（作物遗传育种专业论文）盐胁迫下诱抗剂对水稻P450基因的扩增多态性分析.pdf

盐胁迫下诱抗剂对水稻p 4 5 0 基因的扩增多态性分析 ， 摘要 在诱抗剂h i 能够提高水稻r 6 耐盐能力的基础上，本实验针对水稻r 6 诱导耐盐相 关基因p 4 5 0 作为研究的目标基因，通过“功能基因扩增多态性( f g a p ) 标记方法，分 析基因组d n a 与转录后基因表达( c d n a 序列) 的多态性，并对特殊的条谱进行凝胶回收 测序，分析其特异性。实验主要结果如下： 1 药物处理下的水稻形态表现 与h ：0 对照相比，盐胁迫下水稻的根长受到了明显的抑制，根色发黄，短而粗，苗 高比亲本要矮小。与i n a c l 胁迫相比，经过诱抗剂h i 预处理后，根长得到了诱导，根 色变白，比水的粗比盐的细，苗高分别介于同一类型植株h ：o 和盐处理之间。与盐胁迫 对照相比，红霉素、西咪替丁抑制苗高和根长，利福平促进苗高抑制根长，环孢素a 促 进根长且幼苗比盐处理稍高。 2 采用六种方法提取d n a ，结果显示液氮研磨法、s d s 法、c t a b 法所得的基因组 d n a 效果较好，但在d n a 浓度上明显小于优化s d s 法；优化c t a b 法所提取的基因组d n a 虽然浓度较大，但纯度较差，拖尾较严重：试剂盒提取得到的基因组d n a 纯度高，d n a 量 也很充足，并且没有r n a 污染。 3 不同处理的p 4 5 0 基因c d n a 序列多态性分析 3 1 反应体系的优化结果。本文改良了陈晓口叫的反转录体系，将0 1 i g o d t 引物量由 2ul 改为lpl ，同时在反应条件中增加了2 5 温浴l o m i n 后再进行4 2 的恒温反应， 得到的反转录产物更为完整，a c t i n 引物检测时得到的特异条带更亮更集中。针对c d n a 的p c r 反应体系特点，进一步改良了朱志凯阿钔和陈晓h 鲫的p c r 反应体系，根据条带重新 优化体系，包括反应体系的成分用量以及反应条件。最终优化p c r 反应体系：2 0 | llp c r 反应体系中，含6 0 n g 模板c d n a ，1p12 0 m md n t p ，0 5ut a q d n a 聚合酶，2 5l l1l o p m 随机引物和3 5ull o p m 特异引物，复合退火温度为随机引物3 5 。c ，特异引物5 5 c 。 3 2 对目的基因的退火温度及循环数的筛选，t 2 、t 7 、t 1 5 、p 7 、p 8 、p 9 、p 1 1 、p 1 5 的最佳退火温度分别为5 8 、5 5 、5 5 、5 8 、5 5 、5 8 、5 8 、5 8 ，最佳循环 次数分别为3 4 、3 2 、3 2 、3 4 、3 4 、3 6 、3 4 、3 2 。 3 3 筛选引物组合。筛选与光合速率显著相关的组合进行基因组以及c d n a 序列多态 性检测，共筛选出3 0 对引物组合，分别对水稻r 6 三种处理( 清水、盐及h i ) 条件下提 取的d n a 进行扩增及r n a 进行r t p c r 扩增，产生多态性条带2 4 2 条，多态性达7 5 0 5 ，大 多数条带集中在1 0 0 6 0 0 b p 。 3 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳回收。改进了聚丙烯酰胺凝胶回收的方法，将煮沸法融合 到一步法中，用特异引物t 7 和t 2 扩增，得到了1 5 8 b p 和2 2 6 b p 两条清晰条带。 4 在盐胁迫条件下c s a 诱导水稻n m _ 0 0 1 0 6 6 0 0 6 基因发生选择性剪接。本实验首次 发现用一种功能基因扩增多态性( f u n c t i o n a lg e n e sa m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ，f g a p ) 方法中的组合引物对p 。p ：，进行e d n a 序列扩增，在c s a 作用下，简便有效地区分 n m0 0 1 0 6 6 0 0 6 和n m 一0 0 1 0 6 6 0 0 9 的表达，并对图1 1 ，1 2 中约5 3 0b p 条带是在 n m 处于 b p 内含子，而在一 中却处于b p 外显子作出合理_ 0 0 1 0 6 6 0 0 6 中 1 9 5 n m0 0 1 0 6 6 0 0 9 1 0 2 的解释，可见水稻p 4 5 0 基因对药物c s a 有明显作用，因而在水稻中利用c s a 研究p 4 5 0 基因、m d r 基因与抗逆性的相互作用值得深入探讨。而f g a p 为m r n a 选择性剪接的研究提 供了一个简便有效方法。 5 对p 4 5 0 基因特异条带回收测序分析。回收条带进行p c r 扩增，由上海英俊生物 技术有限公司测序，测序结果显示，用h 。o 、s 、h i 处理后，不同处理的c d n a 序列与 n m 一1 9 0 9 6 6 相同的碱基占7 0 ：在n m - 1 9 0 9 6 6 基因编码序列1 0 4 2 b p 处，清水和h i 处理 的水稻r 6 材料发生了一个碱基的缺失；在n m 一1 9 0 9 6 6 基因编码序9 8 2 - 1 4 5 8 处，水稻r 6 材料发生了6 5 个碱基变异，其中h c l 0 7 9 c h 明显是颠换的结果；但有8 个碱基是在盐胁 迫下发生改变，经过h i 处理后有3 3 个碱基发生了改变，测序结果分析与电泳基本一致。 这种现象是水稻r 6 个体间d n a 差异或是盐胁迫与诱抗剂h i 诱导作用产生的r n a 编辑的 结果? 有待进一步研究。 关键词：盐胁迫，诱抗剂，水稻，p 4 5 0 基因，多态性，选择性剪接 i i a m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s ma n a l y s i so f r i c ep 4 50g e n e t r e a t e db ye l i c i t o r su n d e rs a l ts t r e s s a b s t r a c t t h i se x p e r i m e n tf o rr 6 _ i n d u c e ds a l tt o l e r a n c ei nr i c e r e l a t e dg e n e sa sar e s e a r c hg o a lo f p 4 5 0g e n e s ，a n a l y s i sp o l y m o r p h i s mo fg e n o m i cd n aa n dt h ep o s t - t r a n s c r i p t i o n a l g e n e e x p r e s s i o n ( e d n as e q u e n c e ) ，t h r o u g h f u n c t i o ng e n ea m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ( f g a p ) ， a n a l y s i so fi t ss p e c i f i c i t yb yg e lr e c y c l i n g ，o nt h eb a s i st h a te l i c i t o rh ii m p r o v e ds a l t t o l e r a n c e a b i l i t yo ff i c er 6 t h ef o l l o w i n gr e s u l t s ： 。1t h ef o r mo f p e r f o r m a n c eu n d e r d r u gt r e a t m e n t c o m p a r i n gw i t hh 2 0 ，r 6r o o tl e n g t hu n d e rs a l ts t r e s sw e r ei n h i b i t e d ，w i t hr o o tc o l o r t u r n i n gy e l l o w , s h o r ta n dt k c k ，a n dt h eh e i g h ti sl o w e rt h a nt h ep a r e n t r 6r o o tl e n g t hh a d b e e ni n d u c e d ，r o o tt u r n e dw h i t e ，t h i n k e rt h a ni ti nh 2 0 ，t h i n n e rt h a ni ns a l t t h eh e i g h tw o u l d s t a yb e t w e e ni t i nh 2 0a n ds a l t c o m p a r e dw i t h1 n a c lc o n t r 0 1 c o m p a r i n gw i t h1 n a c i c o n t r o l ，e ma n dc i ms h o r t e n e dt h er o o tl e n g t ha n dt h e s e e d l i n gh e i g h t i 讧pe l o n g a t e dt h e s e e d l i n gh e i g h t , b u ts h o r t e n e dt h er o o tl e n g t h ，c s ae l o n g a t e dt h er o o tl e n g t ha n dt h eh e i g h to f s e e d l i n gi st a l l e rt h a nt h a ti ns a l t 2i nt h es i xm e t h o d so fe x t r a c t i n gd n a ，r e s u l t ss h o w e dt h a t ：g e n o m i cd n ae x t r a c t e db y l i q u i dn i t r o g e ng r i n d i n g 、s d sa n dc t a bw a y si sg o o d ，w h i l et h ed n ad e n s i t yi sl e s st h a n b yt h eo p t i m i z e ds d sm e t h o d t h ed e n s i t yo ft h eg e n o m i cd n ae x t r a c t e db yt h eo p t i m i z e d c r a bi sb e t t e r , b u ti t sp u r i t yi sw o r s ew i t ht e r r i b l yt a i l i n g t h ed n ae x t r a c t e db yk i ti sp u r e a n da b u n d a n tw i t h o u tr n a p o l l u t i o n 3p o l y m o r p h i s ma n a l y s i so fe d n ap 4 5 0g e n eb yd i f f e r e n tt r e a t m e n t 3 1o p t i m i z e dr e s u l t so fr e a c t i o ns y s t e m w i l lo l i g o d tp r i m e r2 山r e p l a c e db yalg l ， s i m u l t a n e o u s l ya ta ni n c r e a s eo f2 5 b a t h10 m i na f t e r4 2 c o n s t a n tt e m p e r a t u r er e a c t i o n r e v e r s et r a n s c r i p t i o np r o d u c to fam o r ec o m p l e t e ，a c t i np r i m e r sd e t e c t e da s p e c i f i cb a n d ，m o r e l i g h ta n dm o r ef o c u s e d f o rt h ec h a r a c t e r i c t i co ft h ep c r r e a c t i o ns y s t e mo fe d n a ，z h u z h i k a i a n dc h e n x i a oa r ef u r t h e ro p t i m i z e d ，a c c o r d i n gt ob a n d st or e - o p t i m i z et h es y s t e m ，i n c l u d i n g t h ea m o u n to fc o m p o n e n t sa sw e l la sr e a c t i o nc o n d i t i o n s ，t h ep c rr e a c t i o ns y s t e me v e n t u a l l y o p t i m i z e d ：2 0 山p c rr e a c t i o ns y s t e m ，c o n t a i n i n g6 0 n ge d n at e m p l a t e ，lg l2 0 m md n t p , 0 5 u t a q d n ap o l y m e r a s e ，2 5 9 llo p mr a n d o mp r i m e r s ，3 5 9 llo p ms p e c i f i cp r i m e r s ，a n n e a l i n g t e m p e r a t u r er a n d o mp r i m e r3 5 ，s p e c i f i cp r i m e r5 5 。c 3 2t ot h et a r g e tg e n ea n dt h ea n n e a l i n gt e m p e r a t u r ec y c l e ss c r e e n i n g ，t h eb e s ta n n e a l i n g t e m p e r a t u r ef o r t 2 、t 7 、t 1 5 、p 7 、p 8 、p 9 、p 1 1 、p 1 5a r e5 8 、5 5 、5 5 、5 8 、5 5 、 i i l 5 8 、5 8 、5 8 ，t h eb e s tc y c l en u m b e rw e r e3 4 、3 2 、3 2 、3 4 、3 4 、3 6 、3 4 、3 2r e s p e c t i v e l y 3 3 p r i m e rc o m b i n a t i o n s s c r e e n i n g s c r e e n i n gs i g n i f i c a n t l y c o r r e l a t e d w i t h p h o t o s y n t h e t i c r a t et ot e s t e dt h ec o m b i n a t i o n g e n o m e a n de d n a s e q u e n c e p o l y m o r p h i s m ，s c r e e n e d at o t a lo f3 0p a i r so fp r i m e rc o m b i n a t i o n s ，u n d e rt h r e ed i f f e r e n t t r e a t m e n t ( h 2 0 ，s a l ta n dh i ) c o n d i t i o n so fr i c er 6 ，e x t r a c t i o no fd n aa m p l i f i c a t i o na n d r n af o rr t - p c ra m p l i f i c a t i o n ，g e n e r a t e d2 4 2p o l y m o r p h i cb a n d s ，7 5 p o l y m o rp h i s m ， m o s tc o n c e n t r a t e di nt h e10 0 6 0 0 b p 3 4p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i sr e c y c l i n g i m p r o v e d p o l y a c r y l a m i d eg e l r e c o v e r ym e t h o d ，i n t e g r a t e db o i l i n gm e t h o di n t ot h eo n e s t e pm e t h o d ，a m p l i f i e db yt 7a n d t 2 ，t h e no b m i n e d158 b pa n d2 2 6 b pt h et w oc l e a rb a n d s 4u n d e rt h ec o n d i t i o n so fs a l ts t r e s s ，c s a - i n d u c e dr i c e n m 一0 0 10 6 6 0 0 6h a p p e n e d a l t e r n a t i v es p l i c i n g p r i m e rc o m b i n a t i o no fp 3 p 2o ff u n c t i o n a lg e n e sa m p l i f i e dp o l y m o r p h i c m e t h o d ( f u n c t i o n a lg e n e sa m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ，f g a f ) ，u n d e re d n aa m p l i f i c a t i o n ，w i t h t h ei m p a c to fc s a ，d i s t i n c t e dt h ee x p r e s s i o nb e t w e e ns i m p l ea n de f f e c t i v en m0 010 6 6 0 0 6 a n dn m _ 0 0 1 0 6 6 0 0 9 ，g i v i n gar e a s o n a b l ee x p l a n a t i o na b o u tf i g 1 1 ，1 2w h e r e5 3 0b pb a n da t n m0 0 1 0 6 6 0 0 6i si na1 9 5b pi n t r o n ，b u ti nt h en m0 0 1 0 6 6 0 0 9i si n1 0 2b pe x o n t h i s i n d i c a t e st h a tr i c ep 4 5 0g e n e sh a se f f e c t e db yc s a t h e r f o r e ，i ti sw o r t h w h i l et of u r t h e rs t u d y a b o u tt h ei n t e r a c t i o na m o n gp 4 5 0g e n e ，m d ra n di t sr e s i s t a n c e ，u s i n gc s ai nr i c er e s e a r c h a n df g a pp r o v i d e sas i m p l ea n de f f e c t i v em e t h o df o rt h es t u d yo fm r n aa l t e r n a t i v e s p l i c i n g 5s e q u e n c i n ga n a l y s i so fp 4 5 0g e n e s p e c i f i cb a n d sr e c y c l i n g r e c y c l i n gs t r i pf o rp c r a m p l i f i c a t i o n ，f r o ms h a n g h a ih a n d s o m eb i o l o g yt e c h n o l o g yc o l t d s e q u e n c i n gr e s u l t s s h o w e dt h a t ，a f t e rh 2 0 ，s ，h it r e a t m e n t ，d i f f e r e n tt r e a t m e n to ft h ee d n as e q u e n c e sw i t h n m 一1 9 0 9 6 6h a v et h es a m eb a s ea c c o u n tf o r7 0 ；n m 一19 0 9 6 6a t10 4 2 b pg e n ec o d i n g s e q u e n c e ，t h et r e a t m e n to fw a t e r a n dh io fr i c er 6h a p p e n e dan u c l e o t i d ed e l e t i o n ； n m 一1 9 0 9 6 6g e n ec o d i n gs e q u e n c ea t9 8 2 - 1 4 5 8d e p a r t m e n t ，r i c em a t e r i a l sr 6 o c c u r r e d6 5b p m u t a t i o n ，a c 10 7 9 c ai so b v i o u s l yt r a n s v e r s i o n s ；h o w e v e r , t h e r ei se i g h tb a s e sc h a n g e du n d e r s a l ts t r e s s ，a f t e rt h et r e a t m e n to fh it h e r ei s3 3b a s e sc h a n g e d ，s e q u e n c i n ga n a l y s i sa n dg e l e l e c t r o p h o r e s i sr e s u l t sa r eb a s i c a l l yc o n s i s t e n t t h i sp h e n o m e n o ni sr i c er 6d n a d i f f e r e n c e s a m o n g i n d i v i d u a l so rt h er o l eo fs a l ts t r e s sw i t hh i - i n d u c e dp r o d u c e dr n ae d i t i n gr e s u l t s ? p e n d i n gf u l t h e rs t u d y k e y w o r d s ：s a l t - s t r e s s ，e l i c i t o r s ，r i c e ，p 4 5 0g e n e ，p o l y m o r p h i s m ，a l t e r n a t i v es p l i c i n g i v 缩写符号英文名 a c r a p s b i s b p c t a b 心r 1 1 p e d t a e s t f g a p h i n c b i p 4 5 0 p c r c d n a s d s t e t e m e d 1 1 r a p t r i s a c r y l a m i d e 缩写词表 n , h i - m e t h t y l e n eb i s - a c r y l a m i d e b a s ep a i r s 中文名 丙烯酞胺 过硫酸胺 n ，n 一亚甲双丙烯酞胺 碱基对 c e t y l - t r i m e h t y l - a m m o n i u mb r o m i d e 十六烷基三甲基溴化铵 d e o x yn u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a - a c e t i ca c i d 脱氧核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s 表达序列标签 f u n c t i o ng e n ea m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m 功能基因扩增多态性 h y m e x a z o l 诱抗剂h i t h en a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g y 国家生物技术中心 c y t o c h r o m ep 4 5 0e n z y m es y s t e m c o m p l e m e n t a r yd n a 细胞色素p 4 5 0 聚合酶链式反应 互补d n a s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 t r i s h c l ，e d t ab u f f e r t e t r a m e t h y le t h y l e n ed i a m i n e 三羟甲基氨基甲烷e d t a 四甲基乙二胺 t a r g e tr e g i o na m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s m 目标区域扩增多态性 3 - h y d r o x y m e t h y l - m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 广东海洋大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名：撇 年6 月哆e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名：徘 导师签名：方设矧琵 2 0 。7 年月哆日 2 0d 尸年多月冲日 广东海洋大学硕士学位论文 第一章引言 1 研究的目的和意义 土壤盐渍化是世界范围内影响作物产量的主要非生物胁迫因子之一。由于世界上存 在大量盐碱地和盐渍化土壤，相当大的一部分农作物品种因受不同程度盐害的影响难 以发挥其增产和优质潜力。影响作物产量的各种环境因素中，干旱和盐碱造成的减产 在4 0 以上。据统计，全球大约有3 8 亿h m 2 土地存在不同程度的盐渍化，约占可耕地面 积的1 0 。中国目前有0 2 亿h m 2 以上盐碱地和o 0 7 亿h l n 2 以上盐渍化土壤，约占可耕地面 积的2 0 n 叫。盐渍土是中国分布广、类型多、对农业生产影响较大的一种低产土壤。盐 渍化土壤的开发利用有多种途径，筛选作物的耐盐品种并加以利用是一种行之有效的 措施h 1 ，它对加速抑盐脱盐进程，提高作物产量都具有重要意义。 众所周知，当今世界人类面临着人口、资源和环境三大问题。我国占世界人口的2 0 ， 人们主要的食粮是大米。对稻谷的消费总量1 9 9 0 年为1 6 4 5 7 2 千吨，2 0 0 0 年为2 1 4 5 4 4 千吨，预计2 0 0 5 年将达到2 6 4 6 5 8 千吨。中国水稻种植面积仅次子印度，占全世界种植 面积的2 2 3 ，居世界第二，而在我国三大粮食作物中水稻的种植面积居第一位。随着 人口的增加、耕地面积的减少、环境的恶化和粮食需求的增加，进一步提高水稻单产将 越来越重要。传统育种技术在水稻改良方面取得了巨大的成功，纵观我国水稻育种历史 与现状，从三系到两系再到一系的实践过程中，无一不是源于新种质的发现与利用。获 得新种质的途径很多，但主要是靠突变诱导和远缘杂交，不仅周期长而且成效低，当前 水稻生产迫切需要的种质资源不一定能从自然突变和人工诱变中获得嘲。 本实验室自配诱抗剂h i 进行诱导，使水稻在原有的基础上提高其耐盐性。随着分 子标记技术的发展，对水稻差异表达的研究变得更加容易。本实验在t r a p 分子标记技 术基础上，根据朱志凯对该分子标记体系的优化，再结合陈晓的半定量r t - p c r 技术， 对水稻r 6 进行三种不同的对照处理，提取r n a ，利用f g a p 分子标记方法进行p 4 5 0 基因 的差异表达分析。从不同的引物组合中筛选出两对出现明显差异条带的引物组合进行再 次扩增，回收差异的条带，检测其真实性，然后设计合适的特异引物进行重新扩增测序， 得到不同药物处理的碱基序列。 2 文献综述 2 1 植物的耐盐机理和生理生化特性 植物的耐盐机理实际就是解决高盐分浓度环境下植物如何生存的问题，即植物如何 实现既要从低水势的介质中获取水分和养分，又补影响本身的代谢和生长发育的双重目 标。植物的不同生理特性、不同发育阶段和在不同环境中所表现的耐盐性千差万别。植 物的耐盐机制是一个相当复杂的过程，有些机制目前虽还不十分清楚，但一般与盐分的 吸收、运输、排泌和分配，膜功能及渗透调节物质的合成和积累密切相关3 。 针对盐渍使植物生长造成的伤害，许多学者已经提出了不少植物盐害理论和假设口1 。 盐胁迫下诱抗剂对水稻p 4 5 0 基因的扩增多态性分析 m u n n s 和t e r m a t ( 1 9 8 6 年) 提出，新生叶生长速度减慢是植物对盐胁迫响应最敏感的生 理过程；叶片含盐量过高是老叶死亡的主要原因；碳水化合物枯竭导致植物死亡。虽然 盐分对植物伤害的种类很多，但从整体上讲，盐渍对植物胁迫主要包括两部分：一是渗 透胁迫，二是离子毒害旧1 。 高等植物有不同的耐盐机理，可概括为选择性，排盐性，稀释作用，离子区域化和 渗透调节等，近年的生理和生化研究已证实渗透调节和离子区域化为植物耐盐的主要机 制们。 2 1 1 渗透调节 在盐渍条件下，植物细胞可以通过积累在渗透上有活性而对细胞无毒的有机物来进 行渗透调节。部分盐生植物和非盐生植物在盐渍环境中可以合成大量的渗透调节物质， 如脯氨酸、甜菜碱和可溶性糖等。一般认为，脯氨酸的作用是平衡液泡中的高浓度盐分， 避免细胞质脱水，但关于脯氨酸与盐胁迫之间的关系迄今仍有争议。有实验报道，脯氨 酸积累与耐盐程度成负相关n0 川，因而认为脯氨酸积累可能是植物受到盐害的结果n2 l j 可溶性糖也是一种渗透调节剂，在盐胁迫初期，植物中可溶性糖含量增加，但到盐胁后 期其含量却降低，这可能是呼吸作用的增强和光合作用的衰竭所致n3 1 。 高浓度可溶性盐引起介质中的水势下降，导致介质中的渗透势的升高及细胞内膨压 的下降，这就构成了对细胞的渗透胁迫。如果植物细胞不能克服这种胁迫，根系就不能 吸水，从而导致生理干旱，严重时会出现气孔关闭，甚至由于细胞要极力维持内外水势 的平衡，发生质壁分离而枯死。植物抵抗耐盐胁迫最有效的就是进行渗透调节，参与渗 透调节的可溶性物质脯氨酸、甜菜碱等的合成需要动员一系列特殊的基因。例如将 山菠菜甜菜碱醛脱氢酶( b a d h ) 基因经根癌土壤杆菌a g l l 介导转入豆瓣菜n 制，提高了 豆瓣菜的耐盐性。 植物在渗透胁迫下，p r o 含量的迅速增加是植物渗透调节的显著特征之一。p r o 是 一种重要的有机渗透调节物质，许多特性与甜菜碱相似。盐渍条件下，不论是低等植物 还是高等植物，盐生植物还是非盐生植物，都发生游离p r o 的积累，积累的p r o 和甜菜 碱不同，随着盐胁迫解除即迅速降低哺1 。 2 1 2 离子毒害 植物耐盐的离子效应是指植物体对过剩n a + 进行细胞水平的区隔化积累以维持细胞 活性( m a r l a ，1 9 8 6 年) ，减少离子毒害。植物对高浓度盐的忍耐可表现在两个方面：一 是土壤存在高浓度盐时，植物体内盐含量仍保持在较低水平，植物生长发育不受较大的 影响；二是高浓度盐的土壤中，植物体内也积累的较高浓度的盐，仍能正常生长发育。 产生这种耐盐性的原因之一，是耐盐性强的植物能把进入细胞内的多种盐运入液泡并将 其封闭在液泡内，将n a + 积累在液泡中是维持细胞质中高k + n a + 的重要机制n 副。植物从 土壤溶液中吸收、积累各种离子，提高细胞内盐分浓度，只要这些离子不至达到极高的 2 广东海洋大学硕士学位论文 舞量寰_ 一一m m m m mm 茸皇曼葛皇舅置鼍窟舅_ 量置_ 皇曼一 浓度而表现出毒性，就能被植物用以提高细胞内渗透压。 植物所具有的对必需元素的选择性吸收功能，也为植物的耐盐机制提供了可靠的证 据。有些植物在高盐土壤中生长，根系具有选择吸收溶于土壤中低浓度必需元素的机能。 由于构成盐渍土壤主体的盐类大多数为n a c l ，一般k + 浓度都很低，因此选择吸收k + 的机 能对植物耐盐性有重要意义。 膜结构和功能的完整性是控制离子运转和分配的主导因素，因此膜系统是植物盐害 的主要部位n 引。l y o n s n 7 3 ( 1 9 7 3 年) 的“质膜伤害学说 认为盐分胁迫对植物的伤害作用 主要是离子胁迫致使植物细胞质膜损伤，使其选择性遭到破坏，胞内大量离子和某些有 机物质外渗，外界有毒盐离子进入，导致细胞内的一系列生理生化过程受到干扰引。研 究表明，质膜膜脂物理状态表现可能是植物感受渗透胁迫的原初反应n 钔。细胞膜是逆境 对植物伤害的原初位点，盐离子破坏植物细胞质膜的完整性，增大质膜透性，原因之一 是破坏了植物细胞内k + 、n a + 、g a 2 + 之间的平衡，当n a + 浓度增大时，破坏了r n a + 平衡， 因而导致细胞膜透性增大啪1 。高浓度的n a + 严重阻碍了植物对k + 、g a 2 + 的吸收和运输，c l 一 抑制对n o 。一及h z p 0 4 一的吸收口。离子间的拮抗作用，使其他一些必需元素的吸收受到抑制， 导致植物因缺乏某些元素而引起生育障碍。 植物的耐盐性不仅与渗透调节能力和保护物质的相对稳定有关，更主要的是取决于 根系对盐分的选择吸收及其在器官、组织和细胞三个层次上的区域化3 。适应n a c l 烟 草悬浮细胞系液泡中n a c l 的浓度比细胞质高8 倍；盐胁迫下，冰叶午时花w - a t p 酶活 性增加一倍，n a + r 逆向转运蛋白的量增加，过多的盐分被区隔到液泡中。盐渍下植物 器官之间n a + 的区域化分配往往决定着植物整体水平的耐盐能力，棉花在茎和叶柄中滞 留和积累n a + ，根中的k + 向上部运输，以维持叶片较高的k + n a + 。g r e e n w a y 和m u n n s 提 出，非盐生植物通过在根部储存较多的n a + ，以阻止n a + 在地上部积累，有利于增强植物 的耐盐性1 。 2 2 诱抗剂的概况 诱抗剂( e l i c i t o r ) 一词最初在1 9 7 2 年k e e n 提出m 1 ，是指可诱导激活植物抗逆境潜能 的外界因子。近年来，有关诱抗剂汹笳3 ( 或称诱导剂佗7 1 、激活剂嘲3 、激发子啪1 等) 的 研究较多，并已在农业生产上有一定应用，但主要在抗病性方面。 水稻是重要的粮食作物，属中等耐盐性植物。为使水稻高产稳产以满足人类对粮食 的需求，人们尝试多种方法提高水稻的耐盐能力。多数学者通过盐诱导的方法，寻求耐盐 性强的水稻材料1 和探讨盐诱导机理口；杨永利等2 1 应用土壤盐碱改良剂控制水稻苗期 盐害。朱晓军等b 3 一钉研究了在盐胁迫下钙对水稻幼苗抗氧化酶活性、膜脂过氧化作用、 光合作用及相关生理特性的影响。方良俊钉已用极微量诱抗剂诱导耐盐性较低的水稻品 种适应高盐胁迫，表明水稻可诱导的抗逆境潜能非常大。植物抗性可以人工诱导的事实 为解决目前农药残留问题提供了另一条有效途径。抗性诱导不改变植物体以外的自然环 盐胁迫下诱抗剂对水稻p 4 5 0 基因的扩增多态性分析 境，不杀灭任何生物，可少用甚至不用农药，极大地改善了农业环境，并有效地提高农作 物的稳产性和适应性，因而逐渐受到人们的重视瞳副。目前，对这类具有生物活性、能使作 物自身适应逆境的诱抗剂的开发利用研究已成为热点，但对诱抗剂诱导水稻耐盐性的筛 选及诱导效果的测定等研究却甚少。 本课题组已对诱抗剂与水稻光合速率的相关性进行了研究，结果显示诱抗剂处理的 水稻单株与光合速率或者呈正相关或者呈负相关。本实验在此基础上，研究诱抗剂有基 因表达的关系，试图研究诱抗剂处理后是否会引起水稻基因的差异表达，进而找到差异 表达的基因测序，找到碱基序列以备后续研究。 2 3 分子标记的研究进展 目前已有4 大类遗传标记得到应用，即形态标记、细胞标记、生化标记、分子标记。 分子标记与形态标记、细胞学标记和生化标记三类遗传标记技术相比，具有因直接以 d n a 的形式表现而在植物的任何生长阶段都可检测、遍布整个基因组、多态性高、检测 手段简单迅速、无基因多效性、能够明确辨别等位基因、实验重复性好等优点m 1 。 分子标记可归纳为四类，总结如下：以传统的s o u t h e r n 杂交为基础的分子标记 技术包括r f l p ：限制性内切酶酶切片段长度多态性标记，s s c p r f l p ：单链构象多态性 r f l p 和d g g e - r f l p ：变性梯度凝胶电泳一r f l p ；以p c r 为基础的分子标记技术包括 r a p d ：随机扩增多态性d n a ，e s t ：表达序列标签，s c a r ：测序的扩增区段，s s c p p c r ：单 链构象多态性p c r ，a f l p ：扩增的限制性内切酶片段长度多态性和s n p ：单核苷酸多态 性；以重复顺序为基础的标记包括m s ：微卫星d n a ( 重复单位为2 5 碱基对) ，s s r ： 简单重复顺序即微卫星d n a 标记和s s r p ：简单重复顺序多态性即微卫星d n a 标记； 以m r n a 为基础的分子标记技术包括d d ：差异显示，r t p c r ：逆转录p c r 和d d r t p c r ： 差异显示逆转录p c r 。蓬勃发展形式多样的分子标记，都有其独到的分析原理和其它标 记所无法比拟的优势，另一方面也有其存在局限性和缺点。 s r a p 是2 0 0 1 年由美国加州大学蔬菜作物系l i 和o u i r o s 口刀所提出的，针对外显子 和内含子特点分别设计富含g c 和a t 为核心序列的两组引物，因不同个体的内含子、启 动子与外显子间隔区长度不等而产生多态性。其分析关键是引物设计，正向引物含有一 段1 4 碱基的核心序列：5 端前1 0 个碱基为“填充”序列，无任何特异组成，接着为c c g g 序列，随后为37 端的3 个选择性碱基，选择性碱基的变化与相同核心序列组合成一套 正向引物，对o r f s 外显子进行特异扩增；反向引物的组成与正向引物类似，但“填充 序列后连接的为从t t ，其后为3 个选择性可变碱基，位于引物3 端，以特异结合富含 a t 的内含子、启动子区域和间隔序列进行特异扩增。s r a p 标记测序显示多数标记为外 显子区域，其多态性产生于两个方面：小片段插入与缺失导致片段大小改变而产生共显 性标记：核苷酸改变影响引物的结合位点，导致显性标记产生，具有多态性和信息量丰 富，技术简便，结果稳定，成本较低的优势。 4 广东海洋大学硕士学位论文 | 曼皇量皇量曹置鼍曼鼍曼曼曼曼量量e 皇量曼量曼曼i 一一一一一一一一一一一一量i 曼皇曼鼍量曩 b u d a k 等利用i s s r 、s s r 、r a p d 、s r a p 对1 5 份牛羊草进行检测，s r a p 是唯一能将 1 5 种基因型区分开来的标记，认为s r a p 标记多态性丰富，能够区分遗传关系很近的品 种。a h m a d 等町用s s r 和s r a p 标记对桃品种的遗传多样性进行了分析，发现s r a p 标 记能将遗传关系很近的桃品种区分开来且比s s r 标记更有效、快捷、成本低。f e r r i o l 等 汹一们用s r a p 标记和a f l p 标记对西葫芦和笋瓜的遗传多样性进行了分析，两者结果一 致，且s r a p 标记所提供的信息更接近于农艺性状的差异和历史演变的结果。林忠旭等 【4 1 ，4 2 】用s r a p 标记构建了棉花s r a p 遗传连锁图也认为s r a p 标记多态性好、操作简 单、重复性好。 总之，s r a p 适用于基因定位、基因克隆、生物多样性、遗传图谱构建h 羽、e d n a 指纹图谱、预测杂种优势、比较基因组学h 4 1 等诸多研究领域，已广泛应用于芸薹属作物、 马铃薯、水稻、莴苣、大蒜、苹果、柑桔属作物、芹菜、棉花、辣椒、小麦、柿属植物、 花生h 钔、烟草、甘薯m 1 等植物中。 和以往的r a d p 、r f l p 、s s r 、i s