（植物病理学专业论文）稻瘟病菌基因表达的表达序列标签和cDNA阵列检测研究.pdf

稻瘟病菌基因表达的表达序列标签和c d n a 阵列检测研究 摘要：稻瘟病菌 如矽印o r 抽p 蠡g n 引起重要水稻病害。稻瘟病互作系统作为真菌一植 物互作分析的模式系统被广泛地研究。目前，研究重点主要集中在稻瘟病菌致病相关发 育特别是附着胞的诱导、形成和成熟及其信号传递途径对基因的表达和调控等方面。本 文构建了稻瘟病菌的表达序列标签( e s n 数据库，并且利用本实验室保存的稻瘟病菌独 立克隆制备的c d n a 阵列进行了病菌不同发育时期和依赖脚缓朋m a p k 信号转导途径 相关基因缺失突变体中基因表达谱的检测。 1 本文构建了稻瘟病菌菌株y 3 4 菌丝、孢子、疏水表面诱导2h 、8h 、2 0h 和3 0h 的芽管、 幼附着胞、不同成熟附着胞等六个发育时期的c q a 混合文库。从这个文库中获得 1 3 0 5 7 条3 e s t s ，拼接出4 7 5 6 个假定独立转录本( n 月s ) ，包含9 6 1 个c o n t i g s 和3 7 9 5 个 s i n m e t o n s 。在全部拼接出的t u t s 中，根据b l a s t x 搜索结果，2 3 3 9 个t u t s 为稻瘟病 菌未知基因( e 1 0 “5 ) ，剩余的2 4 1 7 个t u t s 为功能注释基因，其中3 6 个注释t u t s 描述 为稻瘟病菌功能蛋白。b l a s t n 结果显示，菌株y 3 4 有7 6 3 个t u t s 与菌株7 0 一1 5 基因组 序列不能匹配( e 1 0 。) ，表明稻瘟病菌不同菌株基因间存在较大差异。 2 利用上述稻瘟病菌e s t 数据库制各了含4 1 0 8 个独立克隆的稻瘟病菌c d n a 阵列，用这 些c d n a 阵列检测病菌上述六个发育时期的基因表达谱，c v b c r t 程序共鉴定出5 1 1 个 差异表达基因( ， 2 ) 。定量p c r 分析检测了4 个差异表达基因和1 个 无差异表达基因在这6 个发育时期的表达丰度，验证了c d n a 阵列数据的可靠性。 国n a 阵列分析表明，以菌丝或孢子为参比，在稻瘟病菌孢子萌发后的发育过程中， 大量基因上调表达，其中主要集中在附着胞成熟时期。仅在菌丝和孢子中差异表达 的基因分别有4 6 个和l o 个，在附着胞的诱导、形成和成熟等发育时期中，剩余差异 表达基因主要呈现7 种表达谱类型。在病菌不同发育时期，分别鉴定出许多重要的差 异表达基因( m 8 铲a p o r t l l ec 君p ? ，c y p j ，删g 磅p 豫露? ，膨p g j 和y e a s t 期弦， p r o t e m y r o s i n ep h o s p h a t a s eg c n ee t c ) 的同源基因。 3 用含4 1 0 8 个稻瘟病菌独立克隆的c d n a 阵列检测四个稻瘟病菌爿皤，m a p k 途径相 关基因脚巧d 、埘刀j 、脚r 7 和捌皤，分别缺失的突变体及其野生型菌丝的基因表达 谱。以野生型为参比，在突变体聒0 、m j 、m 盯7 和p m 船中分别鉴定出8 6 个、6 0 个、1 5 1 个和2 6 4 个显著差异表达的基因( p 2 ) 。定量p c r 验证了c d n a i i 阵列数据的可靠性。在四个突变体中仅发现3 个基因都显著差异表达，包括共同上调 表达的葡萄糖抑制基因( g 慵，) 。调节基因j = l 拈巧碓失主要导致基因上调表达，包 括跨膜蛋白、r a s 相关蛋白等信号传递相关基因，表明该基因还参与其它信号传递过 程。级联通路组分基因 舔几j 、 据r 7 和p ，分别缺失导致3 0 个基因都显著差异表 达，其中2 8 个是下调基因，表明m a p k 途径的 舔 ，扎舔，7 一p 缓j 级联通路在菌丝发 育过程中确实存在，并以正调控基因的表达为主。这三个组分基因缺失还分别导致 不同基因的差异表达，尤其在突变体芦m 纠中，发现一些调控胁迫反应的信号传递过 程有关的转录因子( 锌指蛋白和胁迫反应元件结合蛋白等) 上调表达。因此，在翩硝j m a j p k 途径各组分位点上还存在不同信号转导支路途径，调控不同的代谢和生物学 过程，在组分脓位点，病菌胞内的不同信号途径间可通过尸脱k z 相互作用。基因 表达的聚类分析和定量p c r 检测表明，稻瘟病菌菌丝发育过程中，依赖p 艇，的 m a p k 信号转导途径的相关基因至少存在两种表达模式，主要通过 嬲巧d 和捌幽( 位 点，存在p 掰，m a p k 和与其它信号途径问的相互作用。 关键词：稻瘟病菌，表达序列标签，c d n a 阵列，检测，发育，m a p k 信号转导途径， 突变体 h i s t u d yo ng e n ee x p r e s s i o ni n z 醒印( p d r j 协pg s p 口b ye x p r e s s e d s e q u e n c et a g sa n dc d n aa h a ym o n i t o m g a b s t r a c t ：t h e 缸1 9 1 1 s 脚印d ，所8g 胁e 以c a u s e sa 1 1i m p o r t a n tr i c eb l a s t t h er i c eb l a s t p a m o s y s t e i i la sam o d e ls y s t e mf b r 劬g u s - h o s ti n t e m c t i o nh a sb e e ni n v e s t i g a t e di n t e n s i v e l y n o ws t 【l d i e so np a t h o g e n i c i t yo f 也ef 嘶g u sh a v ef o c u s e do na p p r e s s o r i 岫i 1 1 i t i a t i o n ， f o r n l a t i o na n dm a 札珊t i o na n dt 1 c i rd e v e l o p m 锄tr e g u l a 曲nb yc e l ls i 鲫a l 抽g r i 陆ss t u d y c o n s t n l c t e da ne x p r e s s c ds e q u e n c et a g ( e s t ) d a t a b a s eo f mg r 括e n w i l l lt h ep r e p a r e dc d n a a r r a y sc o n t a i l l i n gu 1 1 i q u ed o n e so fm 矿打g ，w ed e t e c t e dt l l ee x p r e s s i o np r o f i l e so fm e 如n g u sa td i 疵r e l l td e v e l o p m e n ts t a g e sa i l dg c n ee x p r e s s i o no f 廿1 em u t a n t sd e f 色c t i v ei n m i t o g e l l 一a c t i v a t e dp r o t e i n 虹m s e ( m a p k ) s i 印a 1t 眦s d u c t i o np a 出w a y 1 1 m i ss t u d yh a sc o n 8 帆c t e dam i x e dc d n a1 i b r a r yw i t hr n as a n l p l e s 丘d mm y c e l i a c o n i d i a ，g e mn i b e s( 2 ho nh y d r o p h o b i cs u r f a c e s ) ，y o 硼ga p p r e s s o r i a ( 8ho n h y d m p h o b i c 叫由c e s ) ，d i 日b r e n tm a t l l r ea p p r e s s o aa t2 0ha i l d3 0ho nh y d r o p h o b i c s u m c e so f mg 加8 日y 3 4 f r o mt h i sc d n al i b r a r yt o t a l l 3 0 5 7e s t so f m e3 7 e n d sw e r e o b t a i n e da 1 1 dh a v eb e e ns u b m i t t c df 研d b e s to fn c b i t h e s ee s ts e q u e n c e sa s s e i l l b l y o u t4 7 5 6t e n t a t i v eu n i q u et r a i l s 谢p t s ( t u t s ) i n c l u d i n g9 6 1c o n t i g sa i l d3 7 9 5s i n g l 咖n s a m o n gm e m ，出e r ew e r e2 3 3 9t u t sw i t l ln ob l a s t xh i t s ( e 1 0 ) a n d2 4 1 7a n i l o t a t e d t u t s a m o n g t h e s ea n n o t a t e dt u t s ，o n l y3 6t u t sw e r ca n n o t a t e da sg e i l e so f mg 廊8 口 b l a s t hs e a r c hi n d i c a t e s 出a t7 6 3o f 4 7 5 6t u t so f m 肼，棚y 3 4c o u l dn o tb em a t c h e d i ng e n o m es e q u e n c e so f mg m 已口7 0 一1 5 ( ev a l u e 1 0 j ) 2 w i 也t h ea b o v et h ee s td a t a b a s ew ep r e p a r e dc d n aa r r a yc o n t a i l l i n g4 1 0 8u 1 1 i q u ed o n e s o fmg r 括阳w 曲t h ec d n aa r r a y s ，w ed e t t c dg 跖ee x p r e s s i o na t 曲o v es 政 d e v e l o p m e l l ts t a g e so f mg 廊阳t 0 t a l5 l ld i f i h e n t i a l l ye x p r e s s c dg e n e sw e r ei d e n t i 6 e d 锄o n ga 1 1 yt 、od e v e l o p m e n ts t a g e sb yp r o 掣锄c y b e 卜t ( p 2 ) t h e r e l i a b i l i 够o fc d n aa r r a yd a t aw a sc o n 6 m e db yq u a n d 切廿v er e a l - 劬er t - p c r ( q p c r ) a n a l y s i s c o m p a r e d 丽t 1 1m y c d i ao rc o n i d i a ，a1 a r g en 硼心e ro fg 锄e ss h o w e dk 曲- l e v e l e x p r e s s i o d l 埘n ga p p r c s 8 0 幽i 1 1 i t i a t i o n ，f o n a t i o na 1 1 dm a t u r a d o n ，m o r eg e n e ss h o w e d d i 丘柏1 f i a le 耳惴s i o ni na p p r e s s o u mm a t u r a t i o nt h 锄a p p r e s s o 打u md i 圩醯e n t i a t i o n n e r ew e r e4 6a 1 1 d1og e n e ss b o 耐n ge s p c d a l l yd i 胁e 址i a l 唧r e s s i o ni nm y c e l i aa n d c o l l i d i ar e s p e c t i v e l y s e v e l le x p r e s s i o np a t t e r n sw e r ec l u s t 日e da n d 鼬e ra i l a l y s e da t g e r mt u b e s ，y o u n ga p p r e s s o r i aa i l dm a n l r e 印p r e s s o r i ac o m p a r e dw i mc o n i d i a t h i ss t l l d y a l s oi d e n t i f i e d h o m 0 1 0 9 u e so f m a n yi m p o r t a n tg e n e s ( m a g n a p o n h e p j ，c 印，心 p z 聊，朋p g a n de a s t 卯，p r o t e i n 研o s i i l ep h o s p h a t a s eg e n ee t c ) a td i f ! 【确t d e v e l o p m e n ts t a g e so f mg ，括e 口 3 1 1 1 e s ec d n aa r r a y so fmg r 妇砌w a sa l s ou s e df o rs t t l d y i n gg e n ee x p r e s s i o ni nt h e m y c e l i ao ff 0 1 l rg e n ed e l e t i o nm u t a n t s ( 船巧d ，聊盯j ，脚a 1 1 dp m 肼) ，w 1 1 i c hi n v o l v e di n m a p ks i 弘a lp a m w a yc a s c a d e s c 0 n l p a r e dw i mw i l d 脚e s ，d i 脑e n t i a l l ye x p r c s s e d g e i l e sw e r ei d e l l t 施e dr e s p e c t i v e l yi nm u t a i l t s 粥巧d ，m s ，鄹a 1 1 dp m 肼( p 2 ) ，a n dm e 锄o u mo f d i f f 醯吼t i a l l ye x p r e s s c dg e n e sw a sl a r g e s ti nt h e p m 加t h e r e l i a b i l i t yo fc d n aa h 谊yd a t aw a sc o n 6 n n e db yq _ p c ra n a l y s i s g 1 u c o s er e p r e s s i b l e g e n ew a sf o u n du p r e g u l a t e d 血a 1 1f 0 1 l rm m a n t s g e n e sm a i n l yd i s p l a y e du p - r e g u l a t e d e x p r e s s i o ni nm u t 越t 粉西d ，i n d u d i n gg e l l e se n c o d i n gi n t e g r a lm e m b r 柚ep r o t e i n ， r a s - r e l a t e dp r o t 咖i i l v o l v e di nc e l ls i g n a l l i n g i ti n d i c a t e dt h a tr e ”1 a t o r yg e n e 船巧d m i 曲ta l s op a n i c i p a t ei no t h e rc e l ls i 印a 1 1 i n gp a 曲w a y s 1 1 1 ed i s m p t i o n so f c a s c a d e sg e l l e 且豁 ，懈，7 ，删r c s p e c 石v e l y c o u l dl e a dt ol es a m e3 0 g e n e sc x p r e s s e d d i 饪打e 1 1 t i a l l y i nm u t a n t s ，i n c l u d i n g2 8d o w n - r e g l l l a t e dg e n e s i ti n d i c a t e d 山a tt 1 1 e 岱 砒s 丁7 一p 艘c a s c a d e sp l a yar 0 1 ei nm y c e l i u md e v e l o p m e mo fm 如口d b u t t h e r ew e r es o m ed i 虢r e mg e n e se x p r e s s e dd i 行h e 商a l l ymm u t a n t sm “，舢疗a i l d 册盯 r e s p e c t i v e l y e s p e c i a l l yi n m u t a l l tp m 触，t h e r ew e r es o m eu p _ r e g u l a t e d 仃a n s 嘶p t i o n f a c t o r s ( z i n cf i n g e rp r o t e m ，s t r e s sr e s p o n s ed 锄e n tb i n d i n gp r o t e i na 1 1 dc t c ) i n v 0 1 v e di n c e l ls i 印a l i l l gr e g i l l a t i n gs 仃e s sr e s p o n s e i ti n d i c a t e dt l l a tt h e r ew a sb r a n c hp 劬w a yo fc d l s i 印a l i n gt l l r 伽曲s o m eg e n e si n v o l v e d i np 缓jm a p kp a t b w a yo fmg m 鲥 h i e r a 耐l i c a lc l u s t e r i n ga n dq p c ra n a j y s i si n d i c a t e dt h e r ew e r ea t1 e a s tt w ob ，p e so f g c e e x p r e s s i o nc h a l l g e sd u 血培m 掰，m a p kp a f h w a yr e g u l a t i n gm y c e l i u md e v e l o p m e n t i t w a 8a l s od e d u c e dt l l a tt l l e r e 面曲tb e “c m s s t a 眦b 咖e c np 饭fm a j p kp 砒1 w a ya i l d o 血e rs i 印a l i n gp a i h w a y st 1 1 r o u 曲g e n em 缎a 1 1 d 埘巧do f mg m 阳 k e yw o r d s ：删细印d r 咖eg r 括e ，e x p r e s s e ds e q u 衄c et a g s ，c d n aa “a y ，m o 血t o r i n 岛 d c v e l o p m e l l t ，m a p ks i 弘a 1 仃a n s d u c t i o np a t h w a y m u 协t s v 致谢 本工作在浙江大学生物技术研究所李德葆教授和董海涛博士领导的生物信息与基 因网络研究组完成，本研究受国家“8 6 3 ”计划项目州o 2 0 0 2 b a 7 1 1 a 1 5 ) 资助。首先， 特别感谢我的导师李德葆教授倾注的无限心血和谆谆教诲。导师严谨的治学态度，高风 亮节的师德风范，渊博的知识和高瞻远瞩的敏锐洞察力都使我终身受益。还要特别感谢 董海涛博士在试验设计、实施和论文撰写过程中的全力指导和支持。董海涛博士废寝忘 食的敬业精神，勇于创薪的开拓能力，求真务实的科学态度，灵活多变的思维方式和幽 默服人的沟通技巧永远值得我学习。 还要特别感谢中国水稻研究所郑康乐研究员和广西大学陈保善教授在实验设计和 论文写作中的宝贵指导意见。非常感谢中国农业大学彭友良教授和美国普渡大学的许金 荣先生提供的稻瘟病菌菌株。感谢美国国立生物技术信息中心( n c b i ) 的陈雄风研究 员在e s t 数据处理和提交方面的帮助。真诚感谢生物信息与基因网络研究组的其它成员 的无私帮助和精诚合作。他们是：邵菁、娄沂春、赵东、戴承恩、方永启、王珂、史文 琴等老师以及邓晔、梁慎、姜玉新、郭小勤、王炎钦、曾志林、王晟和已经毕业的庄晓 峰、张峰、王丽华、蒙托罗、桑德拉、张海燕、于凤池、王兵等朝夕相处的同学。还感 谢生物所后楼真菌实验室的林福呈教授、王洪凯研究员、卢建平博士、王教瑜博士以及 刘小红、董波、刘同宝、刘朋娟等同学在稻瘟病菌培养方面的大力支持和真诚帮助。感 谢在本实验室一起学习的中国农业大学王建民、张伟和广西大学陆海峰、潘英华、吴晓 松、商巾杰、卿冬进以及浙江大学医学院茅幼英等同学提供的许多帮助。 最后，衷心感谢父母对我无私的爱和一如既往的付出，深深地感谢我的妻子窦艳萍， 她不顾自己工作繁忙，始终如一的理解和支持为我完成学业提供了精神动力和营造了温 馨家园。 金庆超 2 0 0 5 年1 1 月2 5 日 浙江大学华家池畔 第一章文献综述 1 稻瘟病菌 稻瘟病菌有性态为坤妇印印d 砌8 捃( h e b e n ) b a 州，子囊菌亚门m a 印a p o r n l e 属： 无性态为灰梨孢 b 衍伽肠一口。馏舶p ( c o o k e ) s a c c 】，半知菌亚门梨孢属。稻瘟病0 u c e b l a s t ) 是该病原菌引起的重要的世界性的水稻病害，已经在8 5 个国家发现，稻瘟病菌对水稻生 产造成严重损失，其造成的水稻产量损失可高达1 1 至3 0 ( b a k e re ta 1 ，1 9 9 7 ；o us l ， 1 9 8 5 1 。由于稻瘟病的危害，全球范围内每年减产的水稻足以养活6 0 0 0 万以上的人口。 特别是在东南亚和南美危害更严重( z e i 西e re ta 1 ，1 9 9 4 ) 。目前，环境问题越来越受到重视， 稻瘟病杀菌剂仍占据最大的农用杀菌剂市场。近来，美国疾病控制和预防中心( c e n t e r s f o rd i s e a s ec o m r 0 1a n dp r e v e n t i o n ) 甚至将稻瘟病菌列为一种潜在的生物武器，认为它有 可能被用来发动“农业恐怖”袭击( m i t c h e l le ta 1 ，2 0 0 3 ) 。另外稻瘟病菌具有较广的寄主 范围，除水稻外它还可使5 0 多种栽培作物和园林植物致病，例如大麦、小麦、穆子、草 坪草等( m i t c h e l le ta 1 ，2 0 0 3 ；o us h ，1 9 8 5 ) 。 稻瘟病因为害时期、部位不同可分为苗瘟、叶瘟、叶枕瘟、节瘟、穗颈瘟、枝梗瘟 和谷粒瘟等。其中以穗颈瘟对水稻产量影响最大，以水稻叶片上的病害症状最为典型， 即病斑呈梭形，中部坏死呈灰白色，病斑边缘红褐色( o us - h ，1 9 8 5 ) 。稻瘟病菌主要在 病斑上产生分生孢子借助风雨传播进行再侵染，它侵染水稻的病害周期可以分为以下几 个时期( 图1 ) ：a 分生孢子接触到水稻叶片表皮细胞后，其尖端产生粘胶( s p o r e 卸 m u c i l a g e ，简称s t m ) 可使孢子附着于水稻叶片的表面；b 在一定条件下分生孢子萌发 产生芽管；c 芽管顶端膨大分化成一种特殊的器官附着胞( a p p r e s s 耐u m ) ，紧密地粘着 在水稻叶片的角质层上；d 附着胞壁上沉积黑色素，胞内膨压积累；e 附着胞形成侵染 栓直接穿透水稻叶片的角质和表皮细胞壁；f 病菌在水稻叶片的表皮细胞内形成初生和 次生菌丝并侵入邻近的细胞和叶肉细胞；g 新的分生孢子从水稻叶片的病斑处产生并释 放出来，进入下一轮病害周期。病菌可以菌丝体和分生孢子在病稻草、病谷上越冬，完 成其侵染循环。稻瘟病菌的侵染循环被认为植物病原真菌典型的植物一病原物互作模式 而被广泛研究。 图1 稻瘟病菌的侵染循环 f i g u r e1 “f ec y c l eo f z 宙g 口 2 稻瘟病菌侵染相关发育( 表1 ) 2 1 分生孢子( c o i d j u m ) 的吸附和萌发 成熟的分生孢子呈洋梨形，一般具有三个细胞。落在寄主表面的分生孢子可依靠粘 胶吸附在寄主表面上( h a i i l e re ta 1 ，1 9 8 8 ) 。粘胶( m u c i l a g e ) 是由分生孢子尖端膨胀而分泌 的混合物，它由蛋白、脂类和碳水化合物( 2 5 的重量) 等物质组成，具有强烈的疏水性 ( h a m e rc ta 1 ，1 9 8 8 ；h o w a r da n d v a l e n t ，1 9 9 6 ) 。孢子成熟后，顶端的细胞壁开裂，顶胞分 泌出粘胶，吸附于孢子顶端，粘胶非特异性地牢固吸附于寄主植物的蜡质表面f h 枷e re t a 1 ，1 9 8 8 ；h o w a r da 1 1 d v a l e l l t ，1 9 9 6 ) 。h o w a m 和v a l e m 认为，粘胶分泌与硬质物质表面对 分生孢子细胞膜产生的局部压力有关，这种压力激活细胞膜上的离子通道，引起信号传 导，导致分生孢子的萌发( h o w a r da n d v a l e n t ，1 9 9 6 ) 。粘胶的产生及多少与菌株及其培养 的时间和条件( 培养基种类、环境条件等) 有关( h o w 甜d ，1 9 9 4 ) 。另外，胞外的糖蛋白也可 能与分生孢子吸附和细胞分化有关( d e i s 曲ge ta 1 ，2 0 0 0 ；a oe ta 1 ，1 9 9 4 a ) 。越来越多的证 据表明，利用粘胶吸附于寄主表面是真菌侵染寄主植物的机制之一口u c k e ra i l dt a l b o t ， 2 0 0 1 、。 稻瘟病菌分生孢予十分容易萌发，当水分充足时，成熟的分生孢子在分生孢子梗上 也可以萌发。在水中，3 0 一9 0 i n i n 后孢子就开始发芽，孢子萌发时，芽管一般从顶胞或基 胞产生( h 锄e re t “，1 9 8 8 ；h o w a r d ，1 9 9 4 ) 。分生孢子萌发依靠自身营养，但当外源营养丰 2 宫，特别是丰富营养液存在时，孢子各细胞都会产生芽管( g e n nt u b e ) 。另外，分生孢 子洗液中含有抑制自身萌发因子一脂溶性自身抑制予( 1 i p 叩h i l i cs e l f i l l l l i b i t o r ) ，高浓度的 分生孢子( 大于1 0 8 个1 1 1 1 ) 置于基物表面不能萌发和形成附着胞( h e g d ea n dk 0 1 a t t u k u d y ， 1 9 9 7 1 。只有当孢子内的抑制物质扩散到周围环境后才能进行孢子萌发和附着胞形成 ( h 锄e re ta 1 ，1 9 8 8 ；h o w 棚a n dv a l e n t ，1 9 9 6 ；t u c k e ra i l dt a l b o t ，2 0 0 1 ) 。 表1 稻瘟病菌致病的主要事件的时问进程和相关基因( t a i b o t ，1 9 9 5 ) t 曲l elt i i l l ec o u r s e so f t l l em a j o re v e n t sd 谢n gp a 山o g e l l e s i sb ym a 印印o n l l e 鲥s e a ，丽m s p e c u l a t i o n sa b o u tt h e1 l n d e r l y i n gg e n ea c t i v “i e sr e q u i r e d 仃a l b o t ，19 9 5 ) t i m 口【舢坩r r p c o n 日- $ j 舯d r i 恤剐d 鹋o s p d t e 咱皤h e a b e 0 一 c 口d h e 5 瑚 c o n l a e m l m b t o | 口1 皑剖船0 fe h o 胖州t j 1 岫毋舶叽1 聃9 驰 i f o 口ht o l 1 b a p i c a e 砷n ；- o ” m h 5 1 5 ，1 u d l b r 艰蜘1 0 a 口0 5 5 。r i u m 粕p 哳，n 如r h 喀日 i m 0o f a p 即：w n u 柙 r 砷帅c 聃1 w 硅稚 蝌a 洲l u 静 t n i n j 、e c e l w a i ll a 归r = f & 1 n 啪p t l b l a r 日“l 删n a b b 。l d 口n t m - b b q o 瞅l t ， 删t 鲥k y 抻e o r 蚺妒 p o 协h # 柚0 n 日啪n d d 咖限r | e 5 i 即珊 e 目f i 曲r r 卅l l 讲口a o f l u e u d 口口p e l 口吲l 口n n 自呻俯l 7 a ：1 0 r i5 ：甜、mt 5 l o j lc 埘i 7 l m “m g ，l 柑u 啦目 h 口机“呻：0 0 竹0 吨 5 p 埘啦i o 甜耐c n k n 忙丌 i i o k n 竹j c e l l ，w * ；v n 钠e 5 b c 抖i 时“d q * n d 8 l 、i “i 舳c r 嚣僦篙磐：搿黧。“濒，：鬻黼。“：篇：嚣善蕊鲁落p “ 嚣善兰。， ”“” n 似* n n d 己嘧u i u b ”州e p 。j o t 晰a n m h j l 妇一n 硼1 w j i 忡j m u i a r ma 雌t e o 咀8 h 1 n t e 洲t nn c i 日f 6 啦b i p n 恤t f e s 盘u n d a 眦 p 0 唧r t r 世崦0 1 0 8 扣柳1 州琦 r i 丌口fm 口口附 a u m i 刚a t r 目o 皑t l 竹 c 0 1 口i e 埘n ed ： g l 雌噼懈c t 眦r 措a ，曲5 c n l 肚n e 【乱明p t c 幛 _ s t 呦r d e o 日d 【e # 槲耻 t u r p 9 r 卵，el i 6 4 8 h ， f 舢e p 一埘触n 岫t b n # o b i n f e t o nh v d h 柏r 。n e h i 呲n d 町l 十1 日e4 u r q m “”目e p w n 拇i s 毕o a dl n l o 嗍4 蝉“ i i 钟i ! 抽m ob 咖n r 啵a 嘣 烈r 哺u 钟n c n 讲日c 鼬i o e i b0 e n 目忡 1 帆d f t o t 耐b m 酆 k n 如i 1 麓簧器；器篙麓= ：姑舅” n 晴自 芷m v e a i 妇鲥：正t i 碥c a d e 燃譬裂掌：! ：纛篱“”“ 器篇絮：等搿：蒜篙嚣黑， d i m n r 口h t od 时e 1 l n a t ct 州hp 砘e m s ；n ；l a to 畸邮日扯h 西n # s u t e ，”b r j p 口n e 坩r 4 d l u i 凇n n 柙e s 7 c d w a 、0 咏嘲ro n r 柙e ， o e l o 枷跚t n 耕r l 泓e c a n d a hr t 嫩：d b o h t p # l 稿一删j # 岍e t dn a k 州e 批1 姗k 甙耐p 时i m o x i n 帮e s 蚋t h e t _ c 种t l 。啡 栅r j c ej e $ 蝴5群州q 相i e c t e 6够。口h 踟壮m x r 蝴矸_ l 钟嚣r h 伸h 龄v 1 5 吲e 址1 n 删 呦西* i 帕”噼n 蒜o q 铲。幅 i b m d m e r b “4 c 口n i a l 帆0 日呻哪r 8u n d e h l t 一口t i d 皓口1w q h 堰“n u m i u i 智 l 洲5 e 口i n 佃t o e 瓣 洲l 8 n 蝌埘i ”曲e l l i 把s 坶 a n d h 哥d w1 哪口 c o n m i b t t 矿 呲州口州0 h i ni b c 口n m d m iv e qh i f * h d i 钾 a di f t 州r u ，00 t * ， d e t 虻t e o ：啪洲举 “u 口t 畔ef e 删s 。黑：器瓮：嚣篓， 注：接种疏水表面0 5 h 、1 5h ，水溶液中的孢子开始萌发，牙管伸长：接种疏水表面2 h _ 4 h ，接受 胞外信号后，牙管顶端停止伸挺，有丝分裂开始进行；接种疏水表面4h - 8h ，附着胞形成，胞壁黑 色素开始沉积，附着胞小孔可见，油脂降解，膨压形成；接种疏水表面1 6h 2 4h ，附着胞成熟，附 着胞下面孔环形成，高膨压继续维持；接种疏水表面2 4h 3 1h ，附着胞进一步发育，膨压达到最高， 侵染栓出现。 n 一 玷 2 2 附着胞( a p p r e s s o r i u m ) 的形成 在固体表面，芽管生长时间一般不超过4 h ( t a r b o t ，1 9 9 5 ) 。生长的芽管顶端感受胞外 信号后才能诱导附着胞的形成。附着胞为单个细胞，它的形成受物理、化学和环境等因 素的影响( h o w a r da i l dv a i e n t ，1 9 9 6 ) 。基物表面的的疏水性( h y ( 1 r o p h o b i c i 劬是附着胞形成 的主要因子，疏水性表面可以诱发附着胞的形成，而亲水表面则使芽管表现为营养生长 ( j “t t oe ta 1 ，1 9 9 4 ；l e ea n dd e a i l ，1 9 9 4 ) 。另外，基物硬度( a oe ta 1 ，1 9 9 4 a ) 、植物表面角 质单体、植物脂类和腊质成分以及植物表面形态结构均影响附着胞的形成( h 锄e re ta 1 ， 1 9 8 8 ；h 啪e ra i l d t a l b o t ，1 9 9 8 ；x i a oe ta 1 ，1 9 9 4 b ) 。营养饥饿( 特别是氮素饥饿) 有利于附 着胞的产生( j e l i t t 。e ta 1 ，1 9 9 4 ；t a i b o te ta 1 ，1 9 9 7 ) 。光照可促进附着胞的产生，强光对芽 管的伸长有抑制作用，但对附着胞的数量没有影响( j e l m oe ta 1 ，1 9 9 4 ) 。水中矿质元素也 影响附着胞的形成，附着胞在自来水比去离子水的产生量大( 林福呈，1 9 9 9 ) 。外源c a m p 也可诱发分生孢子在疏水性表面形成附着胞，附着胞的形成与c a m p 的浓度有关( 1 0 m m 最有效) ( d e a n ，1 9 9 7 ；l e ea i l d d e a n ，1 9 9 3 ) 。在芽管伸长期问，胞外蛋白与疏水基质表面相 互作用，可导致病菌细胞中c a m p 的积累，继而引发信号传导，引起一系列级联反应， 诱导形成附着胞的基因进行表达( l e ea n dd e a n ，1 9 9 3 ) 。研究还发现， i b m x ( 3 一i s o b u t y l - l - m e m y l x a n t h i n e ) 是磷酸二酯酶的抑制剂，它可以阻断c a m p 的分解， 引起c a m p 在细胞中积累，从而有利于亲水表面诱发附着胞的形成( d e a ne t a 1 ， 1 9 9 5 ；d e a l l ，1 9 9 7 ) 。上述结果大部分是在实验室条件下的人工基质表面上获得的，这些因 子对附着胞的形成可能只起到部分诱导或抑制作用。事实上，在水稻叶表面的附着胞的 形成率比其它任何基质都高( h 锄e ra i l dt 舶o t ，1 9 9 8 ；j d i n oe ta 1 ，1 9 9 4 ：l e ea 1 1 dd e a n ， 1 9 9 3 j 舢o te ta 1 ，1 9 9 6 ) ，说明附着胞形成是众多因子综合诱导的结果。 疏水蛋白( h y d r o p h o b i n ) 作为一种胞外蛋白，参与附着胞形成过程中的信号识别过 程，认为是一种识别寄主疏水表面的重要识别因子f r a l b o te ta 1 ，1 9 9 3 ；t a i b o te ta 1 ， 1 9 9 6 ；t a i b o t ，2 0 0 3 ) 。芽管顶端接受附着胞形成信号后，在靠近芽管细胞顶部，特别是在 和生长基质接触附近而不是菌丝尖端出现大量液泡，这些成堆的液泡往往停留在同一地 方( b o u r e t ta n dh o w a r d ，1 9 9 0 ) 。林福呈等( 1 9 9 7 ) 也观察到类似的现象。芽管顶端开始 膨大和弯曲，即“弯钩”的形成，标志着附着胞开始形成。细胞内发生有丝分裂，其中 一个子细胞核移入附着胞中，在牙管和附着胞之间形成隔膜，一次有丝分裂完成f d e a i l ， 1 9 9 7 ；t a l b o t ，1 9 9 5 ) 。从芽管顶端停止生长到附着胞最初形成需约2 4 h 口a l b 咄1 9 9 5 ) 。附 着胞继续膨大，分生孢子和芽管的细胞质的成分和液泡中的液滴转移到初生附着胞。在 人工诱导的条件下，附着胞的膨大过程一般在分生孢子萌发后4 8 h 完成( b o u r e t ta n d h o w 盯d ，1 9 9 0 1 。随着附着胞的成熟，附着胞的细胞壁上沉积了一层叫黑色素的物质。黑 色素呈黑棕色或黑色，是多聚酮( p 0 1 y k e t i d e ) 前体1 ，8 二氢萘( 1 ，8 一d i h y d m n a p h t h a l e n e ， d h n l 的聚合物，为戊二酮生物合成途径的末端产物( h o w a r da n dv a l e n t ，1 9 9 6 ) 。黑色素 主要沉积于附着胞细胞壁的内层，厚度约为1 0 0 n m ，其主要作用是紧密地把附着胞壁上 小孔的四周包围起来，并提高附着胞胞质的膨压。黑色素层降低附着胞壁的孔径小于 1 m 。黑色素化的细胞与非黑色素化的细胞对水和溶质的渗透性是不同的，它可以阻止 大分子溶质的进出，但对水分子的进出则不限制，这样附着胞胞质就很容易形成高膨压 ( h o w a r da i l d v a l e n t ，1 9 9 6 ) 。细胞壁上黑色素的形成与沉积是附着胞形成的重要功能性时 期。在黑色素沉积过程中，与寄主表面紧密相邻的附着胞细胞壁区域高度特异化，此区 域比周围区域薄，缺少黑色素，细胞壁为一层，没有几丁质，后来逐渐形成小孔区，成 为附着胞小孔( a p p r e s s o r i u mp o r e ) 。在显微镜下可以看到附着胞小孔周围有一个环，紧 密的包围了附着胞小孔的四周，称为孔环( p o r er i n g ) ，认为这一孔环起到机械作用， 使附着胞小孔紧密的与基物结合，造成密封状态，利于植物病原物间的信息交流和病原 物的侵入，附着胞小孔是大分子物质从稻瘟病菌进入水稻表皮细胞的唯一通道( h o w a r d a n df e n 稍，1 9 8 9 1 。膨压是附着胞成功侵入寄主的主要机械力量，膨压的产生主要靠黑色 素化后的附着胞细胞内的溶质的产生和积累。溶质主要由孢子中贮存的主要内源营养物 质糖原、海藻糖、甘露糖和脂类( 三脂酰甘油) 等碳水化合物转化二来的( d i x o ne ta 1 ， 1 9 9 9 ；t 舶o t ，1 9 9 5 j a l b o t ，2 0 0 3 ) 。起初发现糖元( g l y c o g 咖o l l r c t ta i l dh o w a r d ，1 9 9 0 ) 等物 质在附着胞中大量积累，但此类溶质难以产生8 o m p a 以上渗透压，只有高于这个压力 附着胞才能发挥有效的寄主侵入过程( h o w a r de ta 1 ，1 9 9 1 ) 。后来研究发现甘油( g l y c e m l ) 在附着胞内短时间内大量积累并实现成功的侵入过程，认为甘油可能是附着胞胞质产生 膨压的主要溶质( d ej o n ge ta 1 ，1 9 9 7 ) 。黑色