（植物学专业论文）对苯二胺氧化产物与dna相互作用研究.pdf

摘要 d n a 与小分子之间的相互作用是当前核酸研究的热点之一，它在遗传学，药物设计， 药理学等方面有着广泛的应用前景。对苯二胺( p p d ) 是氧化型染发剂的主要成分，其 是否存在危害尚未达成共识。本论文利用了原子力显微镜技术( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y , a f m ) 探测d n a 与p p d 氧化产物之问的相互作用，并借助琼脂糖凝胶电泳，紫外可见 分光光度法，质谱法进行辅助分析。从纳米和分子水平上阐述了d n a 与p p d 氧化产物 之间可能的作用机理，预测了二者之间可能存在的结合方式。 1 本论文首次利用a f m 观测了不同来源的d n a 在加入不同浓度，不同氧化时间 p p d 时所产生的结构变化。由a f m 所得的形貌图结果推测p p d 氧化产物能够引起d n a 产生凝集现象，d n a 分子与p p d 氧化产物可能存在静电力作用，这一现象在已知的文献 中尚未见到过报导。实验结果为其它关于p p d 危险性的研究提供了纳米水平上的依据， 并对今后的科学研究提供了一定的参考价值。 2 。琼脂糖凝胶电泳发现，随着p p d 氧化产物的加入，质粒d n a 在4 0 0 0b p 处荧光 明显增强，此现象与a f m 相吻合。 3 紫外分光光度计中的光谱结果显示：当d n a 加入时，p p d 氧化产物的部分谱线 产生了减色和红移现象，说明p p d 氧化产物中的某种成分与d n a 分子之间存在插入嵌 合作用。 4 质谱分析表明，p p d 氧化产物很复杂，其主要的氧化物为b a d r o w s k i s b a s e ( b 8 ，m z = 3 1 9 3 ) 。分析液相及薄层色谱分离的产物，得知d n a 凝集可能是由b b 水溶液 引起。 本论文的结果表明，p p d 氧化产物之一b b 的水溶液与d n a 之间存在明显的相互作 用，可能会影响d n a 正常复制，从而导致遗传疾病。基于此，提倡人们发挥中草药的传 统优势，研制出无毒无害的治疗头发疾病的药物和染发剂替代品。 关键词对苯二胺；b a d r o w s k i sb a s e ；d n a 凝集：原子力显微镜；药用植物 a b s t r a c t t h es t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n ds m a l lm o l e c u l e sa g ec e n t r a lt on u c l e i c a c i dr e s e a r c h t h e r ei sar e m a r k a b l ea p p l i c a t i o ni nt h er e s e a r c hf i e l do fg e n e t i c s ，n o v e l d r u gd e s j g n ，p h a r m a c o l o g i c a la p p l i c a t i o n p - p h e n y l e n e d i a m i n e ( p p d ) i st h em o s tw i d e l y e n c o u n t e r e dp r i m a r yi n t e r m e d i a t ei no x i d a t i o nh a i rd y ef o r m u l a t i o n s i nt h i ss t u d y , w eu s e a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y , a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，u v v i ss p e c t r m na n dm st oa s s a yt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nt h eo x i d a t i o np r o d u c t so f p p da n dd n a w ec o n d u d et h a tt h em e c h a n i s m a n d b i n d i n gf o r mo f t h i si n t e r a c t i o nf r o m n a n o s c a l et om o l e c u l el e v e l 1 i nt h i ss t u d y , w ef i r s te m p l o y e dt h ea t o m i cf o r c em i c r o s c o p yt od e t e r m i n et h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nt h eo x i d a t i o np r o d u c t so fp p da n dd n a d n ac o n d e n s a t i o nw a gf o u n d , a c c o r d i n gt h ea f mt o p o g r a p h y t h i sp h e n o m e n o nw a sn e v e rb e e nr e p o l t e di ne a r l yr e s e a r c h e s ， t h er e s u l t si n d i c a t e dt h e r ew a ge l e c t r o s t a t i cf o r c eb e t w e e nt h eo x i d a t i o np r o d u c t so fp p da n d d n a i ts u p p l i e de v i d e n c ef o ro t h e rr e s e a r c hf r o mn a n o s c a l e ，a n dw a su s e df o rr e f e r e n c ei nt h e f u t u r e ， 2 f r o ma g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t i m ed e p e n d e n td n ac o n d e n s a t i o nw a gr e c o r d e di n t h em i x t u r es o l u t i o n t h i si ss i m i l a rt oa f m t o p o g r a p h y 3 w i t hu v n i ss p e c t r u m ，w ef o u n dh y p o c h r o m i ce f f e c ta t4 15m na n dr e ds h i f ta t5 3 0n l n i tw a ss h o w nt h e r ew a si n t e r c a l a t i o nb i n d i n gs o m es i n a i lm o l e c u l e st od n as t r a n d s 4 f r o mm sa n a l y s i s w ef o u n db a d r o w s k i sb a s e ( b b ，州z = 31 9 3 ) ，t h et r i m e ro fp p d ， w e r ef o r m e d b ba q u e o u ss o l u t i o ni n d u c e dd n ac o n d e n s a t i o nf r o ml i q u i dc h r o m a t o g r a p h y a n dt l cs e p a r a t i n gr e s u l t s w ec o n c l u d et h a tt h e r ei sd i s t i n c tm o l e c u l a ri n t e r a c t i o nb e t w e e nb ba q u e o u ss o l u t i o na n d d n a h a i rd y em a yb ed a n g e r o u sf o rh u m a nh e a l t h s o ，w eh o p et h a tt h ed r u gt h e r a p yf o rh a i r d i s e a s ea n ds u b s t i t u t eo f h a i rd y ew a sd e s i g n e d ，w i t hp h a r m a c e u t i c a lh e r b s k e y w o r d sp - p h e n y l e n e d i a m i n e ，b a d r o w s k i sb a s e ，d n ac o n d e n s a t i o n ，a t o m i c f o r c e m i c r o s c o p y , p h a r m a c e u t i c a lh e r b s i l ， 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 、已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得查i 垦盗些盘鲎或其他教育 l 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 f | 均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：谜寺房百签字日期：2 产加啪 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解壅韭盐些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权壅j 垦盗些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者始谚寺莉 手日期：矽d 7 年6 月魄 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 聊虢剑之圄 签字日期：。d | 年i 月归 电话： 邮编： i 绪论 1 绪论 1 1 对苯二胺研究进展 对苯二胺p p h e n y l e n e d i a m i n e ，p p t 3 ) 是氧化型染发剂的主要成分。统计显示氧化型染 发剂占染发剂市场的7 0 ，在北美大约有l ，3 的女性和1 1 0 的男性使用染发剂，而在亚 ：2 f 使用f l l 氧化型染发剂的比例明显高于北美，这是由于1 匝洲人头发的生理特点决定的。 p p d 化学性质不稳定，易被氧化剂氧化；存储液放置较长时间后，可以自发氧化成多种 氧化产物。氧化过程非常复杂，在不同的条件f 的氧化产物不尽相同，妇图i l 、i 。2 所 示。在p h = 8 6 时，p p d 的经过h 2 0 2 氧化后，主要产物为一种红紫色微溶于水的三聚体 化合物b a d r o w s k i sb a s e ( b b ) 和一种黄色醌类化合物：在p h = 5 6 时，醌类化合物含量 明显高于b b ；当p h 为3 6 时。主要氧化产物则为醌类化合物。若使用较低浓度的h 2 0 2 氧化时，则有利于b b 的形成1 2 1 。有关p p d 及其氧化产物的致突变性，致癌性，致敏性 等方面，已经开展了深入的研究。 p p d 曾被作为一种嵌入型核酸染料，对细胞核染色，可以检测核损伤例。p p d 自身 不具有致突变性，p p d 氧化后或与其它染发剂成分反应后，致突变能力明显增强。b r u c e 等鉴定了染发剂各组分的致突变特性1 4 】，他们通过实验得出8 9 的染发剂中含有致突变 成分。c r e b e l l i 等研究了p p d 与问苯二酚混合物的致突变性1 5 j 。体外实验表明，p p d 能够 有选择性的激活树突状细胞中c d 4 0 和主要组织相容复合体( m h c ) 家族i i 的表达和异 源淋巴细胞的增殖，而b b 则不会引起这些变化【6 l 。b r a c h e r 等分析了p p d 的潜在突变性 1 7 1 。s h a h i n 调查了含氮染料对s a l m o n e l l ar y p h i m u r i u m 的影响佯l 。p b e n z o q u i n o n e ( p b q ) 为p p d 氧化产物之一，能够形成p b q d c ，p b q - d a ，a n dp b q d g 加合物州，而且可以通 过与拓扑异构酶l l 作用，促使d n a 断裂i ”j 。 长期使用染发剂的人容易患有膀胱癌l 、血癌淋巴瘤【珏l ；然而通过对医院病例的个 案分析，却没有得出使用染发剂与神经胶质瘤、脑瘤、听觉神经瘤存在必然的联系l i ”， 以p p d 为主要成分的染料能够引起过敏反应f 1 4 j 。关于p p d 、p b q 、b b 的致敏性试 验表明，o 0 1 的p b q ，0 0 1 b b 能够引起过敏反应，1 p b q 具有一定的刺激性。面 从小鼠淋巴结分析表明，p p d 作用时。e c 3 的表达量高于b b 。b b 可能与l a n g e r h a n s 细 胞相互作用【”l 。经过h 2 0 2 氧化后的p p d 氧化产物引起n i h 3 t 3 发生转化，并有定的 浓度依赖性1 1 6 j 。b a h it a k k o u c h e 等人应用m a t a 统计方法分析了使用染发剂与患有癌症 之问的关系，结果表明尽管有些研究指出血癌和其他几种癌症与使用染发剂有关，然而 多数研究则表明二者并无直接联系，需要等待进一步的研究结果l l j 。 此外，有研究表明p p d 经过h 2 0 2 氧化后可以引起d n a 产生交联7 j 。 然丽以往关于p p d 氧化产物遗传毒性的报导中具体起作用的产物尚无定论，面且作 用机制至今仍不明确鞋”1 。 东北林业人学坝i 学位论上 c o n d e s a t l o n o x i d a t i o n p p d 一淼黑m 抛db b p b q i! ：竺：竺 幽i - 1 p d d 氧化反麻途径 一龟一州廖n p b q n d 2 1 2d n a 分子结构 瑞士科学家于1 8 6 9 年率先发现了d n a 。而直到1 9 5 3 年，接受过噬菌体小组训练的 遗传学家j a m e sw a t s o n 和具有x 射线背景的物理学家f r a n c i sc r i c k 完美组合，才使得 d n a 双螺旋结构为世人所知。a 、t 、g 、c 碱基通过3 ，5 磷酸二酯键连接起来形成线 形或环状结构，即d n a 一级结构。两条反平行的核苷酸链围绕同一中心轴缠绕形成d n a 二级结构，核苷酸链彼此依靠氢键连接，双螺旋平均直径为2n n l ，碱基位于双螺旋的内 侧，a ：t ，g ：c 碱基互补配对。d n a 分子通过扭曲折叠形成三级结构。超螺旋是d n a 三 缴结构的一种形式1 2 0 1 。 。 1 3d n a 与小分子的作用方式 小分子化合物与d n a 相互作用主要有共价结合( c o v a l e n tb o n d i n g ) 和非共价结合 ( n o n e o v a l e n tb o n d i n g ) 两种模式。共价结合包括与亲核试剂的作用和与亲电试剂的反应。 发生共价结合时，能够形成小分子化合物d n a 加合物，使d n a 产生链阃交联、链内交 联等。非共价结合包括静电作用( e l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o n ) 、沟区结合( g r o o v eb o n d i n g ) 以 及嵌插结合( i n t e r c a l a t i o nb o n d i n g ) 。除共价和非共价结合外。还有剪切作用和长距离自组 装等结合方式。 1 4 d n a 凝集结构 在体外通过化学式剂作用，d n a 分子显著地缩小，形成高度紧密而且结构规则有序 的结构过程被称之为d n a 凝集( d n ac o n d e n s a t i o n ) 。从生物化学生物物理和分子生物 学，商分子物理和浓缩态物理，生物技术与医学等方面研究d n a 凝集现象，获悉d n a 凝 集体现着基因信息组装和保护的过程，是相转移液晶行为和聚电解质存在的一种可能形 态。d n a 凝集在基因治疗方面存在很大的潜在应用价值【2 “。引起d n a 凝集的试剂称为 凝集试剂，凝集试剂改变d n a 链间的静电反应d n a ，改变d n a 与溶剂的相互作用或 使d n a 双链弯曲变形等。许多试剂能够促进d n a 凝集。多价阳离子【2 2 】，生物体的蛋白、 阳离子磷脂膜、聚合胺、硅烷化试剂f 2 3 1 和其它的小的聚阳离子等都能导致d n a 分子的 凝集。b l o o m f i e l d 详细论述了d n a 凝集的生物物理过程 2 4 1 。d n a 凝集体一般有棒状( r o d ) 和外径为5 0l 曲，内径为1 5n n a 得环状o o r o i d ) 两种结构。g o l a n 等认为棒状结构是向 环状过渡的一种状态瞄j 。从热力学角度来看d n a 凝集是聚合物卷曲球体转变的一种形 式，更多理论见参考文献【2 6 】。 1 5d n a 与小分子相互作用的分析方法 ， 1 5 1 紫外可见分光光度法 分子吸收紫外或可见光引起电子能级跃迁，产生紫外可见吸收光谱( u v - v i s ) ，波长范 围为1 0 0 8 0 0 n m 。根据吸收峰的位置、强度、形状可以推测化合物的结构。增色、减色 效应和等色点是d n a 特有的与其双螺旋结构密切相关的光谱性质。d n a 分子结构改 变时吸收光谱也会相应的表现出一定的减色效应和增色效应。减色效应是d n a 分子轴向 收缩构象变化的结果。增色效应则是d n a 双螺旋结构被破坏所导致1 2 7 l 。l o n g 和b a r t o n 认为强减色和红移是小分子与d n a 发生嵌插作用的标志1 2 引。万红艳等通过分析d n a 与 芦荟大黄素( a l o c - c m o d i ，a e ) 作用后的紫外光谱变化，发现p h 条件不同时，所得的实 验结果不尽相同。在p h4 0 时，a e 以质子化正离子的形式存在，与d n a 发生静电作用； 当p h 为7 4 时，a e 的4 1 1n m 处 。红移了1 9l l l l i ，并出现明显的减色效应，推断a e 可能嵌插到d n a 分子当中【2 9 l 。王兴明等研究了苏木素 i e ) 与d n a 的相互作用。当d n a 加入h e 溶液后，在6 5 2n l n 附近出现了新的h e d n a 复合物的吸收峰。同时5 6 3n m 附 j 匠的特征吸收峰逐渐减小，d n a 对苏木素在5 6 3n m 处具有明显的减色效应，在波长4 9 5 和5 8 0l l l n 两处出现了等色点，由此推测苏木素嵌插到d n a 双链碱基中。以吖啶橙( a o ) 为探针，发现h e 还能破坏碱基中的氢键，使d n a 分子部分解旋i 姗。 1 5 2 荧光光谱法 荧光光谱属分子发射光谱。此种方法具有灵敏度高、选择性强，需样量少和方法简 便等优点，应用范围虽然不及u v - v i s 广，但随着探针技术的发展，使其在d n a 与小分 子相互作用方面发挥着巨大作用。荧光定量分析法可分为直接测定法( 直接比较法、标准 曲线法) 和间接测定法( 化学转化法、荧光猝灭法、敏化发光法) 两类。荧光淬灭法是较为 常见的相互作用分析方法，荧光猝灭法基于本身不发荧光的被分析物质能使某种荧光化 合物的荧光猝灭的性质，通过测量荧光化合物荧光强度的下降，间接地测定该物质的浓 度。张芳等以e b 为探针，根据e b d n a 体系的荧光将发生猝灭的变化，分析了铜r ) 尔北林业人学坳| f 学位论土 天冬氨酸- 咪唑类配合物与d n a 作用方式i j “。陆天虹研究小组以5 5 0n m 作为激发光， 得到发射峰位于6 1 5n m 的硫堇( t h ) 荧光发射光谱图。随着c t - d n a 浓度的增加，使得 6 1 5n l l l 荧光蜂峰强度逐步降低。当c t - d n a 达到一定量时，6 1 5n m 荧光峰几乎完全猝灭 。淬灭常数为数k s v = 1 0 1x 1 0 4l m o l “) ，说明t h 分子嵌入到d n a 双螺旋链的碱基对 中，产生电子转移导致硫堇的荧光发生强烈猝灭【3 “。 1 5 3 圆二色光谱法 圆二色谱( c i r c u l a rd i c h r o i s m ，c d ) 对手性分子十分敏感，当单色左旋与右旋的圆 偏振光通过某一种手性样品时，该样品对友、右旋圆偏振光的吸收不同，称为圆二色性， 其差值即圆二色值，按波长扫描可以得到圆二色谱( c d 谱) 。生物基础分子一般都具有 手性，对生物分子手性的研究中，发现了对称性破缺现象，即在生物体中除最简单的甘 氨酸不具有手性外，组成蛋白质的2 0 种氨基酸都是l 型，而生物体核酸中的糖环则都是 1 ) 型。通过c d 谱可以获得生物大分子的二级结构信息。因此，c d 是分析d n a 分子的 构象变化重要工具之一眦3 4 j 。杜江燕等应用圆二色谱研究了1 ，4 - - - - 氢吡啶( 1 ，4 - d h p ) 衍生 物与c t - d n a 的相互作用。从c t d n a 溶液的c d 光谱可以看到由碱基的堆积产生的 2 7 7n m 的正峰和d n a 双螺旋b 型构象所对应的2 4 6n r n 负峰。不同的l 。4 ，d h p 衍生物 加入后，c t _ d n a 的正负峰明显减小，谱峰位置没有明显的变化，表明1 4 d h p 衍生物 的嵌入使c d n a 碱基的堆积和b 型的双螺旋结构变得松散，而没有引起解链，不同的 衍生物引起的松散程度各不相同【3 ”。宋玉民等根据小檗碱( b e r b e r i n e ) 和溴化乙锭( e b ) 与d n a 作用的c d 谱图，证实e b 主要与d n a 发生嵌插结合，而小檗碱发生的则是沟 槽结合。 1 。5 4 电化学法 利用电化学方法可以研究d n a 与小分子相互作用，分析药物分子与d n a 分子自j 作 用的热力学性质f ”i 。吴海霞等采用电化学法研究了亚甲基蓝( m b ) 与d n a 的作用。她 们在4x 1 0 。5m o l lm b 中加入不同浓度的d n a ，得出m b 和d n a 可以形成非电活性物 质，二者之间存在静电结合，导致m b 的氧化还原峰电流降低，并发生负移；用m b 与 c t - d n a 修饰电极作用所得结果相同【3 8 1 。周家宏等利用电化学方法研究了中性红( n r ) 与c t - d n a 的相互作用机理。在p h = 7 0 的p b s 缓冲液中，1 0m m 的n r 氧化峰和还 原峰峰电位分别为5 5 8 和6 7 8m v ，峰电位差为1 2 0m v ，氧化峰和还原峰峰电流基本 相等，氧化还原式电位为6 1 8m v ；而1 0m mn r 十o 1g ，lc t - d n a 的峰电位分别为- 5 6 1 和6 2 1m v ，峰电位差为6 0m v 氧化还原式电位e = 5 9 1m v ，氧化还原峰峰电流均降低， e 正方向移动2 7m v ，表明n r 与d n a 存在强烈的嵌插作用p 9 j 。 1 5 5 其它方法 多维核磁共振n m r ( m u l t i d i m e n s i o n a ln m rs p e c t r o s c o p y ) 能够从原予水平上展示小 分子化合物与d n a 作用的细节。x 射线晶体衍射( x r a yc r y s t a l l o g r a p h y ) 删gd n a 结构 最为直接的方法之一，d n a 的双螺旋结构就在x 射线晶体衍射的基础上提出的。拉曼光 l 绪论 谱根据分子对单色光散射引起的拉曼效应，问接观察振动跃迁，可以用于研究生物大分 子构象变化。线二色谱( l i n e a rd i c h r o i s m ，l d ) 也常被用来分析小分子与d n a 相互作用。 计算化学方法可以对小分子和d n a 相互作用进行合理模拟计算。a f m 和电镜技术可以 更直观的观测d n a 与小分子后的形貌变化。然而每种研究手段都有各自的局限性，几乎 所有文献中的实验结果都是通过几种方法联合得出的。 1 6 原子力显微镜技术 1 6 1a f m 简介 1 9 8 6 年，b i n n i g 等i 帅】在扫描隧道显微镜( s t m ) 的基础上发明了世界第一台原子力显 微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，a f m ) 。历经2 0 年的发展，a f m 已成为力学显微镜家族中 重要的一员，被广泛地应用于生命科学领域，充当了人们认识微观世界“眼”( 观察表面 信息) 和“手”( 纳米加工和操纵) 的双重角色。s t m 因依靠隧道电流成像，所以要求样品必 须导电。a f m 则克服了这一缺点，制样简单，不需要任何导电、喷金、包埋和荧光染料 染色等繁琐且技术性要求较高的样品处理过程，节省了大量的时间和经费，分辨率可以 达到1a ，远高于环境扫描电子显微镜( e s e m ) ，略高于透射电子显微镜( t e m ) 。a f m 可 直接将样品黏附于云母、石墨、硅片和玻片等平整的基底表面进行扫描，还可以在接近生 理条件下成像，符合生命科学的实验要求。 a f m 根据光杠杆原理设计的光束偏转技术研制而成。在一个对微形变极为敏感的 悬臂( c a n t i l e v e r ) 的一端安装纳米级的针尖( 曲率半径小予1 0n m ) ，扫描时样品和针尖存 在力的相互作用而使悬臂产，主形交，导致从与针尖相对的悬臂背面反射到四象限检测器 的激光束发生微弱变化，继而产生电压差，最后将这些电压信号转换为图像。a f m 共由 偏转检测系统、探针、扫描系统( 压电陶瓷) 、反馈系统、显示系统5 个部分组成( 图1 - 3 ) 。 用于分析的模式有接触模式( c o n t a c tm o d e ) ，振荡模式( o s c i l l a t i n gm o d e ) 两种成像模式和一 种作用力模式( f o r c em o d e ) 。使用接触模式进行扫描时，针尖与样品相互接触，所成的图 像具有较高的分辨率，通常用来检测样品的物理属性，由于剪切力的存在，对样品有一 定损伤，很少用于探测生物样品。振荡模式是靠声学( t a p p i n gm o d e ) 或磁力( m a g n e t i c a i t y ) 驱动，针尖和样品只有短暂接触，作用力较小，常用于生物样品成像。与前两种模式不 同，作用力模式不能用于成像，而是用来测量针尖与样品表面之间相互作用力。探针是 a f m 的重要部件，探针的好坏直接决定着实验的成败。探针因生产厂家而异，主要有s i 针尖、s i 3 n 4 和最近发展起来的碳纳米管针尖 4 1 l 等几种类型。因为探针的形状、力常数、 固有频率等参数不相同。适合的工作范围也不相同，应根据实验需要甄选。至于更详尽 的a f m 原理见相关介绍i “。 专业所限，下面主要介绍下原子力显微镜在植物学研究中的应用。 幽1 - 3 结合实验室现有仪器绘成的a f m 原理圈 1 6 2a f m 在植物学研究中的应用 1 6 2 1d n a d n a 是生命体的主要遗传物质，研究它的结构和功能，有利于了解生命过程中遗传 信息的储存和传递过程。l i n d s a y , s m 等率先应用原子力显微镜对d n a 分子进行了观 察4 3 1 。随后h a n s m a , h g 等人对d n a 的原子力成像进行了大量的研究：4 5 i 。现在关于 d n a 的实验日臻完善，刘志国等运用了二价阳离子和3 - a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e ( a p t e s ) 修饰的云母来固定d n a 分子，给出了用于d n a 分子成像的合适的d n a 的 浓度和二价离子浓度，在不同的a p t e s 修饰云母的方法中，液相溶液修饰的方法能获得 较好的效果；当使用较高浓度的d n a 分子成像时，观察到了d n a 的网络；展示了一 种简单的伸展长链d n a 分子的方法；讨论了最佳的成像条件和a f m 的操作技术并对 各种固定d n a 的方法进行了比较和评估f 4 6 1 。更多的理论和应用参见国内综述【4 7 1 。 1 6 。2 2 蛋白质 植物细胞中含有成百上千种蛋白质，占细胞干重的比例仅次于纤维素，是植物细胞 的重要组成部分。蛋白质通过结构的改变构象的变化来行使功能。人们采用很多手段分 析蛋白质的结构和功能。而a f m 在蛋白质研究中的应用成为电子显微镜、x 射线晶体衍 射、核磁共振技术的有力补充。 ， 膜蛋白的晶体结构解析是国际公认的难题。光合作用相关蛋白历来是植物学家们关 注的焦点。如2 0 0 4 年，我国科学家成功解析了菠菜主要捕光复合物l h c i i 晶体结构， 这项成果引起了国内外学者的普遍关注【4 埘。利用a f m 最早实现了对单个光系统i l 颗粒 及光系统衍生物的观测i 啦”l 。k e m e n 等采用l a n g m u i b l o d g e t t ( l b ) 技术分离捕光复 合物，借助a f m 了解到在单分子蛋白质和蛋白质脂质混合膜上存在类似环形的结构【5 1 1 。 然而t r u d e l 等利用a f m 和近场光学显微镜( s n o m ) 观察吸附在二氯苯脲膜上的光系统i i 中心复合物( p s i ! c o ) 呈翻球状，推断前入环形结果可能是由于力过大对样品造成了一定 的损伤i s 2 】。a t p 合酶为较大的蛋白复合体，它磷酸化a d p 生成a t p 。s e e l e r t 等在2 5m m m g c h 、1 0m mt r i 川c i 、p h7 8 、室温条件下对菠菜叶绿体a t p 合酶亚基- i i i 低聚物进 行a f m 成像，结果表明这种低聚物形状为两种不同外径的圆环，较窄的为5 9 0 3 衄， 较宽的为7 4 0 3n m ，而内径均为3 5 o 3n m ，并且都存在1 4 个亚基【5 3 1 。他们又在脂 双分子膜片段上重建亚基i 低聚物，测得脂双分子层的厚度为4 1 o 2n r i ，蛋白质的厚 度为7 6 0 2n l n ，低聚物圆环尺寸与以前的实验结果致 5 4 1 。在室温下，接触模式观察 到的菠菜完整的叶绿体a t p 合酶的最大外径同样为7 4 o 3n m ，不完整的a t p 合酶为 7 3 o 3n m ，出现不完整的a t p 合酶可能是由于使用s d s 凝胶导致的p 。水通过脂双层 膜所需的活化能大于细胞膜表面的活化能，由此产生了水通道假说。f o t i a d i s 等借助扫描 透射电子显微镜( s t e m ) 和a f m 观察p m 2 8 a 和p m 2 8 c 两种水通道蛋白亚型晶体，发 现了两种不同的类型，一种是p 4 2 1 2 对称，晶格矢量为a - - b = 9 7 6 0 0 6n l n ；一种是紧 密堆积的四聚体六方晶格，晶胞的尺寸规格为a = b = 8 5 8 0 1 8n n lf 刈。对于其他蛋白质? 的a f m 实验也相继进行。l c 舱等在溶液中得到了六角形、椭圆形、z 字型、彗星形、 金字塔形五种s p c i 蛋白低聚物结构聆日：b i a e n c o u r t 对一种植物胞浆蛋白e n t e r o l o b i n 的分 子模型和a f m 图像进行比较，取得一致的结果垆研；在亲水表测量面玉米醇溶蛋白( z e i n ) 高度为4 0 r i m ，耜糙度为6 9 7n n 1 ；疏水表面的蛋白高度均一，粗糙度为1 8 8 啪1 5 9 】；m c i n t i r e 等采用非接触模式分析了六倍体转基因小麦w h e a t ( t r i t i c u ma e s t i v u m ) 的高分子量麦谷蛋 白亚基的结构( h i g h - m o l e c u l a r - w e i g h , g t m e n i ns u b u n i t s ，h m w - g s ) i e o i ：关于嘌呤吲哚蛋白 基因p i n - a 与二棕榈酰磷脂酰胆碱( d p p c ) 相互作用的研究结果表明，d p p c 单层膜较亮 处为液体压缩相( 1 i q u i dc o n d e n s e dp h a s e , l c ) 和较暗处为液体扩展相( 1 i q u i de x p a n d e dp h a s e , l e ) ，加入p i n a 后l e 与l c 相发生颠倒，其中l e 相有大量浓厚的网状聚集，l c 相出 现众多球形突起【6 ”。分子识别力学显微术( m r f m ) 是一种特殊的a f m ，应用此项技术对 豌豆p e a ( s a t i v u ml i n n ) l 血凝素( p s l ) ，甘露醇结合血凝素( m b l ) 和麦胚素( w g a ) 三种植 物血凝素的识别获得成功1 6 2 j 。 1 6 2 3 细胞壁 细胞壁由多糖、蛋白质、芳香族化合物组成的复合体，为植物的重要组成部分，是 区别于动物的重要特征之一。它主要起支撑作用，同时参与细胞识别，保护植物细胞免 受外界病菌的侵扰等。1 6 6 5 年，罗伯特胡克首先用显微镜发现了植物细胞壁的微观结构。 随着实验手段的改进，包括各种染色技术和显微镜技术的发展，使人们对细胞壁的结构 有了进一步的认识。近几年，a f m 逐渐应用到细胞壁的相关研究中。 纤维素以微纤丝( m i c r o f i b r i l ) 的形式存在。光学显微镜无法看到微纤丝的结构。1 9 9 6 年，k i r b y 等用a f m 分别观察了节果、葶荠c h u f a ( e l e o e h a r i sd u l c i s ) 、马铃薯和胡萝卜 几种植物软组织细胞壁的超级结构。他们将样品分为冻融和鲜样两组，测得微纤丝的直 径为2 5n m l 6 3 1 。单个细胞壁多糖分子m i 、洋葱和拟南芥初生壁的结构【6 5 l 、细胞壁多糖复 合物鼠李半乳糖醛酸聚糖( r g i i ) 分子1 6 6 l 成像相继获得成功；对原始细胞壁进行观察，发 现细胞壁表面覆盖一层蜡质，初生壁和次生壁的纤维素和半纤维素呈网状排列，木质素 位于网络表面，次生壁中有单晶和三晶的纤维素晶体结构存在，同时对相 ( p h a s e ) 进行 了分析一”。与以往的提取方式不同，d i n g 和h i m m e l 直接观察玉米m a i z e 初生壁微纤丝， 提出了纤维网络及其合成过程的理论【6 引。一些针对细胞壁结构和功能相关的化学、物理 处理先后展开。分析纤维素酶对棉花纤维的作用时，a f m 图像提供了最直观的证据。c b h i 纤维素酶单独作用6h ，沿微纤丝出现明显的缝隙；e gi i 纤维素酶单独作用6h 纤维表 面剥落且光滑；e g i i 先作用6 h ，然后c b h i 作用6 h ，纤维膨胀且光滑，无缝隙，可能 是由于吸附e g i i 后影响了c b h i 的作用；而c b h i 和e g i l 同时加入作用6 h ，无法辨 认出微纤丝的轮廓，推断两种纤维素酶同时存在是才会使棉花纤维降解 6 9 1 。对芹菜 c e l e r y ( a p i u mg r a v e o l e n s ) 软组织细胞的研究表明，在脱水过程中微纤丝的直径增加，冻干 后微纤丝的直径大于空气干燥的直径1 7 0 1 。y o s h i n o 等人利用a f m 对经过氤气处理过的大 麦b a r l e y ( h o r d e u mv u l g a r e ) 胚芽鞘细胞，与对照相比，在空气中经0 1m p a 氙气处理过的 细胞的细胞壁变得粗糙，1 2 0n m 宽、5n n l 高的纤维结构分布于初生壁中；而在溶液中经 0 3 8m p a 氙气处理后的细胞壁局部粗糙，局部平滑；0 4 8m p a 处理的则变得光滑“。经 紫外线处理后，葡萄g r a p e ( i q t i sv i n i f e r a ) 细胞壁表面出现了果胶分子链，证明细胞壁具有 抵抗紫外线的能力【翻。由黑云杉( p i c e am a r i a n a ) 制成的牛皮纸纸浆样品经过过氧化氢 ( h 2 0 2 ) 漂白后，纤维表面出现球状的木质素分子堆积，证明了h 2 0 2 能够氧化纤维素和木 质素两种生物大分子1 7 3 1 。 木质素是高度复杂的酚类大分子，通常与纤维素、细胞壁多糖相结合，具体结构还 不十分清楚【7 4 1 。木质素主要用于抵抗机械胁迫和重力影响。结合功能化a f m 和环境扫 描电镜技术( e s e m ) ，m i c i e 等对于光化学木质素模型化合物作力曲线分析，表明分子中 不存在主客体的相互作用，推测这种分子可能在地球表面过多紫外线照射的条件下行使 功能1 7 5 】。他们随后应用s n o m 和a f m 对木质素模型化合物物理化学属性和组装形式进 行研究1 7 6 1 。r a d o t i c 通过实验在木质素圆球直径上获得具有三个峰值( c o h e s i o np e a k s ) 的力 曲线，结合e s e m 判断可能有水或气体充斥在木质素的亲水和疏水区域，这种结构可以 减少质量，同时减轻外界坏境对细胞的胁迫1 7 ”。 1 6 2 4 淀粉 淀粉是植物细胞内的主要贮存多糖，是人类的主要食物来源，在植物生长期间以淀 粉粒形式存在。利用低压扫描电镜和a f m 对小麦和马铃薯淀粉粒表面进行观察，发现表 面有1 0 0 3 0 0n n l 高左右的突起，2 0 5 0n l n 宽的平面，而小麦表面凸起较少，仅有2 0n m 的平面 7 8 1 。在水稻淀粉粒上有3 0n m 左右的颗粒存在，偶尔伴有支链结构排列 7 9 1 。在空 气中干燥后的马铃薯椭圆形淀粉颗粒表面出现不均一的波纹；烘干的淀粉颗粒出现孔洞； 经过烘干再冰冻处理，淀粉颗粒表面无变化，而空气干燥再冰冻后可见到4 0 7 0n l n 的类 似于墙壁的环型突起，这种形状在烘干后再置于水中冰冻处理的样品中发现相同的结构 存在；处于潮湿环境中的样品表面有折叠【8 们。对玉米的直链淀粉非球形颗粒进行分析发 现放射状的晶体片层 8 q 。直链淀粉、支链淀粉的研究显示淀粉表面覆盖1 5 3 5 姗宽，l - 4 1 l i l 高的凸起眵”。淀粉粒的超微结构有簇结构和止水塞两种模型。其中止水塞( b l o c k l e t ) 指的是生长环的结晶层与非结晶层中类似球状的结构，大小、形态因其存在的位置不同 有很大的差异，a f m 为止水塞理论提供了证据 $ 3 ；8 4 ；8 5 】。 1 6 2 5a f m 在植物细胞及亚细胞结构研究中的应用 染色体的结构与功能的研究一直是细胞学、遗传学中的重大课题。w i n f i e l d 等人首 次报道了应用a f m 观察植物染色体的研究。他们采用常规方法分离的小麦染色体，没有 经过染色和喷金处理而直接进行观察，并测量了染色体表面的高度，发现c 带高覆3 5n n l 且成对存在1 8 6 1 。s c h a p e r 等将场发射扫描电镜( f e s e m ) 和a f m 联用分析有丝分裂时期的 大麦染色体形态变化。液相下，a f m 图像显示前中期染色表面凝聚，后期出现染色单体 裂隙，末期着丝粒区域清晰可见；气相下，经过蛋白激酶k 作用后的染色体表面出现网 状结构【s 7 l 。其他研究人员利用s n o m 与a f m 测量荧光原位杂交( f i s h ) 的大麦染色体的 高度和荧光强度，取得了良好效果【勰8 9 ；呲9 。l i u 等用2 mn a c l 从大麦染色质中提取分 子量为4 0 0 0 和2 0 ，0 0 0d a 的两个非组蛋白后，从a f m 的图像中了解到染色质自每粗糙度 增加，高度减小，为研究非组蛋白与d n a 的关系提供了新思路睇】。通过1 5 、3 0 、4 5 三种浓度的乙酸处理大麦染色体，结果表明3 0 浓度时可以得到清晰的染色体形貌，为 研究染色体有序结构创造了条件1 9 3 1 。在染色体结构中，着丝粒与其它区域完全不同，并 且这个区域的染色质纤维结合紧密不易观察。为了解决这个问题，引入了一种利用显微 操作技术机械伸长着丝粒的方法，实现了对染色质纤维的成像 9 4 1 。 b u t t 等( 1 9 9 0 ) 首先将a f m 用于植物细胞的观察。他们获得了南紫薇( l a g e r s t r o e m i a s u b c o s t a t a ) 的叶片表皮及气孔的图像，由于表皮较厚没能展示2 0 0n l f l 以下的更多细节；而 水生植物香睡莲( n y m p h a e ao d o r a t a ) 表皮相对较薄，可以见到表皮微纤丝结构1 9