p a i r i n gm a t e r i a lb e c a u s eo fi t se x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i t y o rb i o a c t i v i t y b u tt h e a p p l i c a t i o nt ot h em o d i f y i n ge l e c t r o d e sh a sn o tb e e nr e p o r t e d i nt h i st h e s i s ,an o v e ld n a - m o d i f i e de l e c t r o d ew a sp r e p a r e db yi m m o b i l i z i n gd s d n a o i lt h eh y d r o x y a p a t i t e ( h a p ) - p o l y v i n y la l c o h o l ( p v a ) c o a t i n gw h i c hw a sp r e p a r e db y s o l g e lm e t h o do hg l a s sc a r b o ne l e c t r o d e ( g c e ) s u r f a c e t h ed n a - m o d i f i e de l e c t r o d e t h e nw a sa p p l i e dt ot h es t u d yo ft h ei n t e r a c t i o n so fd n aw i t he l e c t r o c h e m i c a l - a c t i v e s i i l a l lm o l e c u l e sa n dm e d i c i n em o l e c u l e s ,a n dt h ed e t e c t i o no fd n ao x i d a t i v ed a m a g e m e d i a t e db yf e n t o nr e a c t i o n t h em a i nc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s : 1 s t u d y o ft h ei m m o b i l i z a t i o no fd s d n ao ht h es o l - g e ld e r i v e dn a n o p o r o u s h y d r o x y a p a t i t e - p o l y v i n y la l c o h o lh y b r i dm a t e r i a lc o a t e do ng l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e an o v e lt y p eo fs o l - - g e li n o r g a n i c - o r g a n i ch y b r i dm a t e r i a lc o a t e do ng c ew a su s e df o r i m m o b i l i z a t i o no fd s d n ab a s e do nt h es p e c i f i ca d s o r p t i o no fl l a n oh a pt od s d n a t h e h y b r i dm a t e r i a lc o a t i n gw a sp r o d u c e db ys o l g e lm e t h o dw i t hn a n oh a p - p v a t h e o p t i m u mc o m p o s i t i o no ft h eh y b r i dm a t e r i a lw a sf i r s te x a m i n e d ,a n dt h em o r p h o l o g yo f t h en a n o h a p - p v ac o a t i n g s w e r ei n v e s t i g a t e dw i t ht h eh e l po fs c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e ( s e m ) t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h ed s d n a h a p - p v a g c ew e r es t u d i e db y c y c l i cv o l t a m m e t r y ( c u s i n gt h ep r o b e so fl c o ( p h e n ) 3 1 3 ”+ a n di f e ( c n ) s 3 柞t h e r e s u l t si n d i c a t e t h a tt h ed s d n ac a ub ei m m o b i l i z e do nt h en a u op o r o u sh a p - p v a c o a t i n ge f f e c t i v e l ya n di t ss t a b i l i t yc a ns a t i s f yt h en e c e s s i t yo fs t u d yo ht h ei n t e r a c t i o n so f d s d n aw i t hr e d o x a c t i v em o l e c u l e so nt h ee l e c t r o d es u r f a c e 5 聊城大学硕士学位论文 2 e l e c t r o c h e m i c a is t u d yo ft h ei n t e r a c t i o n so fd s d n aw i t he l e c t r o c h e m i c a l - a c t i v e m o l e c u l e s c o ( b p y ) 3 i 3 + a n di c o ( p h e n ) 3 3 + w e r es e l e c t e da st h em o d e lm o l e c u l e st os t u d yt h e i n t e r a c t i o n so fd s d n aw i t he l e c t r o c h e m i c a l a c t i v em o l e c u l e s s o m ei n f o r m a t i o nc a nb e o b t a i n e du s i n go u rp r e p a r e dd s d n a h a p p v a g c ew i t ho n l ya b o u t2p gd n a s a m p l e s a tp = 5 4 6m m ,ar a t i o t o x k r 。do ft h eb i n d i n gc o n s t a n tf o rt h eo x i d i z e da n dr e d u c e d f o r m so f c o ( p h e n ) j 1 3 + 7 2 + a n d c o ( b p y ) 3 r + 7 2 + w i t hd n ac a l lb ee s t i m a t e df r o i na e “7v a l u e , r e s p e c t i v e l y t h ea m o u n to fd s d n aa d s o r b e do nt h eh a p - p v a g c ec a na l s ob e e s t i m a t e dw i t ht h ef o r m u l a ,p r = n 。州j t ( 4 r 乃w h e nt h ei o n i cs u e n g t h so ft h es o l u t i o n v e r ec h a n g e do v e rt h er a n g eo fi4 6 6 4 6m m t h en a t u r eo ft h ei n t e r a c t i o no fd n a w i t h c o ( p h e n ) 3 1 3 ”+ h a dc h a n g e d a t = 4 9m m ,e l e c t r o s t a t i c a n di n t e r c a l a t i v e i n t e r a c t i o n sw e r ee q u i v a l e n t a t ,l 4 9 m m i n t e r c a l a t i o nw a sd o m i n a n t t h en a t u r eo ft h ei n t e r a c t i o n so fd n aw i t h c o ( b p y ) 3 1 3 + 8 + w e r ea l w a y se l e c t r o s t a t i cd u r i n gt h ei o n i cs t r e n g t h so ft h es o l u t i o nw e r e c h a n g e do v e rt h er a n g eo f1 4 6 7 4 6m m a e ”b a dl i n e a rr e l a t i o n s h i p sw i t h 1 7 2f o r c o ( p h e n ) 3 j 3 + ,”a n d c o ( b p y ) 3 j 3 埘f r o mt h ei n t e r c e p tv a l u e s ,t h e “l i m i t i n g v a l u e so f k 3 十o 忆+ 。c o u l db ed e r i v e da t = 0 t h er e s u l t so b t a i n e db yt h ep r e s e n tm e t h o da r eq u i t e o ra p p r o x i m a t ec o n s i s t e n tw i t ht h o s eo b t a i n e db yo t h e rm e t h o d s 3 e l e c t r o c h e m i c a ls t u d yo ft h ei n t e r a c t i o no fd s d n aw i t hm e t h y l e n eb l u e t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm e t h y l e n eb l u e ( m b ) a n dd s d n ai m m o b i l i z e do nt h e h a p p v af i l mw a si n v e s t i g a t e db ym e a n so fc v r e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e d o xc u r r e n t s o fm ba td n am o d i f i e de l e c t r o d eh a dl i n e a rr e l a t i o n s h i p sw i t hs c a nr a t e s ( f r o m2 0t o 2 0 0m y s ) ,a se x p e c t e df o ras u r f a c e - c o n t r o l l e dp r o c e s s t h ea n o d i ca n dc a t h o d i cp e a k p o t e n t i a l sb o t hs h i f t e dn e g a t i v e l yw i t hi n c r e a s eo ft h ep hv a l u e so fp b s ( f r o m6 0t o7 4 1 a n dh a dl i n e a rr e l a t i o n s h i p sw i t hp hv a l u e s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tt h e i n t e r a c t i o no fd n aw i t hm bw a se l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o na n dd i d n ta f f e c t e d b y c h a n g i n gi o n i cs t r e n g t ho fp b s ,a l t h o u g ht h ef o r m a lp o t e n t i a l 怛“) a td s d n a h a p - p v a g c ea n dh a p - p v a g c eb o t hs h i f t e dt ot h ep o s i t i v ev a l u e sw i t h i n c r e a s i n gi o n i c s t r e n g t ho f s o l u t i o n t h eb i n d i n gc o n s t a n to fm bt od n aw a sc a l c u l a t e dt ob e4 2 1 0 4 m a c c o r d i n g t ol a n g m u i ra d s o r p t i o nf o r m u l a 6 聊城大学硕士学位论文 4 e l e c t r o c h e m i c a ls t u d yo ft h ei n t e , a c t i o no fd s d n aw i t hr u t i n t h ei n t e r a c t i o no fr u t i nw i t hd s d n ai m m o b i l i z e do nt h e h a p p v af i l m w a s i n v e s t i g a t e db ym e a n so fc v t h ee f f e c t so fs c a ur a t e ,p hv a l u ea n di o ns t r e n g t ho ft h e s o l u t i o no ne l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro fr u t i na t d s d n a h a p p v a g c ew e r ea l s o e x a m i n e d r e s u l t ss h o w e dt h a tt h el o gih a dl i u e a rr e l a t i o n s h i p sw i t hl o gv ( f r o m5 0t o 5 0 0 m v s ) ,t h ee l e c t r o d ep r o c e s sw a sc o n t r o l l e ds i m u l t a n e o u s l yb yd i f f u s i o na n d a d s o r p t i o n ,a n dt h ed i f f u s i o np l a y e dnm a i nr o l e t h ef o r t u a l p o t e n t i a l s h i f t e d n e g a t i v e l yw i t hi n c r e a s eo ft h ep hv a l u e s ( f r o m5 6t o7 0 ) a n dh a dl i n e a rr e l a t i o n s h i p w i t hp hv a l u e s i n t e r c a l a t i o nm o d e lb e t w e e nr u t i na n dd n ac o u l db ec o n c l u d e df r o m t h er e s u l tt h a tea td s d n a f h a p - p v a g c es h i f t e dp o s i t i v e l yc o m p a r e dw i t ht h a ta t h a p - p v a g c e t h ei n t e r a c t i o nm o d eo fd n aw i t hr u t i nw a sh a r d l ya f f e c t e db y c h a n g i n gi o ns t r e n g t ho fp b s 5 t h ea p p l i c a t i o no fd n ae l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rt od e t e c t i o no fd n ao x i d a t i v e d a m a g e t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n c o ( p i m o j l 3 + 7 ”a u dd s d n ai m m o b i l i z e do ut h ee l e c t l o d e s u r f a c ew o u l db e c o m ew e a kw h e nd s d n aw a sd a m a g e d ,a n dt h u sp r o d u c es m a l l e l e c t r o c h e m i c a ls i g n a lo f c o ( p h e n ) 3 1 3 + 2 + t h em o r ed e e p l yd a m a g e dd n aw e r e ,t h e s m a l l e rt h ee l e c t r o c h e m i c a ls i g n a lo f c o ( p h e n ) 3 1 3 + “+ b e c a m e s o , c o ( p h e n ) 3 】3 + 璧+ c o u l d b eu s e da sap r o b et od e t e c to x i d a t i v ed a m a g ed e g r e et od s d n am e d i a t e db yf e z + f e n t o nr e a c t i o n t h ee f f e c t st h ec o n c e n t r a t i o n so fa a ,f e 2 + a n de d t aw e r ed i s c u s s e d , r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t sc l e a r l yi n d i c a t e dt h a tt h ed n ad a m a g ec o u l db ea c c e l e r a t e d w i t ht h ep r e s e n c eo fe x c e s s i v ea m o u n to fa ai nt h i se x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n t h el o w e r t i l ec o n c e n t r a t i o no fe d t aa n dt h er e l a t i v eh i g e rc o n c e n t r a t i o no ff e 2 + i l lt h ef e n t o n r e a c t i o ns o l u t i o nw e r e ,t h em o r eo h w o u l dp r o d u c e ,a n dt h e nr e s u l t e di nt h ed e e p e r d a m a g et od n a t h er e s u l t sw e r ec o n s i s t e n tw i t ho t h e rm e t h o d k e y w o r d s :h y d r o x y a p a t i t e ,d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) ,m e t h y l e n eb l u e ,r u t i n , o x i d a t i v ed a m a g e 7 聊城大学硕士学位论文 前言 自1 9 7 5 年化学修饰电极问世以来,它就突破了传统电化学中只限于研究裸电极 电解液界面的范围,开创了从化学状态上人为控制电极表面结构的领域,从而成为当 前电化学、电分析化学的前沿领域。化学修饰电极可在电极表面进行分子设计,将具 有优良化学性质的分子、离子和聚合物等设计固定在电极表而,使电极具有某种特定 的化学和电化学性质,丰富了电化学的电极材料,扩展了电化学的研究领域。目前已 应用于生命科学、环境科学、能源科学、分析科学、电子。产以及材料科学等诸多方面。 脱氧核糖核酸( d n a ) 是一类很重要的生命物质,是绝大多数生物体遗传信息的 载体,对d n a 的研究是生命科学研究领域中极为重要的内容。随着人类基因组计划的 顺利实施,基于d n a 探针的基因传感器、基因芯片的研究_ e 成为基因组研究的一个热 点。无论是在基因传感器和芯片研究中,还是在其他诸如d n a 与药物小分子的相互作 用研究中,d n a 在基底上的固定化都是一个令人感兴趣的课题。 随着材料科学和纳米科学的迅猛发展,把纳米材料引入化学修饰电极领域将推进 生命科学的研究迈上一个更高的台阶。本论文将羟基磷灰石纳米溶胶引入化学修饰电 极材料的行列,用于d n a 的固定,制备d n a 修饰电极,并将制备的d n a 修饰电极用 于研究d n a 与一些电活性小分子及药物问的相互作用,检测l nf e n t o n 反应所导致的 d n a 氧化性损伤及探讨d n a 的损伤机理等。 限于作者水平,本文难免存在不少缺点和错误,敬请各位专家批评指正。 王桂香 2 0 0 5 年4 月 聊城大学硕士学位论文 第一章绪论 d n a 作为绝大多数生物体遗传信息的载体,在生长、发育和繁殖等生命活动中起 着重要的作用,已成为现代生物学和医学研究的重要内容之一。 分子生物学和分子药理学的发展使人们能够从基冈水平理解某些生命现象,并通 过分子设计来寻找灵敏的核酸探针和有效的治疗药物。一方面,d n a 靶向化合物成为 很重要的核酸探针选择对象。另一方面,l 临床上使用的许多抗癌药物都以d n a 为作用 靶点,通过与癌细胞d n a 发生相互作用破坏其结构,进而影响基因调控与表达功能, 袭现山抗癌活性;一些致癌物也能与d n a ) p 4 , 蛇) j l l 合物,这利- d n a 加合物血是可能癌 变的预警标志物。因此,小分子与d n a 的相互作用的研究不仪有利于探索和开发新的 核酸探针,而且有助于从分子水平上了解抗癌药物的作用机理,阐明有毒物的致癌、 致畸的分子生物学机理,为设计临床上更为有效的抗癌药物提供理论指导。 众所周知,各利- 物理和化学试剂( 如紫外线,离子化辐射和光活性染料等) 可以 造成d n a 损伤,这利损伤可以导致有害的基因突变,细胞坏死甚至引发癌症。因此发 展准确快速检测d n a 损伤的方法是当前核酸分析的热门课题,引起了分析化学家们的 极火兴趣。 1 1 脱氧核糖核酸的结构与性质o l d n a 是由很多单体组成的线性大分子,基本结构重复单元是脱氧核苷酸,其组成 结构如下图所示: r 磷酸 d n a 脱氧核苷酸r d 2 一脱氧核糖 l 脱氧核苷r 腺嘌呤 ( a ) l 碱基l鸟嘌呤 ( g ) 1 胞嘧啶 ( c ) l胸腺嘧啶( t ) d n a 分子所具有的独特的双螺旋链状结构赋予了它许多独特的性质,下面将对其中一 些与本论文工作有关的性质进行介绍。 1 1 1d n a 的物化性质4 i 1 1 1 1d n a 的紫外吸收 由于嘌呤和嘧啶碱残基中含有共轭双键结构,所以d n a 具有强烈的紫外吸收性质, 聊城大学硕士学位论文 其最大吸收波长在2 6 0n m 处,而与其混合的蛋白质的紫外吸收最人吸收波长在2 8 0a m 处。因而可通过测定2 6 0n i n 和2 8 0a m 处的吸光度值,利川它们的比值来估计d n a 样 品的纯度。当a 2 6 0 a 2 8 0 的比值大于1 8 时,d n a 样品的纯度较高。同时,可利用比尔 定律对d n a 溶液中核苷酸的摩尔浓度进行估算,d n a 在2 6 0n m 处的摩尔吸光系数占 为6 6 0 0 m 1 c m i s l 。 1 i 1 2d n a 的酸碱性质 d n a 的多核苷酸长链是通过磷酸利戊糖的3 ,5 碳相连而成的,构成d n a 双螺旋 结构的两条长链的两端各不相同,它们走向相反,并以链上的碱基相互配对结合。当 溶液的p h 值高于4 时,多核苷酸分子呈多阴离子状态。碱基对之间氢键的性质与其离 解状态有关,而碱基的离解状态又与p h 值有关,因而溶液的p h 值直接影响d n a 双 螺旋结构中碱基对之间氢键的稳定性。对d n a 而言,碱基对之间的氢键在p h 4 0 1 1 0 之问最稳定,酸性和碱性过强均会导致双链解旋或d n a 变性。 1 1 2d n a 的结构 虽然d n a 分子的形状和大小多利多样,但是它们的主要成分都是由四种基本碱基 组成的脱氧核苻酸,其基本结构也存在许多共同特点。 1 i 2 1d n a 的一级结构”i 所谓d n a 的一级结构就是指组成d n a 的诸脱氧核苻酸 之间连接的性质以及它们在d n a 分子中的排列顺序。如左 图所示,通过y , 5 磷酸二酯键,若干个核苷酸可以成链状连 接起来。当连接起来的核苻酸数少于2 0 个时,通常称作为寡 聚核苷酸或低聚核苷酸( o l i g o n u c l e o t i d e ) ,当更多的核苷酸 连接起来时,就称作为多核苷酸( p o i y n u c l e o t i d e s ) 。大多数 天然多核苷酸长链的两端,总有一端的脱氧核糖带有自由的 5 ,磷酸,称为5 ,端;另一端的脱氧核糖带有自由的y - 羟基, 称为3 ,端。从5 端到3 端的脱氧核苷酸的排列顺序,通常u l i 做d n a 序列( s e q u e n c e ) 。 1 1 2 2d n a 的二级结构 1 0 - 1 2 i 聊城大学硕士学位论文 所谓d n a 的二级结构即w a t s o n 和c i i c k 所提出的著名的d n a 双螺旋分子模型( 即 标准的b d n a 结构) ,如下同所示。b d n a 是m 两条反向平行的多核苷酸链围绕着同 一个中心轴构成的双螺旋结构。由脱氧核糖和磷酸基组成的:卜链的骨架处在螺旋的外 侧,由于糖和磷酸根的化学性质,d n a 主链的骨架是亲水性的。而嘌呤和嘧啶碱基处 于螺旋的内侧,其杂环上的酮基、氨基和杂环氮原子之间形成氢键,在碱基a 和t 之 间,可形成两个氢键,在g 和c 之问,可形成三个氢键,使得两条链成互补关系,即 d n a 是借助两条链上相对的碱基之问形成的氧键所维系的、有规则的双链结构。碱基 互补配对是d n a 双螺旋结构的主要特征。只要一条链上的碱基序列确定,另一条互补 链的碱基序列也就随之被确定了。这种互补关系是d n a 分子复制过程的关键,构成了 分子生物学中心法则的基础。另外,沿螺旋轴向观察,两条主链和碱基并没有充满双 螺旋的全部空间,在双螺旋表面形成两条凹沟,但一条沟深丽宽,叫大沟槽( m a j o r g r o o v e ) ,另一条浅而窄,n u 小沟槽( m i n o rg r o o v e ) 。双螺旋表面的沟槽对研究d n a 与其它物质的作用是很重要的,因为只有在沟槽内才能接触到碱基的序列,特别是大 沟槽携带了其他分子能阅读的信息( 碱培序列) 。 1 1 2 3d n a 的三级结构i ”j d n a 的三级结构指的是d n a 双螺旋的进一步扭曲。d n a 的三级结构包括线状双 链巾可能有的扭结和超螺旋,多重螺旋和分予内单链形成的环以及环状d n a 中诸如结、 5 聊城大学硕士学位论文 超螺旋和连环等的各种拓扑学状态。其中,超螺旋是d n a 三级结构中的最常见形式。 1 1 3 d n a 的变性、复性1 1 3 , 1 4 1 1 1 3 1d n a 的变性 所谓d n a 的变性( d e n a t u r a t i o n ) 就是指由加热、强酸或射线以及一切可以破坏 d n a 氢键的处理导致的d n a 双螺旋结构解开的过程。随着变性过程的进行,d n a 的 物化性质和生物功能都会起显著变化,最重要的徙现就足紫外吸收的急l | :i j j 竹加,u d n a 的增色效应。当将天然d n a 溶液加热时,最大紫外吸收( 4 2 6 0i l l l l ) 在升高到某一温 度前( 8 0 。c 左右,确切的温度取决于d n a 的碱基组成) 维持不变,在这一温度处, 吸光度在很窄的范围内急剧增加约4 0 ,接着是一个平坦的区域。吸光度的增加与两 条链的分离相一致,在吸光度升高约4 0 以后,线状d n a 的两条链完全分开。以温度 作横坐标,2 6 0i l n l 处相对吸光度为纵坐标作图所得到的曲线称为熔解曲线;而当增色 效应达到最大值的5 0 时的温度称为d n a 的熔解温度t 。 1 1 3 2d n a 的复性 当导致变性的因素解除后,因变性而分丌的两条单链还可再聚合成原来的双螺旋 结构,其原有性质也可得到部分的恢复,这就是d n a 的复性( r e n a t u r a t i o n ) 。d n a 的复性主要受三利一因素的制约:( 1 ) 浓度:d n a 浓度较高时,两条互补链彼此相碰的 几率增加,易于复性;( 2 ) 温度:d n a 热变性n 寸,当温度超过t i 。后,如果将溶液迅 速地冷却,不能复性,但当溶液维持在t n 以下的一个较高温度时,则可能复性,一般 比t l 。低2 5 。c 左右时最佳;( 3 ) d n a 片段的大小:大片段的d n a 扩散速度受到妨碍, 减少了发现正确的互补序列的机会,因此,其复性比小片段d n a 困难。此外,缓冲底 液的离子强度、p h 值等对d n a 复性也有一定的影响。 1 2 脱氧核糖核酸在电极表面的固定化研究进展 1 2 1 固定d n a 的基底电极的分类 根据基底电极的不同,可分为以下两类:第一、汞电极,主要是悬汞电极( 1 i l d e ) i 第二、固体电极,常用的固体电极有金电极( a u ) 、玻碳电极( g c e ) 、碳糊电极( c p e ) 和热解石墨( p g e ) ,其中以玻碳电极和金电极应用最多。 电化学分析方法在检测d n a 的完整性
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