（动物学专业论文）黄粉虫发育过程中免疫活性差异研究.pdf

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p c r 方法测定经过三种处理后 黄粉虫三个虫态脂肪体的免疫相关基因的表达差异。 结果表明：总体上，黄粉虫脂肪体中p g r p 基因表达表现出随着生长发育过 程减少的趋势。在n a v e 组中，蛹期没有m r g 基因的表达，幼虫中有微弱的表达， 中文摘要黄粉虫发育过程中免疫活性差异研究 而成虫的表达量比较多；蛹期和成虫没有检测到抗真菌蛋白基因t e n e c i n3 和抗菌 革兰氏阳性菌蛋白基因t e n e c i nj 的表达，幼虫中只有微弱的表达。细菌刺激时， 这些免疫相关基因表达量都大量增加，且幼虫和成虫比蛹明显。没有进行处理时， 只有末龄幼虫和成虫的脂肪体内检测到少量的p p o 表达，而蛹则没有。经过细菌 处理，p p o 的表达量从末龄幼虫到成虫依次增加，即成虫的最高、蛹的次之、末 龄幼虫的最低。 通过研究我们发现黄粉虫的免疫活性具有明显的发育时期相关性，这表现为 免疫反应效应因子的活性和免疫相关基因的表达量上的差异。 关键词：黄粉虫；免疫反应；时期相关性；变态 n 作者：吴必顺 指导老师：许维岸 黄粉虫发育过程中免疫活性差异研究 英文摘要 t h ed i f f e r e n c eo fi m m u n o c o m p t e n c ed u r i n g d e v e l o p m e n t i nt h em e a l w o r mb e e t l e s ，t e n e b r i om o l i t o r ( i n s e c t ac o l e p t e r a ) a b s t r a c t i ni n s e c tp a t h o g e ni n t e r a c t i o n s ，h o s td e v e l o p m e n t a ls t a g ei sa m o n gs e v e r a lf a c t o r s t h a ti n f l u e n c et h e i n d u c t i o no fi m m u n er e s p o n s e s m u c hw o r kh a sr e p o r t e dt h a t v a r i a t i o n si ni m m u n i t yd u r i n gi n s e c t sm e t a m o r p h o s i s h o w e v e r , t h ev a r i a t i o ni s t a x a - r e l a t e d i no r d e rt ou n d e r s t a n dt h e c h a n g e si ni m m u n o c o m p e t e n e eo ft h r e e d e v e l o p m e n t a ls t a g e s ( 1 a s t i n s t a r l a r v a e ，p u p a e a n d a d u l t s ) d u r i n g i n s e c t s m e t a m o r p h o s i s ，m e a l w o r mb e e t l e s ( t e n e b r i om o l i t o r ) f r o me a c hs t a g ew e r ec h o s e nt o b ei n j e c t e d 、j i ，i 血l i v eb a c i l l u ss u b t i l i s i nt h i sp a p e r , t h ei n d i c a t o r so fs t a g e - r e l a t e d i m m u n ef u n c t i o n sw e r eq u a n t i f i e d u s i n gs t a n d a r di m m u n o c o m p e t e n c ea s s a y s i n a d d i t i o n , t h el e v e lo fi m m u n er e s p o n s er e l a t e dg e n e sm r n a a c r o s sd i f f e r e n ts t a g e s w e r ed e t e r m n e du s i n gr t - p c r o u rp r e l i m i n a r ys t u d i e sw i l lp r o v i d et h e o r ye v i d e n c e s f o rt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e na n t i m i e r o b i a lr e s p o n s ea n dm e t a b o l i cp r o c e s s e sa n d r e p r o d u c t i o nd u r i n gi n s e c t sm e t a m o r p h o s i s ，a n dp r o v i d e dav a l u a b l ei n s i g h ti n t ot h e i n s e c tb i o e c o l o g ya tm o l e c u l a rb i o l o g y t w om a i na s p e c t sa l ei n v o l v e d 1 ) s t u d i e so nt h ed i f f e r e n c eo fi m m r n er e s p o n s e t h em e a l w o r mb e e t l ezm o l i t o r t h a tn e w l yf o r m e dl a s ti n s t a rl a r v a e ( 13 mi n s t a o ，p u p a ea n da d u l t sw e r ec o l l e c t e dw i t h i n o n ed a yt ob ei n f e c t e db yl i v eas u b t i l i s a n dw ei n v e s t i g a t e dt h em a g n i t u d ev a r i a t i o n i np h e n o l o x i d a s e ( p o ) a c t i v i t y , l y s o z y m er e l a t i v ea c t i v i t y ( l r a ) ，a n t i m i c r o b i a la c t i v i t y , t o t a lh a e m o c y t e sc o u n t ( t h c ) ，t o t a lh a e m o c y t e sm i c r o a g g r e g a t e sc o u n t ( t h m c ) ， h a e m o c y t e sp h a g o c y t o s i sa n dh a c m o c y t e ss p r e a d i n gc o m p e t e n c ei nh a e m o l y m p ha f t e r 2 4 h t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl a s ti n s t a rl a r v a ek e p tt h eh i g h e s tt h c ，h a e m o c y t e s p h a g o c y t o s i sc o m p e t e n c ea n dh a e m o c y t e ss p r e a d i n gc o m p e t e n c ec o m p a r e dt op u p a e i i i 英文摘要黄粉虫发育过程中免疫活性差异研究 a n da d u l t s i na d d i t i o n ，l a s ti n s t a rl a r v a ea s s e m b l e dm u c hm o r el r aa n da n t i m i c r o b i a l a c t i v i t yt h a np u p a e ，b u th a dt h el o w e s tp oa c t i v i t yi ni t sh a e m o l y m p h a ts a m et i m e t h m ca n dh a e m o c y t e ss p r e a d i n gp e r c e n t a g ew a sr e m a r k a b l yi n c r e a s e db yi l n m u n e i n s u l t s ，e s p e c i a l l ym o r es i g n i f i c a n ti nl a s ti n s t a rl a r v a et h a ni no t h e r s a l t h o u g hp u p a e p o s s e dh i l g ht h ca n dh a e m o c y t e sp h a g o c y t o s i sc o m p e t e n c e ，i t sl r aa n da n t i m i c r o b i a l a c t i v i t yw a sm u c h m o r el o w e rt h a na d u l t s t h e r ew a st h eh i g h e s tp o a c t i v i t yi na d u l t s ， b u tt h ca n dh a e m o c y t e sp h a g o c y t o s i sc o m p e t e n c ea n dh a e m o c y t e ss p r e a d i n g c o m p e t e n c ed i m i n i s h e dt o w a r d so l d e rs t a g e s s ol a s ti n s t a rl a r v a ep o s s e s st h em o s t v i g o r o u sc e l l u l a ri m m u n i t ya n dh i 曲h u m o r a li m m u n i t y ；p u p a em a i n t a i nah i g hc e l l u l a r i m m u n i t y ；w h e r e a sa d u l t sa s s e m b l et h em o s tp r o n o u n c e dh u m o r a li m m u n i t yi ng e n e r a l 2 ) t h ev a r i a t i o n so fi m m u n i t yr e l a t e dg e n e st r a n s c r i p t i o n t h el e v e lo fr e l a t e d g e n e s ( m r a ，p g r p , t e n e c i nj ，t e n e c i n3 ，p p o ) m r n ae x p r e s s i o na c r o s sd i f f e r e n t s t a g e si ni m m u n er e s p o n s ea f t e rt h r e et r e a m e n t sw e r ed e t e r n m e du s i n gr t - p c i l t h er e s u l t sp r e s e n t e dt h a tt h ep g r pt r a n s c r i p ti nf a tb o d yo fzm o l i t o rd e c l i n e d 晰t l ld e v e l o p m e n ti ng e n e r a l i nn a i v eg r o u p ，m r gd i d n te x p r e s si np u a p e ，a n dw e a k l y i nl a s ti n s t a rl a r v a e ，w h i l em u c hi na d u l t s ；t e n e c i n3 ( a n t i f u n g a lp r o t e i ng e n e ) a n d t e n e c i n ( a n t i b a c t e r i a lp e p t i d eg e n e ) m r n aw e r en o te x p r e s s e di np u p a ea n da d u l t ，b u t w e a k l yi nl a s ti n s t a rl a r v a e i nc o n s t r a s t , t h e yw e r oa b u n d a n t l ye x p r e s s e di nl a r v a ea n d a d u l t s ，w h i l el i t t l ew a sd e t e c t e di np u p a ea f t e ri m m u n ec h a l l e n g eb y 丑s u b t i l i s i nn a i v e g r o u p ，p p ow a sn o td e t e c t e di np u p a e ，b u tal i t t l ei n l a s ti n s t a rl a r v a ea n da d u l t s i t i n c r e a s e df r o ml a s ti n s t a rl a r v a et oa d u l t sb yt u r n s ，n a m e l y , p p ot r a n s c r i p tw a st h em o s t i na d u l t s ，n e x ti np u a p e ，t h e ni nl a s ti n s t a rl a r v a e t a k et o g e t h e r , a l le v i d e n c e sw e r ep r o v i d e di nt h i sp a p e r , s u g g e s t i n gt h a tt h e i m m u n er e s p o n s e so fzm o l i t o ri sd e v e l o p m e n t a ls t a g e s - r e l a t e d ，a n dt h i sw a ss h o w nb y t h e d e v e l o p m e n t a la c t i v i t y o ft h ei l n m u n e r e s p o n s e e f f e c t i v e f a c t o r sa n dt h e s t a g e s - d e p e n d e n ti m m u n er e s p o n s er e l a t e dg e n e st r a n s c r i p t k e yw o r d s ：t e n e b r i om o l i t o r ；i m m u n er e s p o n s e ；s t a g e s - r e l a t e d ；m e t a m o r p h o s i s w r i t t e n b y ：w u b i s h u n s u p e r v i s e db y ：x u w e i a n i v 目录 前言”j 1莉罱l 文献综述3 1 昆虫免疫3 2 免疫反应的发育时期相关性1 0 3 免疫反应和发育时期相关性的原因分析1 4 4 国内研究进展：1 7 5 展望“1 7 第一章黄粉虫不同发育时期体液免疫差异研究：1 9 实验材料1 9 实验方法2 0 结果与分析“2 3 讨论2 7 第二章黄粉虫不同发育时期细胞免疫差异3 0 实验材料3 0 实验方法，“3l 结果与分析3 4 讨论4 0 第三章黄粉虫不同发育时期免疫反应相关基因差异表达”4 2 实验材料4 2 实验方法“ 结果与分析4 8 讨论5 7 总结与展望- 6 0 参考文献“一6 2 中英文缩略词表一7 8 硕士在读期间发表论文”7 9 致 射8 0 黄粉虫发育过程中免疫活性差异研究前言 厶_ | 月i j 吾 昆虫生活在自然界必然遭受许多细菌的威胁，因此有效的抵御病菌的入侵和 自我防御保护是昆虫成功生存的重要保障。昆虫抵御病原菌的入侵主要靠许多不 同的生理屏障和免疫功能完成。生理屏障包括表皮中的角质层覆盖物、壳质的气 管、中肠腔合成的围食膜基质【l 】。当细菌突破物理屏障后，昆虫便启动自身的免疫 功能以杀死入侵物。它们缺乏获得性免疫系统以及b 和t 淋巴细胞，但具有很发 达的先天性免疫系统能对感染因子作出迅速反应。昆虫先天性免疫系统依赖于体 液免疫和细胞免疫。 昆虫的免疫反应不是持续的，而是受到感染后在某个时间段增强。因此在昆 虫不同发育时期，其免疫能力可能有很大的差异。最近通过许多对果蝇的研究发 现它的先天免疫反应能力随生长发育下降陆3 4 1 。埃及伊蚊( a e d e sa e g y p t o 受大肠杆 菌免疫刺激后，发现随着生长发育虫体清除细菌能力下降，死亡率升高，说明其 总体的免疫反应能力也是随着发育过程下降【5 1 。通过对免疫反应的组分研究发现， 它们在不同的发育时期其活性也存在差异。烟草夜蛾五龄幼虫的中肠上皮细胞匀 浆的溶菌酶活性在前五天很低或者没有，而从第六天开始伴随着取食停止和游动 期的启动，肠消化道的溶菌酶活性快速增加【6 j 。迸一步研究发现在昆虫不同发育时 期免疫反应相关的基因表达也存在差异。j i a n g 等人发现烟草天蛾幼虫的五岭取食 阶段没有p 1 ，3 葡聚糖识别蛋白2 ( b g r p 2 ) 表达，但是在游动期时m r n a 和蛋白 质都出现快速上调表达【7 1 。p o 作为昆虫体内最为重要的一类酶，在不同的发育时 期其活性以及表达也存在差异。甜菜夜蛾血清中p o 活性在游动期和预蛹幼虫阶段 与六龄幼虫相比明显的增加【8 】：蜜蜂成虫中p p o 基因表达量更多，而在年轻蛹和幼 虫中则相对少【9 1 ，c h a r t 等人还发现成虫工蜂与幼虫相比，血淋巴中p p o 表达量相 差5 0 倍l 川。 通过前人现有的研究发现，昆虫这种免疫反应的时期相关性并不是规律的随 着发育过程变化，而是在不同种属的昆虫中，存在不一样的变化规律。果蝇的先 天免疫反应能力随生长发育下降；m e y l a e r s 等人发现蜡螟血淋巴的抗菌活性最强是 在蛹期，其次是幼虫，最后是成虫【1 1 】；而老龄蜜蜂( 看护蜂和工蜂) 中的免疫活 性比年轻蜜蜂( 幼虫，蛹) 更强。s c h m i d 等人报道看护蜂与工蜂相比其p o 活性增 加，血淋巴总数减少1 1 2 1 。 前言黄粉虫发育过程中免疫活性差异研究 昆虫免疫反应的变化是复杂的，即使在同一个体中体液免疫和血细胞免疫的 变化也不相同。棉贪夜蛾( s p o d o p t e r al i t t o r a l i s ) 早期幼虫与晚期幼虫相比具有更 强的包囊作用，即在四龄期很低，五龄则很少，六龄中没有包囊作用；相反的， 晚期幼虫与早期幼虫相比具有更强的体液免疫反应【1 3 】。还有更多的的研究发现早 期幼虫比晚期幼虫的包囊作用更有效【1 4 1 。当然它们也有可能在昆虫的个体发育过 程中没有很大的变化，如蜜蜂的四个发育时期( 幼虫、蛹、看护蜂和工蜂) 血细 胞包囊作用基本保持一致【1 5 1 。 目前国内也有一些相关方面的报道：马尾松毛虫p o 活性随着虫龄的增加而升 高【1 6 】；黄粉虫在不同虫态时期其抗菌肽活性存在差异，幼虫最高，成虫最低，并 且进一步研究了其蛋白质表达差异【1 7 】；小菜夜蛾四龄幼虫p o 活性高于预蛹，预蛹 高于成熟状态的蛹【1 8 】。就国内外研究情况看，虽然许多文章表明免疫相关基因在 幼虫之间以及幼虫期表达改变，但是这种改变对免疫活性意义很少研究；现有人 比较了昆虫不同龄期或不同虫态之间某些免疫反应指标，但并没有系统的研究昆 虫整个发育过程的免疫反应变化，且单一的免疫反应指标不能反映总的昆虫免疫 反应策略。 黄粉虫俗称面包虫，属鞘翅目，拟步行虫科，粉甲虫属，它的生活史要经历 四个时期，即卵、幼虫、蛹和成虫。虽然有人研究了黄粉虫虫t e n e c i n3m r n a 在 幼虫、蛹和成虫间的差异表达，但是目前还没有系统研究黄粉虫免疫反应与发育 时期相关性的报道。我们选用黄粉虫三个发育时期( 末龄幼虫、蛹和成虫蛹) ，以 三种不同处理方式研究了其体液免疫和细胞免疫以及免疫相关基因的表达情况及 其在免疫效应中的影响，同时探讨其对细菌刺激的免疫反应能力。从而全面的探 讨黄粉虫在不同的发育时期其免疫功能与生长发育过程的关系。这为今后研究昆 虫在发育过程中的免疫反应与新陈代谢、繁殖等生理功能的相互关系提供一定的 理论依据，也为昆虫生态学的研究提供分子水平上的证据。另外黄粉虫是主要的 仓储害虫和重要生物资源库，通过该研究可以为黄粉虫的防治和生物资源的利用 提供一定的实践指导。 2 黄粉虫发育过程中免疫活性差异研究文献综述 文献综述 目前越来越多的学者以昆虫作为研究免疫反应和发育过程相关性的模式生 物。该研究以昆虫作为模式生物具有以下优势：繁殖时间短、寿命短以及可以进 行大量的研究，以减少环境因素对免疫反应测定的影响从而增加统计学说服力。 无脊椎动物只有先天免疫反应缺乏获得性免疫，它们的免疫反应也具有免疫记忆 1 9 1 。研究认为无脊椎动物的免疫记忆是由于现有细胞的再调整加强它们在遭遇病 原物前的吞噬能力，这与获得性免疫的b 和t 淋巴细胞免疫记忆是不同的，目前 该研究还不是很透彻。昆虫缺乏获得性免疫系统也是我们研究免疫功能与发育关 系的一个优势，因为这样我们就可以在没有获得性免疫反应干扰的前提下研究发 育过程与先天免疫反应的关系。由于先天免疫的进化保守性，对于昆虫的发育时 期相关性的先天免疫活性的研究，可以为多细胞动物的先天免疫发育时期相关性 研究提供依据。 关键词：免疫反应；细胞免疫；体液免疫；发育过程；模式生物 1 昆虫免疫 昆虫生活于自然界中必然遭受许多病原菌的威胁，因此有效的抵御病原物入 侵和自我防御保护对昆虫的成功生存起重要的作用。免疫系统在这个过程中扮演 着重要角色，昆虫缺乏获得性免疫系统以及b 、t 淋巴细胞，但是它们有发达的先 天性免疫系统，能对感染因子作出迅速反应。昆虫免疫反应主要由血细胞免疫和 体液免疫组成。血细胞反应包括吞噬作用、结节作用和包囊作用；体液免疫包括 多种抗菌肽、溶菌酶、酚氧化酶、调节血淋巴凝血和黑化的酶级联反应以及产生 的活性氧族( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sr o s ) 和活性氮族( r e a c t i v en i t r o g e ns p e c i e s r n s ) 。这些组分的发育过程中相关性的改变，都可能引起免疫系统效应性的变化。 1 1 免疫反应的激活 昆虫免疫反应的发生主要通过宿主识别非己外源入侵物后诱导。大部分的昆 虫其识别过程主要由血淋巴或血细胞膜上的模式识别受体【2 0 2 1 ，2 2 2 3 2 4 1 识别并结合 微生物中进化保守的分子结构完成。这些分子结构在高级有机体内不存在，具有 特异性，称为病原体相关性分子模式( p a t h o g e na s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a t t e r n ，p a m p ) 。 比如，革兰氏阴性菌( g - ) 的脂多糖类和脂胞壁酸质、革兰氏阳性菌( g + ) 的肽 文献综述黄粉虫发育过程中免疫活性差异研究 聚糖组分、真菌的b 1 ，3 葡聚糖、寄生虫的糖基磷酯酰氨醇等1 2 2 ，2 5 捌。昆虫能够 产生相应的模式识别蛋白( p a t t e r nr e c o g n i t i o np r o t e i n s ，p r p s ) 识别这些p a m p ，如肽聚 糖识别蛋i 兰t ( p e p t i d o g l y e a nr e c o g n i t i o n - b i n d i n gp r o t e i n ，p g i 冲) 跚，c 型凝集素( c - t y p e l e e t i n s ，c t l s ) 1 2 7 1 、g - 菌结合蛋白( g r a mn e g a t i v eb i n d i n gp r o t e i n , g n b p ) 、含硫酯蛋 i 圭t ( t h i o e s t e rc o n t a i n i n gp r o t e i n s ，t e p s ) 、清道夫受体( s c a v e n g e rr e c e p t o r s ，s c r s ) 、半 乳糖苷结合凝集素( g a l a c t o s i d eb i n d m gl e c t i n s ，g a l e ) 、纤维蛋白原样功能域免疫凝 集素( f i b r i n o g e nl i k ed o m a i ni m m u n o l e e t i n s ，f b n s ) 及b 1 ，3 葡聚糖结合蛋白( b e t a1 ，3 - g l u c a nr e c o g n i t i o np r o t e i n s ，g r p ) 等。这些受体有的与脊椎动物的模式识别受体具有 较高的同源序列 2 8 ，2 9 , 3 0 ，这也说明昆虫对病原体的识别的策略上是进化保守的。 通过昆虫现有的研究资料发现，模式识别受体对病原物的识别并结合后可以 激活分泌抗菌肽以及细胞免疫反应的信号通路，也可引起一系列的蛋白水解级联， 从而导致血液凝固和有些昆虫的局部黑化【2 1 3 1 ，3 2 1 。但是有趣的是在秀丽隐杆线虫 ( c a e n o r h a b d i t i s 础御珊) 中不存在调节引起黑化的蛋白水解通路的同源基因哪j 。黑 化反应依赖于酪氨酸代谢途径，如图1 1 ：机体对微生物的细胞壁成份p g n t 3 4 1 和 p - 1 ，3 葡聚糖【3 5 】等p a m p s 识别启动丝氨酸蛋白酶级联反应，从而导致酚氧化酶原 ( p p o ) 激活成有活性的酚氧化酶( p o ) ，它的释放引起产生黑色素的一系列反 应【3 1 1 。黑色素沉积在伤口处，从而引起伤口愈合和伴随黑色素产生的毒素活性组 分，而起到杀菌作用【3 6 , 3 7 , 3 8 1 。 隙陌；t 阳y r o j l l s l n 茸 下羔燎= l 一篇二n 啪a 脚r 乒 l i n 晶蚋s , ed t h y d r o x 蚋n d o l e 。： 量 瓤 l删滁翻；州 图1 - 1 昆虫酪氨酸代谢过程 f i g 1 - 1t y r o s i n em e t a b o l i s mi ni n s e c t s 4 黄粉虫发育过程中免疫活性差异研究文献综述 细胞免疫反应的免疫激活比较复杂，昆虫对外源入侵物识别后，通过不同的 信号途径激活相应的细胞免疫作用。目前认为血细胞免疫的激活方式有：j a k s t a t 信号通路、d r a p e r s r c s y k 途径和f a k s r c 途径。如图1 - 2 ： 图1 2 昆虫血细胞免疫反应信号通路 f i g 1 - 2s i g n a l l i n gp a t h w a y si ni n s e c th a e m o e y t ei m m u n i t y 1 2 血细胞免疫 昆虫血细胞免疫主要包括吞噬作用、结节作用和包囊作用。其中细胞吞噬作 5 文献综述黄粉虫发育过程中免疫活性差异研究 用主要针对比较小的病原物，而包囊作用主要针对较大的难以通过吞噬作用清除 的病原物。大部分的无脊椎动物的血细胞都有吞噬作用，而秀丽隐杆线虫 ( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 的血细胞没有吞噬能力【3 l 】。吞噬作用主要是通过浆细胞 或粒细胞在血淋巴中的循环来实现的，其它的血细胞如类绛色细胞也能吸收病原 体。现已报道烟草夜蛾( m a n d u c as e x t a ) 的吞噬细胞与脊椎动物的吞噬细胞有明 显的功能性区别。果蝇d r o s o p h i l a 中，有三种不同的血细胞参与多种免疫反应： 浆细胞( p l a s m a t o c y t c s ) 、晶细胞和层状细胞( 1 a m e l l o c y t e s ) 【3 9 】。浆细胞是吞噬细 胞，占幼虫中血细胞总数的9 5 以上，是成虫中唯一的血细胞 4 0 1 。晶细胞是小的 血细胞，含有引起p o 级联的酶类。包囊作用和黑化作用参与太大而难以吞噬的大 颗粒的清除，是无脊椎动物特有的特征。参与其细胞聚集的细胞是浆细胞和粒血 细胞( g r a n u l o c y t e s ) 【4 1 1 。果蝇包囊反应仅发生在幼虫时期，主要通过由幼虫的浆 细胞分化产生的层状细胞完成【4 2 】。 吞噬作用包括病原物的结合、细胞质膜再生、细胞骨架诱导变化以及吞噬小 体摄入微生物等复杂的细胞变化过程。通过模式生物以及大规模的基因组研究， 开始初步揭示了调节其过程的基因【4 3 1 。许多受体蛋白家族在浆细胞对微生物的结 合过程很重要。已知的受体蛋白家族包括与哺乳动物c d 3 6 家族同源的果蝇清道夫 蛋白m 、清道夫受体类的c 型1 家族m 5 1 、肽聚糖受体蛋白m 、具有e g f 样重复 的蛋白如e a t e r 4 7 和n i m r o d 【4 阳、免疫球蛋白超家族成员h e m o l i n 4 9 、整合素【5 0 】以 及具有免疫球蛋白功能域的三b c 口聊【5 l 】。d s c a m 基因具有四个选择切害- u ：t b 显子，果 蝇中不同的结合可以产生1 8 0 0 0 多种的转录本，而在按蚊a n o p h e l e s 中可以达3 0 0 0 0 种，这样它们可以识别大量不同的病原物，并可能提供免疫记忆的机制。通过基 因组大范围的r n 硝m 能5 2 】以及r n a i 分析【5 3 】揭露了细胞内摄作用和血细胞聚集过 程需要数百种基因的参与。 目前该研究最大的问题是这些复杂的基因网络是怎么样组织起来调节吞噬作 用。有研究发现血细胞吞噬涉及到血细胞微聚体的形成，而这个过程是受类花生 酸类物质【5 4 1 和血小板激活因子( p l a t e l e t a c t i v a t i n gf a c t o r , p a f ) 5 5 】的调节。类花生 酸类物质还参与了结节作用的调节1 5 6 , 5 7 , 5 8 ，但是这种作用具有一定阶段性。用抑制 剂( c y c l o o x y g e n a s e ，l i p o x y g e n a s e 抑制剂) 可以削弱实验组蜜蜂的血细胞结节能力， 但对老龄成虫没有作用【5 9 1 。信号通路中一些关键酶参与调节血细胞的吞噬活性， 内分泌系统中的一些激素类物质也可以调节吞噬作用。在体外实验证实，用川楝 6 黄粉虫发育过程中免疫活性差异研究 文献综述 素处理猎椿( r h o d n i u sp r o l i x u s ) 单层血细胞，明显降低了其吞噬活性，但是这种 抑制作用可以被蜕皮激素拮抗【6 0 】，这可能是由于川楝素不可逆的阻断了前胸腺蜕 皮激素的产生【6 l 】。 包囊作用的主要过程是当血浆识别不能通过吞噬作用清除入侵物时，将信号 传递给淋巴腺( 1 y m p hg l a n d s ) ，从而触发原血细胞( p r o h a e m o c y t e s ) 大量分化成 层状细胞。粒血细胞通过膜上受体识别异物，接触后释放出趋化性物质，诱使浆 血细胞附着到外源物表面，再形成由多层细胞构成的密封包囊结构。这些细胞附 着后大都坏死或者自溶，接下来常有局部p p o 级联激活反应活化释放的酚类化合 物逐步黑化，醌或半醌类杀死入侵物【6 2 】和黑化包囊反应发生。包囊反应发生时， 血淋巴细胞需要通过黏附蛋白活性的调节由非黏附状态转换成黏附状态，这是包 囊反应的关键步骤【6 3 1 。 无脊椎动物还可以产生补体型蛋白，作为调理作用加强血细胞吞噬。在冈比 亚按蚊( a n o p h e l e s g a m b i a e ) 中，一种循环的含硫酯键蛋白( a t e p 1 ) 可以结合革兰 氏阳性菌和革兰氏阴性菌，并刺激血细胞吞噬【6 4 1 。果蝇d r o s o p h i l a 基因组至少编 码四种t e p 样基因，其中三种在免疫刺激后上调表达，另一种受j a k s t a t 信号 通路上调表达 6 5 , 6 6 , 6 7 】。t e p 编码的蛋白与哺乳动物的补体蛋白c 3 q2 巨球蛋白超 家族具有明显的相似性【眠6 引，这也支持了这种蛋白的主要功能是促进吞噬作用在 进化上保守。 值得说明的是，昆虫血细胞吞噬可能不止一个信号调节途径。在a g a m b i a e 的c e d 基因敲除实验表明与许多和ce l e g a n sc e d 的同源基因可明显影响对细 菌的吞噬作用。特别是a g a m b i a e 其c e d 5 或c e d 6 同源体沉默后可减少吞噬5 0 对革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌。另外，刺激失活c e d 5 和c e d 6 基因可减少8 0 的吞噬作用，这表明至少有两种不同的信号途径调节着a g a m b i a e 的吞噬作用。 最近的研究发现，昆虫体内的激素也可以调节血细胞的结节和包囊作用，2 0 - 羟基蜕皮酮( 2 0 e ) 及其类似物( r h 2 4 8 5 ，r h 0 3 4 5 ，r h 5 8 4 9 ) 可以加强海带多糖 诱导的结节反应，而保幼激素及其类似物( j h a ) 苯氧威和吡丙醚的作用却相反【6 9 】， 且这种作用并具有剂量依赖效应。而在果蝇的蜕皮激素水平很低或者蜕皮激素信 号被阻断时，寄生蜂卵感染的果蝇，其血细胞包囊作用急剧减弱【7 0 1 。 1 3 体液免疫 体液免疫包括多种抗菌肽、溶菌酶、酚氧化酶、调节血淋巴凝血和黑化的酶 7 文献综述黄粉虫发育过程中免疫活性差异研究 级联反应以及产生的r o s 和r n s 。果蝇a m p $ 的产生主要通过调节昆虫脂肪体 n f r , b 转录因子产生的两种信号通路。比较基因组研究表明这种信号通路在许多 昆虫中进化保守【7 1 , 7 2 , 7 3 】。另外功能遗传学研究和基因组序列比较研究表明调节这些 信号的基因与调节哺乳动物的先天免疫反应的基因具有相似性【2 l 。 果蝇中。t o l l 信号通路和免疫缺陷通路( i m d ) 调节产生超过2 0 种不同的 a m p s 7 5 1 ，如图1 2 a 。t o l l 通路与哺乳动物的t o l l 样受体( t l r ) 信号通路相似， 它的激活主要是宿主通过对病原体识别后，将信号传导给一蛋白水解级联过程， 最后导致细胞因子样多肽s # l t z l e ( s p z ) 的剪切。之后，s p z 结合并激活t o l l 受体的 活性。t o l l 蛋白最早在果蝇体内发现，是果蝇胚胎发育时期调节背腹部体轴发育所 必需的蛋白成分，它参与了果蝇发育过程中背腹模式的形成。后来又发现它是果 蝇先天免疫中抗微生物感染作用的重要受体。t l r 家族到目前为止共发现有l o 类受 体，其中对由j a n e w a y 等人在1 9 9 7 年发现的t l r 4 分子的研究最为深入和全面，它是 在人类发现的第一个t o l l 相关蛋白。t o l l 受体的构象发生变化激活后，随之导致至 少三种胞浆蛋白( m y d 8 8 、t u b e 和p e l l e ) 的聚集。m y d 8 8 是一个含有死亡结构域 ( d e a t hd o m a i n ，d d ) ，m y d 8 8 将信号传递给另一个含有d d 的蛋白t u b e 。随后通过 d d 作用与p e l l e 结合，p e l l e 是一种丝氨酸一苏氨酸激酶，能够促使c a c t u s 发生磷酸 化和蛋白水解作用。这三个蛋白和t o l l 自身构成t r e c e p t o r - a d a p t o r 复合物。c a c t u s 是h o b 家族蛋白的一个成员，通常结合并抑制n f k b 转录因子d o r s