（高分子化学与物理专业论文）新型固定金属离子亲和吸附剂的制备和性能研究.pdfVIP

中文摘要 固定金属离子亲和吸附剂( i m a ) 由载体、螯合基和金属离子三部分组成，利用 材料上固定的金属离子与蛋白质表面的组氨酸等残基配位结合，选择性地吸附蛋 白质，在蛋白质固定和分离方面有广泛应用。载体的物理化学性质显著影响着吸附 效果，多糖类软基质载体，生物相容性好，吸附量大，但机械强度小，稳定性差，难以 用于加压体系；无机硅胶类载体，机械强度高，但耐碱性差，吸附量小。硅羟基非特 异吸附强。在硅胶表面修饰天然糖类，钝化硅羟基，创造温和的接触表面，有望制备 一种兼具高吸附量和机械性能的吸附剂。 b 一环糊精( b c y c l o d e x t r i n ) 是7 个葡萄糖残基以。 一1 ，4 一糖苷键连接而成的环 状低聚糖，利用其桶状结构与蛋白质表面的氨基酸产生弱的交互作用，对于抑制 蛋白质聚集，促进化学变性蛋白质复性有显著的作用。这些优点使环糊精成为一 种潜在的新型i m a 载体材料。 本文采用键合法和涂敷法将环糊精分子结合到硅胶表面，制备了环糊精硅胶 载体，然后对载体进行活化、偶联亚氨基二乙酸螯合基，最后固定金属离子，制 成了固定金属离子亲和吸附剂。研究了吸附剂对牛血清蛋白( b s a ) 和a 一淀粉酶的 吸附特性，吸附剂对b s a 的最大吸附量为3 5 3 m g g 而对n 一淀粉酶的吸附量为 2 0 8 m g g 。利用吸附剂纯化了工业级n 一淀粉酶粗品，将其比活提高了1 5 倍，活 性回收率达7 8 8 ，且吸附剂可以多次循环使用。对尿素化学变性的淀粉酶复性过 程研究发现，吸附剂对尿索变性n 一淀粉酶的复性起到了一定的促进作用。 关键词：固定金属离子；亲和；蛋白质：载体：硅胶；b 环糊精 a b s t r a c t i m m o b i l i z e dm e t a l i o n sa m n i t y ( i m a ) a d s o r b e n ti sc o m p o s e do ft h f e ep a r t s ， w m c ha r es u p p o r t ，c h e a l t o ra n di m m o b i l i z e dm e t a l i o n s t h ea d s o r p t i o no ft h e s e a d s o r b e n t si sb a s e do ns p e c i f i ci n t e r a c t i o n sb e t w e e np r o t e i n si ns o l u t i o na n dr n e t a l 0 n s f i x e dt ot h es o l i ds u p p o r t as u i t a b l es u p p o r ti sak e yp o j n tf o rp r o t e i na d s o r p t i o nm 锄y s o f t g e l s o fp o l y s a c c h a r i d e sh a v es e r v e da s s u p p o n s ，、v j t h t h eq u a l i t yo fh i g h b i o c o m p a t i b i l i t ya n dp m t e i nc a p a c i t y h o w e v e lt h e ya l s o h a v es o m es h o n c o m i n g s s u c ha ss e v e r es t l r i n k a g ea f t e rd r y i n go ru n d e rp r e s s u f e ，锄dh y d r o l y z e di na c i d i co r h j 曲t e m p e r a t u r ec o n d i t i o n s s i l i c ag e l a sar 垮ds u p p o r th a sa l s ob e 肌u s e d ，w i t h d i s a d v a n t a g e so fc h e m i c a li n s 诅b i l t ya tp hv a l u e s 伊e a t e rt h 柚8 o ，l o wp m t e i nc a p a c i t y a n d s t r o n gn o n - s p e c i f i ca d s o r p t i o n t h em o d i 矗c a t i o no fs i l i c a g e l s u r f 如e b y p o l y s a c c h a r i d e s c o m b i n e st h e a d v a n t a g e so fp o l y s a c c h a r i d e s ， i n p a r t i c u l a t h e i r h y d r o p h i l i cf 色a n j r e s ，w i t ht h em e c h a n i c a jr e s i s t a n c ep r o p e f t i e so f s i l i c as u p p o n p c y c l o d e ) ( t r i n ( c d ) i sac y c l i co l i g o s a c c h 撕d ec o n s i s t i n go f7g l u c o s eu n i t s l i i l k i n gt l l r o u 曲a l ，4 - g l y c o s i d i cl i n k a g e s c y c l o d e m r i n s c a nf b 肌w e a ka n d n o n - c o v a l e mc o m p l e x e sw i t hh y d r o p h o b i cs i t e sp r e s e n ti np a r t i a l l yr e f o l d e dp r o t e i n i n t e m e d i a t e st op r e v e n ta g g r e g a t i o i l ，w l l i c hh a v ea l s 0p r o v e ne a e c t i v ef o rh e l p i n g p r o t e i nr e f 0 1 d i n g nm a yb ea na l t e m a t i v et ou s ec y c l o d e ) ( t r i n sa s 蹦as u p p o r t s i nt h i sw o r l ( ，t w ot y p e so f 扣m aa d s o r b e n t 谢t hp c y c l o d e m r i nb o n d e ds i l i c ag e l a n dp c y c l o d e ) ( t r i np o l y m e rc o a t e ds i l i c ag e la st h es u p p o r tw e r ep r 印a r e db ya t h r c e s t e pp r o c e d u r e s ，c o n s i s t i n go fa n a c h i n gp c y c l o d e ) ( t r i n0 ns i l i c ag e l ，c o u p l i n gt h e l i g a j l do fi m i n o d i a c e t i ca c i d ( d a ) 们dm e t a li o n si m m o b i l i z a t i o n t h ea d s o r p t i o n c a p a b i l i t yo fa d s o r b e n tt o w a r d sb o 、，i n es e m ma l b u m i n ( b s a ) a n d 酗a m y l a s ew a s g m d i e da n dt h ep u r i f i c a t i o np e r f b m 肌c eo ft l l et e c h m c a l 铲a d e 即a m y l a s ew a s “s o d e t e r i l l i n e dt h er e c o v e r yo f * a m y l a s e 、s7 8 8 、v i t h1 5 一f o l ds p e c i f i ca c t i v i t y e n h a n c e da n dt h ea d s o r b e mc o u l db eu s e dr 印e a t e d i yt h em a 仃i x - a s s i s t c dr e f o l d n go f u r e ad e n a t ：u r e da m v l a s eu ，a sa l s os t u d i e d k e y w o r d s ：i m m o b i l i z e dm e t a l i o n s ：a 伍n i t y ：p r o t e i n ；s u p p o r t ；s i h c ag e i ：p - c y c i o d e 砒r i n ￥9 10 s7 3 关于学位论文独立完成和内容创新的声明 本人向河南大学提出硕士学位阱博士学位口中请。本人郑重 声明：所呈交的学位论文是本人独立完成的，对所研究的课题有 新的见解e 创造性的见解口。据我所知，除文中加皑说明、标注 校学术发展乖进行学术交流等目酌，可皑采取影印、缩即、扫描 和拷贝等复制手段保存、汇编学位论文( 甄质文本和电于文本) 。 ( 涉度保密内京的学位论文在解密后适用本授权书) 学位获得者( 学位论文作者) 签名：口十嵩 如0 6 年6 月：0b 矗童：诘在相应的“口”内划“”。 河南大学硕士学位论文 1 1 白质纯化技术概述 第一章绪论 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发 育及修补组织的原料。蛋白质是以2 0 种天然氨基酸为基本单元，以酰胺键连接而 成的高分子含氮化合物“1 。 蛋白质在组织或细胞中一1 般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞 都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务， 目前还没有一种具有普遍适用性的现成方法，但对任何一种蛋白质都有可能选择 套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品”1 。 表卜l 蛋白质的性质差异及其分离策略 蛋白质性质差异分离方法应用范围 溶解度 分子大小 电荷数量、分布 疏水性 亲和性 等电点沉淀 盐溶和盐析 有机溶剂分级 透析、超滤、离心 凝胶过滤 凝胶电泳 离子交换吸附 疏水吸附 亲和吸附 蛋白质的粗分离 蛋白质的粗分离 蛋白质的粗分离 蛋白质的粗分离、脱盐 蛋白质的精细分离、脱盐 蛋白质的鉴定、分离 蛋白质的精细分离 蛋白质的精细分离 蛋白质的精细分离 和小分子化合物的分离提纯类似，蛋白质的分离提纯也是基于混合物的中各 i 新型固定金属离子型亲和吸附剂的制备和性能研究 种蛋白质在物理、化学、物理化学( 也包括生物学) 性质上的差异，这些性质差 异是由于蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残 基可是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的，此外多肽可 折叠成确定的二级结构( a 螺旋、且折叠和各种转角) 、三级结构和四级结构， 形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况，利用待分离的目标蛋白 质与其它蛋白质之间在性质的差异，能够设计出一组合理的分离步骤，依据蛋白 质不同性质采用与之相对应的方法将蛋白质混合物分离0 3 ，表卜l 列举了目前常用 的蛋白质分离方法即应用范围。 对于蛋白质的粗分离( 预分离) ，一般常采用超滤、离心等技术，主要从细胞裂 解液中去除固体不溶物和其它非蛋白质小分子，经过粗分离，混合物主要由目标 蛋白质和各种杂质蛋白组成，为了分离出目标蛋白，常采用凝胶过滤、离子交换 吸附、疏水吸附、亲和吸附等四种技术对蛋白质进行精细分离，有时为了达到高纯 度，也常将这些技术组合使用，图卜1 中是其不同的分离机理的示意图。 l2 图卜l 常用的四种蛋白质分离机理示意图 吸附4 亲和吸附 1 2 亲和吸附与亲和吸附剂 3 4 1 凝胶过滤2 离子交换吸附3 疏水 吸附剂是蛋白质纯化的“灵魂”，在蛋白质的分离中，既有常规吸附剂的使用， 又有根据蛋白质特点设计的蛋白质吸附剂的使用。按照吸附机理，吸附剂可以分 2 河南大学硕士学位论文 ，物理吸附剂 篝： k 酝剂 亲和作用是两个分子间存在的复杂的相互作用，其中至少存在四种作用力： ( 1 ) 离子间的相互作用：主要是由于氨基酸侧链的电荷引起的静电作用，如天冬氨 酸等带有的负电荷，缬氨酸、赖氨酸等带有的正电荷。( 2 ) 氢键结合：在配体含有 氧或氮原予的场合下，能和结合部位之间形成氢键。由于是原予问的相互作用， 所以结合部位和配体间的位置关系很重要。( 3 ) 疏水性相互作用：配体上有烃链或 芳香环之类的非极性基团，结合部位侧面也有同样的非极性部分对，存在疏水性 相互作用。( 4 ) 与金属原子配位：金属离子与蛋白质上氨基酸的相互作用。这四种 作用力有时共同起作用，有时以一种作用力为主导，而在宏观上则表现出蛋白质 新型固定金属离子型亲和吸附剂的制各和性能研究 和特定分子的识别与结合。 亲和吸附剂就是利用吸附剂表面连接的能与蛋白质分子产生“亲和”作用的 功能基团( 称为配基) 与蛋白分子产生识别作用，从而达到目标蛋白分子的特异性 吸附。而蛋白质与配基之间在空间上的紧密结合在这种特异反应中也起着很大的 作用。根据固定的亲和配基的种类不同，可将亲和吸附剂分为三类：生物特异、 染料仿生和固定金属离子型亲和吸附剂。表卜3 列举了三类常用的亲和吸附剂的性 质。 表卜3 三种类型亲和吸附剂的性能比较 其中生物特异性亲和吸附剂是利用生物分子间的特殊作用( 如酶一底物、抗体 抗原) ，达到极高的专一选择性。但由于这种结合往往过于强烈，造成吸附剂结合 目标分子后，无法解吸附，导致分离失败。同时由于生物特异作用过于专一，一 种吸附剂通常只能吸附有限的一种或几种蛋白，因此其应用大受限制。染料配基 是通过如三嗪类小分子模拟生物配基，取得了一定进展，但是其特异性较低。固 定金属离子型亲合吸附剂由于价格低廉、制备简单等优点，更具有工业应用的价 值。 1 3 固定金属离子亲和吸附技术 4 河南大学硕士学位论文 1 9 7 5 年，p o r a t h “首次利用固定金属亲和吸附技术( i 姗o b i l i z e d e t a l i o n a f f i n i t y ，简称i 姒) 分离蛋白质，开始将金属离子作为一种亲和配基使用，开创了 蛋白质亲和技术的新领域。固定金属亲和吸附技术与传统的亲和技术相比，具有 成本低，吸附剂制备容易，分离过程简单等诸多优点，经过3 0 年的发展，已经成 为蛋白质分离的一种重要手段，尤其是近几年重组蛋白技术逐渐产业化后，为其 服务的下游技术之一的固定金属离子亲和技术也进入快速发展阶段。 1 3 1 基本原理 过度金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩 余的空轨道是电子供体的配位点，在溶液中被水分子或阴离子占据。当蛋白质表 面氨基酸残基与金属离子的结合力比它们更强时，则蛋白质取代它们与金属离子 形成复合物，从而使生物分子被吸附。根据软硬酸碱理论，c u ”、f e ”、c o ”、z n ”、 n i2 + 等为交界酸，易与组氨酸、色氨酸上的交界碱氮原子和半胱氨酸上软碱硫原子 配位结合，而c a ”、m g ”等硬酸则易与磷酰化氨基酸上的硬碱磷原子配位结合。由 于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同，因而与金属螯合 物的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化。1 。 。譬爷吒气。髻 p r o f e mi i g a n d 目标蛋白配基( 整合基) 3 a m l 间隔臂 s u p p o n 载体 图卜2 固定金属离子亲和吸附剂一蛋白质相互作用示意图 新型固定金属离子型亲和吸附剂的制各和性能研究 组氨酸最易与金属离子结合，因此是固定金属离子吸附剂的活性基团。组氨 酸上有a 一氨基、羧基和活性侧链上的咪唑基，它可以由n 一氨基和羧基与金属离 子形成五元环，也可由n 一氨基和眯唑基与金属离子形成六元环，还可由羧基和咪 唑基与金属离子形成七元环，其结构如图卜2 所示。 色氨酸吲哚环上的氮原子、半胱氨酸分子侧链上的巯基也可与金属离子作用。 但是，半胱氨酸一般以二硫桥的形式存在，色氨酸一般位于蛋白质分子的内部， 因此与金属作用较弱。因此，组氨酸的数量和分布是决定蛋白质与固定金属离子 吸附剂作用力强弱的主要因素。一些分子表面含有组氨酸残基的蛋白质能被固定 金属离子亲和吸附剂强烈吸附，如牛血清蛋白、溶菌酶、超氧化物歧化酶等。 1 3 2 吸附模型 固定金属离子亲和吸附作为一种新的蛋白质吸附技术正在兴起和发展，目前 仍有许多理论问题需要研究和解决。由于亲和吸附过程比较复杂，对其机理了解 不多，真正基于物理、化学和生物特异性相互作用的理论模型还未建立，最初基 于配基一蛋白质相互作用的吸附一解离平衡过程提出的理论模型虽有一定的局限 性，但仍然被广泛使用。 设蛋白质p 与金属离子配基l 间为单位点吸附，则 p + l ；兰 p l ( 1 一1 ) 用 p 表示游离蛋白浓度， l 表示未结合蛋白的配基浓度， p l 表示蛋白一金属配 合物的浓度，用解离常数k 。表示配合物的稳定程度 舻背 ( 1 - 2 ) k d 越小，表示配合物稳定程度越高，对于蛋白质亲和吸附常见的k o 值在1 0 一4 m 到 1 0 。m 之间，k 。太大，说明吸附剂对蛋白无显著的吸附作用：k 。过小，说明吸附剂与 蛋白结合太强，难以解吸附，有时甚至需要破坏吸附剂来达到解吸附的目的( 常 6 河南大学硕士学位论文 见于某些抗体一抗原亲和) 。由于 l 、 p l 难以用实验方法测得，因此常采用等 温吸附模型对吸附过程加以描述，对试验数据进行拟合。大多数亲和吸附的理论 模型研究集中于单溶质吸附，目前普遍接受的仍是l a n g m u i r 模型。 达到吸附平衡时的等温方程： g = 昔 ”s ， 其中c 为吸附平衡是时溶液中游离蛋白质的浓度g l ，q 为吸附量j l 】g g 吸附剂， q 。为吸附剂最大吸附量，也称负载量。对( 卜3 ) 式进行变换，得( 卜4 ) 式 c c ? k b 一= = 一+ ； qq mq m ( 卜4 ) 通过测定不同浓度c 下吸附剂的吸附量q ，使用c q 对c 作图，可得斜率为q f l 的 直线，进而求出k 。值。对于固定金属离子吸附剂亲和吸附剂，常使用廉价易得的牛 血清蛋白( b s a ) 为标准蛋白，粗略评价吸附剂的吸附性能。对于一些蛋白与 l a n g i l l u i r 模型符合较差的吸附，也可使用f r e u n l i c h 模型、l a n g m u i r f r e u n l i c h 模 型、t e m k i n 模型等进行拟合”1 ，通过增加方程参数获得更好的拟合度。 1 3 3 吸附剂的制备 a 载体的选择： 理想的载体( 又称为基质、固定相) 应具有下面的条件： ( 1 ) 具有亲水性，蛋白质高分子量的生物活性物质在一些高疏水材料如聚苯乙烯 表面易变性失活，为防止蛋白变性，一般采用天然多糖作为载体，其具有亲水性 新型固定金属离子型亲和吸附剂的制备和性能研究 同时生物相容度高，能为蛋白质提供一个温和的接触环境，同时还有内部扩散阻 力小，吸附容量大的特点。( 2 ) 载体具有固定螯合基时能利用的适当的宫能团。同 时要有较高的理化稳定性，对p h 、离子强度变化不敏感，不会造成吸附剂的流失。 ( 3 ) 目标蛋白以外的非特异性吸附很少。硅胶类无机载体由于非特异吸附很强， 较少直接作为蛋白质吸附材料使用。( 4 ) 有良好的机械强度，能适应一些常用的 分离设备如色谱柱、扩张柱床等对吸附剂强度的要求。 烯。煳。 图卜3 琼脂糖的结构 s 订u c t u 他0 fa g a m 靶鲥 目前尚无一种载体材料完全符合所有的要求，而载体材料的性能又是决定吸 附剂吸附效果和应用范围的关键。在众多文献报道中，琼脂糖凝胶。1 是最常用的载 体材料，琼脂糖凝胶的骨架是依靠许多琼脂糖链缠绕而成的糖胶束，如图卜3 所示， 依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓 度来调节，一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用( 如水，p h 4 9 范围内的盐溶液) 。也有以纤维素、葡聚糖、聚酰胺、聚碳酸酯、聚羟乙基甲基丙 烯酸酯、聚砜、聚乙烯醇、聚丙烯酸环氧烷、树脂及上述物质的衍生物和共聚物“ 等为载体，此外大孔硅胶、多孔玻璃、磷灰石等无机材料也有少量报道o ”。近年 来，又出现了新型有机一无机复合型载体o ”。 8 河南大学硕士学位论文 b 螯合基的选择： 螯合基( c h e l a t o r ) ，是载体表面用于把金属离子束缚在一定空间区域内的功 能基团。相对于各种新型载体的层出不穷，螯合基的选择范围并不宽。螯合基在 与金属配位，完成固定金属离子的目的时，必须考虑两个因素：( 1 ) 螯合基与金属 结合必须牢固：金属离子的流失会污染蛋白质，甚至造成蛋白质的变性失活，同时， 像c u ”、n i ”这样的金属离子对人体有害，因此在分离某些治疗用蛋白时，金属离 子的泄漏是不允许的。( 2 ) 螯合基与金属结合后，必须还能为蛋白质的配位提供 1 3 个空的位点，目前常用的金属螯合物有亚氨基二乙酸( i d a ) 、三羟甲基乙二胺 ( t e d ) ，还有次氨基三乙酸( n t a ) 等。其结构式如图卜4 所示。 c h 2 c o o h，c h 2 c o o h 州n 美裂芑篇，c 邺洲 d an t at e d 图卜4 常用螯合基的分子结构式 图卜5 中显示了亚氨基二乙酸( i d a ) 和次氨基三乙酸( n t a ) 与n i ”螯合后的结构 示意图，可以看到i d a 和n t a 均是通过形成五元环结构与金属形成稳定螯合物。 其中最常用为i d a 螯合剂，其上的一个氮原子、两个氧原子与金属离子如二价镍螯 合后，金属离子上还剩余三个空轨道与蛋白质结合，因此以i d a 为螫合基制成的吸 附剂吸附蛋白质能力较强。i d a 体积小，与蛋白质结合时空间阻碍较小；i d a 具有 亲水性，带有二价阴离子，与金属离子螯合后呈电中性，这使吸附剂与蛋白质问 的非特异吸附减少到最小程度。n t a 比i d a 多一个螯合环，理论上与金属螯合更紧 密一些，但同时空位点减少，与蛋白质的配位能力减弱。实际使用中i d a 和n t a 的 新型固定金属离子型亲和吸附剂的制备和性能研究 h 2 0 n _ - l d a n i n t a 图卜5 亚氨基二乙酸( i d a ) 和次氨基三乙酸( n t a ) 与金属螯合示意图 效果相近，可能是由于n t a 的三条螯合臂并未全部参加与金属作用，因此结构上类 似于i d a 的原因。在选择鳌合剂时，当对金属鳌合物亲和配基稳定性要求较高时， 可选择与金属离子以四个甚至五个配位络合的鳌合剂；当对配基的亲和吸附力要 求较高时，则可选择配位原子数较少的鳌合剂，以便为金属离子空余出更多的配 位点。 c 载体的活化和螯合基的偶联 载体的活化方法不仅影响到螯合基的偶联量，而且影响到螯合基与载体结合 的牢固程度。活化试剂的选择首先要考虑载体及螯合基上可反应基团的种类、耐 受p h 值范围及成键的稳定性：其次考虑试剂的毒性及价格“”。对表面含大量羟基的 多糖而言，目前使用较多的活化方法有： 环氧氯丙烷法 尸 争。竺q 卜。叱墨a 堂唑q 卜。删，昼 环氧氯丙烷活化法对于多羟基类载体具有普遍的实用性，应用较为广泛。环 氧氯丙烷活化的特点是反应容易、偶联螯合基比较牢固，且价格比较便宜。但是 该法存在着水解反应和交联反应等副反应：环氧氯丙烷高温下长时间与碱液接触 1 0 辂 河南大学硕士学位论文 会逐步水解产生甘油；环氧基高温长时间与碱液接触会生成二醇；活化反应的产 物因带有环氧基可能继续与载体上的羟基反应生成交联物。因此，反应时应控制 好温度，另外在反应溶液中加入一定比例的二氧六环或d m f 也有助于提高偶联量。 二氯亚砜法 s o c l 2 争o s 吲一争o - c 该法反应时的温度可以相对较高，反应时问相对环氧氯丙烷法短。但二氯亚 砜遇水强烈水解，整个体系要求完全无水，这给实际操作带来了很大的麻烦。 环氧法： 一般用双环氧化合物，一个环氧基与聚合物的羟基结合，另一个与鳌合剂相 偶联。典型的反应试剂为l ，4 一二羟基正丁烷双缩水甘油醚，其反应式为： 分。一 。& 帅帆扣m 磊 o 一忪眷。* 。机护恣。 该反应的最适p h 为7 9 ，常温下反应很慢，升高温度可加速反应。其余的活化 方法还有溴化氰法、碳二亚胺法等。各种活化方法各有利弊，有的活化时间短， 有的毒性低，有的形成的键稳定等，可以根据不同的偶联对象和实验目的进行适 当选择。 d 金属离子的固定 当螯合基连接成功后，使用金属离子的盐溶液浸泡吸附剂，或让盐溶液流过装 填有吸附剂的柱子，即可实现金属离子的固定，固定金属离子后，用弱酸性的醋 酸盐或柠檬酸盐缓冲液洗涤吸附剂，除去未螯合紧密的金属离子。表卜4 给出了i m a 新型固定金属离子型亲和吸附剂的制各和性能研究 常用的金属离子及其配位数。固定金属离子后可以观察到吸附剂颜色的改变( 如 螯合铜离子后的吸附剂变为蓝色) 。通过滴定螯合前和螯合后金属盐的溶液的金属 离子浓度，根据物料平衡，计算出吸附剂的螯台金属量。需要指出的是吸附剂的 金属螯合量与其蛋白质吸附量并不存在线性关系，因为实际上参与金属一蛋白质作 用的金属离子只占吸附剂固定金属离子总量的5 2 0 左右，这与蛋白质的性质与 螯合基在吸附剂表面的分布等许多条件有关。 表l _ 4i 姒常用金属离子及其配位数 1 3 4 吸附剂的使用应用领域和分离蛋白质的基本步骤 固定金属离子吸附剂目前主要应用于蛋白质的分离工程中，而在其它领域， 如酶的固载领域也有应用。吸附剂的性能和分离步骤是决定一种蛋白质分离是否 成功的两个关键因素。应用固定金属离子吸附蛋白时，可以采取柱色谱形式( i h i a c ) ”“，即将吸附剂填充柱子，让含有目标蛋白的蛋白质混合溶液流过柱子，目标蛋白 因为亲和吸附而被保留，而杂质蛋白不保留，然后将目标蛋白从柱子上洗下来。 柱色谱的方法操作较复杂，但分离过程易于监控，常用于探索最优的分离条件。 由于亲和吸附剂的特异性较高，也采用更简单的批式吸附“b a t c h ”法“，即直接 将吸附剂加入蛋白质溶液，充分吸附后过滤( 或离心) ，留在固体吸附剂表面的目 标蛋白通过解吸附得到。纯化蛋白的步骤根据所选用的设备、方法而有所不同， 但都包括三个基本步骤：( 1 ) 吸附剂和蛋白质混合物相接触( 2 ) 吸附剂识别目标 蛋白产生亲和吸附，而其它未吸附的杂质蛋白通过清洗吸附剂( 或洗柱) 而除去( 3 ) 改变溶液环境，使目标蛋白与吸附剂解吸附，获得目标蛋白。常采用两种方式解 吸附：( 1 ) 降低p h 减弱蛋白与金属配位( 2 ) 加入竞争试剂如咪唑，由于咪唑和组氨 河南大学硕士学位论文 酸类似，且是小分子，因此与金属配位更强，可以将蛋白质取代下来。 i m a 纯化蛋白的过程如图卜6 所示。 j ： i ：? i ! i 山 一一一 ii 蛋白混合物一亲和吸附、除杂一解吸附 图卜6i 姒纯化蛋白质的过程简示图 吸附剂的再生也是i m a 吸附剂使用过程中的一个重要环节，吸附剂经过几次使 用后，可能存在少量金属离子的流失，同时，吸附过程中一些蛋白沉积在吸附剂 表面，造成吸附剂的性能下降，此时用强螯合剂乙二胺四乙酸( e d t a ) 溶液将吸附 剂上的金属离子全部洗下，这时沉积的蛋白也会被洗下来( 必要时可用尿素清洗吸 附剂，彻底除去沉积的蛋白) ，再重复固定金属离子的步骤，完成吸附剂的再生。 1 4 固定金属离子亲和吸附剂研究的新进展 1 4 1 新型固定金属离子亲和吸附剂的研究和应用 自固定金属离子亲和吸附剂诞生以来，研制满足各种分离技术需要的吸附剂 就一直是i m a 的热点。随着新技术设各的出现如扩张柱床技术“”的不断涌现，对 i m a 吸附剂提出了更多的要求。对于i m a 材料的研究发展趋势，主要有以下几点： ( 1 ) 吸附剂的设计从经验设计向理论设计发展：( 2 ) 材料来源从天然材料向天然 与人工合成综合材料发展；( 3 ) 吸附材料的载体从完全亲水型向疏水与亲水混合 型载体发展；( 4 ) 吸附剂使用环境从常压向加压发展；( 5 ) 吸附特征从低特异性向 高特异性发展：( 6 ) 吸附过程和其它分离步骤的整合。 新型固定金属离子型亲和吸附剂的制各和性能研究 1 4 2 蛋白质的化学变性和纯化 图卜7 稳定蛋白质立体结构的作用力盐键氢键 疏水范德华力二硫键 蛋白质的立体结构和其生物活性有着密切的关系，稳定蛋白质三维结构的作 用力主要是一些所谓弱的相互作用或称非共价键或次级键，如图卜7 所示，此外 共价二硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起着重要作用。在尿素、盐酸胍等化 学变性剂的溶液中，这些次级键被打断，蛋白质的三维结构被破坏，蛋白质分子 链伸展开来形成一种松散的线型结构，这时，蛋白质的生物活性完全丧失，只是 具有原来氨基酸序列结构的肽链。当外界的变性环境去除时，该肽链又会缓慢地 重新折叠，恢复原来的立体结构o ”。 人类从天然动植物中提取蛋白质已有数千年的历史。但是许多有极高价值的 蛋白质由于在生物体内含量极少，提取纯化步骤非常复杂生产效率极低。从7 0 年 代兴起的基因工程技术使人们对蛋白质的生物合成，有了新的认识。基因工程的 核心技术是d n a 的重组技术，也就是基因克隆技术，即利用供体生物的遗传物质， 或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成 重组d n a 分子，然后在将重组d n a 分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生 物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。 例如，用限制性核酸内切酶将人体细胞产生干扰素的基因切下，再设法将其导入 1 4 河南大学硕士学位论文 人大肠杆菌，让大肠杆菌进行表达，进行培养后就可以获得大量与人细胞所产生 的一样的干扰素。由于大肠杆菌细胞分裂极快，可以在2 0 分钟内完成一次分裂， 短时间内可产生大量菌体，利用这种基因工程的方法生产干扰素，价格下降到只 有原来的1 3 0 0 。同时利用基因重组技术，可以方便的为许多原来缺乏金属配位点 的蛋白质加上6 “1 0 个组氨酸片断连接而成的“标签”，这些带“标签”蛋白与固 定金属离子能产生强烈的特异吸附，从混合物中分离出目的蛋白变得更为容易， 这大大拓展了固定金属离子亲和吸附剂的应用范围，“标签蛋白一固定金属离子亲 和吸附”已经成为蛋白质领域最常用的技术之。”。 然而，阻碍重组蛋白的广泛应用的瓶颈，依然是蛋白的纯化问题。据统计， 目前基因重组蛋白生产中，纯化成本已经占到总成本的9 0 9 5 ，重组蛋白的纯化 问题是目前生物和化学家们的研究热点。人们发现，细菌在重组蛋白的表达过程 中由于缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成具有正确次级键 的立体结构的活性蛋白。同时，重组蛋白的表达产率过高，超过了细菌正常的代 谢水平，使之表达产物积累起来形成一种聚集态无活性的固体颗粒混合物一包涵 体，如图卜8 所示。 包涵体 尿素盐酸胍 1 ，、厂 、，、厂 变性蛋白 错误折叠聚集 图卜8 包涵体的变性与复性 褊 聚集体 活性蛋白 包涵体一般含有5 0 以上的目标蛋白，其余为核糖体元件、r n a 聚合酶、内毒 素、外膜蛋白等，环状或缺口的质粒d n a ，以及脂体、脂多糖等，具有很高的密度。 且呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。虽然包涵体中目标蛋白含量较 高，但包涵体在的纯化前必须用变性剂使包涵体完全溶解，打断包涵体蛋白质分 新型固定金属离子型亲和吸附剂的制各和性能研究 子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，释放出包含体内的物质，以便于下一 步利用传统的纯化过程中除去杂质。经过纯化后的目标蛋白暂时处于无活性的变 性状态( 肽链处于松散的伸展状态) ，要回复生物活性就必须进行复性。因此重组 蛋白包涵体的纯化，在普通纯化步骤上增加了蛋白变性一复性这几步。 1 4 3 变性蛋白质纯化同时复性 重组蛋白产业为i m a 吸附剂开拓了更为广阔的应用空间，同时也对i 姒提出 了新的挑战。变性蛋白质分离步骤比天然蛋白更加繁杂，而复性步骤中不可避免 地发生目标蛋白的大量损失，其中主要原因是蛋白质在复性过程中发生聚集。防 止聚集体的生成，对于研究蛋白质复性有着重大意义。研究蛋白在吸附剂表面的 复性( 在蛋白质色谱分离中也称柱上复性) ，主要基于以下几点原因：( 1 ) 变性蛋白 在溶液中处于伸展状态，更利于与固定金属离子亲和吸附剂作用，通常在天然状 态下能够被i m a 吸附的蛋白，在变性条件下也能被吸附。吸附剂吸附目标蛋白后， 其它未吸附的杂质蛋自很容易除去，杂质的蛋白的减少会大大提高目标蛋白的复 性效果( 2 ) 缓慢减少吸附剂周围环境中的变性剂浓度，就可以启动目标蛋白的折 叠复性过程( 3 ) 由于目标蛋白质被约束在吸附剂表面特定空间里，无法自由移动 ( 但可以发生构象的变化) ，避免了聚集的发生，复性率较稀释、或透析复性可能 有所提高。“。对于吸附剂辅助蛋白复性的研究发现，吸附剂如果具有一定的疏水 结构区域，蛋白质复性率会明显提高，这可能与疏水作用为蛋白质折叠提供了部 分动力有关，同时疏水区域的存在也有利于稳定折叠的中间体，防止蛋白质聚集 的发生酬。 目前蛋白质的折叠理论较少，由于吸附剂表面的蛋白质折叠复性是一个逐 渐进行的过程，蛋白质折叠经历了许多中间体状态，通过分析这些中间体，对折 叠机理的研究有很大帮助。同时，研究吸附剂表面的蛋白质折叠复性也有重大的 实践意义。蛋白质分离工艺设计中，体现的一个重要思想就是过程的集合，即多 1 6 河南大学硕士学位论文 个分离步骤集中在一个步骤中完成“。过程的集合可以减少蛋白质的损失，降低 成本，节约时间。变性蛋白在吸附剂表面的复性将传统的三个步骤合为一步，如 图卜9 所示，因此大大提高了分离效率脚1 。 1 5 立题依据 图卜9 变性蛋白分离过程的集成 1 5 1 新型有机一无机复合载体i 姒吸附剂 载体材料是固定金属离子亲和吸附剂重要的组成部分，它为螯合基提供了基 质，也直接决定了螯合基的密度，同时，载体的物理化学性能也极大的影响着蛋白 质吸附过程。相对于有限的可供选择的螯合基和金属离子，新型载体的研究一直 是固定金属离子亲和吸附剂的增长点。 最早、最为广泛使用载体材料如琼脂糖凝胶，琼脂糖的粒度均匀，孔径分布 范围小，对生物大分子的非特异性吸附小，表面有密度适宜的可反应的活性基团， 便于连接螯合基。但是，随着固定金属离子亲和吸附技术的发展和不断工业化， 传统的软基质多糖类凝胶载体的缺点逐渐暴露出来。琼脂糖凝胶造价昂贵，由于 1 7 新型固定金属离子型亲和吸附剂的制备和性能研究 是水凝胶不耐压，在较低压力下结构就会产生压缩破坏。为提高其机械强度，常 采用增加交联度的办法，但耐压性提高不大，吸附性能反而大大下降。琼脂糖凝 胶的热稳定性也较差，5 0 以上就开始水解。这些缺点是使其难以满足目前工业 生产中对吸附材料高流速、高稳定性的要求，特别是9 0 年代以后，随着新的扩张 柱床吸附技术的发展，对吸附剂的机械性能要求进一步提高，寻找琼脂糖类软凝胶 的替代品成为热点。众所周知，硅胶类无机材料在一直是被最为广泛使用的吸附 材料。硅胶有高的机械强度和化学稳定性，而且其多孔的结构可根据不同需要进 行调节，各种硅胶孔径分布从小于2 n i i l 的小孔硅胶，2 5 0 册的中孔硅胶，到5 0 n i l l 以上的大孑l 硅胶目前都有成熟的产品。其中中孔、大孔硅胶可用于蛋白质的吸附。 但硅胶本身也有它的缺点，一是硅胶表面的硅羟基对各种蛋白质不加选择的强烈 吸附，造成很强的非特异性吸附：二是硅胶表面较天然多糖表面生物相容性较差， 吸附在硅胶表面的蛋白质更易发生变性而失活，从而沉积在吸附剂表面；三是硅 胶在p h 8 时不稳定，而许多蛋白质的分离纯化是在碱性环境中进行的。 利用硅胶表面的硅羟基进行反应，在无机硅胶表面创造出有机层，是制各各 种有机一无机复合型材料的常用手段。对于吸附材料来说，材料中的无机硅胶提供 多孔的刚性骨架，同时提高吸附剂的机械性能，而硅胶的使用也降低了吸附剂的 成本( 一般有机一无机硅胶复合型材料中，无机成分占7 0 以上) ，而有机层决定着 材料的吸附性能。通常采用两种方法在硅胶表面形成有机层：一“键和”法”， 以硅烷偶联剂为桥梁，在硅胶表面接台有机层；二“涂敷”法”“，将可溶性的低聚 物或单体制成溶液，均匀分布在硅胶表面上，然后蒸去溶剂，令低聚物或单体聚 合形成聚合物涂层。两种方法各有优缺点，常根据实际需要灵活选择。 有机一无机复合型亲和吸附剂，最早见于1 9 9 6 年“，目前最长采用的是壳聚糖 涂敷硅胶型i m a 吸附剂。”，壳聚糖作为一种含有氨基的碱性多糖，有一定的固定 金属的能力，但是壳聚糖缺乏类似亚氨基二乙酸的结构，螯合金属离子容易流失， 同时壳聚糖一金属离子的结构也给蛋白质的接近造成很大的空间阻力，这都大大降 低了材料吸附的性能，因此此类材料并未得到实际应用。 1 8 河南大学硕士学位论文 1 _ 5 2 新型载体材料一环糊精 环糊精是淀粉的酶解产物，在a 一淀粉酶的作用下，直链和支链淀粉中a 一1 ，4 糖苷键水解形成较小分子的直链聚合物一糊精，然后在环糊精葡萄糖苷转移酶的 作用下，形成环状结构的低聚糖化合物。常见的环糊精有三种：n 一环糊精 ( q c d ) 、b 一环糊精( b c d ) 和y 一环糊精( y - c d ) 。由于早期环糊精生成酶稳定 性差、产量低，分离、提纯时加入的有机沉淀剂产生毒性等原因，从而使环糊精 的研究与应用受到限制。直至七十年代中期，在解决了产量和毒性两大问题以后， 才实现了大规模的工业生产，也使环糊精的研究达到了前所未有的地步。近来， 国外各种环糊精及其衍生物在国外已广泛应用于医药、化工、农业、日用消费品 及生物技术等领域中。而我国环糊精生产和应用较晚，许多领域尚处于起步阶段。 辞三固 ab 图卜1 08 一环糊精结构示意图a ：平面结构b ：立体结构 b 一环糊精( 简称b c d ) 是环糊精中最常见的一种，由于生产成本低，应用最 为广泛。其分子量为1 1 3 5 ，结构如图卜1 0 所示，是由7 个葡萄糖单位经q l ，4 糖苷键连接成环形结构的糊精。b 一环糊精立体结构呈圆筒形，分子中间形成一个 穴洞，直径约0 6 5 n m ，分子两端开口，一端大，一端小。小端口处是由c 6 上的7 个伯羟基组成，大端口处是由c 2 、c 3 的1 4 个仲羟基组成，因此环糊精的外壁具 有很强的亲水性。同时b 一环糊精的内腔是由c 3 和c 5 上的氢原子与以上的氧原子 组成，由于c 3 和c 5 上的氢原子对c 1 上的氧原子的覆盖作用，使得环糊精的内腔 新型固定金属离子型亲和吸附剂的制备和性能研究 相对于外壁来说，呈现出一定的疏水性。环糊精可以在水溶液中选择性结合许 多有机、无机以及生物分子形成主一客体包合物( i n c l u s i o nc o m p o u n d s ) 。与客体 分子形成包合物是环糊精最重要的性质，所谓“包合”就是主体与客体通过分子 间相互作用，完成彼此间的识别过程，最终使得客体分子部分或全部嵌入主体内 部的现象，由于形成包合物的过程中没有共价键的破坏与形成，它们之间的主要 作用属于范德华力的范畴，因此这一类的化合物也称为超分子化合物 ( s u p e r m 0 1 e c u l ec o m p o u n d s ) 。表卜5 给出了环糊精的分子结构参数。 表卜5 环糊精的分子结构参数 环糊精包合物的制各、结构、性质和应用研究是环糊精化学的一个重要内容， 除此以外，有关环糊精的修饰、聚合和多重识别研究不仅能提供研究超分子领域 中弱相互作用和分子组装主体，同时修饰后的环糊精衍生物或环糊精聚合物也可 以作为很好的催化剂和酶模型，而广泛应用于仿生化学、催化和有机合成等众多 领域。在利用其包合能力的同时，人们也发现由于特殊的环状结构而没有还原末 端，环糊精与常见的线型多糖相比，具有较强的稳定性与抗水解能力，由此，各 种环糊精也被作为固定相材料在色谱领域得到广泛应用，如环糊精一硅胶柱常用于 手性有机小分子的分离1 。 环糊精和小分子化合物的作用已经有广泛和深入的研究，但环糊精和生物大 分子间的交互作用尚处于起步阶段，缺少系统的理论，许多模型和假设缺充分的 2 0 河南大学硕士学位论文 实验手段证明，这与生物大分子体系的复杂性和目前试验技术上的限制有关。虽 然环糊精的空腔无法包合整个蛋白质分子( 常见球型蛋白的分子直径在1 册以上) ， 但处于水溶液中时，蛋白质表面的氨基酸能部分嵌入环糊精空腔中，产生弱的超分 子包和作用，从而对蛋白质的行为产生影响。a a c h a n n 。”研究了环糊精与蛋白质 作用，发现环糊精的存在，能有效减弱蛋白质分子的集合，同时防止降解，这得 益于蛋白质表面易于产生集合或易于被蛋白酶进攻的氨基酸残基嵌入了环糊精空 腔。使用有环糊精存在的固定相分离、复性有机溶剂变性的蛋白质时，蛋白质的 复性率显著提高，许多以往无法复性的蛋白质在这类介质上都可获得较好的复性。 环糊精对蛋白质复性促进作用的机理可能也是由于环糊精空腔的存在，掩蔽了对