（预防兽医学专业论文）SARS冠状病毒S蛋白抗原表位分析与定位研究.pdf

摘要 严重急性砰吸综合症( s e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e 。s a r s ) 是由s a r s 冠状病毒( s a i l s - c o v ) 引起的人类新发传染病，s 、m 、n 、e 蛋白是s a r s c o v 病毒粒子的几种主要结构蛋白。用l a s e r g e n e 软件系统分析s a r s 病毒结构蛋白s 、m 、n 蛋白，预测了1 2 个抗原表位，用这些预测表位芹列设 计组合成四个嵌合基因s s c v - a ，s s c v b 、s s c v c 、s s c v d 。人工合成后插入p g e x 6 p - i 的b a m h l 和a h o l 位点间，构建成融合袭达质粒，转化宿主蘸b l 2 1 经1 p t g 诱导后嵌合基因表达产物为可溶 性蛋白。经免疫印迹试验表明嵌合基囡表达产物可被s a r s 康复患者斑清所识别，表明重组融合蛋 白具有免疫反虚性提示预 曼0 表位中含有s a r s - c o v 结构蛋自的抗原表协。用纯化的重组融合蛋白 g s t - s s c v - d 和g s t s s c v _ a 为抗原制备了一系列单克隆抗体。抗s s c v - d 的单抗有两株，分别为 d 3 d 1 和d 3 c 5 。将6 个s 蛋白预测表僚分剐与g s t 融合表达。在这6 个融合蛋白中，g s t - s 5 可以 和单克隆抗体d 3 c 5 反应，g s t - s 2 可以和单抗d 3 d i 反应。w e s t e r nb l o t 分析表明两个单抗所识别 的表位均为线性表位。两个表位分别位于s a r s - c o v 纤突蛋白的第4 4 7 至4 5 8 氪基酸残基和7 8 9 至 7 9 9 氨基酸残基。d 3 d i 袭位( 4 4 - 4 5 8 ) 正位于s 蛋白与受体结合的结构域中。 2 c 5 是一株s a r s c o vs 蛋白特异的有中和活性的单克隆抗体。以2 c 5 为筛选靶分子，筛选噬 菌体展示随机7 肚库。经三轮淘洗后随机挑选2 0 个噬菌体克隆进行e l i s a 分析和序列测定。在10 个e l i s ao d 值大干0 2 的阳性嘴菌体克隆中，有8 个噬菌体克隆展示有共同的7 肽序列t p e q q f t ， 展示有该序列的嘴菌体克隆能竞争抑制s a r s c o vs 蛋白抗原与单抗2 c 5 的结合。与s a r s c o vs 蛋白序列比对分析发现该7 黻序列散布于s 蛋白的第5 3 9 位到第5 5 9 能氮基酸上。将s 蛋白 t s 3 9 p s s k r f q p f q q f g r d v s d f t s 5 9 的2 i 肽与g s t 进行融合表达，得到了可溶解的融合蛋白。该融 合蛋白能不能被单抗2 c 5 识别，但经w e s t e mb l o t 分析表明该融合蛋向能被灭活s a r s 冠状病毒免疫 鸡血清识别。表明t p s s k r f q p f q q f g r d v s d f t 5 5 9 是s 蛋白的卟线性衷位而t p e q q f t 为单 克隆抗体2 c 5 的模拟表位。 s a r s 冠状病毒s 蛋自在病毒与宿主细胞受体结合、细胞膜融合及入侵、诱导机体产生中和抗体 。l t 起重要作用；s 蛋白受体结合结构域的核心区域为3 1 8 - - - 5 1 0 片段。克隆并融合表达了s 蛋白3 1 8 - 5 1 0 片段，分析表明原核表达的受体结台结构域融合蛋白能被s a r s 康复患者清和高免动物血清所识别。 进一步设计了套2 3 个覆盖整个该受体结合结构域的长为1 6 氨基酸残基的部分重叠的短肽。并进 行了融合表达。用2 3 个融合蛋向对受体结合结构域进行抗原表位作图。结果鉴定出两个抗原袁位 s r b d 3 ( f 3 3 4 p s v y a w e r k k i s n c v 3 4 9 ) 和表位d 3 d 1 ( 7 l r p f e r d l 4 5 ，) 。 s a p s 冠状痫毒s 蛋白s l 鄙分在与细胞受体结合以及诱导机体产生保护性小和抗体一p 发挥重要 作用。用p c r 扩增s 1 ( 1 2 , - 6 7 2 ) 发s i n ( 1 2 5 1 0 ) ，s l c ( 3 1 8 - 6 7 2 ) 和s r b d ( 3 1 8 5 1 0 ) 四个片 段。p c r 产物分别克隆 表达载体p g e x ，6 p - 1c i t 。经诱导箨融合蛋矗均以包涵体形式表达。w e s t e r n b l o t 分析表明融合蛋白均能被单克隆抗体d 3 d i 和鸡抗s a r s 冠状病毒血清识别。融合蛋白包涵体变 性溶解后与鸡抗s a r s 冠状病毒血清e l i s a 分析结果也显示良好的免疫反应性。与鸡抗s a r s 冠状 病毒血清的e l i s a 和w e s t e r n b l o t 结果均表明位于s 蛋白5 l o 巧7 2 氨基酸残基片段是s l 蛋白中的免 疫优势决定区。为了对这一免疫优势区域进行进一步的抗原表位鉴定殴计了一套1 6 个部分重叠的 短肽，这些短肽履盖全部5 1 0 - 一6 7 2 片段。每个短肽合成一对寡核营酸链，退火后插入表达载体 p g e x - 6 p - 1 ，与g s t 进行融合表达。各表达融合蛋白均以可溶解的形式表达。表达的融合蛋白以谷 胱甘肽亲和柱层析纯化。用免疫鸡血清对1 6 个短肽融合蛋白进行w e s t e r n n o t 和e l i s a 反应性扫描， 鉴定出了四个抗原表位。分别为s l c 3 ( 5 3 9 5 5 9 ) ，s i c 4 ( 5 4 8 - 5 6 7 ) s i c 7 8 ( 5 8 3 - - 6 0 6 ) 和s 1 c 1 0 1l ( 6 0 7 - - 6 3 0 ) 。用这四个融合蛋自对小鼠进行免疫，结果表明这四个融合蛋白均能诱导小鼠产生s 蛋 自特异的抗体，且间接免疫荧光试验表明这些抗体均能识别真核表达豹s 蛋自的表面结构域。该结 果可以为进一步进行基于抗原表位的s a p s 诊断、治疗试剂的研究提供理论基础。 本实验鉴定出了7 个s 蛋白线性抗原表位：s r b d 3 ，d 3 c 5 ，d 3 d i ，s i c 3 ，s i c 4 ，s 1 c 7 8 ，s i c l 0 1 1 ， 和一个s 蛋白模拟表位。对进1 步分析s 蛋向的结构与功能以及建立以表位为基础的抗原抗体诊断 方法和基于表位的疫苗的设计研究具有重要的意义。 关键词：s a r s 冠状病毒，纤突蛋白，单克隆抗体，表位袁位作图 i d e n t i f i c a t i o na n d m a p p i n go f a n t i g e n i ce p i t o p e s o fs e v e r ea c u t e r e s p i r a t o r y c o r o n a v i r u s s p i k e p r o t e i n a b s t r a c t s e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e ( s a r s ) i san e w l ye m e r g e dh u m a ni n f e c t i o u sd i s e a s ec a u s e db yt h e s e v e r ea c u t er e s p i r m o r ys y n d r o m ec o r o n a v i r u s ( s a g s - c o v ) a n dt h es ，m ，na n dep r o t e i na r ef o u r m a i ns t r u c t u r a lp r o t e i n so fs a r s - c o v t h es p i k c ( s ) p r o t e i no fs a r s - c o vi sam a j o rv i r i o ns t r u c t u r a l p r o t e i n i tp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nt h ei n t e r a c t i o nw i t hr e c e p t o r sa n dn e u t r a l i z i n ga n t i b o d i e s i nt h e s t u d y , s i xe p i t o p e s ( s t s 2s 3s 4s 5s 6 ) o ft b e s p i k ep r o t e i n o fs a r s - c o vw e r ep r e d i c t e d b y b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s f i r s t l y , am u l t i e p i t o p e sc h i m e r i ca n t i g e ng e n ew a sc o n s t r u c t e da n ds y n t h e s i z e d t h ec h i m e r i ca n t i g e ng e n et h e nf u s e dt od o w n s t r e a mg s tg e n ei np g e x - 6 p 1 t h ew e s t e r nb l o ta s s a y d e m o n s t r a t e dt h a ts a r s p a t i e n to o n v a i e s c o n ts e r u n lc o u l dr e c o g n i z et h er e c o m b i n a n tf u s i o np r o t e i n a n d s i xp r e d i c t e de p i t o p e sg e n e 融e dt og s t e x p r e s s e di ne c o i lb l 2 1r e s p e c t i v e l y a m o n gs i xf u s i o np r o t e i n s g s t s 5r e a c t e dw i t hm o n o c l o n a la n t i b o d yd 3 c 5a n dg s t - s 2r e a c t e dw i t hm o n o c l o n a la n t i b o d yd 3 dl a g a i n s ts p i k ep r o t e i no fs a r s - c o v t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h ee p i t o p e sr e c o g n i z e db ym o n o c l o n a l a n t i b o d yd 3 c 5 a n dd 3 d 1a r ea l ll i n e a le p i t o p e s t h et w o e p i t o p e sc o r r e s p o n dt h es e q u e n c eo f4 4 7t o4 5 8 a n d7 8 9 - 7 9 9a m i n oa c i do f s p i k e p r o t e i no f s a r s - c o vr e s p e c t i v e l y 2 c 5i sas a r s - c o vs p i k ep r o t e i ns p e c i f i cn e u t r a l i z i n gm o n o c l o n a la n t i b o d y b a s e d2 c 5a st h e t a r g e tm o l e c u l a r , c 7 c t mp h a g ed i s p l a yp e p t i d el i b r a r yw e r es c r e e n e d a f t e rt h et h i r dp a n n i n g2 0p h a g e c l o n e sw e r ea n a l y z e da n ds e q u e n c e d a m o n gt h e s e2 0c l o n e s t h e r e a r c7g e tt h es a m es e q u e n c e t p e q q f t a n dt h e i ro dv a l u ei ne l i s aa r ea l lo v e r0 2 a n dt h ep h a g e sd i s p l a y e dt h i sp e p t i d ec o u l d i n h i b i ta n dc o i l l l 3 e t ew i t hs a r s c o v s p i k ep r o t e i ni nb i n d i n gw i t hm o n o c l o n a la n t i b o d y2 c 5 a l i g nt h e p e p t i d ew i t hs p i k ep r o t e i ns e q u e n e e ，w ef o u n di tm a yl o c a t e di na m i n oa c i d5 3 9t o5 5 9o fs p i k ep r o t e i n 1 nf i 2 口t h e rs t e p $ 5 3 9 - 5 5 9w a sf u s e dw i t hg s ta n de x p r e s s e da n dp u r i f i e d b u tt h ef o l l o w e da n a l y s i s d e m o n s t r a t e dt h a t2 c 5d i dn o tb i n d i n gw i t hs 5 3 9 - 5 5 9 h o w e v e r , t h i sf u s i o np r o t e i nc o u l db er e c o g n i z e d b yi m m u n i z e dc h i c k e ns e r a s os 5 3 9 5 5 9i sal i n e a le p i t o p eo fs p i k ep r o t e i n ，b u tn o tt h ee p i t o p eo f2 c 5 a n dt h es e q u e n c et p e q q f ti sam i m i c e p i t o p eo f m o n o c l o n a la n t i b o d y2 c 5 a m i n oa c i d3 1 8t o5 1 0i st h er e c e p t o rb i n d i n gd o m a i no fs a r s - c o vs p i k ep r o t e i n t om a pt h e a n t i g e n i ce p i t o p eo ft h i sr e g i o n ，as e to f2 3p a r t i a l l yo v e r l a p p i n gf r a g m e n t ss p a n n i n gt h ef r a g m e n tw e r e f u s e dw i t hg s ta n de x p r e s s e d w i t hw e s t e r nb l o ta n de l i s aa n a l y s i s ，t w oa n t i g e n i ce p i t o p e ss r b d 3 ( 3 3 4 - 3 4 9 ) a n de p i t o p ed 3 d 1 ( 4 4 7 - 4 5 5 ) w e r ei d e n t i f i e d i m m u n i z a t i o no fm i c ew i t he a c ho ft h et w o a n t i g e n i ce p i t o p e - f u s e dp r o t e i n sr e v e a l e dt h a ta 1 1f o u rp r o t e i n sc o u l de l i c i ts p i k ep r o t e i ns p e c i f i ca n t i s e r a i nt h i ss t u d y t h es 1d o m a i no f t h es p i k ep r o t e i na n dt h r e et r u n c a t e df r a g m e n t ss i n ，s l ca n ds r b d w e r ee x p r e s s e db yf i l s i o nw i t hg s ti nap e e x - 6 p - lv l o r e l i s aa n dw e s t e m b l o tr e s u l t sd e m o n s t r a t e d t h a tt h e5 1 0 - 6 7 2f r a g m e n to ft h es ld o m a i ni st h ea n t i g e n i cd o m i n a n tr e g i o n t om a pt h ea n t i g e n i c e p i t o p eo f t h i sa n t i g e n i cd o m i n a n tr e g i o n , as e to f1 6p a r t i a l l yo v e r l a p p i n gf r a g m e n 招s p a n n i n g t h ef r a g m e n t w e r ef u s e dw i t hg s ta n de x p r e s s e d f o u ra n t i g e n i ce p i t o p c ss 1 c 3 ( 5 3 9 5 5 9 ) ，s 1 c 4 ( 5 4 8 5 6 7 ) ，s i c 7 8 ( 5 s 3 - 6 0 6 ) a n ds i c l 0 il ( 6 0 7 6 3 0 ) w e r ei d e n t i f i e d i m m u n i z a t i o no f m i c e w i t he a c ho f t h ef o u ra n t i g e n i c e p i t o p e - f u s e dp r o t e i n sr e v e a l e dt h a ta l lf o u rp r o t e i n sc o u l d e l i c i ts p i k ep r o t e i ns p e c i f i ca n t i s e r a a n da l lo f t h e mw e r ea b l et ob i n dt ot h es u r f a c ed o m a i no f w h o l es p i k ep r o t e i ne x p r e s s e db yr e c o m b i n a n tb a c u l o v i r a s i ni n s e c tc e l l s i d e n t i f i c a t i o no fa n t i g e n i ce p i t o p e so ft h es p i k ep r o t e i no fs a r s c o vm a yp r o v i d et h e b a s i sf o rt h ed e v e l o p m e n to fi m m u n i t y - b a s e dp r o p h y l a c t i c ，t h e r a p c m i c ，a n dd i a g n o s t i cc l i n i c a lt e c h n i q u e s f o rs e v e r ea c u t e r e s p i r a t o r ys y n d r o m e a l l t o g e t h e r , s e m l i n e a l a n t i g e n i ce p i t o p e ss r b d 3 ，d 3 c 5 ，d 3 d i ，s 1 c 3 s i c 4 ，s 1 c w 8 ，s i c l 0 1 1 a n do n em i m i c 印i t o p ew e r ei d e m i f i e d t h i sw o r kc o u l dp r o v i d et h eb a s i sf o rt h ed e v e l o p m e n to f i m m u n i t y - b a s e dp r o p h y l a c t i c ，t h e r a p e u t i c ，a n dd i a g n o s t i ct e c h n i q u e s f o rt h ec o n t r o lo fs e v e r ea c u t e r e s p j r a t o r ys y n d r o m ea n d f u r t h e rs t r u c t u r a la n df u n c t i o na n a l y s i s o f s p i k ep r o t e i n k e y w o r d s ：s a r s - c o v , s p i k ep r o t e i n , m o n o c l o n a la n t i b o d y , e p i t o p e ，e p i t o p em a p p i n g 中国农业科学院研究生论文评审 论文评阅人：吴东来研究员 论文答辩委员会 主席： 专家组成员： 涂长春研究员 刘文周教授 王君伟教授 吴东来研究员 相文华研究员 步志高研究员 李景鹏教授 李一经教授 刘胜旺研究员 答辩日期：2 0 0 5 年6 月1 6 日 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 中国哈尔滨 插图和表格清单 图1 1s a r s 冠状病毒结构模式图与病毒粒子电镜照片 1 图1 2s a r s c o v 的系统进化分析4 图l ，3s a r s - c o v 基因组及亚基因组表达情况示意图一 5 图1 ，4 病毒与细胞膜融合与抑制示意图一一 8 图2 1s a r s c o v s 蛋白、m 蛋白、n 蛋白的抗原性、亲水性和表面可及性分析一 2 2 图2 2 重组嵌合蛋白的亲水性和抗原性以及表面可及性分析 2 4 图2 3 重组质粒的酶切签定一一。 2 5 图2 - 4 重组质粒诱导表达的s d s p a g e 分析一 2 5 图2 - 5 纯化融合蛋白的s d s - p a g e 分析 2 6 图2 - 6 融合蛋白的w e s t e m - b l o t 分析 2 6 图3 1 熏组融合蛋白的免疫印迹分析一 3 2 图3 2s a r s - c o ve l i s a 对6 株单克隆抗体细胞株腹水特异性检测 3 3 图3 3 单抗d 3 d 1 与灭活和超声波裂解后的s a r s - c o v 的w e s t e r nb l o t 分析 3 4 图3 - 4 预测表位融合蛋白与单克隆抗体的w e s t e r nb l o t 分析结果 3 5 图3 5 预测表位融合蛋白与单克隆抗体的e l i s a 检测结果 3 6 图3 - 6 袁位s 2 和s 5 精确定位的w e s t e r nb l o t 分析结果一 3 7 图3 7 表位鉴定结果示意图一一 3 8 图4 一l 噬菌体噬斑 4 5 图4 2 噬菌体与单克隆抗体2 c 5 的e l i s a 结合分析一 4 5 图4 3 噬菌体展示肽序列与s 蛋白序列的比对分析 4 7 图4 4 噬菌体的竞争抑制e l i s a 一一4 7 图4 5 短肽融合蛋白表达与纯化的s d s p a g e 分析 4 8 图4 - 6 融合蛋白与单克隆抗体2 c 5 的e l i s a ( a ) 和与免疫鸡血清的w e s t e r nb l o t ( b ) 4 9 图5 一l 四个基因片段的p c r 扩增一 5 5 图5 2 重组质粒的酶切鉴定 5 5 图5 3 表达产物的s d s p a g e 分析 5 6 图5 - 4 重组融合蛋白的w e s t e r nb l o t 分析 5 7 图5 - 5 重组融合蛋白的e l i s a 检测 5 7 图5 - 6 重组融台蛋白与免疫鸡血清w e s t e r nb l o t 反应示意图 5 8 图6 - 1短肽融合蛋白组的设计表达与纯化 6 6 图6 - 2 融合蛋白组的e l i s a 和w e s t e r n b l o t 扫描 6 7 图6 3 表位融合蛋白与s a r s 康复患者血清的e l i s a 反应 6 8 图6 - 4 表位融合蛋白的竞争抑制e l i s a 6 8 图6 ，5 融合蛋白抗血清与s 蛋白抗原的e l i s a 和w e s t e r nb l o t 反应性分析 6 9 图6 - 6 表位单因子血清对表达s 蛋白细胞的间接免疫荧光染色 7 0 图7 - lg s t - s r b d 融合蛋白表达的s d s - p a g e 分析7 8 图7 _ 2g s t - s r b dw e s t e r nb l o t 分析7 8 图7 3 表达s r b d l - - s r b d 2 3 融合蛋白的s d s p a g e 分析 7 9 圈7 4 融合蛋白g s t - s r b d 3 的纯化8 0 图7 - 5 短肽融合蛋白g s t - s r b d l 至g s t - s r b d 2 3 与免疫鸡血清的w e s t e r nb l o t 分析 s 0 图7 - 6 短肽融合蛋白g s t - s r b d i 至g s t - s r b d 2 3 与单抗d 3 d i 的e l i s a 分析 8 l 图7 7g s t - s r b d 3 抗血清与杆状病毒表达s 蛋白反应性的e l i s a 分析 8 l 图7 _ 8 s 蛋白受体结合区表位作图结果示意图一 8 2 表l - 1 动物冠状病毒的分类一 3 表2 - 1 结构蛋白表位预测 2 1 表3 - 1 合成的寡核萤酸序列及编码的多肽序列 3 0 表3 2 s a r s - c o v 合成表位单克隆抗体亚型的鉴定 3 3 表4 - i 噬菌体肽库的筛选 4 4 表4 - 2 噬菌体序列测定结果一 4 6 表5 - 1 p c r 引物序列 5 3 表6 i 短肽序列与位置一 6 2 表6 2 编码短肽寡核苷酸序列表 6 3 表7 - 1 覆盖受体结合结构域的部分重叠短肤的设计表 7 4 表7 - 2 编码短肽寡核昔酸序列表 7 5 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了谢意。 研究生盛名：缘礞泫乙时间：争蛐多年月日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学 院有权保留送交文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：镌礞么。时间：，- 多年石月乒7 日 导师签f 秀乞乞帆砂啦月影日 ：兽銮些翌兰氅：! ：兰垡兰兰：! 奎 引言 2 0 0 2 年1 1 月1 6 日，第一例严重急性呼吸综台征( s e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e ，s a r s ) 病例在中国广东省佛山市出现。之后，s a r s 迅速传播至其它国家和地区。至2 0 0 3 年9 月2 6 日， 全球累计8 0 9 8 人被感染，死亡7 7 4 人( h t t p ：w w w w h o i n f f c s r s a t s c o u m r y t a b l e 2 0 0 30 92 3 e n l ) 。 s a r s 的出现与传播，引起了中国国家卫生部和世界卫生组织( w h o ) 的关注。2 0 0 3 年3 月1 2 日，w h o 发布了s a p s 的全球性警告。随后在w h o 的组织协调f 由中国、德国、美国等1 0 个 国家和地区的1 3 个实验室组成一个s a r s 研究网络。3 月2 3 日，香港地区和美国几乎同时报告， 一种冠状病毒有可能是真正的元凶。4 月1 2 日，加拿大科学家绘制出了被怀疑是“非典”痫原体的 冠状病毒的基因图谱，并进行了基因组破译研究( m a r r a 等，2 0 0 3 ；s h a d e r 等，2 0 0 3 ) 。世界卫生 组织认为这是一个重大的研究突破。随后美国和中国以及其它国家和地r 科学家也先后完成了数 株病毒的全基因组钡4 序工作( k s i a z e k 等2 0 0 3 ：q i ne d 等，2 0 0 3 ：r o t a 等，2 0 0 3 ) 。在研究网 络的协作努力下，2 0 0 3 年4 月1 6 日世界卫生组织正式宣布这种新型冠状病毒为s a r s 病源，并 将其命名为s a r s 冠状病毒( s a r s c o v ) ( p e i r i s 等，2 0 0 3 a ；h o l m e s 等，2 0 0 3 ；k s i a z e k 等，2 0 0 3 ： d r o s t e n 等，2 0 0 3 ) 。 1s a r s c o v 的形态结构 s a r s - c o v 属于尼多病毒目( 0 r d e r ：n i d o v i r a l e s ) 、冠状病毒科( f a m i l y ：c o r o n a v i r i d a e ) 、冠 状病毒属( g e n u s ：c o r o n a v i r u s ) 。s a r s c o v 病毒粒子呈球形，直径约为8 0 - 一1 4 0 n m ，有囊膜，与 其它冠状病毒一样其囊膜表面有排列较宽，形如日冕的纤突蛋白s 蛋白形成的放射状结构厚 约2 0 , - 4 0 n m ，无血凝素酯酶糖蛋白( k s i a z e k 等，2 0 0 3 ) s a r s 冠状病毒的模式图和电镜照片如 图1 1 所示。基因组为单链正义r n a ，与核蛋自结合形成螺旋结构位，病毒粒子的中央。 s a r s - c o v 的形态结构与其它动物冠状病毒极为相似。 图i - l s a r s 冠状病毒结构模式围与病毒粒子电镜照片 f i g i - lt h e m o d e la n d n e g a t i v e - s t a i ne l e c t r o n m i c r o s c o p yp i c t u r e o f s a r s - c o v ：詈奎兰型兰璧兰：竺兰三 ： 耋 2 s a p s c o v 的病原学与分类 ；旺状病毒最早7 - 1 9 3 7 年从鸡中分离到，即为禽传染性支气管炎病毒( i b v ) 。至今该病毒科按 血清型主要分为3 组共有t 8 个种( h t t p ：w w w , n c b i n l m , n i h g o v l t a x o n o m y b r o w s e r w w w t a x c g i ) ， 除感染人外，还感染牛、猪、猫、狗、禽类和啮齿类动物。人冠状病毒( h u m a nc o r o n av i r u s ) 是导致感冒的主要病源之一。1 9 6 5 年t y r r e l l 和b y n o e 等人用人胚气管培养首次分离了人冠状病 毒( h c o v ) 。也是首次确认了冠状病毒令人类出现感冒。随后，h a m r e 管用人胚肾细胞分离到类 似病毒，代表株命名为2 2 9 e 病毒。1 9 6 7 年，m e i n t o s h 等用人胚气管培养从感冒病人中分离到 批病毒，其代表株是0 1 2 4 3 株。1 9 6 8 年，a l m e i d a 等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜 观察发现这些病毒的包膜上有形状类似目冕的棘突故提出命名这类病毒为冠状病毒。1 9 7 5 年病 毒命名委员会正式命名了冠状病毒科。根据病毒的血清学特点和核苷酸序列的莘异，目前冠状病 毒分为冠状病毒和环曲病毒两个属。代表株为禽传染性支气管炎病毒( a v i a ni n f e c t i o u sb r o n c h i t i s v i r u s ，i b v ) 。其它成员有：人冠状病毒( h u m a ne o r o n a v i r u s ) ，鼠肝炎病毒；( m u r i n ev i r u sh e p a t i t i s ， m h v ) 潴血凝性脑脊髓炎病毒( p o r c i n eh e m a g g l u t i n a t i n ge n c e p h ai o m y e l i t i sv i r u s ) ，猪传染性胃肠 炎病毒( p o r c i n et r a n s m i s s i b l eg a s t r o e n t e r it i sv i r u s t g e v ) 。初生犊腹泻冠状病毒( n e o n a t a lc a l f d i a r r h e a c o r o n a v i r u s ，b c v ) 大鼠冠状病毒( r a t c o r o n a v i r u s ，r c v ) ，火鸡蓝冠病毒( t u r k e yb i u e c o m b v i r u s ) ，猫传染性腹膜炎病毒( f e l i n e i n f e c l i o u s p e r i t o n i t i s v i r u s ) ，可能成员有：犬冠状病毒( c a n i n e c o r o n a v i r u s ) ，犬鼠涎泪腺炎病毒( s i a l o d a c r y o a d e n i t i sv i r u so fr a t ) ，人肠道冠状病毒( h u m a ne n t e r i c c o r o n a v i r u s ) 在2 0 0 3 年非典型肺炎发生前，人类仅发现两种可传于人体的冠状病毒，但只会引发感冒。除 此之外。其他冠状病毒，多数只存活在猪牛及鸡等畜禽及哺乳动物身上。s a r s 冠病毒是一种新 的冠病毒，以前从未被医学界发现，它在进化树上是独立的分支，跟已知的鸟，牛，鼠等冠病毒 在进化距离上相等。比对结果显示其基因组咀及各结构蛋白跟已知的冠病毒都有较大的不同 ( k s i a z e k 等，2 0 0 3 ；张其鹏等2 0 0 3 ：r o t a ：等，2 0 0 3r u a n 等2 0 0 3 ) 。这种新病毒从何面来， 已有的研究分析表明它不可能是一种人源病毒( m a r r a 等，2 0 0 3 ) ，也排除了人造病毒的可能( q i n e d - 等，2 0 0 3 ) ，一般认为s a i l s 冠状病毒极有可能来源于其它动物。香港科学家：g u a n 等最先从。 东野生动物市场内的果子狸中分离出t s a r s 冠状病毒样病毒( g u a n y 等，2 0 0 3 ) 。而且实验表 明s a r s 冠状病毒可以感染猫、老鼠、雪貂、猕猴( m a c a q u e s ) 等野生动物( k u i k e n 等，2 0 0 3 ： s u b b a r a o 等，2 0 0 4 ；m a r t i n a - ! 等，2 0 0 3 ) 。所以在分类上，s a r s 冠状病毒不同，己知的三群动物 冠状病毒中的任何一群，现列为每4 群( 表1 1 ) 。 2 土星銮些型兰兰兰圭兰竺鎏三 ：! j 表i 1动物冠状病毒的分类 1 a b l ei 1c l a s s i f i c a t i o no f c o r o n a v i r l s 抗原群病毒宿主致病性 1h c o v - 2 2 9 e t g e v p r c o v p e d v f i p v f c o v c c o v 2 3 h c u o c 4 3 m h v r c o v h e v b c o v 旧v i c o v h u m a n p i g p i g p i g c a t c a t d o g h u m a n m o u s e r a t p i g c a t t l e c h i c k e n t u r k e y r e s p i r a t o r yi n f e c t i o r 、 e n t e m s r e s p i r a t o r yi n f e c t i o n e n f e r i t i s p e r i t o n i t i s s y s t e m i ci n f e c t i o n e n t e r i t i s e n t e r i t i s r e s p i r a t o r yi n f e c t i o n r e s p i r a t o r y , e n t e r i t i s 。h e p a t i t i s ，e n c e p h a l i t i s r e s p i r a t o r yi n o n r e s p i r a t o r y , e n c e p a l o m y e l i t i s e n t e r i t i s r e s p i r a t o r yi n f e c t i o n e n t e r i t i s 一： ! 垒曼! ：里! ： 坚! 竺竺! ! ! ! 竺! 坚! ! ! 竺! 竺： 3 s p d i s - c o v 的基因组学研究进展 冠状病毒基因组为一不分节段的正义单链r n a ，长度约为2 7 - - 3 l k b ，位丁情毒颗粒中央与 核农壳蛋白结合。基因组5 端有甲基化帽子结构，3 端有p o l y a 尾结构，结构特征与其它正链 r n a 病毒相似。在成熟的冠状病毒粒子中不存在r n a 病毒复制所需的r n a 聚合酶病毒进入 细胞后以病毒基因组r n a 为翻译模板表达出病毒r n a 聚合酶，进一步转录合成负链基因组 r n a 和各结构蛋白m r n a 以及病毒基因组r n a 的复制。冠状病毒各个结构蛋白成熟m r n a 的 合成