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(动物学专业论文)云南地区恒河猴mhc部分基因频率及多态性的分析.pdf.pdf 免费下载
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文档简介
云南地区恒河猴删c 部分基因频率及多态性的分析 t h ea n a l y s i so fp a r t so f 删cg e n ef r e q u e n c i e sa n d p 0 1 y m o r p h i s mo f 埘白c a c a 口7 d a 妇p o p u l a t i o ni ny u n n a n 研究生:陈瑾 导师:孙晓梅( 副研究员) 导师组:代解杰( 研究员) 唐东红( 副主任技师) 学科专业:动物学 研究方向:实验动物 入学时间:二o o 五年九月 所在院所:医学生物学研究所 二0 0 八年六月 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 摘要 不同种群的恒河猴( 物胧刀a r 芒a ) m h c ( m 旬o rl l i s t o c o m p a t i b i l i 够 c o m p l e x ) 基因的差异性,很大程度上影响了用其作为动物模型的实验研究结果 的稳定性、可靠性和可重复性。因此清晰的了解云南地区恒河猴种群免疫遗传学 背景对于运用该种群开展各项研究是非常重要的。 恒河猴删ci 类基因m a m u ( 胞阳删厶f 细m h cg e n e ) 一a 目前已有大量报道 证明它与很多疾病的易感性和发病进程相关。m a m u a 木0 1 位点阳性就被公认与猴 免疫缺陷病毒( s i v ) 的感染与延缓病程相联系。另外a 木0 2 、a 木0 4 也有报道 证实这两个位点同样与s i v 感染后的病程发展有关;m a m u i i 类基因在很多疾 病尤其是病毒感染中也起了非常重要的作用,部分位点被证明也与s i v 感染后的 病程发展有关。 针对目前研究热点的恒河猴删c 基因m 锄ui 类基因及i i 类基因部分位点, 采用序列特异性引物一聚合酶链式反应分型方法( p c r s s p ) ,对云南地区的1 4 0 只恒河猴( 其中9 2 只来源于云南景东野外自然繁殖群、4 8 只来源于本灵长类中 心自繁群) 的m 锄ui 类基因m 锄u a 木0 l 至a 木0 6 这6 个等位基因,和m a m u i i 类基因m a m u d r b 区的m 锄u d r b l 木0 3 0 3 、0 3 0 5 0 6 、0 3 0 9 、0 4 0 3 、1 0 0 5 0 7 ; d r b 3 木0 4 0 3 ;d r b 5 ,i c 0 3 0 i 0 2 ;d r b 6 木0 1 0 l 、0 1 0 3 、0 1 0 4 0 5 这1 0 个等位基因进行 检测。统计结果显示m 锄ui 类基因m a m u a 木0 1 至a 木0 6 位点结果为阴性;所 检测的m 锄ui i 类基因m a m u d r b 区1 0 个等位基因阳性率分别为,野外群 d r b l 木0 3 0 5 0 6 位点3 4 8 ;d r b l 木0 3 0 9 位点4 1 3 ;d r b l 木0 4 0 3 位点2 7 2 ; d r b 3 术0 4 0 3 位点4 0 2 ;d r b 6 术0 1 0 l 位点4 0 2 ;d r b 6 术0 1 0 3 位点9 5 7 。自繁群 d r b l 木0 3 0 5 0 6 位点4 5 8 ;d r b l 术0 3 0 9 位点5 8 3 ;d r b l 木0 4 0 3 位点2 2 9 ; d r b 3 木0 4 0 3 位点6 6 7 ;d r b 6 半0 1 0 l 位点5 4 2 ;d r b 6 术0 1 0 3 位点6 2 5 ,其余位 点结果为阴性。与国内其他地区及印度猴群比较发现,云南地区的猴群携带的 删c 基因有所不同。另外比较云南地区的野外群与自繁群的删c 基因情况发现, 这两个群体间并未出现基因多态性的显著差别。 为进一步验证检测出的各位点各等位基因扩增产物的正确性,选取i i 类基因 m a 叫一d r b 区的m a m u d r b l 木0 3 0 5 0 6 、0 3 0 9 位点进行了部分测序并结合单链构象 多态性分析( s s c p ) 的方法进行深入分析。发现抽取的三个m a 叫一d r b l 牢0 3 0 5 0 6 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 位点阳性样本测序结果中2 个与g e n b a n k 参考序列完全相同,另一个检测出5 个碱基的突变;随机抽取的2 个m a 舢一d r b l 冰0 3 0 9 位点阳性样本测序结果都与 g e n b a n k 参考序列完全相同。s s c p 检测结果显示有大于8 0 的阳性样本与测序样 本相同,即含同一等位基因,引物针对本次实验研究种群特异性较好。初步证明 用s s c p 方法进行准确性控制是可行的。 直接测序和s s c p 两种方法的结合使用,能够在避免大规模测序的同时较好 的保证检测结果的正确性,大大节约研究成本 关键词:恒河猴;m h c 基因;m a m ui 类基因;m a 舢i i 类基因;p c r s s p ; s s c p ; 基因频率;多态性 2 中围医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 a b s t r a c t m h c g e n ed i v e r s i t i e sa r ew i d e l ye x i s t e n c ei nr h e s u sm a c a q u ef m a 所“肠以口) p o p u l a t i o n 丘o md i f r e r e n tg e o 粤a p l l i c a lo n g i n ,i tc a ni n n u e n c et 1 1 es 劬i l i 哆,r e l ia _ b i l i 够 a 1 1 dr e p r o d u c i b i l i t yo f 也ee x p 甜m e n t a lr e s u l t t h e r e f o r e ,i 1 1o r d e rt oe v a l u a t et h e r e s u l t so fr e s e a r c h ,i t s v e 巧i m p o r r t a n tt ou n d e r s t a n d i n gm ei m m u n o g e n e t i c s b a c k g r o u n do fo u rr h e s u sm a c a q u ep o p u l a t i o n m a c a c am u l a t t am h c g e n ec l a s sim 锄u aa l l e l e sw a sp r o v e dt 0a s s o c i a t e dw i m s u s c e p t i b i l i 够a n dp r o 伊e s s i o no fm a n yd i s e a s e s t h ek e yr o l eo fm a i 】u a 木0 1a 1 1 e i e s i i l m a c a q u e si n f e c t e dw i ms i m i a ni m m m l o d e f i c i e n c yv i m s ( s i v ) w a sw i d e l y a c c e p t e d t h eo t h e ra l l e l e sm 删一a 搴0 2 、a 木0 4w a sa l s op r o v e dt oa s s o c i a t e dw i t h s i n f e c t i o n m a m uc l a s si ig e n ep l a yav e r yi m p o r t e n tr 0 1 ei nv i m si n f e c t i o n s o m e o ft h e mw a sd e m o n s t r a t e dt 0r e l e v e n tt 0s i n f e c t i o n 朋如口c 口聊甜7 a 蹦口m h cg e n e t i cc h a r a c t e r i z a t i o nb e c o m e san e wr e s e a 1 1 i n g h o t s p o t h 1t h j sr e p o r t ,s o m e1 0 c u sl o c a t e do nm 锄uc l a s sia i l di ig e n eo fr h e s u s m a c a q u ew e r ea 1 1 a l y z e db yp 0 1 y m e r a l s ec h a i nr e a c t i o nw i ms e q u e n c e - s p e c i f i c p r i m e r s ( p c r - s s p ) 。 s 政a l l e l e si nm h cc l a s sia r e g i o n ( 自o mm 锄u a 木0 1t oa 木 0 6 ) a n dt e na l l e l e so ff o l l rl o c l l si 1 1m h cc l a s si id r br e 百o n ( m 锄_ u d r b l 宰0 3 0 3 、 0 3 0 0 6 、0 3 0 9 、0 4 0 3 、l 0 0 5 0 7 ;d r b 3 宰0 4 0 3 ;d i 乇b 5 堆0 3 0 i 0 2 :d r b 6 木0 1 0 1 、0 1 0 3 、 o10 4 0 5 ) o f14 0y u n n a no r i g i nr h e s u sm a c a q u ew e r et y p e d 9 2o ft h e s er h e s l l s m a c a q u ew e r e 舶mw i l dg r o u po fy u 衄a nj i n d o n g ,a n d4 8w e r e 舶mb r e e d i n g c o l o n yi nm ep r i m a t ec e n t e ro fo u ri n s t i t u t e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm 锄u a 宰01t o a 书0 6g e n ew e r em i s s i n gi nt h e s er e s e 矗c hg r o u p s f o rm h cc l a s si id r b r e g i o n ,t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tm e 仔e q u e n c i e so f d r b l 幸0 3 0 5 0 6 、d r b l 幸0 3 0 9 、d r b l 幸0 4 0 3 、 d r b 3 乖0 4 0 3 、d r b 6 幸0 1 0 l 、d r b 6 宰o 1 0 3i nw i l dg r o u pw a s3 4 8 、4 1 3 、2 7 2 、 4 0 2 、4 0 2 、9 5 7 o nt h eo t h e rs i d et h e 仔e q u e n c i e so fm e s e1 0 c ii nb r e e d i n g c o l o n yw e r e4 5 8 、5 8 3 、2 2 9 、6 6 7 、5 4 2 、6 2 5 t h ed e t e c t i o nr e s u l to f t h er e s t1 0 c iw e r en e g a t i v e c o m p a r e dw i t ho t h e rr e g i o n so fc h i n e s er h e s u si n a c a q u e a n di n d i a i lo r i 百nr h e s u sm a c a q u e ( 1 1 1 d i a l l 伊o u p ) ,y u 肋a i lr h e s u sm a c a q u es h o w sa d i s t i n c td i 仃e r e n c eo fm h c g e n e 1 1 1a d d i t i o n ,t h ed i 仃e r e n c e so fa l l e l i cp o l y m o 印m s m 3 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 a r en o ts i 鲥f i c a mb e 觚e e nw i l dg r o u pa n d b r e e d i n gc o l o n y i no r d e rt 0v e r i 母f 叭h e rc o r r e c t n e s so fa 1 1 1 p l i f i c a t i o np r o d u c t so fe a c ha 1 1 e l ea i l d 1 0 c u s ,n l em a n d i 氇l 木0 3 0 5 0 6a i l d0 3 0 9a l l e l e so fc l a s s i ig e n ew e r ec h o s e nt 0 d i r e c t s e q u e n c i n g a n du s es i n g l e s t r m dc o n f o m a t i o np o l y m o 神i s m ( s s c p ) d e t e c t i o n t w oo f t i l r e em d o m s a i l l p l i n gs e q u e n c i n g r e s u l t s o f m 锄u d r b1 宰0 3 0 5 0 6i sc o m p l e t e l yi d e n t i c a lw i t ht h er e f e r e n c es e q u e n c eo f g e i 出a n k ,b u ta n o t h e ri sm u t a t e di n5b a s ep a i r s t h es a m p l i n gs e q u e n c i n gr e s u l to f m 锄u d r b1 幸0 3 0 9i sc o m p l e t e l yi d e n t i c a lw i mm er e f e r e n c es e q u e n c eo fg e n b 甜1 k t h er e s u l to fs s c ps h o w e st h a tm o r et h a n8 0 p o s i t i v es a n l p l e sa r em es a m ew i t ht h e s e q u e n c i n gs 锄p l e s ,t l l e 研m e r sh a v eg o o ds p e c i f i c i t y c o n l b i n dt h em e t h o do f s e q u e n c i n gw i t l ls s c pe n s u r e st h e c o r r e c t n e s so ft 1 1 er e s u l t ,a v o i d1 a 玛e - s c a l e s e q u e n c i n g ,a n dr e d u c et h er e s e a r c hc o s t k e y w o r d : r h e s u sm a c a q u e ;m h cg e n e ;m a n l uc l a s si g e n e ; m a m uc l a s si i g e n e ;p c r s s p ;s s c p ;g e n e 仔e ( 1 u e n c i e s ;p 0 1 y m o 印h i s m 4 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果 论文中除了特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人或其它结构 已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡 献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。 作者签名: 日期: 论文使用授权声明 本人完全了解中国协和医科大学有关保留、使用学位论文的规定, 即:学校有权保留送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅:学校可 以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印,缩印或其它复制手段保 存论文,保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名:导师:日期: 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 】- 1 - - 刖舌 恒河猴在组织结构、免疫、生理和代谢等方面与人类高度相似,是生物医学 研究中应用最为广泛的非人灵长类实验动物,已被广泛的运用于各种临床前试验, 常常作为建立人类感染性疾病和自身免疫疾病的动物模型。然而随着研究的深入, 越来越多的学者发现,在同一实验中,同一组动物,个体间敏感性差异大、病理生 理过程表现不一,实验重复性差,统计结果混淆不清。尤其在感染动物模型的建 立过程中这些现象更为突出。如在a i d s 疫苗研究中,即便同时感染相同致病量的 猴免疫缺陷病毒( s i v ) ,恒河猴个体的成活时间差异很大,从小于8 0 天到超过5 年不等,后续研究发现这些差异与猴个体的删c 基因遗传背景差异密切相关。 因此,伴随着a i d s 疾病动物模型研究进一步深入而引发的恒河猴m c 基因多样性 分析研究成为了新的研究热点。 m h c 是与免疫功能密切相关的一个庞大基因家族,主要分为经典的m h ci 类和i i 类基因,及主要编码血清补体成分的i i i 类基因,但由于类基因不直接参 与抗原递呈,因此对它的研究相对较少。由m h c 基因编码所产生的蛋白分子即为 主要组织相容性复合体( 删c ) ,在免疫学上具有极为重要的意义:第一,它参与 对抗原的处理;第二,约束免疫细胞间相互作用:巨噬细胞( m 由) 与t h 细胞间 的相互作用受m h c i i 类抗原的约束。t h 的t c r 联合识别免疫原性多肽片段的表位 ( e p i t o p e ) 以及m h c 1 1 分子ql 、b1 功能区的多态性决定簇。同时,t h 细胞表 面的c d 4 分子识别m h c i i 类分子q2 、b2 功能区的非多肽性决定簇,由此启动免 疫应答;t c 与病毒感染的靶细胞相互作用受5 m c i 类抗原的约束。t c 的t c r 联合 识别靶细胞表面的病毒抗原以及删c i 类分子q2 和b2 功能区的多态性决定簇。 同时,t c 表面的c d 8 分子识别i 类分子q3 区的非多态性决定簇;第三,参与对免 疫应答的遗传控制;第四,诱导自身或同种淋巴细胞反应,m h c 分子可作为自身 或同种反应的刺激分子从而诱导免疫应答或参与免疫调节;第五,参与t 细胞分 化过程,早期t 细胞必须与表达m h c i 或i i 类抗原的胸腺上皮细胞接触才能分别 分化成c d 8 + 或c d 4 + t 细胞。 正因为m h c 分子具有以上这些关键的作用,它的差异将导致免疫反应的差 别,而这些差异取决于编码它的基因。因此研究m h c 基因的差异性能帮助更好 的分析实验结果及进行实验动物的筛选。 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 恒河猴的m h c 基因及m 删( 胞c a 删如芒锄基因位于6 号染色体长臂6 q 2 4 上,大约为3 4m b 口1 。和人类相似,恒河猴心c 分子存在大量的等位基因并具有 高度多态性。在漫长的进化过程中,由于分化时间的差异和生存压力的不同,地 理隔绝甚至养殖场封闭养殖都造成了心c 基因不同的存在状态,使得不同个体的 恒河猴m 锄u 基因在数量和功能上有所差异呤删 随着印度恒河猴的禁止出口,中国恒河猴在国际灵长类实验动物中的应用比 例的不断扩大,清晰的遗传背景资料已变得越来越重要。 近年来很多研究发现中国恒河猴和印度恒河猴的删c 基因差别很大,即使同 是中国恒河猴,来源于云南、四川、广东、广西、海南等不同地域,其洲c 基因 差别同样很大1 。云南地区植被茂盛,恒河猴资源丰富,对该种群恒河猴删c 基 因多态性进行分析研究对于开发和利用这一指名亚种动物资源是非常有价值的。 m h ci 类基因m a m u a 目前已有大量报道证明它与很多疾病的易感性和发病进 程相关。m 锄u 一斛0 1 位点阳性就被公认与s i v 的感染与延缓病程相联系田1 0 3 。另外 a :l c0 2 、a ,i c0 4 也有报道证实这两个位点同样与s i v 感染后的病程发展有关1 1 1 2 3 。 胁0 7 位点有报道指出很可能与关节炎的发病有一定关联口3 1 。 随着研究的深入,很多文献相继报道删ci i 类分子在很多疾病尤其是病毒感 染中也起了非常重要的作用。姗ci i 类分子能够与病毒肽结合,并把它递呈给 c d 4 + t 细胞。恒河猴m h c i i 类基因分为d q 、d p 和d r 等3 个抗原基因。d r 在细胞 表面有较高的浓度,在免疫反应起始中具有重要作用。如带有m a 舢一d r b l 术1 0 0 3 和 d r b l 半0 3 0 6 基因的个体在感染s i v 时表现出存活时间长,病毒载量低的特点n4 1 。 m a 咖一d q b l 术0 6 0 1 被证明与加速s i v 感染病程恶化相关,d q b l 术0 6 0 1 和 d r b l 木0 3 0 9 一d r b 冰w 2 0 1 这几个位点也有文献报道与加速病程发展相关n 引。 本实验主要针对具有丰富资源的云南地区恒河猴群,对m a m u 基因i 、i i 两大 类中热点研究的,与重大疾病较为相关的,几个等位基因的频率及多态性进行分 析。m a m ui 类基因主要选取了m 硼u a 术o 卜0 6 六个位点( 其中m a m u a 牢0 1 、a ,l c0 2 、 a 木0 4 已被证实与s i v 感染的病程发展相关) ,和m h ci i 类基因m a m u d r b 区的多个 位点( d r b 区被认为结构是最复杂的区域,且最近的研究也发现它与s i v 感染后的 病程发展密切相关) 进行调查。 用于检测删c 基因多态性的方法很多,如血清学方法n 刮、一维等电聚焦电泳 6 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 n 引、限制性片段长度多态性分析n 引、变性梯度凝胶电泳n 6 1 等等,其中传统的血清 学方法运用最为广泛,但有其局限性,属于同一血清学特异性的抗原往往可以由 数个不同的等位基因所编码,因此只能作粗略检测。1 9 9 2 年以来,p c r s s p 技 术己成为姗c 分型研究的常规手段,具有简洁、快速、准确及重复性好等特点n 9 1 , 所以本实验采用该方法对删ci 类m a m u a 基因及删c i i 类m a m u d r b 基因的部分位 点进行检测。 由于之前的研究主要是围绕印度来源恒河猴展开,很多方法的特异性都未在 中国来源恒河猴上检验过,所以需要寻找一种方法对p c r s s p 扩增得到的产物进 行准确性验证。最准确也是最常用的方法是直接测序,但当样本量很大时,直接 测序需要耗费大量资金。基于即节省经费又要求准确的考虑,我们选用了s s c p 的方法在部分测序的基础上进行准确性的验证。 s s c p 是一种以p c r 为基础,基于d n a 构象差别而进行快速、灵敏、有效 的检测基因点突变的方法。其基本原理是经p c r 扩增的d n a 片段在变性剂或低 离子浓度下,经高温处理使之解链并保持在单链状态下,d n a 单链可折叠成一 定空间构象,在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,相同长度d n a 单 链因其碱基序列不同,甚至单个碱基不同,导致形成的构象不同,而且单链 d n a 构象的变化很可能引起了迁移率的改变,每条单链处于一定的位置,靶 d n a 中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时,就会出现泳动变位,通过显色 或显影后在凝胶上就会显示出带型的差别,即多态性。 该技术的优点在于:第一,可以检测任何( 包括己知的和未知的) d n a 位点上 的多态性和突变,且检测灵敏性高,能够检测出1 b p 的小缺失和点突变;第二, 适合于同时对大量样品进行筛选;第三,对d n a 原始材料纯度要求不高,且所需 量较少。但它也有一定局限性:第一,不能对d n a 序列变异进行精确的定位,只 能对其进行初筛,需要结合序列分析才能确定变异的位置及内容;第二,对大于 3 0 0 b p 的d n a 片段,随着d n a 片段长度的增加,检测的敏感性逐渐降低。而且分 析结果受多种因素如电泳温度、离子强度( 即电泳缓冲液浓度) 、凝胶浓度、甘 油的浓度和交联剂亚甲基双丙烯酰胺的浓度等的影响。尽管如此,该方法和其他 方法相比仍有较高的检测率啪1 。s s c p 技术还被广泛应用于检测引起各种遗传病 的基因突变,鉴定物种及种类阮“2 2 1 、用于群体遗传分析2 引、基因分型等晗5 j 。 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 基于以上s s c p 技术的特点,我们选取了m a m u d r b 基因中的两个位点尝试使用 该技术进行准确性检测,并初步探讨用这一方法代替大规模测序的可行性。 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 第一部分 实验研究 p c r s s p 的方法检测多个删c 基因位点 一、实验材料与方法 ( 一) 研究对象 详见附录一 ( 二) 实验材料 1 云南恒河猴血液样本。该猴群属于中国恒河猴云南指名亚种。血液样本由 我中心提供,均选择健康恒河猴,共1 4 0 只。其中有9 2 只来源于云南景东地区野 外猴群,编号为卜9 3 ;4 8 只来源于该中心自繁群,编号为9 4 1 4 1 。 分别采血3m 1 ,e d t a 抗凝。 2 主要试剂及配制 ( 1 )蛋白酶k ( 德国m e r c k 公司) ( 2 ) r t a qd n a 聚合酶( 日本儆锄公司) ( 3 ) m g c l 2 ( 日本做锄公司) ( 4 ) d n t p ( 日本1 址a r a 公司) ( 5 ) 1 0 b u 虢“m 孑+ 肌e ) ( 日本做a r a 公司) ( 6 ) 溴乙锭( e b ) ( 7 ) 溴酚蓝 ( 8 ) 琼脂糖 ( 9 ) 无水乙醇 ( 1 0 ) 1 0 0l a d d e rm 批e r ( 日本础a r a 公司) ( 1 1 ) 嘶s ( 1 2 ) 饱和酚 ( 1 3 ) 氯仿 ( 1 4 ) 浓h c l ( 1 5 ) n a o h 注:主要试剂的配制见附表三 9 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 ( 三) 仪器及设备 1 离心机 s i 乎m 2 0 2 m k ( 德国s i g m a ) l a b o 如g e4 0 0 r 2 m y c y c l e rt h e m a lc y c l e rp c r 仪( 美国b i o r a d ) 3 水平电泳仪p o w e rp a c 3 0 0 ( 美国b i o r a d ) 4 s y n g e n e 凝胶自动成像分析仪( 英国s y n o p t i c s 公司) 5 水浴锅( 上海医疗器械厂) ( 四) 实验方法 1样本d n a 的提取 ( 1 ) 酚氯仿法抽提全血d n a a 冻存血标本取出置室温溶化,取1 0 m l 置于1 5 m l 试管或离心管待抽 提;新鲜血液取1 0 m l 置于1 5 m l 试管或离心管待抽提; b 上述中管加入6 倍体积( 6 m 1 ) 溶血液,混匀,冰浴静置3 0 分钟, 2 5 0 0 9 离心3 0 分钟; c 弃上清( 尽量除尽) ,加入s t e1 m l 悬浮沉淀,将其转移到1 5 m l 的离心管中; d 8 0 0 0g 离心,5 分钟; e 弃上清( 尽量除尽) ,加入s t e5 0 0 u 1 悬浮沉淀并吹散之,再加入 1 0 s d s4 0 u 1 ,2 0 m g m l 蛋白酶k 1 卜1 5 u l ( 视沉淀多寡) ; f 3 7 水浴过夜( 或6 5 2 3 小时) 其间上下颠倒混匀数次,以充 分消化; g 用等体积酚抽提一次,8 0 0 0 9 离心1 0 分钟留上清( 抽提中混匀动 作要轻柔) ; h 用等体积酚氯仿抽提一次,8 0 0 0 9 离心1 0 分钟留上清; i 用等体积氯仿异戊醇( 体积比为2 4 :1 ) 抽提一次,8 0 0 0 9 离心l o 分钟留上清; j 加入3 m n a a c5 0 _ _ 6 0 u 1 ( 上清液体积的1 1 0 ) ,两倍体积预冷( 一2 0 ) 无水乙醇,轻摇混匀,有白色絮状沉淀出现,将其挑至一灭菌 l o 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 的1 5 m 1 离心管中; k 用7 0 酒精洗涤沉淀除盐,离心1 0 0 0 0 9 ,l o 分钟( 两次) l 弃上清,挥干残留酒精,加入1 0 卜1 5 0 u 1 灭菌t e 溶解,置一2 0 保 存。 ( 2 ) p c r s s p 法检测各等位基因的基因频率 a m a m u a 木0 l 至a 木0 6 这6 个等位基因的引物设计2 6 3 表1 :引物序列、特异位点名称及产物大小 t a b l e1 :p r i m e rs e q u e n c e 、1 0 c in a m ea n ds i z e o fp c rp r o d u c t s b p c r 扩增 反应体系1 2 5 u 1 反应条件 热盖温度1 1 0 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 预变性 9 5 变性 9 4 复性 6 5 延伸7 2 变性9 4 复性 5 7 延伸 7 2 i 兰三) 3 。次循未 三圣) ,。次循环 后延伸 7 2 2 r 1 1 i n c m a m u d r b l 木0 3 0 3 、0 3 0 5 0 6 、0 3 0 9 、0 4 0 3 、1 0 0 5 0 7 ;d r b 3 木0 4 0 3 ; d r b 5 ,i c 0 3 0 i 0 2 ;d r b 6 术0 1 0 1 、0 1 0 3 、0 1 0 4 0 5 这1 0 个等位基因的引物设计 表2 :引物序列、特异位点名称及产物大小 t a b l e2 :p r i m e rs e q u e n c e 、1 0 c in a m ea n ds i z e o fp c rp r o d u c t s 1 2 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 d p c r 扩增 反应体系1 2 5 u l 反应条件 热盖温度1 1 0 预变性9 5 变性 9 4 复性6 2 “3 延伸7 2 变性 9 4 复性 5 7 延伸 7 2 后延伸7 2 3 0 次循环 1 0 次循环 e p c r 产物琼脂糖电泳的检测 a ) 配制2 的琼脂糖胶 b ) 称取1 9 琼脂糖粉于三角烧瓶中,加入1 xt a e 缓冲液,微波炉加 热2 m i i l ,取出稍凉后加入适量溴乙锭( e b ) ,倒入制胶槽中冷却。 c ) 上样,调整电压为1 2 0 v ,电泳3 0 r n j n 。 d ) 取出胶块放于凝胶成像仪下观察,并记录图象。 、lj、j b n 泓 魄 佻 吣 腿 腿 佻 善 l 3 5 3 3 5 2 2 二、实验结果 1 对m h c i 类基因m a m u a 十叭生a 十0 6 和川c l i 类基冈m a m u d 船1 0 3 ( 培、 0 3 0 j 0 6 、0 3 0 9 、0 4 0 3 、1 0 0 5 0 7 、d r b 3 0 4 0 3 、d r b j 0 3 0 i 0 2 、d r b 6 0 l o 0 l 叫、叭0 4 0 5 进行扩增,琼脂糖凝胶电泳检测,根据图谱判断结果。 目lm 硼u a 点吡r 椅刮结果 f 1z 1t h ep 伸衄p l l f l c a t l o _ iie s u l t 吖m alo c l 图1 显示的是 ci 类基冈m a m ua 各位点进行p c r s s p 检测的结果,未发 现阳性位点检出,但都扩增出了大小约3 0 0 b p 的内参片段,证明p c r 反应体 系成立。 中国医学科学院北京协自学院e 学物学研究所 目28 0 、8 1 # 枰m & 黜邪各位ap c r 扩m # 粜,( “+ ”为此对应白谆位 为m * ) f 1 9 it h ep c r 锄p l l f l c 8 t l e s u ho f 舭口埘i o fs 唧l e8 0 、8 l ( “,s h o w st h ep o s i u v e l o c l ) 剧2 琼脂糖凝胶照片硅示的是8 0 、8 l 号样m a j i 】ud r b 并位点的检测结果, 8 0 、8 1 号样d r b l $ 0 3 0 9 、d r b l 0 4 0 3 、d r b 3 + 0 4 0 3 、d r b 6 0 1 。3 位点判断为阳性, 其余位点阴性。每个位点的反应体系中都加入了片段大小约4 0 0 b p 的内参,用于 证明反应体系成立。 2 各等位基因在不同研究群中的频率: 对于m l ci 类m 舯a 基因6 个位点的统计结果显示( 见表3 ) ,云南地区的猴 群在本次检测中未检测出所选这几个位点的阳性样本。 另外,与困内研究报道。”的比较发现基幽m a ua 0 1 、0 2 在中国地区的猴群 中阳性率很低,云南地区、j 。西地区的猴群均不带有该基因。海南地区猴群和该 文献中提到的内陆地区杂交群( 杂交群) 携带率也不高,m a m u a 0 1 分别为2 9 及 05 ,m a 叫a 十0 2 分别为8 8 及o5 。国外文献报道的恒河猴群以上两个基因的 阳性率为1 43 及1 6 。“。海南恒河猴群、杂交群和国外印度来源猴群的这两个基 因携带阳性率之间存在显著性差异( p j h 佻 弧 弧 佻 腿 吣 1 3 5 3 3 5 2 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 2 p c r 扩增 将所有之前检测的位点m a i 】u d r b l 木0 3 0 6 、d r b l 水0 3 0 9 阳性的样本进行p c r 扩增 反应体系2 5 u l 反应条件 热盖温度1 1 0 预变性 9 5 1 :3 0 s 变性 9 4 3 0 s 1 l 复性6 2 “3 5 0 s 3 0 次循环 i 延伸 7 2 3 0 s j 变性 9 4 3 0 s 1 i 复性 5 7 5 0 s -1 0 次循环 i 延伸7 2 2 0 sj 后延伸 7 2 2 m i n 3 s s c p 法 ( 1 ) 把上述扩增出的p c r 产物分别取1 0 u l 与变性剂1 0 u 1 混合后,p c r 仪中9 5 变性1 0 m i n ,迅速取出置于冰上2 1 1 1 i n ,全部上样。 ( 2 ) 准备1 2 的p a g e 胶。 ( 3 ) 上样。 ( 4 ) 1 5 0 v 预电泳1 m i i l , 中国学科学院北京协和医学院学生物学研,l 所 ( 5 ) 1 2 0 v 冰浴电泳2 3 0 m m ,( 冰浴电泳非常重要,s s c p 法要保证检测 的准确性就必须保持电泳过程在比较低的温度下完成,并且过程中 最好僳持温度的恒定。) ( 6 ) 剥胶,放于加有适量e b 的缓冲液中浸泡5 一l o m i n 染色。 ( 7 ) 凝胶成像仪观察。 二、实验结果 ( 一) 涮序结果 1 m 锄u d r b l 帅3 0 5 0 6 位点 :。盆蓝g x 6 0 :c6 c i ;6 出i 垫婪盎绒6 逝监也盐j d 1 66 i 如a 尬越 雌鱼。, 蛊盟:l 止止 。写芦。:逝j 3 3 l5 d 血6 拙垃c 6 盐i i t 2 龇i 出t 66 _ _ 】i6 出dd 垃d l t 。d 出越址6 地。一 圈41 1 6 号样车的岫一嘲l 卸3 0 5 0 6 位点特异扩增产物铡序站果波形图 f i g4t h c 1 1 1 0 盯龃s 。q u b n c l n gr e 8 u l to fm 一嘲l 卸3 0 5 0 6a l l e l fs 锄p k1 1 6 s s n e c l f l c 岬l l f d u c t ll l 监出掣蛳邋衄虹6 血k 虹龇圳衄血也心 :“r “。 8 6 :6 | 6 t 。越幽k “i 。 中凼医学科学院北京悱和* 学rk 学生精学r 所 筮- ? - 美墨箍裂竺:掣蠡j 竺蓝;掣当:婆棼 目51 1 7 秆车v 删d r b l 如3 0 5 0 6 位点特* 扩增产物耐咩结果的波* 削 f 。g5l k 。o 舢5 q 1 n g 眦u l to f m 帅* d r b l 0 3 0 帅6a l k l o f s 帅p l e1 1 7 1 ss p k l n c 觚p 1 i 目 d 删u c i 如图5 所示,箭头符号标山的地方为与1 1 6 号测序结果对比有突变碱 基的地力,从以e 两张罔比较可以看h ,1 1 6 弓样本的碱基序列与1 1 7 号样 本的碱基序列在5 个位置有所不同。 警! 譬譬譬荨三型羔穗篓。二警簪爱一黑 一j j i :_ 。:4 j o y 。jr 髻f j h 二:0 ;止。芷:;:山j :丝:l :划:j 盥盐l :。i :。j l 。:? o0- i i _oj - 一- _ : 目61 1 5 目栉本的ud r bj 岫3 0 5 0 6 靛点特, 扩增p 物测序蛄果的波形罔 f 1 9 6 1 k o i o 鲫5 q ”州。岵瞄u i t 。f m 珊m d r b i 0 3 0 5 m 6a 目吖i 抓c l l 5 s p e c m c 圳p l l 母 d r o d i l c 【 比较1 1 5 号样及1 1 6 号样的测序波形图发现,l 】5 导样为 m 舢u d r b l 0 3 0 5 0 6 位点杂合子。其叶1 一套峰型与1 1 6 号样一致。 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 2m 柚u d l b l 0 3 0 9 位点 兰墅型婴型i 弘! 立i 逝z d 裂缸66 3 j :出6 出盛! ! 啦:雌出越1 2 1:6i 出址 出t l 。5 :i 呲监吐丝。也妇池l 1 i , j l 鹫攀攀誊萋簪攀翳霹鼍。:。一 ? t l “i j i - 。o - r : r - : :1 圈7 鲫号样奉的m 一啪l 如3 0 9 位点特异扩增产物澍睁绌果的放形圈 7 1 1 l i l o 踟嘲o g 噶山io f m 肌十d 胁l 0 3 0 9a 时锄忡ss p e c l e c 枷叫母 d 刊吲 ,錾型:i 蛆- _ ! 知丑o 8 i ! 1 6 i 越2 6 l 崆6 滥 i ! 纽i 也! i l i66 :| 6 i 卜fn , | l 龇盐盛姓越出池盟地l ,丝蜓i 甄,i 蜮剿彗地蜒她则逝龇址垃丘呲出 i l j ! h :i 越盐盐k 越6 。也出也i 目8 1 3 2 样车的岫啪l 奉。3 0 9 位脂特异扩增产物测序镕果渡* 目 8t h e 删l 咖嘲g 瞄m o f m 锄u _ d 髓1 叼3 呻“l e 慨酊“p l e l 3 2 、s p e c l 6 c 枷p 母 d 删u c l 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 对比以上两张图发现,8 0 号样和1 3 2 号样的序列相同。 3 与g e n b a i l l ( 公布序列的比较 m a m u d i ml 木0 3 0 5 0 6 g e n b a n kg g a g t a c t c t a c a t c t g a g t g t c a c t t c t t c a a t g g g a c g 1 1 6t 一一一 1 1 5一一一一一一一一一一一一一一一一 11 7一一一一一一一一一一一一一 g e n b a n k 1 1 6 1 1 5 1 1 7 g e n b a n k 1 1 6 1 1 5 1 1 7 g e n b a n k 1 1 6 1 1 5 1 1 7 g
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