（外科学专业论文）st13基因多态性与结直肠癌发病风险的关联研究.pdf

乙 目录 - 0oo - 1 ”“一一4 s t l 3 基因多态性与结直肠癌发病风险的关联研究 前言 7 日l j 舌 “一一”一“”“一”“”“”“”7 材料与方法0 1 oooo ooe010000 0ooooorio 8 结果 oo ooood6o010 1 2 附图、附表d o oooo io goooqo ooooooioi oooooo q00 1 5 讨论- 2 2 参考文献o oo ooo 2 6 综述s t l 3 基因和癌症相关性的研究进展2 9 致谢i ooo o 4 0 个人简历o ooio ooo 4 1 风险的关联研究 目的：s t l 3 基因( s u p p r e s s i o no f t u m o r g e n e c i t y l 3g e n e ) 是一种应用减 式杂交技术筛选出来的结直肠癌( c o l o r e c t a lc a n c e r ，c r c ) 负相关基因， s t l 3 基因多态性与c r c 发病风险的研究国内外均尚未见报道，本研究旨 在探讨s t l 3 基因r s 5 7 5 8 0 9 8 a g 、r s l 3 8 3 3 5 g c 、r s l 3 8 3 4 4 c g 单核苷酸多 态性( s n ps i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ) 与c r c 遗传易感性的关系， 从分子生物学水平为结直肠癌的预防和诊治提供依据。 方法：本研究采用病例一对照研究方法，收集2 0 0 例结直肠癌患者和 2 0 0 例健康对照个体的静脉抗凝血各5 m l ，同时记录其病史和个人相关资 料。采用蛋白酶k 消化一饱和氯化钠盐析法提取外周血白细胞d n a ，采 用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性( p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，p c r - r f l p ) 方法分别对 r s 5 7 5 8 0 9 8a g 、r s l 3 8 3 3 5 g c 、r s l 3 8 3 4 4 c g 三个s n p 位点进行基因分型。 数据统计分析采用s p s s l1 5 版软件包( s p s sc o m p a n y , c h i c a g o ， i l l i n o i s ，u s a ) 进行，p o 0 5 ) 。 2s t l 3 基因r s 5 7 5 8 0 9 8a g 多态的a 、g 等位基因频率在病例组和对照 组分别为8 4 3 、1 5 7 和8 3 o 、1 7 o ，两组相比无显著差异( 尸 o 0 5 ) ； a 、a g 、g g3 种基因型频率在病例组和对照组中分别是：6 9 o 、 3 0 5 、o 5 和7 0 5 、2 5 o 、4 5 ，两组比较有显著性差异( 尸= o 0 2 3 ) 。 与a 基因型相比，携带g 和g g 基因型均可增加c r c 发病风险 中文摘要 ( o r = 8 6 0 0 ，9 5 c i = 1 0 7 0 - 6 9 0 8 9 和o r = 1 0 6 7 1 ，9 5 c i = i 2 9 9 - 8 7 6 4 7 ) 。 根据个体吸烟史进行分层分析发现，在不吸烟人群中，与黜，a 基因型相 比，携带a g 和g g 基因型可明显增加c r c 的发病风险( o r = 8 1 7 5 ，9 5 c i = i 0 1 5 “5 8 7 1 和o r = 1 0 9 3 9 ，9 5 c i = i 3 1 8 9 0 8 0 2 ) 。未发现s t l 3 基因r s 5 7 5 8 0 9 8 a gs n p 对吸烟人群c r c 发病风险的影响( o r = 0 9 2 3 ，9 5 c i = 0 3 6 1 2 3 5 7 ) 。根据个体饮酒史进行分层分析发现，与a 基因型 相比，携带a g 和g g 基因型可明显增加不饮酒人群中c r c 的发病风险 ( o r = 8 4 2 7 ，9 5 c i = i 0 4 6 - 6 7 8 8 0 和o r = 1 1 5 5 4 ，9 5 c i = 1 3 9 6 - 9 5 6 4 5 ) 。 未发现s t l 3 基因r s 5 7 5 8 0 9 8 a gs n p 对饮酒人群c r c 发病风险的影响 ( o r = i 3 4 7 ，9 5 c i = 0 4 9 1 - 3 7 0 0 ) 。 3s t l 3 基因r s l 3 8 3 3 5g c 多态的c 、g 等位基因频率在病例组和对照组 分别为4 8 8 、5 1 2 和5 3 0 、4 7 o ，两组相比无显著差异( p o 0 5 ) ； c c 、g c 、g g3 种基因型频率在病例组和对照组中分别是：2 5 o 、4 7 5 、 2 7 5 和3 1 5 、4 3 o 、2 5 5 ，两组比较也无差异( p 0 0 5 ) 。与g g 基因型相比，携带g c 、c c 基因型对c r c 的发病风险无明显影响( o i p l 3 6 0 ，9 5 c i = 0 7 9 8 - 2 3 1 5 和o r = i 3 8 9 ，9 5 c i = 0 8 6 6 2 2 2 8 ) 。根 据个体吸烟、饮酒状况进行分层分析发现，与g g 基因型相比，携带g c 和c c 基因型与c r c 的发病风险无明显相关性。 4s t l 3 基因r s l 3 8 3 4 4c g 多态的c 、g 等位基因频率在病例组和对照组 分别为9 1 8 、8 。2 和9 4 o 、6 o ，两组相比无显著差异( 尸 o 0 5 ) ； c c 、c g 、g g3 种基因型频率在病例组和对照组中分别是：8 5 5 、1 2 5 、 2 o 和8 8 o 、1 2 o 、0 o ，两组比较也无差异( 尸 o 0 5 ) 。与c c 基 因型相比，携带g 等位基因型( c g + g g ) 与c r c 的发病风险无明显相关 性( o r = i 2 4 0 ，9 5 c i = 0 6 9 4 - - 2 2 1 7 ) 。根据个体吸烟、饮酒状况进行分层 分析亦发现，与c c 基因型相比，携带g 等位基因型与c r c 的发病风险 无明显相关性。 结论： l 本研究结果提示：s t l 3 基因r s 5 7 5 8 0 9 8a gs n p 可能与结直肠癌的发病 风险有关，携带a g 和g g 基因型可显著增加c r c 发病风险，尤其是 在不吸烟和不饮酒人群中。 2s t l 3 基因r s l 3 8 3 3 5g cs n p 可能与结直肠癌的发病风险无关。 2 中文摘要 3s t l 3 基因r s l 3 8 3 4 4c gs n p 可能与结直肠癌的发病风险无关。 性 关键词：结直肠癌；s t l 3 基i n ；单核苷酸多态性( s n p ) ；遗传易感 英文摘要 t h ea s s o c i a t i o no fs t l 3p o l y m o r p h i s mw i t ht h er i s ko f c o l o r e c t a lc a n c e r a b s t r a c t o b j e c t i v e ：s t 13g e n e ( s u p p r e s s i o no ft u m o r g e n e c i t y13 g e n e ) i sa n e g a t i v e l yr e l a t e dg e n eo fc o l o r e c t a lc a n c e r ( c r c ) d i s c o v e r e db ys u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n t h ep r i t e i ne n c o d e db yt h es t 13g e n ew a sc o n s i d e r e da sa n h s p 7 0 - s p e c i f i cp o s i t i v ec o c h a p e r o n et op l a ya ni m p o r t a n tr o l ei np r o t e i n f o l d i n ga n di nc o n t r o l l i n gt h ea c t i v i t yo fr e g u l a t o r yp r o t e i n sa n dm i g h t c o r r e l a t ew i t ht h eo c c u r r e n c ea n d d e v e l o p m e n to fc a n c e r t h eg e n e t i c p o l y m o r p h i s m so fs t 13g e n em i g h tb ea b l et oi n f l u e n c et h eg e n et r a n s c r i p t i o n a n de x p r e s s i o na tt h ep r o t e i nl e v e l ，w h i c hm i g h ta f f e c tt h ei n d i v i d u a lt u m o r s u s c e p t i v i t yf u r t h e r th es t u d yw a sd e s i g n e dt oi n v e s t i g a t et h ec o r r e l a t i o no f s t l 3r s 5 7 5 8 0 9 8 a g 、r s l 3 8 3 3 5g c 、r s l 3 8 3 4 4 c gs n p sw i t ht h er i s ko f c r c b y t h i sw a y , w eh o p et oo f f e rs o m ee v i d e n c e sf o rt h ep r e v e n t i o na n d t h e r a p y o fc r ca tm e l o c u l a r b i o l o g i c a ll e v e l m e t h o d s ：t h i sp o p u l a t i o n - b a s e dc a s e - - c o n t r o ls t u d yi n c l u d e d2 0 0c r c p a t i e n t sa n d2 0 0h e a a l t h yc o n t r o l s t h eg e n o m i cd n a w a se x t r a c t e db yu s i n g p r o t e i n a s ekd i g e s t i o nf o l l o w e db yas a l t i n go u tp r o c e d u r e g e n o t y p e so ft h e s t13g e n ew e r ea n a l y z e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ( p c r - r f l p ) m e t h o d s t a t i s t i c a la n a l y s i sw a sp e r f o r m e du s i n gs p s sl1 5s o f t w a r ep a c k a g e a p r o b a b i l i t yl e v e lo f5 w a sc o n s i d e r e ds i g n i f i c a n tf o ra l ls t a t i s t i c a la n a l y s e s t h ea g ed if f e r e n c eo fc a s e sa n df r e q u e n c y m a t c h e dc o n t r o l sw a sa n a l y z e db y t h et - t e s t ，w h i l et h e a n a l y s i s o ft h e g e n d e rd i f f e r e n c eb e t w e e nc a s e sa n d c o n t r o l su s e dc h i s q u a r et e s t h a r d y w e i n b e r ga n a l y s i sw a sp e r f o r m e db y c o m p a r i n gt h eo b s e r v e da n de x p e c t e dg e n o t y p ef r e q u e n c i e si ns t u d yg r o u p s u s i n gc h i - s q u a r et e s t c o m p a r i s o no ft h es t 13g e n o t y p ea n da l l e l o t y p e d i s t r i b u t i o ni np a t i e n t sa n dh e a l t h yc o n t r o l sw a sp e r f o r m e db ym e a n so f t w o s i d e dc o n t i n g e n c yt a b l e su s i n gc h i - s q u a r et e s t t h eo d d sr a t i o ( o r ) a n d 4 l o g i s t i c i o no ft h ea ，a ，a ga n dg gg e n o t y p e sb e t w e e nc r c p a t i e n t s ( 6 9 0 ， 3 0 5 a n d0 5 ，r e s p e c t i v e l y ) a n dc o n t r o l s ( 7 0 5 ，2 5 0 a n d4 5 ，r e s p e c t i v e l y ) h a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p o 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht h eg g g e n o t y p e ，t h eg ca n dc cg e n o t y p e sc o u l dn o ti n c r e a s et h er i s ko fd e v e l 英文摘要 o p i n gc r c ，t h eo d d sr a t i ow e r e1 3 6 0 ( 9 5 c i = 0 7 9 8 - 2 3 15 ) a n d1 3 8 9 ( 9 5 c i = 0 8 6 6 - - - 2 2 2 8 ) w h e ns t r a t i f i e df o rs m o k i n ga n dd r i n k i n gs t a t u s ，n o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei ng e n o t y p ea n da l l e l ed i s t r i b u t i o n sw a sf o u n db e t w e e np a t i e n t sa n dc o n t r o lg r o u p si ns t l 3r s l 3 8 3 3 5 g c ( 尸 0 0 5 ) 4t h ef r e q u e n c i e so ft h es t13r s138 3 4 4 c gca n dga l l e l ea m o n gc r c p a t i e n t sa n dh e a l t h yc o n t r o l sw e r e9 1 8 ，8 2 a n d9 4 o ，6 o r e s p e c t i v e l y ； n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nt h es t13r s138 3 4 4 c ga l l e l ed i s t r i b u t i o nw a s s h o w nb e t w e e nc r c p a t i e n t sa n dc o n t r o l s ( 胗0 0 5 ) t h ed i s t r i b u t i o no f t h ec c ，c ga n dg gg e n o t y p e sb e t w e e nc r c p a t i e n t s ( 8 5 5 ，12 5 a n d2 o ，r e s p e c t i v e l y ) a n dc o n t r o l s ( 8 8 o ，1 2 o a n d0 o ，r e s p e c t i v e l y ) a l s oh a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( 胗o 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht h ec c g e n o t y p e ，t h ec g + g gg e n o t y p e sc o u l dn o ti n c r e a s e t h er i s ko f d e v e l o p i n gc r c ，t h eo d d sr a t i ow a s1 2 4 0 ( 9 5 c i = 0 6 9 4 - 2 2 17 ) w h e ns t r a t i f i e df o rs m o k i n ga n dd r i n k i n gs t a t u s ，n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e i ng e n o t y p ea n da l l e l ed i s t r i b u t i o n sw a sf o u n db e t w e e np a t i e n t sa n d c o n t r o lg r o u p si ns t13r s138 3 4 4 c g ( d 0 0 5 ) c o n c l u s i o n s ： 1t h es t l3r s 5 7 5 8 0 9 8 a gs n pw a sa s s o c i a t e dw i t ht h er i s ko fd e v e l o p i n g c r c t h es u b je c t s ，p a r t i c u l a r l yn o n s m o k e r so rn o n d r i n k e r s ，c a r r y i n g a ga n dg gg e n o t y p e sc o u l db ea s s o c i a t e dw i t ht h ei n c r e a s e dr i s ko f d e v e l o p i n gc r c 2t h es t l 3r s l 3 8 3 3 5 g cs n p m i g h t n o tb er e l a t e dt ot h er i s ko f c r cd e - v e l o p m e n t 3t h e r ew a sn os i g n i f i c a n ta s s o c i a t i o nb e t w e e nt h es t13r s138 3 4 4 c g s n pa n dt h er i s ko fd e v e l o p i n gc r c k e yw o r d s ： c o l o r e c t a lc a n c e r ( c r c ) ；s t13 g e n e ；s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ( s n p ) ；s u s c e p t i b i l i t y 6 研究论文 s t l3 基因多态性与结直肠癌发病风险的关联研究 - _ 一 刖罱 结直肠癌( c o l o r e c t a lc a n c e rc r c ) 是威胁人类健康的主要恶性肿瘤 之一。在我国，随着经济的发展和人民生活水平的不断提高，结直肠癌的 发病率正在逐年上升，并有年轻化的趋势。统计学预测表明，不久的将来， 在女性中结直肠癌发病率将超过胃癌，成为胃肠道肿瘤中导致死亡的首要 原因，而在男性中则可能成为居于肺、胃癌之后成为第三位导致死亡的恶 性肿瘤【1 1 。 结直肠癌的发病过程一般较长，从正常上皮、增生、腺瘤、原位癌到 转移，有明显的阶段性，这为研究结直肠癌的发病机理提供了理想的模型， 从分子生物学角度研究，在结直肠癌的发生和发展过程中，细胞内会发生 一系列分子水平的变化，正是这些分子水平的变化，才导致了最终形态上 明显可见的病理改变。1 9 8 8 年，v o g e l s t e i n 提出结直肠癌发展的多基因参 与、多步骤及多阶段的分子事件模式，如d n a 甲基化水平变化、r a s 激活、 m y c 扩增、a p c 和p 5 3 突变等【2 】。随着研究的深入，模式逐渐被充实，现 已明确，癌基因、抑癌基因、错配修复基因、以及细胞周期调控相关因子 基因等大量基因的结构及表达异常，是结直肠癌发生发展的基础。 因此，在结直肠癌病因学研究中，有必要寻找与其发生、发展相关的 遗传易感基因，探讨基因在c r c 发生发展中的作用，进一步从分子水平 阐明结直肠癌的发病机制，为其早发现、早诊断和早治疗提供重要的理论 基础。 s t l 3 基因( s u p p r e s s i o no f t u m o r g e n e c i t y l 3g e n e ) 是一种应用减式杂交 技术筛选出来的大肠癌负相关基因，定位于人染色体2 2 q 1 3 ，它编码的蛋 白质作为作为h s p 7 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n7 0 ) 分子共伴侣，在蛋白质调节方 面扮演着非常重要的角色，并与肿瘤的发生发展有着非常密切的关系。已 有研究显示：在正常肠粘膜和结直肠癌粘膜中，s t l 3 基因m r n a 表达水 平和蛋白表达均有显著性差异，在癌组织中表达低于正常粘膜，且动物实 验已经证明，s t l 3 基因能够影响肿瘤的生长和转移1 3 。6 】。 迄今为止，关于s t l 3 基因分子结构及功能研究等方面国内外已有诸 研究论文 多报道，而其单核苷酸多态性( s n ps i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ) 与 c i 汇发病风险的研究国内外均未见报道。s t l 3 基因上的s n p 位点可能通 过影响其的转录和蛋白质表达导致生物学活性的个体差异，从而影响个体 肿瘤的易感性。本实验通过结合n c b i 网站和h a p m a p 基因数据库，运用 h a p l o v i e w 软件，以r z o 8 和m a f 0 1 0 为条件筛选出r s 5 7 5 8 0 9 8 a g 、 r s l 3 8 3 3 5 g c 、r s l 3 8 3 4 4 c g 三个标签位点( t a g g e rs n p s ) ，采用病例一对 照研究，探讨s t l 3 基因多态性与中国北方汉族人群结直肠癌发病风险的 关系，从分子生物学水平为结直肠癌的预防和诊治提供依据。 材料与方法 l 研究对象 2 0 0 例结直肠癌患者为2 0 0 8 年7 月2 0 0 9 年8 月在河北医科大学第四 医院外二科行首次手术治疗的患者，术前未行放射或化学治疗，术后标本 均经病理学证实。2 0 0 名对照人群为同期在河北医科大学第四医院内镜室 健康体检者。所有研究对象均来自于河北省石家庄及其周边地区，为北方 汉族人群。所有研究对象的性别、年龄、吸烟史、饮酒史状况在经当事人 知情同意前提下由专门的登记员询问调查。现吸烟或曾吸烟每天5 支以 上，并持续两年或两年以上者定义为吸烟个体。每周饮酒2 次或以上，持 续半年以上者定义为饮酒个体。 2 主要实验设备与仪器 ( 1 ) s w - c j 2 f d 型净化工作台苏州安泰空气技术公司 ( 2 ) 离心机l x j 6 4 0 1北京医疗仪器修理厂 ( 3 ) 台式离心机p q 1 6 0 0 a上海培清科技有限公司 ( 4 ) h j 一3 恒温磁力搅拌器江苏金坛医疗仪器厂 ( 5 ) h 一1 微型混合器上海彭氏实业有限公司 ( 6 ) 电子天平p b 3 0 0 2 一sm e l r l e rc o m p a n y , s w i t z e r l a n d ( 7 ) p c r 扩增仪m a s t e r c y c l e r 5 3 3 3德国e p p e n d o r f 公司 ( 8 ) d y y - i i l 2 稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂 ( 9 ) d y v i i l 31 d 型电泳槽北京市六一仪器厂 ( 1 0 ) 微波炉( m i c r o w a v eo v e n ) 上海中达医学应用研究所 研究论文 ( 1 1 ) 紫外线检测仪北京市新技术应用研究所 ( 1 2 ) 澳柯玛冰柜青岛澳柯玛公司 ( 1 3 ) 海尔冰箱b c 一1 6 5 d青岛海尔集团 ( 1 4 ) m d f u 5 0 v 。8 6 低温冰箱日本三洋公司 ( 1 5 ) 2 0 2 2 a 型电热恒温烤箱上海阳光实验仪器公司 ( 16 ) e p p e n d o r fr e s e a r c h 移液器 德国e p p e n d o r f 公司 ( 1 7 ) d y v i i i2 8 a 型电泳槽北京市六一仪器厂 ( 1 8 ) t s 1 型脱色摇床江苏省海门市麒麟医用仪器厂 ( 1 9 ) 凝胶成像分析仪a l p h a l m a g e r2 2 0 0美国a n l a i 公司 3 主要实验试剂 ( 1 ) t r i t o n - x 1 0 0 s i gm a ( 2 ) t r i s h c l ( 三羟甲基氨基烷)s i g m a ( 3 ) e d t a ( 乙二胺) s i g m a ( 4 ) s d s ( 十二烷基磺酸钠)s i gm a ( 5 ) 蛋白酶km e r c k ，g e r m a n y ( 6 ) 1 0 x p c rb u f f e r北京赛百盛生物有限公司 ( 7 ) 10m m o l ld n t p s q b i o ge n e ，g e r m a n y ( 8 ) i h q d n a 聚合酶 北京赛百盛生物有限公司 ( 9 ) 琼脂糖s i g m a ( 1 0 ) 溴化乙锭( e b ) s i g m a ( 1 1 ) 1 0 0 b pd n a l a d d e r华美生物工程公司 ( 1 2 ) 限制性内切酶 r s ai h i n ti i ( 1 3 ) 引物合成 4 实验方法 p r o m e g ac o r p o r a t i o n 北京赛百盛生物有限公司 北京赛百盛生物有限公司 4 1 外周血白细胞d n a 的提取 采集每位研究个体的静脉血5 m l ，经枸橼酸钠抗凝，置4 0 c 冰箱保存， 并于采血后1 周内提取外周血自细胞d n a 。采用蛋白酶k 消化饱和氯化 钠盐析法【7 1 。具体操作程序如下： 外周血5 m l 加冷蒸馏水至5 0 m l ，2 5 0 0 r p m 室温离心1 0 m i n ，弃上清。 研究论文 重复2 3 次至红细胞完全裂解。加入预冷的0 1 t r i t o n x1 0 04 5 m l 同上 离心去上清，洗涤l - - 2 次。沉淀加3 m ld n a 提取液，充分混匀，悬浮白 细胞，加1 0 s d s1 5 0 i _ t l ( 终浓度0 5 ) 剧烈振荡至无凝块。加入蛋白酶 k 至终浓度为1 0 0 1 a g m l ( 1 m g m l 约4 0 0 u 1 ) ，混匀，3 7 。c 消化过夜。然后， 加入5 m o l l 的n a c l1 2 m l ，剧烈振荡1 5 s ，2 5 0 0 r p m 室温离心1 5 m i n 。将 上清倒入另一离心管中，弃沉淀。上清中加入1 0 0 乙醇8 m l ，反复颠倒 混匀，挑出d n a 至高压灭菌的e p p e n d o r f 管中，以7 0 乙醇洗涤l 2 次，倒置e p p e n d o r f 管并使乙醇挥发干净。以2 0 0 1 a lt e 溶解d n a ，4 0 c 至 少放置2 4 h ，彻底溶解后经电泳或测o d 值定量。 4 2 鉴定：将提取的基因组d n a ，在o 8 琼脂糖凝胶中电泳( 恒压8 0 v ， 电泳缓冲液1 t b e ) 3 0 分钟后，将凝胶移至0 【成像系统下进行观察。 4 - 3 引物的设计与合成：运用g e n e t o o l 软件设计s t l 3 基因上的多态性位 点特异性核苷酸序列引物，由北京塞百盛基因技术有限公司合成。 4 3 1s t l 3r s 5 7 5 8 0 9 8 a g 上游引物为：5 - a a g c a c a g g a c a c a t t t t c a g a a g a 3 下游引物为：5 - a c c t g a c a l 盯g c t a c g t 盯c t a c c a 3 4 3 2s t l 3r s l 3 8 3 3 5 g c 上游引物为：5 。c c g a t g t t c t g c a a t t t t c t g t g 3 下游引物为：5 - g t c c g t c t g a a a c c t a a a c a c t g t g 3 4 3 3s t l 3r s l 3 8 3 4 4 c g 上游引物为：5 。t r t c c t c a c t t g a t g g t t c g t c t g c 3 下游引物为：5 - c c a c c a c g t c c g g c t a a t t t g t a t 3 4 4 扩增s t l 3 基因的反应体系： 灭菌去离子水1 0 8 p 1 ( r s 5 7 5 8 0 9 8 a g 、r s l 3 8 3 4 4 c g ) 1 1 2 i - t l ( r s l 3 8 3 3 5 g c ) 1 0 x p c r 缓冲液 2 4p l ( r s 5 7 5 8 0 9 8 a g 、r s l 3 8 3 4 4 c g ) 2 0p l ( r s l3 8 3 3 5 g c ) p c r 染料 上游引物 下游引物 1 0m m o l ld n t p s 2 0 肛l 1 0p l 1 0l a l o 4p l 1 0 研究论文 taq酶04 l a l 模板d n a 2 0 “l 将上述反应液轻弹混匀、短暂离心以集中反应液于管底。 4 5 依据设计的循环参数进行扩增，反应条件： 9 4 预变性5m i n ，以后按9 4 。c 变性4 5 s ，6 1 ( r s 5 7 5 8 0 9 8 a g ) 、6 2 ( r s l 3 8 3 3 5 g c ) 、6 7 1 ( r s l 3 8 3 4 4 c g ) 退火4 5 s ，7 2 延伸4 5s ，3 5 个 循环后，7 2 延伸7 m i n 。 4 6 琼脂糖凝胶的制备 用电子天平分别秤取2g 、3g 的琼脂糖粉末，溶于10 0m llx t a e 中， 加入装有琼脂糖粉末的椎形瓶中混匀，置于微波炉内至熔融，取出后加入 溴化乙锭1 0p l ( o 5 i ，t g m 1 ) ，充分混匀后将熔融液体倒入胶板，冷却备用。 2 、3 的琼脂糖凝胶分别用于p c r 产物和酶切产物分析。 4 7p c r 产物分析 4 7 1 将制备好的胶板放入水平电泳槽内。 4 7 2 将稀释的1 x t a e 液，倒入电泳槽至稍高出胶面为宜。 4 7 3 吸取3 9 l 扩增产物( 余置于4 c 保存备用) 上样于琼脂糖凝胶电泳， 必要时同时上样阴性对照( 未加模板d n a ，用灭菌去离子水替代的p c r 产物) 及阳性对照( 多次重复所获得的稳定的p c r 产物) ，同时选择1 0 0 b p d n al a d d e r 水平电泳。 4 7 4 通电，稳压1 0 0v ，电泳时间为5 m i n 左右。 4 7 5 电泳结束后，取出凝胶，紫外灯下与m a r k e r 跑出的条带相比较，可 判定扩增片段长度。 4 8 基因型分析 4 8 1r s 5 7 5 8 0 9 8 a g p c r 产物的电泳条带为5 0 8 b p 。用限制性内切酶 h i n ci i 对p c r 产物进行酶切，具体操作为：在1 个1 5 m l 灭菌的e p p e n d o r f 管中依次加入下列各试剂成分( 反应体系为1 0 t 1 ) ：1 0 xb u f f e rl “l ， h i n ci i1 “l ，灭菌去离子水2 “l ，p c r 产物6 1 a l 。将上述混合液短暂离心， 3 7 温箱过夜消化。酶切反应结束后，吸取全部消化产物，上样于2 琼 脂糖凝胶，同时上样阴性对照( 同前) 、阳性对照( 多次试验确定的稳定 的纯合子的酶切产物) ，并选择合适分子量的d n a 标志物( m a r k e r ) 。通 电，稳压1 0 0v ，电泳时间为3 0 m i n 。电泳结束后，取出凝胶，凝胶成像 研究论文 仪下观察酶切结果。s t l 3 基因r s 5 7 5 8 0 9 8 核苷酸位点处a 为g 所替代， 从而产生一个h i n ci i 限制性酶切位点，g g 基因型经限制性内切酶消化后 的片段为3 3 4 b p 和1 7 4 b p 两条d n a 片段，a 基因型缺乏h i n ci i 的识别 位点保持原有p c r 后的5 0 8 b p ，a g 杂合基因型则显示为5 0 8 b p 、3 3 4 b p 和17 4 b p 三条片段( f i g 1 ) 。 4 8 2r s l3 8 3 3 5 g c p c r 产物的电泳条带为3 6 2 b p 。用限制性内切酶r s a i 对p c r 产物进行酶切，酶切体系为：1 0 xb u f f e r1 p l ，r s a10 2 “l ，灭菌 去离子水2 8 t l ，b s a1 l a l ，p c r 产物5 1 a l 。将上述混合液短暂离心，3 7 温箱过夜消化。酶切反应结束后，吸取全部消化产物，上样于3 琼脂 糖凝胶，余操作同上。基因型c c 存在r s ai 的识别位点产生1 4 8 b p 和2 1 4 b p 两条d n a 片段，基因型g g 缺乏r s ai 的识别位点保持原有p c r 后的 3 6 2 b p ，g c 杂合基因型则显示为3 6 2 b p 、2 1 4 b p 和1 4 8 b p 三条片段( f i g 2 ) 。 4 8 - 3r s l3 8 3 4 4 c g p c r 产物的电泳条带为3 0 8 b p 。用限制性内切酶r s a i 对p c r 产物进行酶切，酶切体系同r s l 3 8 3 3 5 g c ，将上述混合液短暂离 心，3 7 温箱过夜消化。酶切反应结束后，吸取全部消化产物，上样于 3 琼脂糖凝胶，余操作同上。基因型c c 存在r s ai 的识别位点产生9 0 b p 和2 1 8 b p 两条d n a 片段，基因型g g 缺乏r s ai 的识别位点保持原有p c r 后的3 0 8 b p ，c g 杂合基因型则显示为3 0 8 b p 、2 1 8 b p 和9 0 b p 三条片段 ( f i g 3 ) 。 4 9 统计学分析 所有数据均应用s p s s l1 5 软件进行统计分析。病例组与对照组的年 龄差异行t 检验，性别差异行，检验。用，检验比较基因频率的观察值与 预期值，并进行h a r d y w e i n b e r g 平衡分析。以非条件l o g i s t i c 回归方法计 算表示相对风险度的比值比( o d d sr a t i o ，o r ) 及其9 5 可信区间 ( c o n f i d e n c ei n t e r v a l ，c i ) 。以p o 0 5 ) 。 1 2c r c 患者组中吸烟个体比例为2 6 5 ，与健康对照组( 2 0 o ) 相比， 无显著性差异( x 2 = 2 3 6 8 ，p = o 1 2 4 ) 。 1 3c r c 患者组中饮酒个体比例为2 1 o ，与健康对照组( 1 8 5 ) 相比，无 显著性差异( f = o 3 9 4 ，p = o 5 3 0 ) 。 1 4 所有研究对象的d n a 标本均经p c r r f l p 方法成功检测了s t l3 r s 5 7 5 8 0 9 8 a g 、r s l 3 8 3 3 5 g c 、r s l 3 8 3 4 4 c g 三种多态性的基因型，且1 5 的d n a 标本进行重复分型，结果与原始结果完全相符。 2 健康对照组的r s 5 7 5 8 0 9 8 a g 、r s l 3 8 3 3 5 g c 和r s l 3 8 3 4 4 c g 多态位点的 基因型频率分布均符合h a r d y w e i n b e r g 平衡( p o 0 5 ) 。 3s t l 3 基因r s 5 7 5 8 0 9 8 g 多态性与c r c 发病风险的相关性分析 综合t a b l e2 和t a b l e3 结果可见：在c r c 患者组与健康对照组中a 、 g 的等位基因频率分别为8 4 3 、1 5 7 和8 3 o 、1 7 o ，无显著性差 异( p o 0 5 ) 。a 、a g 、g g3 种基因型频率分别为：6 9 o 、3 0 5 、 o 5 和7 0 5 、2 5 o 、4 5 ，具有显著性差异( p = o 0 2 3 ) ，与a a 基因 型相比，携带g 和g g 基因型均可增加c r c 发病风险( o r = 8 6 0 0 ，9 5 c i = i 0 7 0 6 9 0 8 9 和o r = 1 0 6 7 1 9 5 c i = i 2 9 9 8 7 6 4 7 ) 。根据个体吸烟 史进行分层分析发现，在不吸烟人群中，与a 基因型相比，携带a g 和g g 基因型可明显增加c r c 的发病风险( o r = 8 1 7 5 ，9 5 c i = i 0 1 5 - - 6 5 8 7 1 和o r = 1 0 9 3 9 ，9 5 c i = i 3 1 8 - - 9 0 8 0 2 ) 。未发现s t l 3 基因 r s 5 7 5 8 0 9 8 a ，gs n p 对吸烟人群c r c 发病风险的影响( o r = 0 9 2 3 ，9 5 c i = 0 3