（外科学专业论文）趋化因子受体cxcr4在神经胶质瘤中的表达及意义.pdf

目录 删删唧删删i j j i y 19 0 0 8 3 彳 中文摘要1 英文摘要4 研究论文趋化因子受体c x c r 4 在神经胶质瘤中的表达及意义 前言8日u 舌8 材料与方法9 结果1 6 附图1 8 附表2 2 讨论2 3 结论2 7 参考文献2 8 综述s d f 1 c x c r 4 生物学轴在脑胶质瘤中的研究进展3 3 致谢3 9 个人简历4 0 中文摘要 趋化因子受体c x c r 4 在神经胶质瘤中的表达及意义 摘要 目的：神经胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，发病率高，呈侵袭性生 长并且术后容易复发，传统的各种治疗方法效果均不理想。目前神经胶质 瘤的具体发病机制还不十分清楚。随着对神经胶质瘤发病机制的逐渐深入 研究以及分子生物学技术的快速发展，分子靶向治疗逐渐成为一种具有广 阔前景的治疗新手段。 已有研究表明，趋化因子s d f 1 及其受体c x c r 4 在神经胶质瘤发生 和发展过程中发挥着重要而复杂的作用，他们能促进胶质瘤细胞增殖、引 起胶质瘤细胞发生迁移、加速胶质瘤细胞的扩散和恶变以及促进血管生 成。因此，从趋化因子及其受体的角度来研究神经胶质瘤的侵袭和促进血 管生成的机制，对认识胶质瘤发生、发展的机制、胶质瘤的抗血管生成和 分子靶向治疗，具有十分重要的意义。 本课题旨在通过研究趋化因子受体c x c r 4 在神经胶质瘤各病理级别 中的表达情况，来分析其表达与神经胶质瘤的侵袭性的内在关系及其与微 血管密度( m v d ) 的关系。 方法：收集河北医科大学第二医院神经外科2 0 0 9 年1 0 月2 0 1 0 年3 月经手术治疗的资料完整的3 8 例神经胶质瘤患者( 其中男性2 2 例，女性 1 6 例) 的手术标本，所有病人均为首发病例，术前未行放化疗等治疗手 段，另取5 例内减压术后的正常脑组织标本作为对照。每一例标本均取两 份，其中一份以4 的多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋；另一份在标本 切除后马上放到冻存管中并于液氮瓶中速冻保存。所有组织均行病理组织 学检查确诊，并按照w h o ( 2 0 0 0 ) 神经系统肿瘤的分类、分级标准进行 临床病理分期。 l 运用免疫组织化学方法检测标本中趋化因子受体c x c l m 及c d 3 4 的表 达情况，并计算微血管密度值。 组化结果判定方法：采用阳性细胞百分比结合显色强度法判读结果， 阳性细胞的百分比分为以下四级计分： 5 0 计3 分。染色强度按瘤细胞深浅记分：o 分，不 中文摘要 着色；1 分，弱；2 分，中等；3 分，强。将2 个分值相加即得出该例标 本的免疫组化阳性分度：o 1 分为阴性，记为；2 4 分为弱阳性，记为 + ；5 分以上为阳性，记为+ + 。 测定微血管密度的方法：瘤组织内任何被抗c d 3 4 抗体染成棕黄色的 单个内皮细胞或内皮细胞簇，有或无管腔，只要与其它结缔组织成分有明 显区别，均计为1 个阳性血管标记，每例观察切片1 张，避开肿瘤坏死或 出血区域，在低倍镜( 4 0 ) 下选择微血管最丰富区，即“热点( “h o ts p o t ”) ， 在高倍视野( 2 0 0 ) 下计数，计数5 个2 0 0 倍视野下的血管数，在目镜网格 测微尺o 2 5 m m 2 的范围内计数，其算术平均数计为该例切片的m v d 测定 值。 2 运用实时荧光定量p c r 的方法测定标本中趋化因子受体c x c r 4 在胶 质瘤组织中的相对表达量。 采用嘶z o l 法提取总r n a ，行琼脂糖凝胶电泳检测，采用分光光度 计检测r n a 纯度。m r n a 反转录成c d n a 并进行检测，以p - a c t i n 作为 内参照，使用严格的复孔法测定。 3 统计学方法 根据数据采集的不同方法及统计学处理的不同要求，所有计量资料 均用均数士标准差表示，选用x 2 检验和t 检验的统计学方法，使用s p s sl7 o 统计软件进行统计分析，尸 o 0 5 表示差异有显著的统计学意义，尸 o 0 1 表示差异有非常显著性的统计学意义。 结果： l 免疫组织化学实验结果显示趋化因子受体c x c r 4 在正常脑组织中表 达阴性，c x c r 4 在其中的2 4 例胶质瘤组织中表达呈阳性，总阳性表 达率为6 3 1 6 ，在低级别( i i 级) 和高级别( i i i 、级) 胶质瘤组的 阳性表达率分别为4 4 4 4 、8 0 o o 。c x c r 4 阳性表达率随着胶质瘤 病理级别的增高而呈上升趋势，且高级别组c x c i h 的阳性表达率明显 高于低级别组，差异具有显著的统计学意义( p o 0 5 ) 。 2 以c d 3 4 单克隆抗体标记的微血管密度( m v d ) 在正常脑组织和脑胶质 瘤组中的表达均值分别为3 7 6 士o 4 8 和3 5 2 5 士9 7 5 ，m v d 的表达在脑 胶质瘤组明显高于正常脑组织组，差异具有非常显著的统计学意义 ( 尸 o 0 1 ) ；在低级别胶质瘤组和高级别胶质瘤组中的表达均值分别为 中文摘要 2 7 3 8 士5 0 4 和4 2 3 4 士7 1 2 ，m v d 在高级别胶质瘤组的表达明显高于低 级别胶质瘤组，差异具有非常显著的统计学意义( 脚0 1 ) 。 3m v d 在1 4 例c x c r 4 表达阴性的胶质瘤组织中的表达均值为 2 6 3 7 士5 1 l ，在2 4 例c x c r 4 表达阳性的胶质瘤组织中的表达均值为 4 0 4 3 士7 8 8 ，通过统计检验可知m v d 在c x c r 4 表达阴性和阳性的胶 质瘤组织中的表达均值具有非常显著的差异( p o 0 1 ) 。 4 实时荧光定量p c r 实验结果显示趋化因子受体c x c r 4 m r n a 在低级 别( i i 级) 胶质瘤组中的相对正常脑组织组的表达量为2 2 2 士o 8 0 ， 在高级别( i i i 、级) 胶质瘤组的相对正常脑组织组的表达量为4 0 3 士1 9 8 ，趋势是随胶质瘤病理级别的增高而升高，差别具有显著的统计 学意义( 尸 o 0 5 ) 。 结论： 1 趋化因子受体c x c r 4 在正常脑组织中表达呈阴性，而在胶质瘤组织中 表达阳性，表明c x c r 4 可能与胶质瘤的侵袭性有关。 2 在神经胶质瘤组织中，趋化因子受体c x c r 4 在蛋白水平和分子水平均 有高表达，且随病理级别的升高而表达增加，说明c x c i m 可能与胶质 瘤的恶性程度相关。 3 在神经胶质瘤组织中，能反映新生血管增加的m v d 值随着病理级别 的增加而增加，提示脑胶质瘤的血管生成与瘤内的m 关系密不可 分；m v d 愈高，肿瘤的血管生成愈多，肿瘤的恶性程度愈高。验证了 m v d 是判定肿瘤恶性程度和预后的重要指标的论断。 4 本实验研究结果显示，m v d 值在趋化因子受体c x c i m 表达阴性和阳 性的胶质瘤组织中的表达具有显著的差异，并且c x c r 4 在胶质瘤的瘤 血管内皮细胞上同样存在表达，提示c x c r 4 可能参与胶质瘤的新生血 管生成。 关键词：c x c r 4 ；神经胶质瘤；c d 3 4 ；m v d ；免疫组化；血管生成； 实时荧光定量p c r 英文摘要 e x d r e s s i o na n ds i g n i f i c a n c eo fc h e m o l 【i n er e c e p t o rc x c r 4i ne x d r e s s l o na n ds l g n l l l c a n c e0 tc n e m o k l n er e c e p t o rl 天乙k - 4l n g l i o m a a b s t r a c t o b j e c t i v e ：g l i o m ai st h em o s tc o m m o nm a l i g n a n tt u m o ri nb r a i n ，w h i c h h a sh i g hi n c i d e n c e ，s t r o n g l yi n v a s i v ep o w e ra n dr e c u 玎e ：n c ef a s ta r e rs u r g e 巧 t h ee f f e c t so fav a r i e t yo ft r a d i t i o n a lt r e a t m e n tm e m o d sa r en o ti d e a l a tt h e p r e s e n tt i m e ，t h es p e c i f i cp a t h o g e n e s i s o fg l i o m ai sn o tc l e a r w i t ht h e g r a d u a l l yd e 印 s t u d yf o r n l e p a t h o g e n e s i s o fg l i o m aa n dt h e r a l p i d d e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n i q v e s ，m o l e c u l a rt a r g e tt i e a t m e n to f c a n c e ri sg m d u a l l yb e c o m i n gap r o m i s i n gn e wm e a n so ft r e a t m e n t s t u d i e sh a v es h o w nt h a tc h e m o k i n e ss d f 一1 锄dt h e i rr e c 印t o r sc x c r 4 p l a yi m p o r t a ma n dc o m p l e xr o l e si nc a r c i n o g e n e s i s a n dd e v e l o p m e n to f g l i o m a ，m e yc a np r o m o t eg l i o m ac e l l sp r 0 1 i f e n i o na n dm i g r a t i o n ，a c c e l e r a t e p e r v a s i o na 1 1 dc a l l c e r a t i o no fg l i o m ac e l l so ra n g i o g e n e s i si nt u m o rt i s s u e t h e r e f o r e ，i ti so fg r e a ts i g n i f i c a n c et os t u d yt h er o l e so fc h e m 0 1 ( i n e sa n dt h e i r r e c 印t o r si nt h ep r o c e s so fc a r c i n o g e n e s i s ，i n v a s i o na 1 1 da i l g i o g e n e s i so f9 1 i o m a f o ru n d e r s t a n d i n gt h em e c h a n i s mo fc a r c i n o g e n e s i sa i l d d e v e l o p m e n t ， a n t i - a n g i o g e n i ca n dm o l e c u l a rt a r g e tt r e a 缸n e n to fg l i o m a t h eo b j e c t i v eo ft h i ss t l l d yi st oa n a l y z et h ei n t e m a lr e l a t i o n sb e t w e e nt h e e ) 【p r e s s i o no fc h e m o k i n e sr e c 印t o r sc x c r 4 a i l di i 2 u s i o no f9 1 i o m a ，a i l dt h e r e l a t i o n sw i t hm i c r o v e s s e ld e n s i t y ( m v d ) b ys t u d 姐n gt h ee ) 【p r e s s i o no f c x c r 4i na l lg r a d e g l i o m a s m e t h o d s ：3 89 1 i o m at i s s u es p e c i m e n sw e r ec 0 1 l e c t e df 如mt h eg l i o m a p a t i e n t sw h ow e r eo p e r a t e di nt h en e u r o s u 唱e 巧o ft h es e c o n dh o s p i t a lo f h e b e im e d i c a lu n i v e r s i t yf b m2 0 0 9 1 0t o2 0 1 0 3 ( 2 2o ft h e mw e r em a l e ，1 6 o ft h e mw e r ef e m a l e ) ，a l lo ft h ep a t i e n t sa r ei n i t i a lc a s e sa n dn o ta c c 印t e dt h e t r e a c m e n to fr a d i o t h 唧ya n dc h e m o t h e r a p ye t c a n d5n o m l a lb r a i nt i s s u e s p e c i m e n so fi n t r a c r a n i a ld e c o m p r e s s i o no p e r a 【t i o nw e r eg a t h e r e da sc o n t r o l g r o u p t w os p e c i m e n sw e r et 砒踟f o re a c h ，o n eo fw h i c hw a sf i x e db y4 4 美文摘要 _ 一- _ 一 s t a t i s t i c a lm e t h o d s ：a c c o r d i n gt om ed i 虢r e n tm e m o d so f d a t aa c q u i s i t i o n a n dv a d o u sr e q u i r e m e n t so fs t a t i s t i c a la n a l y s i s ，a l lo fm em e a s u r e m e n t d a t ai s s h o w nw i t hm e a l l 士s d w ec h o o s ex 2 t e s t ，t t e s t ，a n dt - t e s t w eu s es p s s l7 o s t a t i s t i c ss o 肌a r et op r o c e s s i n gd a t a w h e np o 0 5 ，t h ed a t ah a ss i g n i f i c a i l t s t a t i s t i c ss i 星：i l i f i c a n c e m e np o o1 ，t h ed a t ah a sv e 巧s i g n i f i c a ms t a t i s t i c s s i g n i f i c a n c e r e s u l t s ： 1i m m u n o h i s t o c h e m i s t 搿e ) 【p e r i m e n ts h o w e dt h a t c h e m o k i n e sr e c 印t o r s c x c r 4w a sn e g a t i v e l ye x p r e s s e di nn o 眦a 1b r a i nt i s s u e sa n dp o s i t i v e l y e x p r e s s e di n2 4c a s e s9 1 i o m at i s s u e ，t h et o t a lp o s i t i v ee x p r e s s l o nr a t e sm t u m o rg r o u pa r e6 3 16 ，a n dm ep o s i t i v ee ) 【p r e s s i o nr a t e sw e r es 印a r a t e l y 4 4 4 4 a n d8 0 o o i n1 0 w g r a 【d e ( g r a d ei i ) g l i o m ag r o u pa n dh i 曲。伊a d e ( g r a d ei i i a n d )9 1 i o r n ag r o u p t h e p o s i t i v ee x p r e s s i o nr a t e so f c x c r 4 i n c r e a s e da l o n gw i t ht h ep a t h o l o g i c a lg r a d e so f9 1 i o m a ，a n dt h ep o s i t i v e e x p r e s s i o nr a t e so fh i 曲g r a d e9 1 i o m ag r o u pw e r es i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a n l o w g r a d eg l i o m a g r o u p ， m ed a t a h a s s i g n i j f i c a n t s t a t i s t i c s s i g n i f i c a j l c e ( 尸l o 0 5 ) 2t h ee x p r e s s i o na v e m g eo fm v dl a b e l l e dw i t ha n t i - c d 3 4m o n o c l o n 甜 a n t i b o d yi nn o m a lb r a i nt i s s u e sg r o u pa n dt i l m o rg r o u p r e s p e c t i v e l y w e r e3 7 6 士o 4 8a n d3 5 2 5 士9 7 5 ，t h ee x p r e s s i o no fm v d i s h i 曲e ri n g l i o m at i s s u e sg r o u pt h a l li nn o m a l b r a i nt i s s u e sg r o u p ，t h ed a t ah a dv e r y s i g i l i f i c a n t s t a t i s t i c ss i 萨i f i c a n c e ( p o 0 1 ) t l l ee x p r e s s i o n o fm v di n l o w g r a d e9 1 i o m ag r o u pa n dh i 曲一g r a d e9 1 i o m ag r o u pr e s p e c t l v e l y w e r e 2 7 38 士5 0 4 a n d4 2 3 4 士7 12 ，t h ee x p r e s s i o no fm v d i sh i g h e ri nh i 曲一g r a d e 9 1 i o m ag r o u pt h a ni nl o w g r a d e9 1 i o m ag r o u p ，廿1 ed i 虢r e n c eh a dv e r y s i 呈r n i f i c a n ts t a t i s t i c ss i g n i f i c a l i l c e ( j ) o o1 ) 3t h ee x p r e s s i o na v e r a g eo fm v dr e s p e c t i v e l y w e r e2 6 3 7 士5 1 1a n d 4 0 4 3 士7 8 8i n1 4c a s e sn e g a t i v ee x p r e s s i o no fc x c r 4a n d2 4c a s e s p o s i t i v ee x p r e s s i o no fc x c r 4i n 酉i o m at i s s u e s ，w e c a nk n o wt h a tt h ed a t a h a sv e 巧s i g n i f i c a n ts t a t i s t i c ss i g n i f i c a n c et h r o u g hm es t a t l s t l c a l t e s t ( 尺o 0 1 ) 英文摘要 4q u a n t i t a t i v er e a l t i m ep c rd e t e c t i o ns h o w e dt h a tt h en o m l a l i z e d c h e m o l ( i n e sr e c 印t o r sc x c r 4m r n aa m o u n tr e l a t i v et on o m a lb r a i n t i s s u e sg r o u pw a s2 2 2 士o 8 0i nl o w - 莎a d e 百i o m ag r o u p ，a n d4 0 3 士1 9 8i n h i 曲一伊a d eg l i o m a 铲o u p ，t h ed a t ai n c r e a s e da l o n gw i t ht h ep a t h o l o g i c a l g r a d e so fg l i o m a ，t h ed i 仃e r e n c eh a ds i g n i f i c a n ts t a t i s t i c ss i g n i f i c a n c e ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n ： 1c h 锄0 1 ( i n e sr e c e p t o r sc x c r 4e x p r e s s e sn e g a t i v e l yi ng r o u po fn o n n a l b r a i nt i s s u e s ，a n de ) 【p r e s s e sp o s i t i v e l yi ng r o u po f9 1 i o m at i s s u e s ，i ts u g g e s t s t h a tc x c r 4i sr e l a t e dt ot h ei n v a s i v e n e s so f g l i o m a 2i ng l i o m at i s s u e ，c h e m o k i n e sr e c 印t o r sc x c r 4h a sh i g h e re x p r e s s i o na t p r o t e i na n dm o l e c u l a r1 e v e l ，a n dt h ee x p r e s s i o ni n c r e a s e da l o n gw i t ht h e p a t h o l o g i c a lg r a d e so f9 1 i o m a ，t h i ss u g g e s t sn l a tc x c r 4 i sr e l a t e dt ot h e m a l i g n a n c yo fg l i o m a 3i ng l i o m at i s s u e ，m v dw h i c hc a nr e n e c tt h ei n c r e a s eo f n e o v a s c u l a r i z a t i o n ， i n c r e a s e da l o n g 谢t ht h ep a t h o l o 西c a l 伊a d e so fg l i o m a i ts u g g e s t st h a tt h e r e l a t i o nb e 咐e e nt h ea n g i o g e n e s i so fg l i o m aa n dm v di si n s 印a r a b l e t h e h i 曲e rm v d ，t h em o r et u m o ra n g i o g e n e s i s ，t h eh i g h e rm a l i 印a n c yo ft h e t l l m o r s i tw a sp r o v e dt h a tm v dw a sa 1 1i m p o r t a n ti n d i c a t o ro fd e t e m l i n i n g m a l i g n a n c y a i l dp r o g n o s i so ft u m o r s 4t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tt h ee x p r e s s i o no fm v dh a ss i g l l i f i c a n t s t a t i s t i c ss i g l l i f i c a n c eb e 帆e e nt 1 1 en e g a t i v ee x p r e s s i o no fc x c r 4a n d p o s i t i v ee x p r e s s i o no fc x c r 4i ng l i o m at i s s u e ，a n dc x c r 4c a na l s o e x p r e s si nv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l so fg l i o m a ，w h i c hs u g g e s t st h a tc x c r 4 m i g h t 冰ep a n i nt h ea n g i o g e n e s i so f 酉i o m a k e yw o r d s ：c x c r 4 ；g l i o m a ；c d 3 4 ；m v d ；i m m u n o h i s t o c h e m i s t 巧； a n g i o g e n e s i s ；q u a n t i t a t i v er e a l - t i i n ep c r 7 研究论文 趋化因子受体c x c r 4 在神经胶质瘤中的表达及意义 - - 一 刖吾 神经胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，发病率高，约占全部颅内肿瘤 的4 0 5 0 ，其恶性程度较高并有逐年上升的趋势，具体发生机制不清， 传统的手术治疗难以彻底切除，且术后复发率高，而放疗、化疗等治疗方 法又效果不佳，预后较差。因此，探索新的有效的治疗方法成为目前神经 外科领域的主要研究课题之一。 趋化因子( c h e m o k i n e s ，c h e m o a t t r a c t a n tc y t o k i n e s ) 是由小分子细胞因子 组成的细胞因子大家族，是一类对免疫细胞起趋化作用的促炎因子。以4 个保守的半胱氨酸序列形成的2 个二硫键为特征，根据其形成的二硫键的 4 个保守半胱氨酸的位置可分为4 类：c c 趋化因子、c x c 趋化因子、c x 3 c 趋化因子和c 趋化因子。趋化因子受体属于g 蛋白偶联受体 ( g p r o t e i n c o u p l e dr e i c 印t o r ，g p c r ) 超家族，是一种特殊的g 蛋白，均含有 7 个跨膜区域，趋化因子受体根据结合配体的不同也可相应的分为四类： c x c r ，c c r ，x c r 和c x l c r ，均为g p c r 家族成员【1 1 。 趋化因子只有与其相应的受体结合才能发挥作用，因此目前探讨肿瘤 的侵袭、转移和血管生成的机制的方法之一就是研究肿瘤的趋化因子受体 的表达。目前已有研究发现趋化因子受体c x c r 4 与肿瘤的侵袭性生长及 血管生成密切相关【2 5 】。也有研究显示在神经胶质瘤细胞中有趋化因子受 体c x c r 4 的表达，并且其表达可能与胶质瘤的恶性程度有关，另外研究 还显示神经胶质瘤血管内皮增生随其恶性程度增加而明显增加，支持血管 生成是胶质瘤进展的重要特征【2 6 7 】。因此研究趋化因子受体c x c r 4 在神 经胶质瘤细胞中的表达及与血管生成的关系，对于探究以趋化因子受体为 靶点的治疗策略具有十分重要的意义。 本实验研究是以人脑神经胶质瘤组织为材料，分别从蛋白水平和分子 水平观察趋化因子受体c x c r 4 在人脑神经胶质瘤组织各病理级别中的表 达情况，并在蛋白水平观察了c x c r 4 的表达与微血管密度的关系，揭示 其在胶质瘤的侵袭性及血管生成方面所起的作用。 研究论文 材料与方法 1 材料 1 1 标本来源 收集河北医科大学第二医院神经外科2 0 0 9 年1 0 月2 0 l o 年3 月经 手术切除的资料完整的3 8 例神经胶质瘤患者( 其中男性2 2 例，女性1 6 例) 的手术标本，平均年龄4 6 1 2 士1 7 1 3 岁，所有患者均为首发病例，术 前未行放化疗等治疗手段，另取5 例行内减压术患者的正常脑组织标本作 为对照，患者平均年龄为4 8 8 0 士1 4 8 2 岁。每一例标本均取两份，其中一 份以4 的多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，5 “m 厚连续切片，贴于涂 有多聚赖氨酸防脱片胶的载玻片上，烤片后备用行免疫组织化学染色实 验；另一份在新鲜标本离体o 5 h 内，无菌手术刀切取适量组织，迅速置 于冻存管中液氮速冻，8 0 0 c 冰柜冻存以备行实时荧光定量p c r 实验。所 有组织均行病理组织学检查确诊，并按照、o ( 2 0 0 0 ) 脑肿瘤分类、分 级标准进行临床病理分期。其中i i 级1 8 例，i i i 级1 2 例，级8 例。为了 方便统计，将i i 级归为低级别组，i 级归为高级别组。 1 2 主要仪器 l w 2 1 3 5l e i c a 石蜡切片机德国l c i c a 公司 h 1 1 2 l ol e i c a 展片仪德国l e i c a 公司 o l y m p u s 光学显微镜日本0 l y n 巾u s 光学工业株式会社 8 0 超低温冰箱日本s 6 心o 公司 t s 1 型脱色摇床江苏省金坛市富华仪器有限公司 j b 3 定时双向磁力恒温搅拌器江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 x w 二8 0 a 漩涡混合器上海医科大学仪器厂 电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司 m l s 3 0 2 0 型高压消毒锅日本s a n y o 公司 f a 2 0 0 4 n 电子天平宁波新芝生物科技股份有限公司 3 7 恒温孵育箱上海福玛实验设备有限公司 s 2 9 3 自动双重纯水蒸馏器上海强申生化仪器厂 微波炉格兰仕电器实业有限公司 f m 7 0 a 制冰机意大利g r a n t 公司 研究论文 m i c r o c l2 1 r 微量离心机 p t c 2 0 0p c r 扩增仪 7 5 0 0 荧光定量p c r 仪 n a n o d r o pl o o o 微量核酸蛋白 检测仪 黑马凝胶图像分析仪 d v 8 9i i 型电动玻璃匀浆器 1 3 主要药品及试剂 兔抗人c x c r 4 单克隆抗体 鼠抗人原始造血细胞( c d 3 4 ) 单克隆抗体工作液 兔免疫组化试剂盒 小鼠s p 染色试剂盒 浓缩型d a b 试剂 3 0 过氧化氢 甲醇 无水乙醇 二甲苯 切片石蜡 氯化钾 柠檬酸三钠 多聚赖氨酸 磷酸二氢钾 磷酸氢二钠 柠檬酸 t n z o l d e p c p c r 引物 p - a c t i o n p r i m e s c r i p pr tr e g e n t t 美国t h e n n o 公司 美国m j 公司 美国a b i 公司 美国基因公司 珠海黑马医学仪器有限公司 宁波新芝有限公司 美国e p i t o m i c s 公司 北京中衫金桥生物技术有限公司 北京四正柏生物科技有限公司 美国z e d 公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 天津市东方化工厂 天津市永大化工厂 天津市北方天医化学试剂厂 保定化学试剂厂 天津市化学试剂一厂 天津市永大化学试剂中心 北京益利精细化学品有限公司 美国s i g m a 公司 天津市化学试剂六厂三分厂 天津市北方天医化学试剂厂 天津市华东试剂厂 宝生物工程( 大连) 有限公司 北京赛百盛基因技术有限公司 上海生工生物工程有限公司合成 上海生工生物工程有限公司 宝生物工程( 大连) 有限公司 研究论文 s rp r e m i x 戥勋q宝生物工程( 大连) 有限公司 其他试剂为国产分析纯 1 4 主要试剂配制 1 4 1o 0 1 m p b s 溶液 n a c l 1 6 9 k c l o 4 0 9 k h 2 p 0 4o 4 8 9 n a 2 h p 0 4 12 h 2 02 8 8 9 以上物质溶于2 0 0 0 m l 双蒸水中，调整p h 至7 4 ，高温高压后4 保存。 1 4 2l o m m 柠檬酸钠抗原修复液 c 6 h 5 n a 3 0 7 2 h 2 03 9 c 6 h 8 0 7 h 2 0o 4 9 溶于1 0 0 0 m l 蒸馏水中，调p h 至6 o 。 1 4 3d a b 显色剂( 临用前配制) ： 取d a b 显色试剂盒中的a ，b ，c 试剂各一滴，加入1m l 蒸馏水中混匀 即为o o1 d a b d d h 2 0 显色液。 1 4 4 抗体： 浓缩型抗体用抗体稀释液稀释，c x c i 单克隆抗体按1 ：1 0 0 稀释，4 保存备用。 c d 3 4 单克隆抗体为工作液，可即用。 2 方法： 2 1 免疫组织化学染色 2 1 1 免疫组织化学染色的原理 免疫组织化学是根据免疫学和组织化学原理，用特殊标记物标记抗体 或抗原，通过抗原抗体反应在组织和细胞上进行的一种化学反应，并利用 化学反应所呈现的颜色，在原位上确定组织细胞结构的化学成分和化学性 质。s p 法是其中一种染色方法，它采用生物素标记的第二抗体与链霉菌 抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质色素混合液来测定细胞和组织中 的抗原。 2 1 2 免疫组织化学染色步骤 采用s p 法进行免疫组织化学检测，d a b 显色，苏木素复染。操作步 研究论文 骤按试剂盒说明书进行，常规设阴性对照和阳性对照。 2 1 2 1c x c r 4 免疫组织化学染色步骤 ( 1 ) 石蜡切片于6 0 温箱中复温2 0 m i n ： ( 2 ) 脱蜡，分别于二甲苯il o m i n ，二甲苯i il o m i n ； ( 3 ) 脱水，分别在1 0 0 i 、1 0 0 i i 、9 5 、9 0 乙醇中依次浸泡5 m i n ， 蒸馏水中2 m i n ： ( 4 ) 标本用o o1m p b s ( p h 7 4 ) 漂洗，5 m i n 3 次； ( 5 ) 微波修复抗原：将切片浸入1 0 i i l 】柠檬酸钠抗原修复液( p h 6 o ) 中，先加热至沸腾，间隔3 分钟后再次加热至沸腾，共循环3 次后自然冷却 室温后，o 0 1 m p b s 洗涤，5 m i n 3 次； ( 6 ) 滴加新鲜配置的3 双氧水室温孵育3 0 m i n ，p b s 浸泡，5 m i n 3 次； ( 7 ) 滴加正常山羊血清工作液封闭游离结合位点，3 7 温箱，5 0 m i n ； ( 8 ) 倒去封闭液，滴加一抗( 1 ：1 0 0 ) ，4 过夜； ( 9 ) p b s 洗涤，3 0 m i n ； ( 1 0 ) 滴加抗兔生物素化二抗工作液，3 7 温箱，3 0 m i n ； ( 1 1 ) p b s 洗涤，3 0 m i n ； ( 1 2 ) 滴加h r p 标记链亲和素工作液，3 7 温箱，3 5 m i n ； ( 1 3 ) p b s 洗涤，5 m i n 3 次； ( 1 4 ) d a b 显色剂显色，边显色边镜下观察，自来水中止显色； ( 1 5 ) 苏木素复染2 0 秒，自来水冲洗、浸泡1 0 分钟； ( 1 6 ) 常规酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。 2 1 2 2c d 3 4 免疫组织化学染色步骤 ( 1 ) 石蜡切片于6 0 温箱中复温2 0 m i n ； ( 2 ) 脱蜡，分别于二甲苯il o m i n ，二甲苯i i1 0 m i n ； ( 3 ) 脱水，分别在1 0 0 i 、1 0 0 i i 、9 5 、9 0 乙醇中依次浸泡5 m i n ， 蒸馏水中2 m i n ； ( 4 ) 标本用o 0 1 m p b s ( p h 7 4 ) 漂洗，5 m i n 3 次； ( 5 ) 微波修复抗原：将切片浸入1 0 r i l m 柠檬酸钠抗原修复液( p h 6 o ) 中，先加热至沸腾，间隔3 分钟后再次加热至沸腾，共循环3 次后自然冷却 室温后，o o l m p b s 洗涤，5 m i n 3 次； 研究论文 ( 6 ) 滴加试剂盒中的3 h 2 0 2 去离子水室温孵育2 5 m i n ，p b s 浸泡， 5 m i n 3 次； ( 7 ) 滴加正常山羊血清工作液封闭游离结合位点，3 7 温箱，5 0 m i n ； ( 8 ) 倒去封闭液，滴加一抗工作液，4 过夜； ( 9 ) p b s 洗涤，3 0 l i l i n ； ( 1 0 ) 滴加生物素标记山羊抗小鼠i g g 二抗工作液，3 7 温箱，3 0 m i n ； ( 1 1 ) p b s 洗涤，3 0 m i n ； ( 1 2 ) 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，3 7 温箱，3 5 m i n ； ( 1 3 ) p b s 洗涤，5 m i n 3 次； ( 1 4 ) d a b 显色剂显色，边显色边镜下观察，自来水中止显色； ( 1 5 ) 苏木素复染2 0 秒，自来水冲洗、浸泡1 0 分钟； ( 1 6 ) 常规酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。 2 1 2 3 结果判定 ( 1 ) c x c r 4 结果判定：c x c r 4 免疫反应阳性物质呈棕黄色颗粒，定 位于细胞胞膜及细胞浆，核不着色。参考相关文献【8 】进行肿瘤细胞阳性分 析。在高倍镜随机选择5 个高倍视野，每个视野记数1 0 0 个肿瘤细胞，避开 肿瘤边缘和坏死区，根据阳性瘤细胞数目所占百分比得出c x c r 4 标记指 数( l a b e l i n gi n d e x ，l i ) ，即c x c r 4l i = 阳性瘤细胞数5 0 0 个瘤细胞1 0 0 。 阳性细胞的百分比分为以下四级计分： 5 0 计3 分。染色强度按瘤细胞深浅记分：o 分，不着色；1 分，弱；2 分，中等；3 分，强。将2 个分值相加即得出该例标本的免疫组 化阳性分度：o 1 分为阴性，记为；2 4 分为弱阳性，记为+ ；5 分以上 为阳性，记为+ + 。 ( 2 ) 微血管密度( m v d ) 的测定：参照w d d n d 9 】报道的方法进行 测定，瘤组织内任何被抗c d 3 4 抗体染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细 胞簇，有或无管腔，只要与其它组织成分有明显区别，均计为1 个阳性血 管标记，每例观察切片l 张，避开肿瘤坏死或出血区域，在低倍镜( 4 0 ) 下选择微血管最丰富区，即“热点”( “h o ts p o t ) ，在高倍视野( 2 0 0 ) 下计数， 计数5 个2 0 0 倍视野下的血管数，在目镜网格测微尺o 2 5 m m 2 的范围内计 数，取其算术平均数计为该例切片的m v d 测定值。 2 2 实时荧光定量p c r 实验 研究论文 2 2 1 实时荧光定量p c r 实验原